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de Guevara
CONTENIDO
1. 2. 3. 4. INTRODUCCIN..1 TEORIA DE LA SEDIMENTACIN...2 FUERZA CENTRFUGA RELATIVA..3 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN.. 3 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN ESTNDAR... 4 DEPENDENCIA DE S CON RESPECTO A LA CONCENTRACIN...4 SEDIMENTACIN DEPENDIENTE DE LA VELOCIDAD...6 EFECTO DE LA CARGA EN LA SEDIMENTACIN....7 MEDICIN EXACTA DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIN.....7 CENTRFUGAS..8 CENTRFUGAS DE BAJA VELOCIDAD....8 CENTRFUGAS DE ALTA VELOCIDAD....8 ULTRACENTRFUGAS.8 CENTRFUGA TUBULAR..11 CENTRFUGA DE CAMARA MULTIPLE.11 CENTRFUGAS DECANTADORAS O DE TORNILLOS.12 CENTRFUGAS DE DISCOS...12 TIPOS DE ROTORES...13 ROTORES DE COLUMPIO.13 ROTORES DE NGULO FIJO....14 ROTORES VERTICALES....14 ROTORES ZONAL...15 FACTOR K Y K...16 TIPOS DE CENTRIFUGACIN..17 CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL O PELLETING...18 CENTRIFUGACIN ZONAL..18 MATERIALES PARA GENERAR UN GRADIENTE DE DENSIDAD.20 FORMAS DE GRADIENTES...22 CENTRIFUGACIN AL EQUILIBRIO...23 GRADIENTES DE DENSIDAD AUTOGENERADOS..24 MATERIALES PARA FORMAR GRADIENTES AUTOGENERADOS..24 PREPARARACIN DE GRADIENTES..25 GRADIENTES DISCONTINUOS....25 GRADIENTES CONTINUOS..26 GRADIENTES PREFORMADOS....26 GRADIENTES AUTOGENERADOS..27 DETERMINACIN DE LA FORMA DE UN GRADIENTE AUTOGENERADO..29 GRADIENTES ISOSMTICOS...29 ANLISIS DE LA DISTRIBUCIN DE LA MUESTRA EN EL GRADIENTE...29 INSPECCIN VISUAL.....29 ANLISIS RADIOQUIMICOS DE LA MUESTRA ...30 APLICACIONES...31 CROMATOGRAFA DE PRECIPITACIN CENTRFUGA.31 MICROSCOPIO DE POLARIZACIN CENTRFUGA.32 SEPARACIN DE DNA, RNA Y PROTEINAS DE NUCLEOS FIBROBLASTOS DE HAMSTER...33 SEPARACIN DE DNA EN BASE ALA COMPOSICIN GC, CON USO DE BAMD..33 SEPARACIN DE DNA NATIVO Y DESNATURALIZADO CON GRADIENTES DE DENSIDAD DE TRICLOROACETATO DE RUBIDIO...33 FRACCIONAMIENTO DE RNA.34 SEPARACIN DE DNA PLASMDICO, EN ROTORES DE TUBO VERTICAL....34 FRACCIONAMIENTO CELULAR POR CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL..35 BIBLIOGRAFA36 APNDICE ...37
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INTRODUCCIN
La separacin de lquidos y partculas insolubles se ha dado en la naturaleza desde que se form el universo. La aplicacin de una fuerza centrfuga ayuda a la separacin y este proceso se ha venido aplicando recientemente. La separacin de partculas por medio de la centrifugacin tuvo aplicaciones en procesos industriales hasta hace aproximadamente 100 aos. Los primeros usos fueron en la manufactura del azcar y en separar la crema de la leche. Las primeras separaciones de partculas usando centrifugacin fueron probablemente inventadas en 1877 por el ingeniero sueco Carl Gustaf Patrik DeLaval para separar crema de leche, estas centrfugas funcionaban a velocidades de hasta 3 000 r.p.m. El desarrollo de la ultracentrfuga se le atribuye a Svedberg quien trabaj entre 1920 y 1930, el fue quien introdujo el termino de ultracentrfuga y debido a que era un qumico coloidal, estudiaba la estructura de las protenas ( en esa poca todas las protenas eran consideradas coloides); su grupo utilizaba la ultracentrfuga para determinar el peso molecular y la subunidad estructural de la hemoglobina, sus estudios cambiaron las ideas concernientes a la estructura de las protenas que se tenan en aquel tiempo. El grupo de Svedberg desarrollo algunas centrfugas y los primeros modelos funcionaban a velocidades de hasta 900 000 g y cuyos rotores eran pequeos; otros modelos funcionaban a velocidades de hasta 260 000 g. SPINCO produjo en 1940 la primera centrfuga comercial, el modelo original es mostrado en la siguiente figura.
Una de las tcnicas ms comnmente utilizadas en la actualidad para caracterizar las macromolculas es la sedimentacin. Utilizando las variantes adecuadas de esta tcnica, se pueden obtener el peso molecular, la densidad y la forma general de la macromolcula; adems, se puede detectar cambios en estos parmetros y cualquiera de ellos se puede aprovechar como base para la separacin de los componentes de una mezcla con propsitos preparativos o analticos. Debido a la facilidad con la que se obtienen los resultados en los modernos instrumentos automticos, hacen de la ultracentrifugacin una tcnica especialmente til. En realidad, con una ultracentrfuga solamente se hace una cosa: mover a las partculas por la fuerza centrfuga y medir, una o varias veces a lo largo del tiempo, la distribucin de la concentracin de las partculas a lo largo del tubo de la centrifugadora. La medicin realizada mientras las molculas se estn moviendo a lo largo del eje de la fuerza centrfuga, se denomina determinacin de la velocidad de sedimentacin y el resultado es un coeficiente de sedimentacin, cifra que proporciona informacin sobre el peso molecular y la forma de la partcula. Cuando se mide la distribucin de concentraciones bajo condiciones en las que la distribucin ya no cambia con el tiempo, se dice que las partculas han alcanzado el equilibrio de sedimentacin; este segundo tipo de medida proporciona datos sobre los pesos moleculares, la densidad y la composicin de las partculas.
