1

Initiation la Recherche Atelier Scrtion

Master 1 de Microbiologie, Biologie Vgtale et Biotechnologies
Sophie Bleves et Amel Latifi, enseignantes responsables. Thibault Sana, moniteur.

Introduction
Pseudomonas aeruginosa est une bactrie Gram-ngatif, pathogne opportuniste de lhomme. Elle est notamment redoute dans le milieu hospitalier (infections nosocomiales) chez les malades immunodprims et les grands brls. Cette bactrie est aussi connue pour les complications, souvent fatales, quelle entrane chez les patients atteints de mucoviscidose. Sa virulence est multifactorielle: elle est lie dune part des facteurs associs aux bactries, tels que le flagelle, les pili ou lalginate (un exopolysacharide muqueux), ou la scrtion de diverses toxines et enzymes dgradatives dans le milieu extracellulaire (figure 1). Figure 1 : Des facteurs de virulence de P. aeruginosa

* rsistance AB

pompes efflux*

Exopolysaccharide (biofilm*, adhsine, antiphagocytose anticomplment)

*
Scrtion / Injection d'enzymes dgradatives et de toxines

pigments fluorescents Squestration du fer Pili Flagelle (mobilit, (mobilit, adhrence,biofilm) biofilm)

2 La scrtion chez les bactries Gram ngatif implique pour les protines scrter (exoprotines) la traverse de deux membranes (interne et externe) et dun compartiment aqueux contenant un rseau de peptidoglycane, le priplasme. Six voies de scrtion sont conserves au sein des bactries Gram ngatif et vous seront dtailles en cours. Cinq dentre elles sont prsentes chez P. aeruginosa (figure 2), cette caractristique en faisant un modle particulirement intressant pour ltude des mcanismes de scrtion.

Figure 2 : Schma des 5 voies de scrtion prsentes chez P. aeruginosa.

Au cours de cet atelier, nous nous intresserons plus particulirement 2 voies de scrtion prsentes chez P. aeruginosa. La machinerie de scrtion de type I ou voie des ABC transporteurs est la plus simple et comprend 3 protines Apr (alkaline protease). Elle permet notamment la scrtion en une tape de la protase alcaline. Le gne structural de celle-ci (aprA) appartient lopron arpADEF qui code aussi pour les composants de la machinerie de scrtion : AprD est le transporteur ABC (ATPase de la membrane interne), AprE (une protine adaptatrice de la membrane interne) et AprF le composant de membrane externe. La machinerie de scrtion de type II est compose de 12 protines Xcp (extracellular protein deficient) qui sassocieraient en un complexe multiprotique reliant les deux membranes (figure 3). Elle est ncessaire entre autre la scrtion de llastase qui se droule en deux tapes : adressage via le peptide signal la machinerie dexport Sec pour la traverse de la membrane interne, puis traverse de la membrane externe via la machinerie de scrtion

3 Xcp. Les 12 gnes xcp sont organiss sur un mme locus, en deux oprons divergents, xcpPQ, et xcpR-Z, alors que les gnes codant les protines scrtes sont localiss diffrents loci du chromosome. Les protines XcpT, U, V, W et X sont appeles pseudopilines, de par leur homologie avec la piline des pili de type IV, et sassemblent pour former un pseudopilus transmembranaire.

Figure 3: Modle de la machinerie Xcp (T2SS).

4 Quels sont les objectifs de cet atelier? Partie A Nous allons chercher dterminer sil existe un quelconque lien, ou cross-talk , entre les diffrentes machineries de scrtion prsentes chez P. aeruginosa. Est-ce quune mutation dans un des composants dune machinerie a des rpercussions sur lefficacit dune autre machinerie alors que celles-ci sont indpendantes? Aucune donne na jamais t publie ce sujet chez P. aeruginosa, mais quelques exemples sont dcrits dans la littrature chez dautres bactries. Nous avons choisi de vous limiter aux machineries de type I et II, et souhaitons aborder cette question : une voie de scrtion influence-t-elle la scrtion
des exoprotines transitant par une autre voie de scrtion ? Nous vous demandons denvisager les manipulations que vous entreprendrez pour y rpondre. Pour vous aider, vous trouverez dans les annexes un panel de techniques,

