Patogénesis molecular de la infección por

virus de la Hepatitis B y de la Hepatitis C:

persistencia viral, apoptosis y oncogénesis

José Raúl Oubiña

Depto. Microbiología
Fac. de Medicina. Universidad de Buenos Aires.
Argentina. www.mancia.com.ar
 Infección por Virus
de la Hepatitis B y
de la Hepatitis C
¿Por qué pueden evolucionar
a la cronicidad?
Hígado normal

Hepatitis crónica y cirrosis

 Propuesta temática

VHB y VHC VHB

• Infección aguda y • ¿Puede evolucionar
temporalidad de la hacia la cronicidad
respuesta inmune aún en presencia de
adaptativa anticuerpos
• Variabilidad y “neutralizantes ?
persistencia viral
•VHB y VHC: Apoptosis y oncogénesis
 Morfología del VHB

HBs Ag

40 nm

HBc Ag
 Morfología del VHC

Partícula de 55 –
65 nm con finas
proyecciones
espiculadas.
Kaito M. y col.. J Gen
Virol 75: 1755- 1760,
1994. 50 nm
 Modelo cinético del ADN de VHB y del ARN de
VHC en suero en la infección autolimitada
1000
Respuesta inmune adaptativa
Indetectable Detectable
100

10 A D N VH B
A R N VH C

0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
S em ana s p.i.
ADN sérico de VHB
y lesión hepática en la infección autolimitada
1000

Respuesta inmune adaptativa

Indetectable Detectable
100
1800
TGP

10
A D N VH B

1 600 UI /
ml

0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

S em ana s p.i. JR Oubiña

UBA
 ARN sérico de VHC
y lesión hepática en la infección autolimitada
1000
Respuesta inmune adaptativa
Indetectable Detectable
1800

100

TGP
! ?
10
A R N VH C

600 UI /
1

ml

0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

S em ana s p.i.
 Dinámica viral
HBV HBV HIV HCV
Adefovir Lamivudine Ritonavir Ifn alfa

Virus en plasma
Vida 1/2 26,4 h 14 h 5,8 h 2,7 - 7,2 h

Producción viral 2,1 x 1011 1010 1,1 - 12,7

/ día 1012 x 1011

Células 11 - 30 10 - 100 días 1,6 días 2,4 - 4,9

infectadas días días
Vida 1/2
 Eventos tempranos de la infección

VHB VHC
• Escasa replicación • Importante replicación
desde los 1ros. días
por 7- 10 semanas

• 7% de LT CD8+ EC
• 1% de LT CD8+ a las 8 – 10 semanas
citotóxicos específicos
• Defecto funcional de LT:
circulantes (LT CD8+ EC)
a las 8 –10 semanas ↓ perforina
↓ interferón γ
↓ capacidad de
expansión
 El genoma del VHC

Serina proteasa
Cápside Envoltura Proteasa RNA helicasa
Cofactor RNA polimerasa
de NS3
5´NCR 3´NCR
C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B

F Canal iónico ? ?
Infectividad
?
RNA (+) 9,4 kb.
Flia. Flaviviridae. Género Hepacivirus
 Proteínas del VHC
livaje por proteasas celulares

Serina proteasa
Cápside Envoltura Proteasa RNA helicasa RNA
Cofactor polimerasa
de NS3
C E1 E2 p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B
1F Canal iónico ? ? 3008-
Infectividad
3037
?
Frameshifting ribosomal
Clivaje por proteasas virales
JR Oubiñ
UBA
 Genoma del VHB

Envoltura •Genes solapados

en fase y desfasados

•3,2 kb de ADN
Transcriptasa •Parcialmente
inversa
bicatenario
Algunas regiones de interés
Cápside

Transactivador
Ag e soluble transcripcional
 Proteínas derivadas de las
regiones genómicas pre-S / S
Proteína

Pre-S1

Pre-S2

ATG ATG ATG TAG

Gen
JR Oubiña
UBA P (codón fuera de fase: S + 1)
 Proteínas derivadas de las
regiones pre-core /core