Teora de la Sedimentacin
Las partculas en disolucin pueden sufrir alteracin espacial, es decir, pueden cambiar de posicin con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusin (en un gradiente de concentracin, las partculas tienden a ir de la zona de mayor concentracin a la de menor concentracin) o bien a procesos de sedimentacin. En un proceso de sedimentacin la velocidad a la cual sedimentan las partculas en una suspensin, no slo depende de su naturaleza, depende tambin de la naturaleza del medio en el cual estn suspendidas as como, de la fuerza aplicada a las partculas. Intuitivamente, uno especulara que las partculas ms grandes sedimentarn ms rpido que las ms pequeas. Un factor que afecta la sedimentacin de las partculas es la viscosidad del medio. En 1856 Sir Gabriel Stokes propuso que la fuerza friccional, F, que acta en una partcula esfrica de radio rp es relacionada a la viscosidad, h, por la siguiente ecuacin: F= 6 p h rp dr/dt Donde dr/dt es la velocidad de la partcula. La fuerza que experimenta una partcula no est slo determinada por la fuerza gravitacional, g, sino tambin, por los efectos de flotacin que reflejan las diferencias en la densidad del medio dm y de la partcula dp, por lo que tenemos: (dm - dp) V g = 6 p h rp dr/dt V= volumen de la partcula Como se asume que la partcula es esfrica, el volumen puede ser expresado en trminos del radio: (dm - dp) ( 4/3 p rp3) g = 6 p h rp dr/dt en la prctica, la fuerza centrfuga que mueve a la partcula sobre su eje de rotacin es mucho mayor que la fuerza de gravedad, se puede expresar la fuerza centrfuga de la siguiente manera: Fuerza centrfuga = w2r / g Donde r es la distancia radial de la partcula del eje de rotacin y w es la velocidad angular en radianes / segundo, haciendo una sustitucin en esta frmula y simplificando la expresin en trminos de la velocidad de la partcula, tenemos: dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r dt 9h Esta expresin es cierta para partculas esfricas. Las partculas no esfricas tienen altos coeficientes de friccin, por lo que, la expresin se puede modificar en base a los coeficientes de friccin de una molcula dada, f (f= 2phmD), con relacin al coeficiente de friccin de una partcula esfrica, fo. dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r dt 9h (f/fo)
Por la anterior ecuacin, podemos deducir que: 1) Una partcula con mayor masa tiende a moverse ms de prisa que una de menos masa 2) Una partcula ms densa se mueve ms de prisa que otra menos densa 3) Cuanto ms densa sea la disolucin, ms lentamente se mover la partcula 4) A mayor coeficiente de friccin, ms lento ser el movimiento de la partcula
La fuerza centrifuga es dada en trminos de g y N esta dada en miles de r.p.m.. Si la fuerza centrifuga es conocida, entonces la velocidad (N) requerida en r.p.m. para obtener esa fuerza centrfuga a un punto r (cm) de el centro de rotacin puede ser calculada con solo despejar la ecuacin anterior.
Coeficiente
de Sedimentacin
Como la velocidad de una molcula es proporcional a la magnitud del campo centrfugo (w2r) es comn discutir las propiedades de sedimentacin en trminos de la velocidad por unidad de campo, o sea: s = (dt/dr) / w2 r
Donde s es el coeficiente de sedimentacin; el objetivo inmediato de muchos de los experimentos de velocidad de sedimentacin es la determinacin del valor del coeficiente de sedimentacin. Dado que la velocidad de sedimentacin es mucho mas pequea que la velocidad angular, para la mayora de macromolculas biolgicas la magnitud de s es alrededor de 10-13 seg y es por ello que la unidad de sedimentacin Svedberg (S) ha sido definida como 10-13 S = 10-13 seg As por ejemplo, tenemos que la constante de sedimentacin de los ribosomas de eucarotes es 80S, o sea, s = 80 x 10-13 seg.
Coeficiente
de Sedimentacin Estndar
En una centrifugacin, el valor del coeficiente de sedimentacin no depende slo de la velocidad o tipo de rotor, depende tambin del tamao y densidad de la partcula, as como, de la densidad y viscosidad del medio utilizado para la centrifugacin. La dependencia de la viscosidad del medio se puede descartar siempre que se utilice el mismo medio para la centrifugacin. El medio ms utilizado es el agua, cuya densidad y viscosidad son conocidas a 20 0C. El coeficiente de sedimentacin de una partcula en agua a esta temperatura se denotar s20,w y como las condiciones de viscosidad y densidad del medio se descartan por ser siempre las mismas, ahora, el coeficiente de sedimentacin depender slo de las parmetros de la partcula. Entonces tenemos: s20,w = k [D2 (d - d20,w)] / h20,w Donde k es 1.18 para una partcula esfrica y 1.12 para una partcula cilndrica, D es el dimetro en cm, d es la densidad de la partcula (g/cm3) , d20,w y h20,w son la densidad y viscosidad del agua. Para determinar la constante de sedimentacin no es necesario realizar la centrifugacin con agua como medio, los datos de la centrifugacin pueden obtenerse con otro medio cuya densidad y viscosidad sean conocidas. Para transformar el coeficiente de sedimentacin de una partcula de un experimento dado a la constante de sedimentacin estndar, s20,w es dividida entre s, as, se obtiene la eliminacin de k y D2 : s20,w = s [ (d - d20,w) hm ] / [ (d - dm ) h20,w] Sustituyendo s en la ecuacin, tenemos: s20,w = v w2r . (d - d20,w) hm (d - dm ) h20,w
Donde d es la densidad de la partcula (g/cm3), v es la velocidad de sedimentacin, r es la distancia de la partcula al eje de rotacin (cm) y w es la velocidad angular (rad/seg). El coeficiente de sedimentacin de las macromolculas depende de toda una serie de factores, puesto que las molculas tienen una forma que depende de la composicin del disolvente, muchas de ellas pueden estar elctricamente cargadas, son muy grandes comparadas con las molculas del disolvente y se deforman a medida que se mueven. Estos efectos se manifiestan en la dependencia que s presenta respecto a la concentracin, la velocidad de centrifugacin y la fuerza inica del disolvente.
consiguiente se reduce s. Como la probabilidad de colisin aumenta tanto con el volumen como con el grado de extensin de la molcula, la magnitud de la dependencia respecto a la concentracin tambin aumenta a medida que lo hacen dichos parmetros. En la siguiente figura se ejemplifica este punto con varias curvas de s en funcin de la concentracin de DNA o de protena.
Fago FX 174
s/s0
T7 DNA
T6 DNA
Concentracin mg/ml Dependencia de s con respecto a la concentracin expresada como s/so donde s0 es el valor de s extrapolado a concentracin cero.
En la grfica se puede observar que la dependencia respecto a la concentracin aumenta a medida que aumenta el peso molecular y a medida que la molcula es ms extendida. Las protenas pequeas son ms pequeas que Fago fx 174, este es ms pequeo que el DNA del fago T7. Nota: El valor de so se obtiene experimentalmente midiendo s a varias concentraciones y representando grficamente 1/s frente a la concentracin para determinar 1/s0 por extrapolacin a concentracin de cero. Esto se deduce de la siguiente ecuacin 1/sc= 1/s0 + k/s0. Si las molculas de una disolucin tienen diferentes s y la concentracin es relativamente alta, surge un nuevo problema. En este caso, las molculas no solamente interfieren con la sedimentacin de las de su misma clase, sino tambin con las de otros tipos. Es ms, la molcula con el mayor s y mayor dependencia respecto a la concentracin, tiene que sedimentar a travs de la disolucin de las molculas de movimiento ms lento . A concentraciones elevadas, las molculas ms veloces resultan tan impedidas en su movimiento que sedimentan a la misma o similar velocidad que las lentas, lo cual puede enmascarar el hecho de que, en realidad, se trata de una mezcla y dar la informacin errnea de que el material que se est analizando es homogneo. Este fenmeno se conoce como efecto de Jhonston-Ogston. De hecho, con cidos nucleicos de gran tamao se hace necesario utilizar pequesimas concentraciones antes de que los dos tipos de molculas puedan diferenciarse e, incluso a estas concentraciones, los datos indican a menudo que hay menos cantidad del componente rpido de la que realmente hay. Cabe mencionar que este problema queda muy reducido con el uso de la tcnica de centrifugacin zonal.