ainsi quun tableau rcapitulatif des souches bactriennes (sauvage et mutantes), et des anticorps dont vous disposez. Parties B & C Nous tudierons plus particulirement une des exoprotines scrtes par la machinerie de type II, llastase. Llastase code par le gne lasB est une des exoprotines les plus prsentes dans le milieu extracellulaire de P. aeruginosa. Cest une mtalloprotase Zinc, qui possde une activit lastolytique sur llastine, prsente notamment dans la matrice extracellulaire du tissu pulmonaire, mais aussi une trs forte activit protase envers divers substrats. Cest dailleurs la protase la plus active scrte par P. aeruginosa. Diffrentes publications (dont deux que vous travaillerez) rapportent que lactivit enzymatique de llastase est active au cours de son transport depuis le cytoplasme vers le milieu extracellulaire. Nous nous proposons de vrifier la maturation et lactivation de llastase au cours de sa scrtion. Pour se faire, vous allez construire une forme tiquete His6 de llastase (clonage -Partie B-). Celle-ci sera produite dans lhte htrologue Escherichia coli, et purifie par chromatographie daffinit sur colonne de Nickel (Partie C). Vous mesurerez et comparerez lactivit de llastase recombinante produite dans le cytoplasme dE. coli et celle scrte dans le milieu extracellulaire par P. aeruginosa.
En vous servant des annexes, prparez le schma exprimental que vous suivrez.

En parallle, nous nous intresserons la topologie de la protine XcpY, un composant de la membrane interne de la machinerie de scrtion de type II. Par une analyse bio-informatique de sa squence (in silico), vous obtiendrez toutes les prdictions de topologie la prsentant comme une protine de membrane interne : nombre de segments transmembranaires (certains et putatifs), orientations possibles du polypeptide (extrmit Nterminale dans le cytoplasme ou dans le priplasme). Ces prdictions de topologie seront confirmes par une approche in vivo qui consiste tudier le phnotype sur bote de diffrentes fusions traductionnelles de XcpY avec des enzymes rapporteurs (voir le principe en annexe).

Programme
Lun10/10 M SB AM Mar11/10 M+AM Mer12/10 M+AM Jeu13/10 M AM Ven14/10 M SB Lun17/10 M+AM TS Mar18/10 M+AM TS TS SB SB SB SB Introduction lUnit (9h salle de TP de lESIL) et latelier (10 h, salle 400) Lire les 4 pages dintroduction Prparations (milieux, tampons et autres solutions) Croissance, Prparation de protines scrtes, Montage SDS-PAGE Fin prparation chantillons protiques, Electrophorse, Western-blot Immunodtection Bilan Partie A Bio-Informatique Analyse de squences- (salle Consortium, btiment A) Bio-Informatique -Prdiction topologie XcpY- (salle Info TP 4me) +Travail Personnel (Articles prparer) Prparation insert & vecteur, Ligation Bactries comptentes et Transformation Comparaison des protocoles dextraction dADN plasmidique par lyse alcaline et semi-boiling Screening PCR sur transformants, Electrophorse ADN Prparation de plasmides Carte restriction thorique Analyse restriction, Electrophorse ADN Bilan Partie B Croissance (Surproduction lastase tiquete His6 chez E. coli) Vrification de la production (SDS-PAGE& Coloration Coomassie)

Mer19/10 M TS

AM SB Jeu20/10 M TS AM AL Ven21/10 M+AM AL Lun24/10 M+AM AL

Purification de llastase recombinante par chromatographie daffinit Fin purification Dosage de protines selon le protocole de Bradford Mesure activit protase de llastase produite chez E . coli ou scrte Prsentation Article Bilan Partie C Examen crit (10-12h, amphi 7) Oral (SB-AM)

Mar25/10 M AL Me26/10 M Ven28/10 M

SB : Sophie Bleves (bleves@ifr88.cnrs-mrs.fr) AL : Amel Latifi (latifi@ifr88.cnrs-mrs.fr) TS : Thibault Sana (tsana@ifr88.cnrs-mrs.fr)

Annexes
Souches bactriennes P. aeruginosa
PAO1 PAO1 xcpY PAO1 aprE

Caractristiques
Sauvage Dltion du gne xcpY dans la souche PAO1 Insertion dun Tn (Hg R) dans le gne aprE de la souche PAO1
supE, hsdR, thi(lac-proAB), F' (traD36, proAB+ , lacIq , lacZM15))

E. coli TG1 BL21(DE3) Plasmides

pET-22b(+) plasB pSB4 pSB52 pSB3

F ompT hsdSB(rB, mB) gal dcm lon (DE3 : lacIq; lambda; lacUV5-T7 gene)