Proteína 1 29 214

e soluble
Secuencia señal

HB core
Unión a A:N
X TTG TAG P
codón de stop
ADN ATG ATG TAG
JR Oubiña 1814 1901 2455
UBA 1896
nt
 Variabilidad del VHC y del VHB

JR Oubiña
UBA
 Variabilidad genómica del VHC
(II)

JR Oubiña
UBA

TIPOS (1-6)

Recombinantes
(2k - 1b)
Subtipos
(a,b,c…)
Aislamientos

Cuasiespecies
 Variabilidad genómica del VHB
(III)

TIPOS (A H)
Recombinantes
(G A; C D)
Subtipos
(A1 A 2, ó Aa Ae;
Ba Bj;)
Aislamientos
Cuasiespecies
JR Oubiña
UBA
 Variabilidad del VHB y del VHC
(IV)
UBA

• Cambios menores:
Transcriptasa inversa
(VHB) y ARN
polimerasa (VHC):
1 c/103 – 104 nt/sitio/año (genómico)

Presión de selección
de la Rta. Inmune (Ag)
CUASIESPECIES
• CAMBIOS MAYORES
JR Oubiña Rta. Inmune Recombinación
 Prevalencia genotípica de HCV
en Buenos Aires, Argentina

60
60

50 50

T ipo 1
40 40
T ip o 1
T ip o 2T ipo 2
30
30 T ip o 3
M ixta s
20 T ipo3
20

10
M ixtas
10
0

Oubiña y col, J Med Virol 1995; Quarleri y col, J Clin Genotipos 4 y 5: excepcionalmente
Microbiol 2000; Quarleri y col, J Clin Microbiol 2003).
M e persistencia viral
e
c Estrategias
a • Resistencia
ni • Contraataque
s
m • Escape
o
s El intocable Nicolino Locche: argentino

d Campeón mundial de boxeo 1968 –1972. JR

Oubiña
 Regulación viral de la apoptosis
Señal
apoptótica Mitocondria
B C
Proteínas pro-apoptóticas
C Smac/Diablo y Omi/HtrA2
Citocromo C
26 S proteasoma

Apaf 1 19S
B Otras proteínas
pro-apoptóticas
Caspasa 9 20S

Caspasas efectoras 19S

JR Oubiña
UBA Muerte celular
 Inhibición de la PKR, del IRF3 y del proteasoma:
persistencia viral y oncogénesis

MX Inmuno Caspasas
modulación OAS Inhibición
Interferón
RNAsa L de la
C NS 3 Síntesis proteica.
Programa Programa pro Virus
P
antiviral apoptótico B X P
PKR
NS5A ¿core? FE i 2 alfa
IRES, E2,
P PKR
NS5A
X
IRF3 ? FE i 2 alfa
Elemento de
Rta. Sensible al IFN
NS3/ / 4A
core NS5A
STAT IK B

JAK Interferón NFK B

Promotor del JR Oubiña
Interferón UBA
 Ejemplos del contraataque viral
VHC VHB
• Inhibición de NK (E2 • Tolerancia perinatal
/CD81) (Ag e)
• Regulación de apoptosis • Promoción de respuesta
en linfocitos y hepatocitos Th2 (Ag e)
(core /TNFR o Fas)
• Inhibición de LT (core/
gC1qR)

Agotamiento del sistema inmune (alta carga viral)

Afectación de las células dendríticas (?)
 Escape a la respuesta inmune
(por modificación viral)
• Modificación de
epítopes T y B.
• Antagonismo para el
receptor T.
• Variantes virales de
escape a anticuerpos
neutralizantes
(RHV deVHC; S/PreS de VHB).

