MANUAL DE DESCONGELACIN Y SIEMBRA DE LA LNEA CELULAR 3T3-L1

GLOSARIO Cultivo celular: Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de clulas in vitro, conservando al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas Cultivo celular primario: Se establece a partir de clulas, tejidos u rganos y consiste en preservar su viabilidad por un periodo limitado de tiempo. Diferenciacin celular: Es el proceso por el que las clulas adquieren una forma y una funcin determinada durante el desarrollo embrionario o la vida de un organismo pluricelular, especializndose en un tipo celular. Lnea celular: Se origina a partir de un cultivo de clulas u rganos primarios y posee la caracterstica de ser inmortal. Lnea celular 3T3-L1: Esta lnea celular se origina a partir del cultivo primario de las clulas 3T3 del ratn suizo albino. Tiene caractersticas morfolgicas de fibroblastos que bajo ciertos estmulos de tipo hormonal llegan a diferenciarse a adipocitos. Suero de ternera: Suero que sirve para enriquecer los medios de cultivo y propiciar el crecimiento celular. Proviene de bovino recin nacido

MANUAL DE DESCONGELACIN Y SIEMBRA DE LA LNEA CELULAR 3T3-L1

Objetivo Establecer las condiciones experimentales necesarias para la descongelacin y siembra de la lnea celular 3T3-L1. Alcance Personal involucrado en el crecimiento y diferenciacin de la lnea celular 3T3-L1 Frecuencia Cada vez que se tenga que descongelar clulas para su posterior diferenciacin Material y equipo Pipetas, centrfuga, crioviales, bao mara, medio DMEM 1X (suero de ternera), tubo cnico de 15 2 2 mL, vaso de precipitado para desechos, vrtex, botella de cultivo de 75 cm o 175 cm , colorante azul de tripano, micropipetas, incubadora de CO2.

INSTRUCCIONES 1.- Colocar el frasco de DMEM 1X (suero de ternera) en bao Mara a 37C (Ver ANEXO 1) 2.- Descongelar las clulas en bao Mara a una temperatura de 37C 3.- Centrifugar el criovial, 3 min/4000 rpm a TA, para eliminar el DMSO y DMEM. 4.- Decantar el sobrenadante, resuspender las clulas en 1 mL de DMEM 1X suero de ternera (previamente temperado a 37 C) y cuidadosamente homogenizar con pipeta. 5.- Contar las clulas (Ver ANEXO 2) 6.- Pasar las clulas a una botella de cultivo y agregar DMEM 1X (suero de ternera) necesario hasta obtener el volumen adecuado (ver Tabla 1). Observar clulas al microscopio. 7.- Incubar las clulas a 37 C en incubadora al 5% de CO 2 y 95 % de humedad. 8.- Revisar las clulas a las 48 hrs, si no vira el pH del medio de cultivo, hacer el cambio a las 72 hrs (pH ptimo: 7.4 0.2).

MANUAL DE DESCONGELACIN Y SIEMBRA DE LA LNEA CELULAR 3T3-L1

Tabla 1 DMEM 1X 25 cm2 75 cm2 5 mL 12 mL

FLUJOGRAMA DE DESCONGELACIN DE CLULAS Y SIEMBRA 3T3- L1

Colocar DMEM 1X (suero de ternera) a una temperatura de 37 C

Descongelar clulas a una temperatura de 37 C

Centrifugar el criovial para eliminar el DMSO y DMEM

Verter el sobrenadante y resuspender clulas en 1 mL de DMEM 1X (suero de ternera)

Contar las clulas

Pasar las clulas a una botella de cultivo

Incubar las clulas a 37 C al 5% de CO2 y 95% humedad

Revisar las clulas a las 48 hrs

MANUAL DE DESCONGELACIN Y SIEMBRA DE LA LNEA CELULAR 3T3-L1

BIBLIOGRAFA Libro de cultivo celular y el inserto de lneas 3T3-L1 Bitcoras: Saray Quintero y Roco Lpez http://difcelular08.blogspot.es/ accesado 15 de julio 2010 Freshneyr R. Ian. Culture of animal cells. A manual of Basic Technique; 3rd ed Wiley-Liss New York USA 1994. ISBN 0-471-58966-7

MANUAL DE DESCONGELACIN Y SIEMBRA DE LA LNEA CELULAR 3T3-L1

ANEXOS
Anexo 1 Preparacin de DMEM 1X Para 1000 mL 850 mL 10 mL 10 mL 10 mL 20 mL 100 mL Para 500 mL Para 250 mL Para 100 mL 425 mL 212.5 mL 85 mL 5 mL 2.5 mL 1 mL 5 mL 2.5 mL 1 mL 5 mL 2.5 mL 1 mL 10 mL 50 mL 5 mL 25 mL 2 mL 10 mL

DMEM Aminocidos 10 mM 100X Piruvato de Na 100 mM 100X L-glutamina 200 mM, Penicilina 10,000 U/mL/Estreptomicina 10,000 g/mL HEPES (1.25 M-Stock) 25 mM* Suero de ternera (previamente inactivado)**

*Ver anexo 3

**Ver anexo 4

NOTA: Colocar una pequea porcin en un tubo e incubar para observar si existe algn cambio de coloracin.

Anexo 2 Conteo de clulas 1.- Resuspender las clulas y tomar una alcuota de 20 L de clulas 2.- Colocarlas en un tubo eppendorf de PCR 3.- Adicionar 20 L de colorante azul tripano 4.- Homogenizar 5.- Colocar 10 L de la mezcla anterior en la cmara de Neubauer y contar NOTA: Contar solo las clulas redondas y refringentes, las clulas teidas de azul son clulas muertas. 6.- Contar los cuatro cuadros con la letra L

Frmula: # clulas en la suspensin celular =

MANUAL DE DESCONGELACIN Y SIEMBRA DE LA LNEA CELULAR 3T3-L1

Anexo 3 Preparacin de HEPES 1.- Sigma H-4034 100 mg PM 238.3 2.- Pesar 29.7875 g de HEPES para 1.25 M (solucin stock) 3.- Aforar a 100 mL con agua destilada estril (preparar en condiciones de esterilidad) 4.- Almacenar a 4 C.

Anexo 4 Preparacin de HEPES 1.- Calentar previamente el bao mara a 60 C 2.- Monitorear la temperatura del bao con un termmetro, el cual debe estar dentro de una botella y estar dentro del bao para observar que no haya variacin en la temperatura. 3.- Colocar el suero en el bao Mara durante 30 minutos 4.- Alicuotar el suero en volmenes de 5 y 10 mL 5.- Etiquetar el suero de ternera (inactivado) 6.- Almacenar a -20 C.