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DNA DE PORCENTAJE
Peso molecular
CENTRFUGAS
Los experimentos de centrifugacin requieren aparatos que funcionan a velocidades exactamente conocidas con pequeas variaciones y sin fluctuaciones de temperatura. Existen varios criterios para clasificar las centrfugas, uno de ellos es por la mximo velocidad a la que operan, as tenemos:
Ultracentrfugas
La fuerza generada por las ultracentrfugas pueden ser significativamente mayor de los 600,000 g, los cuales son suficientes para separar protenas pequeas. Las ultracentrfugas son subdivididas en dos tipos: analticas y preparativas. La ultracentrfuga analtica a menudo es confundida con la ultracentrfuga preparativa. Sin embargo, los experimentos con la analtica son diferentes en varios aspectos. El ms importante es que cuenta con un sistema ptico, por lo que, la muestra es visualizada en tiempo real durante la sedimentacin, permitiendo la determinacin exacta de parmetros hidrodinmicos y termodinmicos. Adems, el propsito del experimento es para caracterizar las propiedades claves de la muestra o para purificar la muestra para un uso posterior.
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En contraste a muchas tcnicas biofsicas, las biomolculas son caracterizadas durante la ultracentrifugacin analtica en su estado nativo bajo condiciones biolgicas importantes. En el siguiente esquema se pueden observar las diferencias entre un rotor de una centrfuga analtica y una centrfuga preparativa.
Analtica
Preparativa
Las ultracentrfugas analticas Beckman se componen esencialmente de un motor, de un rotor de centrifugacin, que esta en una cmara blindada protectora y de un sistema fotogrfico para registrar la distribucin de las concentraciones de la muestra en la celda de centrifugacin, o bien, de una computadora. El rotor esta suspendido en el centro del motor mediante un cable. Uno de los agujeros del rotor contiene la celda de centrifugacin; el otro sirve para equilibrar el peso y contiene un agujero de referencia para determinar la distancia al centro de rotacin. Las paredes de la celda estn diseadas de modo que si se orientan con cuidado al colocar la celda en el rotor, tales paredes sern paralelas a las lneas del campo centrfugo, lo cual impide la acumulacin de materiales en las paredes de la celda. La celda consta de una pieza central que contiene la muestra lquida, dos ventanas, un cilindro soporte en el que se introduce la pieza central y las ventanas; y una compuerta de alimentacin. Las ventanas suelen estar hechas de cuarzo, aunque a veces se utiliza zafiro para centrfugas de velocidades muy altas puesto que se deforma menos cuando se opera a fuerzas elevadas. La pieza central suele estar hecha de metal (aluminio) o de plstico, las primeras tienen la ventaja de que el equilibrio trmico queda establecido rpidamente, reduciendo al mnimo la conveccin producida por los gradientes trmicos. La desventaja del metal es que a veces reacciona con el disolvente o el soluto por lo que, hay que utilizar el plstico. Una ultracentrfuga analtica es una ultracentrfuga preparativa complementada con un sistema de deteccin ptico que es capaz de medir directamente la concentracin de la muestra durante la sedimentacin. La introduccin de la ultracentrfuga analtica Beckman Coulter XL-A fue en 1992 y en contraste a la versin anterior (modelo E), el modelo XL-A es compacto y fcil de utilizar. Los parmetros de centrifugacin (velocidad del rotor, temperatura.) y adquisicin de datos son bajo control computarizado y experimentos largos, de horas o das, se llevan a cabo con la mnima intervencin del operador y si se desea, los datos pueden ser vistos o analizados en tiempo real. El modelo XL-A utiliza un sistema ptico de absorbancia basado en una lmpara de xenn, un rastreador monocromtico que permite la medicin de la concentracin de la muestra en un rango de longitud de onda de 200 a 800 nanmetros. El sistema ptico de interferencia Rayleigh fue adicionado al modelo XLA creando la ultracentrifuga analtica XL-I que puede obtener datos simultneamente con ambos tipos de sistemas pticos. El sistema ptico de interferencia Rayleigh mide la concentracin de la muestra basado en cambios en el ndice de refraccin.
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Cada sistema ptico tiene ciertas ventajas y desventajas. La ptica de absorcin es sensible para la deteccin de macromolculas que contienen fuertes grupos cromforos. Por ejemplo, tomando la ventaja de la intensa absorcin del grupo amida en el lejano ultravioleta (230 nm), las protenas pueden ser caracterizadas con una buena seal a concentraciones de 10 mg/ml. Similarmente, los cidos nucleicos pueden ser estudiados en la misma concentracin por su absorbancia a 260 nm. Para muestras que contienen dos a ms componentes con diferente espectro de absorcin (por ejemplo protenas y cidos nucleicos) los datos pueden ser obtenidos a mltiples longitudes de onda para detectar selectivamente las diferentes especies en solucin. El sistema ptico de interferencia Rayleigh es utilizado para el anlisis de macromolculas que carecen de cromforos intensos (ejemplo polisacridos) y muestras que contienen molculas que absorben fuertemente (ejemplo ATP, GTP, DTTOXIDADO). Este sistema ptico es utilizado para la caracterizacin de muestras muy concentradas.
Existe otro tipo de sistema ptico utilizado en las centrfugas analticas llamado sistema Schlieren, en el cual la luz que atraviesa las regiones de concentracin uniforme prosigue su camino sin desviarse, mientras que la que atraviesa regiones de concentracin cambiante se desva debido al cambio del ndice de refraccin que vara con la concentracin. El sistema ptico de las modernas centrfugas convierte estas desviaciones en una curva que muestra el gradiente de concentracin. Se puede ajustar el sistema de modo que las curvas sean ms o menos agudas; sin embargo, al realizar estos ajustes, el rea rodeada por la curva Schlieren y la lnea de base debe permanecer constante y proporcional a la concentracin. Midiendo estas reas y utilizando ciertas constantes pticas del aparato, se puede determinar la concentracin. A medida que disminuye la
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concentracin del material en la celda, tambin disminuye el rea englobada por el pico hasta que apenas puede diferenciarse de la lnea de base. En la prctica, el limite inferior del sistema Schlieren es una concentracin de algunos miligramos por milmetro. El valor del sistema Schlieren reside en su gran capacidad para examinar el perfil del frente de sedimentacin y para detectar la presencia de heterogeneidades en s. Se ha utilizado muy ampliamente, sobre todo para la determinacin del coeficiente de sedimentacin de las protenas. Otras variantes de centrfugas utilizadas ampliamente, son descritas a continuacin.