AB
Ap Plasmide dexpression, tiquetage His6 Ap Clonage dun fragment PCR (lasBUP-lasBDown) du gne lasB sans squence signal et codon STOP Ap Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au rsidu 232 Ap Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au rsidu 278 Km Fusion traductionnelle XcpY avec la -lactamase au rsidu 363

Anticorps polyclonaux (de lapins) Oligonuclotides

lasBUP lasBDown

Anti lastase, Anti protase alcaline

5- CATATG GCC GAC CTG ATC GAC GTG T -3 (Tm : 62) 5- CTC GAG CAA CGC GCT CGG GCA GG -3 (Tm : 62)

Protocoles exprimentaux
Croissances bactriennes
On considre quune unit DO 600nm (DO600) correspond 5.108 1.109 bactries/ml. Milieux de culture: P. aeruginosa est cultiv sur milieu PAB (Pseudomonas Agar Base) ou milieu riche LB (Luria broth). E. coli est cultive en milieu riche LB supplment en cas de besoin par les antibiotiques suivants : ampicilline (Ap) 50g /ml. Milieux didentification: A/ Llastase et la protase alcaline sont deux protases, et leur activit enzymatique peut tre mise en vidence sur deux types de botes, contenant de la casine (bote au lait ou skim-milk) ou de llastine. Llastase utilise comme substrats llastine et la casine alors que la protase alcaline nutilise que la casine. Ces activits se traduisent par un halot dhydrolyse autour des colonies de Pseudomonas aprs 24 48h de croissance 37C. B/ Botes activit phosphatase alcaline Milieu LB supplment de BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) 0,4mg/ml et IPTG 0,1mM.

Techniques de gntique Prparation cellules comptentes

1 Ensemencer 50 ml de milieu liquide LB au 1/100 avec culture de la nuit de la souche DH5. 2- Incuber 37C avec agitation. 3 - Quand DO600 0,45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. Transfrer dans des falcons de 50ml. 4 - Centrifuger 15 minutes 2500 rpm 4C. 5 - Jeter le surnageant en gouttant au maximum et reprendre trs dlicatement le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM glac. Complter 20 ml avec la mme solution. 6- Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus). 7 - Centrifuger 15 minutes 2500 rpm 4C. 8 - Jeter le surnageant et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM -15% glycrol glac avec agitation douce. Complter 1,25 ml. 9 - Laisser dans la glace 15 minutes au moins.

Transformation
Prparer des tubes de bactries comptentes contenant 100l d'une suspension de cellules d'Escherichia coli. Ils doivent tre maintenus dans de la glace. Les manipulations devront se faire strilement prs d'un bec Bunsen allum. Protocole : 1 - t = 0. Ajouter l'ADN dans les tubes; agiter le tube. Les bactries restent dans la glace. 2 - t = 45 minutes. Agiter lgrement et transfrer les tubes dans un bain-marie 42C pendant 2 minutes. 3 - t = 47 minutes. Agiter lgrement et laisser les tubes 5 minutes dans la glace. 4 - t = 52 minutes. Ajouter strilement 0,5 ml de milieu liquide Luria Broth (LB) prchauff 37C ; agiter lgrement. Transfrer 37C durant 60 minutes. 5 - t = 112 minutes. Agiter lgrement et taler les bactries (taler 100l, centrifuger les 400l restant, les reprendre dans 100l et taler).

Techniques de biologie molculaire Miniprparation dADN plasmidique

NucleoSpin Plasmid QuickPure (Macherey-Nagel)

10

Construction dune forme recombinante de llastase

Stratgie Le gne lasB amplifi par les oligonuclotides lasBUP et lasBDown, dpourvu de sa squence signal et de son codon STOP, a t clon dans le pGEM-T pour donner le plasB : - lasBUP shybride en 3 de la rgion codant le peptide signal de llastase et cre un site NdeI en 5 de cette rgion du gne lasB. - lasBDOWN shybride sur la fin du gne lasB, supprimant son codon STOP et crant un site XhoI en phase avec la rgion codant ltiquette His6 du pET-22b(+).

Un fragment NdeI-XhoI de 1,4 kb du plasB sera clon dans le pET-22b(+) ouvert par NdeIXhoI de sorte placer le gne lasB sous le promoteur T7 et ltiqueter.