JR Oubiña
UBA ¿Causa o consecuencia de la persistencia viral?
 Pacientes
Banda
1 2 3 4 5 en la 1 5
2 3 4
SSCP
1 X

2 X X

3 X X X X

4 X

5 X X X X

6 X X X X

7 X X X X X

8 X

9 X X X

10 X X X X X

11 X X X

12 X X X X X
Serología, PCR y genotipo de HBV en las muestras del paciente RI
Hepatitis crónica activa con cirrosis

H B sA g
V alo res d e H B sA g y anti-H B s
400 30
RI98

300 RI97

RI95 20
anti-H B s
200
U I/L
10
100

0 0
1995 1996 1997 1998 1999

H B sA g anti-H B s
HBe Ag / anti HBe +
PCR [+] y genotipo F Mathet y col, J Med Virol 2003
 F grupo IV

Gen S:
Análisis filogenético F grupo Ib
de secuencias obtenidas
a partir de productos de PCR y
de 50 clones de las muestras
RI95, RI97 y RI98

JR Oubiña
UBA
Modelo de la estructura secundaria del HBsAg

CISTEÍNA
CASO ÚNICO DE MUTANTE
(Mt)
Mt EN MÁS DE UN CASO
Mt MÁS COMÚNMENTE
OBSERVADA
MUTACIÓN
POTENCIAL PUENTE
DISULFURO
 Estudio de las Cys en el HBsAg
en los 50 clones de las muestras RI95, RI97 y RI98

Posición Cambio Sustitución Posición nucleotídica* Clon

Aminoacídica Aminoacídico Nucleotídica / Posición en el codón

65 Cys x Tyr Transición G A 348 / 2da. RI97.1

69 Cys x Tyr Transición G A 360 / 2da. RI98.11

76 Cys x Arg Transición T C 380 / 1ra. RI98.6

90 Cys x Tyr Transición G A 423 / 2da. RI98.2

124 Cys x Arg Transición T C 524 / 1ra. RI98.6

Cys x Tyr Transición G A 525 / 2da. RI97.1

RI98.14

138 Cys x Arg Transición T C 566 / 1ra. RI98.14

139 Cys x Arg Transición T C 569 / 1ra. RI98.12

 Pérfil de Hidrofilicidad para la proteína S
Hidrofilicidad

Estudio de la 3.2

Hidrofilicidad del HBsAg 2.4

(aa 120-150) en los 50 1.6

clones de las muestras 0.8

RI95, RI97 y RI98 0

-0.8
Método de Hopp & Woods -1.6

-2.4

120 125 130 145 150

Posición aminoacídica
120 125 130 135 140 145 150

RI95.8 PCKTCTTLAQGTSMFPSCCCSKPSDGNCTCI
RI95.6 ....................P..........
RI97.1 ....Y.....K..I...........E.....
RI98.14 ....Y.............R.T..........
RI98.6 ....R..........................
RI98.12 .........R.........R...........
JR Oubiña RI98.7 .......P.......................
UBA
Cepas de VHB mutadas pueden persistir en
presencia de anticuerpos anti S circulantes

• Se documentó por vez

primera en la literatura, la
evolución temporal in vivo
de cuasiespecies del VHB
con fenotipo HBeAg (-), en
presencia de anticuerpos
anti-HBs:

JR Oubiña
UBA
Beso de la muerte de una linfocito T citotóxico con
especificidad para el HBs Ag (proveniente de un ratón
histocompatible sensibilizado con dicho antígeno) a
hepatocitos de un ratón transgénico para el gen S.
J Immunol 152: 3245, 1994.
 La eliminación viral
por células citotóxicas
• Hasta 1999, se
afirmaba que la
eliminación viral de
los hepatocitos
requería su
destrucción.
“Es como tener que padecer el dolor
de las espinas,
para percibir el perfume de la
rosa...”
 Hay eliminación viral
sin destrucción celular

Viral Clearance Without

Destruction of Infected Cells
During Acute HBV Infection
Luca G. Guidotti,1 Rosemary Rochford,2 Josan Chung,1
Max Shapiro,3 Robert Purcell,4 Francis V. Chisari1*
Viral clearance during hepatitis B virus (HBV) infection has been thought to
reflect the destruction of infected hepatocytes by CD81 T lymphocytes. However,
in this study, HBV DNA was shown to largely disappear from the liver and
the blood of acutely infected chimpanzees long before the peak of T cell
infiltration and most of the liver disease. These results demonstrate that
noncytopathic antiviral mechanisms contribute to viral clearance during acute
viral hepatitis by purging HBV replicative intermediates from the cytoplasm and
covalently closed circular viral DNA from the nucleus of infected cells.