Centrfuga Tubular
Las centrifugas tubulares (CT) consisten bsicamente de un tubo vertical esbelto que gira a altas velocidades por la accin de un motor elctrico, o una turbina de aire o vapor. Este tipo de centrfuga es una de los ms eficientes y sencillos, capaz de separar partculas hasta de 0.1 mm. Las CT pueden contar con un sistema de enfriamiento por lo que son empleadas en el manejo de caldos con enzimas o protenas. Durante la operacin de la CT la suspensin es alimentada por la parte inferior y los slidos sedimentan en la pared del tubo. El lquido claro se recolecta por rebosamiento en la parte superior. Conforme se forma la precipitado el rea de flujo se reduce y el tiempo de residencia del liquido disminuye. Esto se traduce en un aumento gradual del contenido de slidos en el sobrenadante que puede ser determinado por mediciones de turbidez. Un modelo tpico de laboratorio consta de un tubo de 4.5 cm de dimetro por 25 cm de longitud, el cual puede girar a una velocidad de hasta 50 000 r.p.m., desarrollando campos de hasta 62 000 g, con una capacidad de hasta 100 l/h. En la siguiente imagen se muestra una centrfuga tubular.
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El dimetro de los equipos de cmara mltiple vara de 335 a 615 mm, con velocidades de rotacin entre 5 000 y 8 400 r.p.m., produciendo campos entre 5 000 y 9 000 g, respectivamente. La capacidad de manejo de slidos vara entre 2.5 y 60 litros dependiendo del material y del nmero de cmaras. La descarga de slidos y el mantenimiento de estos equipos es ms difcil que el de las centrfugas tubulares, ya que la centrfuga tiene que ser desarmada para sacar los slidos.
Centrfuga de Discos
La centrfuga de discos consta de un eje vertical sobre el cual se montan un conjunto de discos en forma de conos truncados, uno sobre otro. El rotor de la centrifuga provoca el giro tanto de los discos como del tazn de la centrifuga. Los discos constan de bordes internos que permiten mantener pequeas separaciones entre ellos, del orden de 0.5 a 2.0 mm. El ngulo que forman los conos con la vertical vara entre 35 y 500 dependiendo de la aplicacin particular. Entre la pila de discos y el tazn existe un espacio que permite la acumulacin de slidos. Durante la operacin de la centrifuga de discos la suspensin es alimentada continuamente en el fondo del tazn a travs de la parte central de la flecha, y fluye hacia arriba entre las placas hacia la salida en la parte central superior del equipo. Debido a la fuerza centrfuga, los slidos se depositan en la cara interna de los discos, resbalando hacia la cmara colectora debido al ngulo de los discos. La siguiente imagen muestra una centrfuga de discos. En Internet, se encuentra un archivo del funcionamiento de este tipo de centrfugas en la direccin: te://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html
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TIPOS DE ROTORES
Los rotores para centrfugas preparativas pueden ser clasificados en cuatro tipos principalmente: rotores de columpio, rotores de ngulo fijo, rotores verticales y rotores zonales.
Rotores de Columpio
En el caso de estos rotores la muestra estn en una cubeta individual el cual se mueve de forma perpendicular al eje de rotacin del rotor, por lo tanto, en estos rotores, la fuerza centrfuga es ejercida a lo largo del eje del tubo, y a pesar de que la fuerza centrfuga es axial, algunas partculas son sedimentadas sobre la pared del tubo; esto se puede evitar con la sedimentacin zonal. Estos rotores llevan de tres a seis tubos fijados a un soporte de metal que esta libremente suspendido, la suspensin libre sirve solo para fijar la posicin de inicio del tubo con la muestra, cuando el rotor comienza a girar, el bucket se pone de forma horizontal. Todos los buckets de un rotor son de igual masa por lo que slo se necesita balancear los tubos con la muestra. La superficie de los buckets debe de estar seca y limpia Los rotores de columpio Beckman tiene un nmero que designa la mxima velocidad permitida (r.p.m. x 1000) y por Ti si esta hecho de titanio, el digito adicional que sigue a la marca mencionada indica la variante del rotor con la misma velocidad mxima ( 50 Ti, 50.2 Ti, etc.) seguido de las letras SW. Estos rotores pueden ser divididos en tres grupos. 1.- Rotores de alta velocidad con tubos de 4.4 y 5 ml. Tipo SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti y SW 65 Ti. Estos rotores son convenientes para centrifugacin zonal y al equilibrio donde no es necesaria una fina resolucin. 2.- Rotores de velocidad moderada para tubos de 13.2 a 17 ml de capacidad, son convenientes para la separacin de partculas de masa similar por medio de centrifugacin zonal en gradientes de densidad de sacarosa. Este grupo incluye rotores del tipo SW 20.1, SW 40 Ti y SW 41 Ti. 3.- Rotores para tubos largos y de baja velocidad de rotacin. Incluye rotores del tipo SW 25.1 que contiene tres tubos de 34 ml, el tipo SW 25.2 (3x 60 ml) y SW 28 con seis tubos de 38.5 ml. A continuacin, la imagen corresponde a un rotor de columpio.
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Eje de rotacin
rmin rmax
Rotores Verticales
Estos rotores se utilizan en la mayora de centrfugas de alta velocidad y ultracentrfugas. En estos rotores, los tubos estn en posicin vertical y se podra considerar que es una forma extrema de un rotor de ngulo fijo, sin embargo, las caractersticas del rotor vertical son lo suficientemente diferentes para considerarse otra categora. Cuando el rotor gira la solucin se reorienta 900, esta reorientacin se lleva a cabo debajo de las 1000 r.p.m. y si la aceleracin es suficientemente lenta la reorientacin no rompe el gradiente. La caracterstica importante de los rotores verticales es la corta trayectoria de sedimentacin de las partculas (que equivale al dimetro del tubo). El diseo de los rotores verticales permite muy altas fuerzas centrfugas.
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Los rotores verticales no son convenientes para sedimentacin pero pueden ser utilizados para centrifugacin isopcnica. La siguiente imagen muestra un rotor vertical.
Rotores Zonal
Los procesos de sedimentacin que se llevan a cabo en un rotor zonal son similares a los que ocurren en los rotores de bucket, sin embargo, en lugar de tubos hay cuatro sectores en el cuerpo del rotor zonal formados por la insercin de una cilindro de cuatro sectores que esta hecha de Noryl, un qumico inerte y suave. El ensamble del aspa asegura la rotacin del liquido junto con el rotor y consecuentemente la formacin de una fuerza centrfuga. La direccin de la sedimentacin es hacia la periferia del rotor. En el interior del centro de las aspas hay canales que conectan la parte central y la regin perifrica del rotor con un dispositivo transicional que se encuentra arriba del rotor. Esto permite que el rotor pueda ser llenado y descargado mientras esta girando a baja velocidad (2000 a 3000 r.p.m.), esto es necesario para crear un gradiente de densidad al inicio de la corrida y prevenir la ruptura del mismo despus del fraccionamiento. La densidad del gradiente aumenta del centro a la periferia del rotor haciendo que la fuerza centrfuga sea mantenida a lo largo de la corrida. La siguiente imagen ilustra la carga de la muestra: la solucin es bombeada o inyectada con una jeringa por un canal central, mientras el exceso de muestra es desalojado del sistema. Para asegurar la eficiencia de separacin el volumen no debe de exceder el 10 % de la cavidad del rotor. La inyeccin de la muestra debe de ser en forma lenta y uniforme.