11

En pratique 1- Digrer le plasB et le pET-22b(+) par NdeI et XhoI 2- Vrifier les digestions par lctrophorse sur gel dagarose 3- Dcouper le fragment de 1,5 kb du plasB du gel dagarose et extraire lADN (NucleoSpin Extract II) Purifier le pET-22b(+) linaris (NucleoSpin Extract II) 4- Vrifier les quantits sur gel 5- Ligation ON 16C

Ligation
La ligation de fragments dADN extrmit cohsive ncessite une concentration dADN dans le mlange ractionnel entre 10 et 30 ng/l. Le volume du mlange ractionnel ne doit idalement pas dpasser les 20 l. Le rapport molaire vecteur/insert doit tre de 1/3 (Attention : le rapport tant molaire, vous devez tenir compte pour ce calcul de la diffrence de taille entre le vecteur et linsert). Composition dun mlange ractionnel de 10 l : ADN Tampon ligase : 1X Ligase : 1l H2O : QSP 10 l Remarques : * La ligation de fragments dADN bouts francs ncessite une concentration dADN dans le mlange ractionnel largement suprieure 30 ng/l et un rapport molaire de 1/6. * Pour raliser des liaisons phosphodiesters entre les fragments dADN liguer, la ligase utilise de lATP. Le tampon de la ligase doit donc rester tout le temps de la manipulation dans la glace.

Electrophorse dADN
- prparer un gel d'agarose 0,7% en TBE 0,5X faire bouillir au micro-ondes (salle de pese) Laisser refroidir et ajouter 1 l de Sight DNA stain (EUROMEDEX) pour 200 ml d'agarose. porter des gants: le Sight DNA stain est un intercalant de lADN. - Mettre les peignes et couler dans le support

- rajouter 5l de tampon de charge ADN dans chaque tube et charger 15l de chaque chantillon sur le gel d'agarose Dposer 5l de marqueur de taille (Molecular Weight Marker X, Roche) Tampon de charge ADN: 30% glycrol, 0,25% bleu de bromophnol, 0,25% -mercaptothanol TBE 20x 1,8M Tris, 40mM EDTA, 1,8M Acide Borique

12 _________________________________________________

Extraction dun fragment dADN dun gel dagarose

NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel)

13 ______________________________________________________

Screening par PCR

Lyse des bactries - reprendre une colonie dans100 l d'H2O et lyser les bactries 10' 95C (attention ce que l'eau ne pntre pas dans les tubes! Cap-locks) - centrifuger 1 les chantillons PCR - prparer les mlanges ractionnels suivants dans des eppendorfs PCR sur la glace en ajoutant l'enzyme quand tous les groupes sont prts lancer la PCR 5 l d'ADN (bactries lyses, PAOI ou PAO1 xcpY ) + oligo lasBUp (20 pmol partir solution 10pmol/l) + oligo lasBDown (20 pmol partir solution 10pmol/l) + dNTP (1mM final partir solution 10mM) + tampon ADN polymrase (1X final) + MgCl2 (1X final) + 1l DMSO (limiter les structures secondaires ADN) H2O qsp 20l +0,2l ADN polymrase thermostable (Taq polymrase, 5U/l) programmation de l'appareil PCR ( 3h) 95C 7' _______________ 95C 1' 55C 1' 30 cycles 72C 1'30 ________________ 72C 10'

14

Techniques de biochimie Prparation de protines scrtes - prendre la DO 600 nm (DO600) des cultures de nuit ( overnigth , O/N)

DO600 inoculum de nuit 5-6 ...... quoi faut-il penser? - ensemencer 50 ml de milieu LB une DO600 initiale de 0,1 - incuber 37C sous agitation (180 RPM) - prendre la DO600 de chaque culture aprs une heure, puis suivre la croissance toutes les 30 minutes pendant la phase exponentielle de croissance puis toutes les heures jusqu DO600= 4 Prlever et transvaser dans un eppendorf de 1,5 ml, 1,5 ml de culture DO6001 1 ml de culture DO6002 et 4 tracer au fur et mesure sur papier semi-logarithmique la DO600 en fonction du temps pour chaque souche - centrifugation de chaque prlvement (10, 8000RPM) inutile de manipuler strilement * le surnageant de culture contenant les protines scrtes est soigneusement transvas dans un nouvel eppendorf, plac dans la glace puis 225l (T1) ou 150l de TCA 75% (acide trichloroactique) sont ajouts pour prcipiter les protines toute la nuit (ON) 4C * le culot cellulaire est repris 1 U DO600 par 50 l de tampon de charge SDS-PAGE puis conserv 20C (= C) - centrifuger les surnageants de culture que vous avez prcipit ON 4C (30, 13000RPM), le surnageant est limin et le culot est lav par 1 ml dactone 90% - centrifugation (10, 13000RPM), liminer tout lactone et vaporer le reste dactone en laissant les eppendorfs ouverts 5 min 37C. - le culot est repris 1 U DO600 par 10 l de tampon de charge SDS-PAGE (= SN) ___________________________________________________________________________