Science, 284: April 30, 1999.

Hepatitis C crónica
 Apoptosis en células transfectadas
con el gen core del VHC

Tinción de Hoechst Inmunofluorescencia indirecta

 Traducción /
replicación
Apoptosis y hepatitis
Luz del RE
Citoplasma

Núcleo
M
Expresión
it
o génica
c
o
n
d
r Estrés oxidativo y alteración
i
a del potencial de membrana

Activación de NF kB y STAT 3 por HBx y NS5A de HCV.

La citoqueratina 18 clivada por la caspasa 3
es un biomarcador de apoptosis
 Citoqueratina 18 clivada:
biomarcador sérico de apoptosis

Suero

hrp
Hepatocito
Citoqueratina 18 M30 anti CK18 -c

Caspasa 3
anti-CK 18

238 396 ELISA

 Mecanismos de apoptosis en la infección por
VHC

JAK-STAT Hepatocito
TRAIL-r Ifn
NF kB Rta. a Ifn
PKR 2´5´OAS

Granzima B
Perforinas
Bcl-2 Activación de
VHC core IAPsº procaspasas

Cascada de caspasas Ligandos

HLA-I HCV Ag TCR de
muerte
Activación de Fas Fas L
JR caspasa 8 TRAIL- r TRAIL
Oubiña UBA
TNF -r TNF
 Infección crónica y estrés celular
Infección viral

Estrés del RE

Activación de
PERK

Estrés
oxidativo APOPTOSIS

Activación de Fibrosis / cirrosis Recambio

células estrelladas Carcinoma hepatocítario
Apoptosis y ciclo celular
Apoptosis y ciclo celular
 Incidencia relativa de los 5
principales cánceres en el mundo

23%
P ulm ón
21%
M am a
C olorrectal
E stóm ago
28% H ígado
15%
13%
 Mortalidad asociada a los 5 tipos
más frecuentes de cáncer

1500

1000 P ulm ón
M uertes
(x 1000) E stóm go
500 H ígado
3
0 C olorrectal
M am a
T ip o d e cán cer
 Traducción /
replicación
Apoptosis y hepatitis
Luz del RE
Citoplasma

Núcleo
M
Expresión
it
o génica
c
o
n
d
r Estrés oxidativo y alteración
i
a del potencial de membrana

Activación de NF kB y STAT 3 por HBx y NS5A de HCV.

Telomerasa
 Conclusiones
Potenciales implicancias

∨ Fuerte asociación entre actividad de telomerasa hepática y CHC (90%),

independientemente de su grado de diferenciación.

∨ Niveles mínimos de actividad enzimática en tejidos cirróticos,

potencialmente atribuible al infiltrado linfocitario o a presencia de células
sinusoidales y/o endoteliales.

∨ Posible participación de mecanismos alternativos de mantenimiento de la

longitud del telómero (ALT) independientes de la actividad de telomerasa.
 Desarrolode un método para Cuantificación del RNAm de
telomerasa(hTERT)

RT-PCR competitiva Co-amplificación de 2templados de diferentelongitud

(RT-PCRc) eigualsec.de reconocimiento paralos cebadores

RNA (B) RNA (C)

C = C (1+e)n = C
(A cuantificar) (Cantidad conocida)
B (1+e)n
6
Reacción de RT 5
4
(competencia por el cebador) 3
2
1
0 0 2 4 6
PCR -1
y = 1,2x - 1,5333
Log olé cC (m
C (m
1 2 3 ulas o
) léculas) R2 = 0,871

B Análisisdensitométrico
C (software)