El siguiente esquema muestra el paso final de una centrifugacin zonal. El rotor es cerrado con una tapa y gira a altas velocidades, las partculas estn distribuidas a lo largo del gradiente de acuerdo a sus respectivas constantes de sedimentacin.
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Carga y fraccionamiento de un gradiente: Mientras el rotor est girando lentamente el lquido de mayor densidad que ser usado en la formacin de gradiente se carga a travs de una conexin hacia el centro del rotor, seguida por las dems soluciones de densidad decreciente. El siguiente esquema muestra la salida de las soluciones del gradiente, esta es a travs de una lnea central donde la salida de la solucin menos densa precede a la ms densa. La solucin es monitoreada por un densitmetro, fluormetro o medidor de la radioactividad para que las fracciones puedan ser colectadas individualmente.
Se han desarrollado diferentes diseos de este tipo de rotores a los que se las ha agrupado en diferentes series, de tal manera que hay de la serie A, B, C, D, F, K y J. Cada serie agrupa a rotores que comparten caractersticas en cuanto a su velocidad. En la siguiente tabla se muestran las aplicaciones de los rotores en los diferentes tipos de centrifugacin.
Tipos de rotores y sus aplicaciones.
Tipo de separacin Tipo de rotor ngulo fijo. Vertical. De columpio. Zonal. sedimentacin zonal excelente Pobre Ineficiente Pobre isopcnica buena excelente adecuado adecuado
Factor k y k
Un concepto para la seleccin o funcionamiento de un rotor es el factor k y el factor k. Estos factores pueden ser utilizados para comparar la eficiencia de varios rotores para el material con el que se esta trabajando. El factor k provee una estimacin del tiempo t en horas, requerido para separar la partcula de inters con un coeficiente de sedimentacin conocido s (en unidades Svedberg), a la mxima velocidad del rotor, por lo que tenemos: t= k / S20,w Si se conoce el coeficiente de sedimentacin de la partcula en el medio utilizado y el factor k del rotor, es posible estimar el tiempo de separacin de la partcula.
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El factor k se calcula de la siguiente manera k= ln (rmax/rmin) x 1013 w2 3600 donde, w es igual a 0.104720x r.p.m., rmax es la mxima distancia radial de el eje centrifugo (en cm) y rmin es la distancia mnima radial de el eje centrfugo (en cm). A menor valor de k, ms eficiente es el rotor, puesto que varia directamente proporcional al tiempo en que tarda la partcula en separarse. El factor k es utilizado para estimar el tiempo requerido para mover una zona de partculas a el fondo del tubo a travs de un gradiente lineal de sacarosa a la mxima velocidad del rotor. K = I Z2 I Z1 x 1013 W2 3600 Donde Z2 es el mximo porcentaje de el gradiente de sacarosa, Z1 es el mnimo porcentaje de el gradiente de sacarosa, I es el valor integral obtenido en unas tablas (ver tabla I del apndice), despus de calcular Z0. Z0 = Z1 rmax Z2 rmin rmax rmin El tiempo t (en hrs) para que una partcula (que se conoce su coeficiente de sedimentacin), alcance el fondo del tubo en un gradiente lineal de sacarosa se puede calcular por la siguiente ecuacin: t = k/s20,w. Frecuentemente el tiempo de corrida que se utiliza es el que se encuentra en la literatura, o bien, es determinado arbitrariamente hasta que se completa la separacin. El utilizar los factores k y k podra ahorrar tiempo en la centrifugacin. Estos factores pueden ser utilizados para convertir un tiempo de corrida de un tipo de rotor a otro. Por ejemplo si el rotor tipo 40 tiene una mxima velocidad de 40 000 r.p.m. se lleva 4 horas en realizar la separacin, el tiempo de corrida que se lleva un rotor tipo 60 Ti a 60 000 r.p.m. puede ser determinado por la siguiente relacin: t1 = k1 x t2 / k2 donde t1 es el tiempo de corrida de el rotor tipo 60 Ti, k1 es el factor k del rotor 60 Ti, t2 es el tiempo observado en el rotor tipo 40 y k2 es el factor k para el rotor tipo 40. Para el ejemplo anterior el tiempo de corrida para el rotor 60 Ti es aproximadamente de dos horas
TIPOS DE CENTRIFUGACIN
El objetivo de la centrifugacin es la separacin de partculas especificas en una solucin. El trmino partcula involucra sustancias disueltas y partculas de tamao microscpico y macroscpico que se encuentran suspendidas en un fluido que usualmente es agua. En biologa las partculas suelen ser clulas, organelos subcelulares o molculas grandes; en qumica, usualmente son solutos macromoleculares disueltos. Existen tres tipos principales de centrifugacin: Centrifugacin diferencial, centrifugacin zonal y centrifugacin al equilibrio.
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Otro mtodo de separacin es por gradiente de densidad, un mtodo que es ms complicado que la centrifugacin diferencial pero tiene algunas ventajas: el mtodo de gradiente de densidad permite la completa separacin de algunos o todos los componentes de la mezcla y tambin permite que se puedan realizar mediciones analticas. Hay dos mtodos bsicos de centrifugacin por gradiente de densidad: La centrifugacin zonal y la centrifugacin isopcnica o al equilibrio.
Centrifugacin Zonal
Cuando se coloca una pequea cantidad de la disolucin con las molculas que se quieren caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un tubo de centrifugacin, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte superior de el gradiente y cuando se centrifuga el tubo las molculas de la capa superior sedimentan a travs de el gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentacin sedimentarn en una estrecha franja, sin embargo, si hay molculas con distintos coeficientes de sedimentacin, se separaran unas de otras a medida que se produzca la centrifugacin y finalmente los diferentes componentes se resolvern en una serie de zonas o bandas, de ah el nombre de centrifugacin zonal. Una vez completada la centrifugacin, se fracciona el contenido del tubo generalmente por recoleccin de las gotas cuando se hace un orificio en el fondo del tubo y el goteo es lo suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa una lamina del tubo y una fraccin est representada por una o varias gotas.