SDS-PAGE (Mini Protean III Biorad-)

- monter le systme (prsent dans le fascicule de principes techniques) - dlimiter par un trait de marqueur la hauteur du gel de sparation ( 5 cm) vrifier que le systme ne fuit pas en ralisant un essai avec de leau Tant que lacrylamide na pas polymris, il est toxique : MANIPULER AVEC DES GANTS - prparer dans 2 bchers (volume pour 2 gels) gel de sparation (10%) 6,6 ml 8,4 ml 5 ml gel de sparation (12%) 8 ml 7 ml 5 ml gel de concentration 0,8 ml 4,8 ml 2 ml

Acrylamide 30% H2 0 Lower Tris Upper Tris

15

- QUAND VOUS ETES PRETS A COULER LE GEL de sparation ajouter 800 l dAPS 1% et 25 l de TEMED dans le bcher correspondant, mlanger doucement et couler le gel au pipetman jusquau trait et vrifier le niveau (la surface doit tre horizontale). Dposer dlicatement de leau distille laide de la pissette la surface du gel. - quand le gel a polymris (vrifier avec ce quil reste dans le bcher), liminer leau en retournant le systme - ajouter 400 l dAPS 1% et 8 l de TEMED dans le bcher du gel de concentration, mlanger doucement et couler le gel au pipetman . Mettre immdiatement les peignes en vitant autant que possible de faire des bulles. - monter la chambre dlectrophorse, la placer dans la cuve et remplir les 2 compartiments de tampon dlectrophorse - enlever dlicatement le peigne - dnaturer tous vos chantillons (C et SN) pendant 8 au bain marie bouillant fermer soigneusement vos eppendorfs (Cap-locks) et veiller ce quils ne se remplissent pas deau du Bain Marie ! NB les centrifuger 5 secondes avant de les charger - charger la gamme talon protine (Molecular Weight Marker, Promga), la protase alcaline et llastase pures, ainsi que lquivalent de 0,2 U DO600 de cellules (C) et de 1 U DO600 surnageant (SN) - appliquer 80V par systme pour le gel de concentration, puis migrer 150V - suivre la migration par lavance du front du bleu et larrter avant quil ne sorte ( 1h30) Tampon de charge SDS-PAGE : 2% SDS, 10% glycrol, 5% -mercapthothanol, 62,5mM Tris-HCl, pH 6,8, bout de spatule de BBP (Bromophnol Blue) Lower Tris : 1,5M Tris-HCl, 0,4% SDS, pH 8,8 Upper Tris : 0,5M Tris-HCl, 0,4% SDS, pH 6,8 Tampon dlectrophorse (10X): 250mM Tris, 1,9M Glycine, 35mM SDS ___________________________________________________________________________

SDS-PAGE en PhastSystem (Pharmacia Biotech)

A/ Prparation des chantillons : -Pour les chantillons de culture resuspendre lquivalent de 0,2 UDO600 de cellules dans 20 l deau. Ajouter 7,5l de tampon de charge SDS-PAGE. - Pour les chantillons solubles : dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, placer lchantillon contenu dans un volume total de 15 l (si le volume dchantillon protique traiter est infrieur 15 l, complter 15 l avec de leau). Ajouter 10 l de tampon de charge -Dans le cas des lectrophorses dnaturantes, faire bouillir pendant 5 min. Pour cela mettre en route une bouilloire et fermer les tubes laide de capuchons colors. Aprs incubation, centrifuger quelques secondes pour rassembler lchantillon dans le fond du tube.