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Se pueden utilizar una gran variedad de tcnicas para medir la cantidad de los materiales y, a partir de stas, determinar la distribucin de las concentraciones. En la centrifugacin analtica se depende totalmente de tcnicas pticas para detectar las molculas. En cambio, las porciones obtenidas de un tubo fraccionado por goteo, pueden titularse radiactivamente por reacciones qumicas, por actividad enzimtica, por absorcin, fluorescencia o por una combinacin de todas estas tcnicas. La necesidad de un gradiente de concentracin para la centrifugacin zonal se debe a lo siguiente: considrese las consecuencias de colocar una disolucin de baja densidad sobre otra de alta densidad en la que no existe gradiente de concentracin. Inicialmente, el sistema es estable, debido a la diferencia de densidades en la interfase, supngase que hay pequeas fluctuaciones de temperatura en la disolucin, como la densidad de la mayora de las disoluciones disminuye al aumentar la temperatura, estas fluctuaciones crearn inversiones locales de la densidad lo que se traducir en un flujo local de lquido, flujo que recibe nombre de conveccin. Esta conveccin tendr un efecto nulo sobre la interfase inicial, ya que la diferencia de densidades en dicha interfase suele ser lo suficientemente grande como para que no se produzcan mezclas a travs de ellas, a menos que la diferencia de temperatura sea enorme (10 oC a 20 oC). Por el contrario, tras la sedimentacin, las molculas que se pretenden estudiar se habrn movido hacia el interior de las capas inferiores ms densas, donde la conveccin comentada puede distorsionar cualquier tipo de banda que pudiera formarse. La introduccin de un gradiente de densidad pronunciado asegura que los cambios de temperatura tengan que ser muy grandes para poder crear las diferencias de densidad suficientemente grandes para provocar conveccin en el interior del gradiente. Una segunda funcin importante del gradiente es el impedir las mezclas debidas a perturbaciones mecnicas; cualquier perturbacin sera contrarrestada por la tendencia a restablecer el equilibrio en el que la densidad baja esta por encima de la alta. El gradiente tiene una tercera funcin. Considrese un sistema sin gradiente en el que no existieran ni fluctuaciones de temperatura ni perturbaciones mecnicas, en el que las molculas que estn sedimentando han entrado en la capa inferior y formado una banda. En esta zona, la propia presencia de las molculas incrementa la densidad de la disolucin, normalmente un efecto muy pequeo, pero que es muy importante cuando se utilizan concentraciones elevadas. De modo que la densidad de la banda es superior a la de la capa inmediatamente por debajo de ella, lo que se traduce en el flujo convectivo de la zona hacia el fondo del tubo.
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Si, por el contrario, se realiza la sedimentacin a travs de un gradiente de concentracin previamente formado, las molculas en sedimentacin estaran constantemente entrando en una zona de mayor densidad . Su llegada aumentara la densidad de la regin, pero si el gradiente fuera suficientemente fuerte, el soporte de las molculas recin llegadas sera insuficiente para ocasionar una inversin de la densidad y el sistema permanecera estable. El material ms comnmente utilizado para formar gradientes de densidad es la sacarosa, debido a su pureza, su bajo costo y su no interferencia con la mayora de las mediciones qumicas, pticas o enzimticas. Si la macromolcula en estudio es una enzima o una protena inestable se usa frecuentemente el glicerol, puesto que muchas protenas son ms estables y se desnaturalizan ms difcilmente en presencia de glicerol. La separacin zonal es ideal para separar partculas de tamao definido (ejemplo: protenas, RNA y ribosomas), sin embargo, las partculas del mismo tipo son heterogneas; en este caso, la separacin por centrifugacin zonal no es eficiente y es mas apropiado separar las partculas en base a otro parmetro como la densidad; por lo tanto se recurre a la separacin isopcnica.
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Glicerol: El glicerol est disponible como reactivo puro y sus gradientes han sido utilizados en lugar de soluciones de sacarosa en centrifugacin zonal. Las soluciones de glicerol son menos densas y menos viscosas que las correspondientes soluciones de sacarosa, sin embargo, las soluciones de glicerol de la misma densidad de una solucin de sacarosa es mucho ms viscosa que la solucin equivalente de sacarosa. La ventaja de utilizar glicerol es que ayuda a conservar la actividad de un gran nmero de enzimas adems de ser muy barato. Polisacridos: Para evitar el problema que se puede originar en el fraccionamiento de partculas osmticamente sensibles (clulas y organelos) en altas fuerzas osmticas en las soluciones de sacarosa, se han utilizado un gran nmero de polisacridos como medio para la formacin de gradientes. Se han utilizado polisacridos como glucgeno, dextrn y otros materiales, sin embrago, el ms utilizado es el Ficoll. El Ficoll es producido por la copolimerizacin de molculas de sacarosa con epiclorohidrina para dar un polisacrido con un peso molecular promedio de 400 KDa. La soluciones de Ficoll por debajo del 20% (P/V) equivalente a una densidad de 1.07 g/cm3 son inertes osmticamente pero la desventaja que presentan es que a altas concentraciones, la osmolaridad aumenta abruptamente. El otro problema al trabajar con estas soluciones de Ficoll es su alta viscosidad. Su aplicacin ha sido en separaciones zonal e isopcnica. La muestra se puede separar de la solucin de ficoll por pelleting de la fraccin diluida. Gradientes de iodinato: la mayora de los compuestos iodinatos usados como medio para generar gradientes tienen una estructura basada en el cido tri-iodobenzoico, en el que los grupos hidroflicos estn unidos para aumentar la solubilidad de estos compuestos en agua. La metrizamida y Nycodenz son solubles en medio acuoso y son estables en un rango de pH 2 a 12.5. Las soluciones de metrizoato de sodio y Nycodenz no son termolbiles por lo que pueden ser esterilizadas en autoclave, sin embargo, el grupo glucosamida de la metrizamida la hace inestable a temperaturas por arriba de los 55 0C , por lo que, deben ser esterilizadas por filtracin. En comparacin con otros medios para generar gradientes, los compuestos iodinatos tienen grandes ventajas. Por ejemplo, a todas las densidades, los gradientes de iodinato presentan menor viscosidad y osmolaridad que los de sacarosa. Los gradientes de iodinatos pueden ser preformados y la muestra se carga en la parte superior del gradiente. Este mtodo es preferible para la preparacin de gradientes isopcnicos y para la separacin de partculas grandes (clulas, organelos et.) los cuales necesitan ser centrifugados por corto tiempo (2 horas o menos). Alternativamente, para partculas pequeas es posible realizar gradientes autogenerados durante la centrifugacin, en este caso, la muestra es mezclada con la solucin del gradiente haciendo posible el uso de un mayor volumen de la muestra. Suspensiones coloidales de slica: las suspensiones coloidales de slica contienen partculas en el rango de 3-15 milimtros de dimetro y son extensamente usadas para varias aplicaciones industriales y para separaciones centrfugas. El Percoll tiene algunas ventajas sobre las preparaciones de slica de las que deriva. Las partculas coloidales estn cubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) la cual minimiza sus interacciones con material biolgico. Las suspensiones de slica coloidal son desestabilizadas por condiciones que tienden a neutralizar las cargas de las partculas, por lo tanto, el Percoll precipita a bajo pH y las altas fuerzas inicas tambin desestabilizan la suspensin coloidal. El Percoll interfiere con la mayora de los tipos de los anlisis de protenas y para algunos tipos de anlisis de cidos nucleicos y polisacridos. El uso de gradientes de Percoll es restringido para separaciones isopcnicas y estos gradientes pueden ser usados para clulas, organelos y algunos virus. La slica coloidal puede ser removida de las fracciones por centrifugacin diferencial para retirar el material fraccionado de la mayora de las partculas de slice.
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Formas de Gradientes
La forma del gradiente se refiere al perfil de concentracin, es decir, a la variacin de la concentracin en el gradiente a lo largo del tubo. Hay dos tipos bsicos de gradientes que son representados con funciones matemticas simples y son fciles de preparar con equipo de laboratorio, estos son: 1) Continuos que pueden tener forma lineal, convexo, cncavo y 2) discontinuo. La siguiente imagen muestra ambos gradientes.
Los gradientes continuos pueden ser producidos por adicin continua de una solucin de alta densidad CD desde un reservorio a un compartimento que contiene una solucin de baja densidad CL, mientras al mismo tiempo se desplaza la mezcla al tubo que contiene el gradiente. El gradiente producido es lineal si los dos compartimentos tienen el mismo dimetro. Cuando los compartimentos tienen diferentes dimetros se pueden producir gradientes convexos o cncavos como se puede observar en las siguientes figuras.
La forma del gradiente es importante para lograr la separacin deseada, y para determinar propiedades tales como densidad de flotacin y coeficiente de sedimentacin. Los gradientes lineales en densidad son los mas utilizados y a menudo dan la mejor resolucin de componentes de protenas, enzimas, hormonas, subunidades ribosomales y algunos virus de plantas. En un gradiente lineal la densidad incrementa linealmente conforme aumenta la distancia del centro de rotacin. Cuando se disea un gradiente lineal en un rotor vertical o de columpio, la densidad en la superficie del gradiente debe soportar la muestra, mientras que la densidad en el fondo del tubo no debe exceder la densidad de las partculas a ser separadas y en general, a mayor pendiente del gradiente (ms pronunciado), mayor resolucin. Para algunas aplicaciones es necesario generar gradientes cncavos o convexos. Cuando el gradiente necesita un cambio pronunciado en la superficie para soportar la muestra y no tener un cambio abrupto conforme se acerque al fondo, es necesario utilizar un gradiente de forma convexa. Si es necesario que en la terminacin del gradiente haya un cambio abrupto, se puede realizar un gradiente de forma cncavo. Este tipo de gradiente es preferido cuando se necesita un cambio brusco en la viscosidad cerca del fondo del tubo, el cual puede ser utilizado para disminuir la sedimentacin de partculas de un tamao determinado mientras las zonas de menor viscosidad siguen separando a las otras partculas. Los gradientes cncavos son utilizados para separacin de lipoprotenas. En los gradientes discontinuos, el cambio de concentracin de las soluciones en el gradiente no es gradual. Los gradientes discontinuos se utilizan para separar clulas u organelos subcelulares de plantas u homogenados de tejidos animales y para la purificacin de algunos virus.
Centrifugacin al Equilibrio
En la separacin isopcnica las partculas son separadas en base a su densidad, el tamao solo afecta la velocidad con la que las partculas alcanzan su posicin isopcnica. Estas separaciones se llevan a cabo en un gradiente de densidad en el que las partculas se mueven hasta el punto en el que su densidad es la misma que el medio. La tcnica de centrifugacin al equilibrio fue desarrollada por Matthew Meselson, Franklin Stahl y Jerome Vinograd. En esta tcnica la densidad del disolvente es casi la misma que la de la molcula que se est estudiando. Esta tcnica requiere un tercer componente (normalmente una sal de cesio), de bajo peso molecular y elevada densidad. Cuando se centrifuga la disolucin, las sal se redistribuye y alcanza un equilibrio, formando, un gradiente de concentracin que es menos denso en la parte superior y ms denso en el fondo del tubo obtenindose como resultado un gradiente de densidad. Las macromolculas tambin sedimentan, pero el material en la parte superior del tubo se mueve centrfugamente a travs del gradiente, mientras que el mismo material en la parte baja del tubo se mueve centrpetamente. Este movimiento continua hasta que las macromolculas forman una banda en una posicin determinada del gradiente de concentracin, posicin en la que la densidad de la macromolcula iguala a la de la disolucin. La anchura de la banda est determinada por el equilibrio entre la fuerza centrfuga (que tiende a estrechar la banda), la difusin (que tiende a ensancharla) y el gradiente de densidad (un gradiente ms pronunciado dar una banda ms estrecha). Como se mencion anteriormente, la muestra se mezcla con la solucin del gradiente y conforme se lleva a cabo la centrifugacin se genera el gradiente (gradiente autogenerado) a la vez que se separan las partculas de la muestra. Sin embargo, la muestra puede ser colocada en la superficie de un gradiente preformado de igual forma que en la centrifugacin zonal.
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Los gradientes de cloruro de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA de acuerdo a su composicin de bases. Las especies de DNA que son enriquecidas en citosina y guanina bandean denso. El grado de separacin de diferentes especies puede ser utilizado por la adicin de drogas como la distamicina la cual se une selectivamente a regiones del DNA que son ricas en adenina y timina y disminuye la densidad de este DNA. En suma, en la presencia de bromuro de etidio, es posible separar DNA de diferentes conformaciones (ejemplo, superhelicoidal y lineal) incluso teniendo la misma composicin de bases. Los gradientes de sulfato de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA, sin embargo, la composicin de bases tiene un efecto pequeo en la densidad de flotacin de DNA y los gradientes deben de ser abruptos. Una ventaja de los gradientes de sulfato de cesio comparado con el gradiente de cloruro de cesio es que ellos pueden ser utilizados para bandear RNA. Algunas especies de alto peso molecular de RNA tienden a agregarse y precipitar en gradientes de sulfato de cesio, sin embargo, estos se pueden minimizar adicionando urea 4 M al gradiente. Cuando se utiliza un gradiente abrupto es posible bandear protenas, DNA y RNA en un solo gradiente de sulfato de cesio. Un problema con los gradientes de sulfato de cesio es que los iones de sulfato reaccionan y se precipitan con la mayora de los fluidos de centelleo. El cloruro de cesio y el sulfato de cesio son las sales de cesio mas utilizadas para la separacin de cidos nucleicos, sin embargo, hay otras sales de cesio que pueden ser utilizadas para obtener mejores separaciones. Por ejemplo, las sales de tricloroacetato y trifluoroacetato se han utilizado para buenas separaciones de cidos nuclecos. En el caso del trifluoroacetao de cesio es posible obtener una buena separacin de plsmidos superhelicoidal y DNA lineal sin la adicin de bromuro de etidio. Sales de sodio y potasio. El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayora de las macromolculas, el bromuro de sodio, el yoduro de sodio, el bromuro de potasio y el yoduro de potasio forman soluciones densas no viscosas y han sido utilizadas para el bandeo de lipoprotenas, protenas y cidos nucleicos. Una ventaja de los gradientes de yoduro de potasio y de yoduro de sodio es que el RNA no se agrega y precipita como en los gradientes de sulfato de cesio. Sin embargo, las sales de yodo tienen la desventaja de que son propensas a la oxidacin y se pueden adicionar algunos agentes reductores para prevenir la formacin de yodo libre. Sales de rubidio. Estas sales han sido utilizadas para fraccionamientos isopcnicos, en particular se han utilizado gradientes de cloruro de rubidio en lugar de gradientes de cloruro de cesio para separaciones isopcnicas de protenas, sin embargo el uso de esta sal para la formacin de gradientes no presenta mas ventajas que las que se obtienen al utilizar gradientes con cloruro de cesio.