16

B/ Mise en route de llectrophorse : Le Phast system Pharmacia permet deffectuer des sparations de protines sur gel dlectrophorse dans des conditions standardises. Il sera pos dans lappareil au niveau dun des cadres rouges : - un gel de polyacrylamide prcoul sur un film plastique. Diffrents gels sont votre disposition (12% dans votre cas). - le support de mches sera cal sur les plots prvus cet effet. 2 mches adquates auront t pralablement places dans le support de faon venir en contact, pour lune avec le haut du gel, pour lautre avec le bas. - rabattre la cale noire sur le dispositif. Celle-ci appuie lgrement sur les mches et permet dassurer le contact avec le gel. Elle contient galement les encoches permettant de placer le peigne charg avec les chantillons. 4 l dchantillon protique sont introduits dans chaque dent dun peigne 6 dents OU BIEN 1 l dans chaque dent dun peigne 8 dents. Le peigne est plac dans les encoches, le capot de lappareil referm et llectrophorse programme. Contrler lavancement de llectrophorse en suivant la migration du bleu. Arrter avant que le bleu nait atteint le niveau de la deuxime mche. Ouvrir le capot. Retirer dlicatement le peigne. Puis soulever les diffrents lments poss sur le gel afin de pouvoir rcuprer celui-ci. Le gel est plac dans une boite plastique. C/ Fixation et coloration du gel aprs migration : Recouvrir le gel dun peu de solution de bleu de Coomassie, et laisser incuber 20 minutes. Verser dans lvier. Ajouter du dcolorant. Laisser incuber jusqu dcoloration du fond du gel et apparition des bandes de protines sur fond clair. Changer de temps en temps la solution de dcoloration. Ajouter un petit tampon de mousse dans le bain afin de fixer le colorant et donc dacclrer la dcoloration. Tampon de coloration (20) Bleu de Coomassie 0.25% Ethanol Acide actique H2O QSP 1g 125ml 40ml 500ml

Tampon de Dcoloration (acclration en passant aux micro-ondes) 250ml dthanol et 80ml dacide actique, H2O QSP 1 litre.

17

Western-blot
NB Penser mettre le systme rfrigrant au conglateur - placer le gel dans du tampon de transfert ainsi quun feuille de nitrocellulose et 2 feuilles de papier Whatman - mettre dans lordre sur la face grise de la cassette de lappareil blot en prenant soin dliminer les bulles (en faisant rouler une pipette) : lponge Scotch-Brite , 1 feuille de papier Whatman, le gel, la membrane de nitrocellulose, 1 feuille de papier Whatman, et enfin la deuxime ponge Scotch-Brite , (voir schma) ne jamais toucher la feuille de nitrocellulose avec ses doigts --> porter des gants et des pinces mtalliques sont votre disposition

quand le transfert est termin, placer la feuille de - -transfrer 1h en se plaant 100 V (1l de tampon de transfert par systme) nitrocellulose dans un bain de rouge ponceau (coloration temporaire des protines), puis la transfrer immdiatement dans un bain deau. Agiter doucement, les protines apparaissent en rouge. Quand la gamme talon se dtecte bien, repasser au stylo bille les diffrentes bandes, faire un point au niveau de la protase alcaline (48 kDa) ou de llastase (30 kDa) purifie, puis venir me voir pour dcouper la membrane. Conserver les 2 morceaux de nitrocellulose dans du papier daluminium -20C aprs dcoloration totale dans de leau. MW Promega

18 - immunodtection : incuber la membrane de nitrocellulose sous agitation - 30 min en TBS lait 5% Tween 20 0,1% - 1h30 en TBS lait 5% Tween 20 0,1% contenant soit Ac lastase (1/500), soit protase alcaline (1/1000). - 3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0,1% - 1h en TBS lait 5% Tween 20 0,1% contenant Ac secondaire anti IgG de lapins marqu la phosphatase alcaline (1/7500) - 3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0,1% - Placer la membrane dans 5 ml du kit de dtection de lactivit phosphatase alcaline (Western Blue Stabilized substrate for alkaline phophatase Promega-). Agiter et laisser la coloration se dvelopper et larrter en plaant la membrane dans de leau. La scher dans du papier absorbant. Tampon de transfert (1X): 48mM Tris, 40mM Glycine, 20% Et-OH TBS (10x) : 0,5M Tris-HCl, 1,5M NaCl, pH8

Production de protine dexpression T7) - prendre la DO600 des cultures de nuit

recombinante

chez

E.coli

(systme

- ensemencer 50 ml de milieu LB une DO600 initiale de 0,1 - incuber 37C sous agitation - prendre la DO600 aprs 90 min, et rajouter de lIPTG (1 mM final) quand DO600= 0,5 - poursuivre la croissance x heures - centrifuger les cultures bactriennes dans des pots de centrifugation de 250 ml et 8 000 rpm pendant 15min 4C (centrifugeuse Sorvall quipe du rotor GSA ou centrifugeuse Sigma) . - vider le surnageant et resuspendre la totalit des cellules dans 20 ml de tampon Tris-HCl 30 mM, pH 8, froid. - placer la suspension homogne dans un bcher propre de 50 ml. - les cellules seront casses par sonication en prsence de Lysosyme une concentration finale de 1mg/ml. - centrifuger 14000 rpm pendant 30 min 4C dans un rotor SS34 et dans la centrifugeuse Sorvall. - rcuprer le surnageant (extrait soluble) la pipette et propipette. Le placer dans un bcher propre de 50 ml. Conserver 4C.
Producing Proteins with the pET Expression System A pET vector is a bacterial plasmid designed to enable the quick production of a large quantity of any desired protein when activated. This plasmid (pictured below) contains several important elements : (1) a lacI gene which codes for the lac repressor protein, (2) a T7 promoter which is specific to only T7 RNA polymerase (not bacterial RNA polymerase), (3) a lac operator which can block transcription, (4) a polylinker, (5) a f1 and a ColE1 origins of replication, and (6) an ampicillin resistance gene.