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interfase desaparece rpidamente. La siguiente imagen muestra las dos formas de hacer un gradiente discontinuo.
A)
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El lquido denso en la cmara A se mezcla continuamente con el lquido menos denso en la cmara B. El flujo es producido por una bomba peristltica (P) la cual coloca el lquido cada vez ms denso en el fondo del tubo de centrifuga. La llave (T) controla el flujo del liquido de A a B . La mezcla en la cmara B se da con un agitador magntico (SB).
Gradientes Autogenerados
En un gradiente autogenerado, las soluciones son centrifugadas y las molculas del medio tienden a sedimentar formando un gradiente de densidad. En algunos casos, los gradientes como los de Percoll, forman muy rpidamente un gradiente (20,000 g x 30 min.) sin embargo, hay otras soluciones como el cloruro de cesio que toma muchas horas para alcanzar el equilibrio. Existen una serie de ecuaciones que permiten conocer algunos parmetros tiles en una corrida de centrifugacin. En el caso de metales alcalinos (ej. CsCl) es posible predecir el rango del gradiente y el tiempo en que alcanza el equilibrio. Estos clculos son basados en el valor de b0 (ver valores en el apndice) que es la constante de proporcionalidad del gradiente de densidad cuyo valor ha derivado de trabajos experimentales. Utilizando este valor, el rango del gradiente de densidad en el equilibrio puede ser calculado como sigue. Primero es necesario encontrar el punto de isoconcentracin de el gradiente. Este es el punto (rc) donde la concentracin del gradiente es constante independientemente de su forma: rc= [1/3 (rmin2 + r min x rmax + rmax2)] 1/2 Donde rmin y respectivamente. rmax son la distancia radial (cm) de la parte superior y del fondo del gradiente
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La densidad (dr) en cualquier punto r de el centro de rotacin relativo a la densidad en el punto de isoconcentracin puede ser calculada con la siguiente ecuacin: dr = 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 r2) 2 b0 donde N es la velocidad del rotor en miles de r.p.m.. Por lo tanto, conociendo la densidad inicial de la solucin (di), es posible calcular la densidad mxima (en el fondo del tubo) y la densidad mnima (parte superior del tubo) del gradiente en el equilibrio utilizando las siguientes ecuaciones: dmax = di - 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 rmax2) 2 b0 dmin = di - 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 rmin2) 2 b0 Una vez teniendo los valores de dmax y d min , por diferencia podemos conocer el valor del rango de densidad (Dd) que est presente a lo largo del tubo del gradiente, o bien, rearreglando las anteriores ecuaciones, tenemos que:
Dd = 0.545 x 104 x N2 (rmax2 rmin2) = dmax- dmin b0 Alternativamente podemos utilizar esta ecuacin para conocer la velocidad del rotor siempre que se conozca el valor de Dd. Es muy importante conocer el valor de la d max de el soluto con el que estamos formando el gradiente, este parmetro nos informa si el soluto cristaliza en el fondo del tubo. Por ejemplo, cuando la densidad del cloruro de cesio en el fondo del tubo es mayor a 1.8 g/cm3 (1.75 g/cm3 a bajas temperaturas), se encuentra formando cristales y puede ocasionar dao en el rotor. Por otra parte, el tiempo para llegar al equilibrio es muy grande, tpicamente 100 hrs. para un gradiente de 12 ml, sin embrago, la velocidad a la que se forma el gradiente es exponencial, y una buena separacin se puede obtener en una tercera parte del tiempo calculado. El tiempo requerido para que las partculas alcancen la posicin isopcnica puede ser calculado para gradientes no viscosos (CsCl) usando la siguiente ecuacin: t (h) = 9.83 x 1013 x b0 (dp 1) Q4 x rp2 x sp Donde dp y sp son la densidad y coeficiente de sedimentacin de la partcula, y rp es la distancia radial de la banda de partculas en el equilibrio.
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Donde w es la velocidad angular (rad/seg), r es la distancia (cm) de el eje de rotacin, N es la velocidad del rotor (r.p.m.). Esta ecuacin puede predecir la pendiente del gradiente para la regin central que abarca.
Gradientes Isoosmticos
La separacin de clulas animales y otras partculas sensibles osmticamente requieren que el gradiente para la centrifugacin sea conveniente osmticamente, es decir, mantengan constante la osmolaridad a travs del gradiente. Las soluciones utilizadas son: suspensiones de slica coloidal como el Percoll, iodonidatos como el Nycodenz y metrizamida.
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Fotografa de un fraccionamiento de hepatocito de rata utilizando centrifugacin zonal con rotor vertical.
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La siguiente figura muestra un huevo de erizo de mar (Arbacia punctulata) observado en un microscopio de polarizacin centrfugo en donde se utiliz un gradiente isopcnico y despus de haber centrifugado 15 min a 5 200 r.p.m.
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Fraccionamiento de RNA
Si es necesario separar un rango completo de molculas de RNA desde s20,w = 4S a s20,w = 28S (1:7) en una corrida de centrifugacin se puede utilizar un gradiente abrupto con una diferencia de concentracin de 25 %, por ejemplo 10 35 % de sacarosa a la mxima velocidad del rotor SW 40 Ti. Se utiliz una centrifugacin a 30 000 r.p.m. x 14 hrs a 0 0C. Utilizando nomogramas ( d = 1.5) dan una posicin de x / L = 0.45 para RNA 28 S y x / L = 0.06 para RNA 4 S. Nota: los nomogramas son grficas que representan unas constantes (a , S ) en el eje de las ordenadas y x/L (longitud del gradiente) en el eje de las absisas. Estas grficas ayudan a obtener los parmetros para realizar una centrifugacin.
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Condiciones: primera centrifugacin: 600 g por 5 min segunda centrifugacin: 3000 g por 20 min tercera centrifugacin: 15 000 g por 1 h
La centrifugacin es una tcnica que no slo se utiliza en el laboratorio, sino que tambin se usa a nivel industrial. Por ejemplo es utilizada para purificar y recuperar aceites, fluidos hidrulicos y enfriadores ahorrando miles de dlares a la industria. Otra aplicacin es en la industria de alimentos en donde las centrfugas son utilizadas en muchas operaciones. Por ejemplo en la extraccin de protenas comestibles de productos vegetales y animales; en la industria farmacutica cada vez tienen ms auge en procesos de control automatizados. Las impurezas del caf, t y jugos de fruta son eliminadas con la ayuda de centrfugas. Cabe mencionar que cada vez son ms las aplicaciones de la centrifugacin en micro y macro escala, sto es debido a los nuevos diseos automatizados que proporcionan mayor eficiencia y nuevas aplicaciones en los procesos de separacin de molculas.
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BIBLIOGRAFA
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APNDICE
En el siguiente apndice se encuentran algunas tablas con informacin relevante en el tema de la centrifugacin, cada una tiene un encabezado que permite identificar su uso.
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