19
To start the process, your favorite gene (yfg) is cloned into a pET plasmid at the polylinker site. Both the T7 promoter and the lac operator are located 5' to yfg. When the T7 RNA polymerase is present and the lac operator is not repressed, the transcription of yfg proceeds rapidly. Because T7 is a viral promoter, it transcribes rapidly and profusely for as long as the T7 RNA polymerase is present. The expression of your favorite protein (YFP) increases rapidly as the amount of mRNA transcribed from yfg increases. Within a few hours, YFP is one of the most prevalent components of the cell. Prokaryotic cells do not produce the T7 RNA polymerase that must be added. Usually, the host cell for this expression system is a bacteria which has been genetically engineered to incorporate the gene for T7 RNA polymerase, the lac promoter and the lac operator in it's genome. When lactose or a molecule similar to lactose is present inside the cell, transcription of the T7 RNA polymerase is activated. Typically, the host cell used is E. coli strain BL21(DE3). The diagram below shows the genome of the host cell. Control of the pET expression system is accomplished through the lac promoter and operator. Before YFG can be transcribed, T7 polymerase must be present. The gene on the host cell chromosome usually has an inducible promoter which is activated by IPTG. This molecule, IPTG, displaces the repressor from the lac operator. Since there are lac operators on both the gene encoding T7 polymerase and YFG, IPTG activates both genes. Therefore, when IPTG is added to the cell, the T7 polymerase is expressed, and quickly begins to transcribe yfg which is then translated as YFP.

___________________________________________________________________________

Purification de protine recombinante par chromatographie daffinit (Kit Protino, Macherey-Nagel)

Attention les diffrentes tapes de ce protocole doivent tre ralises 4C.

20

___________________________________________________________________________

Concentration/dilution/concentration des solutions protiques

Principe: La centrifugation est utilise comme force de filtration travers une membrane. Les molcules plus grosses que les pores de la membrane seront retenues dans le rservoir dchantillon (rservoir suprieur), les solvants et les molcules de faible Mr passant travers la membrane vers le rservoir de filtrat. Afin dobtenir un rendement de rcupration optimum, il convient de choisir une taille dexclusion 3 5 fois infrieure la taille de la molcule concentrer ; la taille dexclusion dune membrane dultrafiltration tant dfinie par sa capacit retenir 90% dune molcule globulaire idale dont la Mr est la taille dexclusion. Le systme que vous utiliserez a une taille dexclusion de10 000 Da. * Placer votre chantillon concentrer dans le rservoir du haut. Centrifuger 9000g 30 min 4C. Contrler le niveau du liquide dans le corps suprieur de lunit de filtration, remettre centrifuger si ncessaire. * Vider le tampon pass dans la partie infrieure et remettre centrifuger. * Ajouter du tampon Tris-HCl 30 mM, pH 8, dans le corps suprieur du rservoir car il est important d'liminer l'imidazole. Cette tape devra tre ralise plusieurs fois. * Recueillir en fin de protocole la solution protique concentre. Pour cela pipeter dans le rservoir dchantillon et placer le dans un tube propre. ___________________________________________________________________________

Dosage des protines totales

Mthode Lowry: voir Fascicule de Principes Techniques Mthode Bradford:

21 Gamme talon : Diluer 40l dalbumine bovine (BSA) 10mg/ml dans 960l dH2O soit solution 400g/ml Faire la gamme (5 6 points) dans les cuvettes : 200l de BSA, 600l dH2O et 200l de ractif Bradford Mlanger 800l dchantillon et 200l de ractif Bradford. Incuber 5minutes temprature ambiante. Lire la densit optique 595. Penser raliser une courbe talon avec la BSA (albumine bovine).

___________________________________________________ Mesure dactivit protase:

Lhydrolyse de lazocasine est mesure dans un mlange de raction contenant : 0,1 ml de Tris-HCl 1M, pH8, 0,1 ml dH2O, 0,5 ml dazocaseine 2% et 0,3ml dextrait. Le mlange est incub ,37C entre 15 et 90 minutes. La raction est arrte par lajout de 2 ml dacide perchlorique 10% (prcipitation de lazocasine non hydrolyse). Le surnageant est prlev et ensuite neutralis par lajout de 0,3 ml de NaOH 10 M, et la lecture de DO430 effectue. Labsorbance 430 nm est linaire jusqu une valeur de 0,6. Les units dactivit sont dfinies comme labsorbance 430 nm par heure et par ml : Units Protase/h/ml = DO430/(t x v) x60 T : temps dincubation v : volume dextrait

22

Autres protocoles Prdiction de la topologie dune protine transmembranaire, XcpY

Les protines intgrales de la membrane interne sont ancres dans celle-ci par des segments dune vingtaine de rsidus, dont la structure secondaire correspond des hlices hydrophobes. Une protine possdant un segment transmembranaire est dite bitopique. Une protine possdant plusieurs segments transmembranaires est dite polytopique. Les informations dterminant la topologie dune protine sont contenues dans sa squence en acides amins, et les paramtres tudis sont : Lhydrophobicit --> identification des segments transmembranaires potentiels La rpartition des charges --> orientation de la protine dans la membrane qui est dtermine par la distribution des rsidus chargs aux extrmits des segments hydrophobes ( positive inside rule ) La topologie protique est prdite in silico : * recherche de squence dans une banque de donne (http://www.pseudomonas.com/). * prdiction de la topologie dune protine membranaire (http://www.expasy.org/) La topologie de XcpY est confirme in vivo par la ralisation de fusions traductionelles avec un gne rapporteur. La -lactamase et la phosphatase alcaline sont 2 enzymes priplasmiques qui sont classiquement utilises. Le principe est de gnrer des fusions en phase dans diffrentes rgions du gne tudier avec la partie du gne rapporteur codant pour la forme mature de lenzyme (prive de sa squence signal). La translocation de lhybride travers la membrane interne est alors dpendante de la prsence dans le gne tudier dune rgion codant pour un segment hydrophobe servant de signal dexportation. Lanalyse des hybrides repose sur une proprit particulire de lenzyme rapporteur, qui a une activit diffrentielle selon que la protine est dans le cytoplasme ou dans le priplasme. Colonne 1 : enzyme rapporteur mature transloque dans le prriplasme Colonne 2: enzyme rapporteur prive de sa squence signal, non transloque Colonne3: fusion traductionnelle avec un polypeptide possdant un ou plusieurs segments transmembranaires, et exposant lenzyme rapporteur vers le priplasme Colonne 4: fusion traductionnelle avec un polypeptide ne possdant pas de segments transmembranaires, ou possdant un ou plusieurs segments transmembranaires, mais exposant lenzyme rapporteur vers le cytoplasme

23 Lactivit phosphatase alcaline est dtecte sur milieu contenant du BCIP (5-bromo-4-chloro3-indolyl phosphate), un substrat chromogne qui donne une coloration bleue la bactrie lorsquil est hydrolys. En jouant sur la densit cellulaire de la culture bactrienne (colonie isole ou patch) et la concentration dampicilline, il est possible de diffrencier les fusions exposant la -lactamase vers le cytoplasme ou le priplasme. Des bactries portant une fusion exposant la -lactamase vers le priplasme seront toujours rsistantes lampicilline (mme en colonies isolees). Les bactries portant une fusion exposant la -lactamase vers le cytoplasme seront uniquement rsistantes lampicilline aprs croissance en patch (gros amas de plusieurse colonies): les premires bactries qui essayeront de pousser seront lyses par lantibiotique, ce qui librera leur -lactamase, qui dgradera alors lantibiotique prsent dans le milieu et autorisera la croissance ce niveau des bactries suivantes dans la colonie. Patch test Faire un trait de bactries loeuse sur bote LB Ap200 Spot test Resuspendre une oeuse de bactries dans 100 l de LB, puis procder des dilutions en cascade jusqu 10-4. Dposer 15 l de chaque dilution et de la solution-mre sur Ap50. ___________________________________________________________________________

Rfrences bibliographiques

McIver KS, Kessler E, Olson JC, Ohman DE. (1995) The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 18(5):877-89. Braun P, Tommassen J, Filloux A. (1996) Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 19(2):297-306.