APLICAES DOS MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA NAS QUESTES DE IDENTIFICAO HUMANA NO MBITO CVEL E FORENSE Jane Carmem

de Souza; Paulo Roberto Queiroz (1) Autor: Biloga. UniCEUB, Brasil. janecarmem@gmail.com (2) Orientador: Bilogo. PhD. Biologia Animal. UnB prqzqueiroz@gmail.com Resumo
O processo de identificao iniciou a partir do momento que o homem externou caractersticas que s eram atribudas a sua pessoa. As caractersticas individuais foram descritas de forma minuciosa por vrios estudiosos. A anlise de amostras biolgicas como prova forense teve seu incio no sculo XX e o primeiro marcador sorolgico em percias forenses foi o sistema ABO. A partir de 1980, iniciaram-se os estudos dos marcadores genticos de regies hipervariveis do DNA humano. O objetivo desse trabalho foi descrever as principais aplicaes dos marcadores moleculares baseados em DNA na identificao de grupos humanos. Marcadores moleculares baseados em DNA (VNTR, STR, SNP e mtDNA) passaram a ser utilizados nas questes de identificao humana no mbito cvel e forense. Como exemplo de aplicao em 1989, os marcadores genticos foram utilizados em uma investigao de restos sseos exumados no Brasil referentes a Mengele, mdico nazista do conhecido campo de concentrao de Aushwitz. O emprego de tcnicas de identificao baseadas em DNA vem auxiliar o processo legal e na elucidao de atos delituosos, tornando a identificao de indivduos mais precisa. Dessa forma, a anlise por meio do DNA tornou-se uma das ferramentas mais poderosas e precisas que so utilizadas nas cincias forenses. Palavras-chave: VNTR, STR, mtDNA, SNP

Abstract
The identification process began from the moment that the man who only voiced characteristics were attributed to him. Individual characteristics were described in detail by several scholars. The analysis of biological samples as forensic evidence began in the twentieth century and the first serologic marker in forensics was the ABO system. Starting in 1980, began studies of genetic markers of hypervariable regions of human DNA.. The aim of this study was to describe the current applications of DNA molecular markers in the identification of human groups. DNA molecular markers (VNTR, STR, SNP and mtDNA) are now used in human identification issues in civil and forensic. As an illustration, in 1989, the genetic markers were used in an investigation of skeletal remains exhumed in Brazil in Mengele, the Nazi doctor known concentration camp at Auschwitz. The use of identification techniques based on DNA has been assisting the legal process and the elucidation of criminal acts, making identification of individuals more precisely. Thus, through analysis of DNA has become one of the most powerful and accurate tools that are used in forensic science. Keywords: VNTR, STR, mtDNA, SNP.

INTRODUO

A evoluo humana um processo resultante da inter-relao entre os aspectos biolgicos e culturais. Trata-se de um processo de crescimento e conhecimento. Segundo Cotrim (2002), com o desenvolvimento do psiquismo, o homem tornou-se um ser biolgico e cultural. 1

Segundo Jobim et al. (2005) considera-se que a origem da espcie humana venha da frica. A existncia de fsseis uma evidncia da migrao e da descendncia direta. O modelo que melhor trata sobre o processo evolutivo prope uma nica populao ancestral oriunda da frica por volta de 100.000 a 200.000 anos. Segundo estudos feitos por Cavalli-Sforza (1997) a primeira estimativa de tempo de separao dos primeiros imigrantes fora da frica de 146.000 anos, muito perto das datas obtidas com sequenciamento total do DNA mitocondrial (mtDNA) e em resultados utilizando-se 30 microssatlites. A busca pela identidade, ou seja, o conjunto de caracteres que individualiza uma pessoa ou coisa, fazendo-a distinta das demais segue desde os primrdios dos tempos at os dias atuais. O valor da identificao estabelece uma relao social bem como exigncias civis (FRANA, 1998). O convvio em sociedade e a conscincia de si mesmo incitaram o homem na busca por conhecimentos. Esta necessidade de conhecer influenciou na evoluo da cincia como um todo. A evoluo no campo da identidade (tanto civil quanto criminal) acentuou-se a partir do estudo do genoma humano. A impresso digital gentica do DNA contribuiu para percias para vnculo de paternidade bem como um novo campo na criminalstica que passou a analisar os vestgios humanos com o uso de marcadores genticos e polimorfismos do DNA que so de interesse forense. Os mtodos de identificao humana tm contribudo para a anlise de vestgios humanos no mbito pericial. Fluidos biolgicos como sangue, smen, saliva, bem como plos e partes cadavricas podem ser objetos de identificao de indivduos (FRANA, 1998). Ao longo dos ltimos vinte anos, a anlise do DNA revolucionou a cincia forense e tornou-se um instrumento dominante na aplicao da lei. Hoje, a evidncia do DNA a chave para a condenao ou exonerao de suspeitos de vrios tipos de crime, do roubo ao estupro e assassinato (MORLING et al., 2010).

OBJETIVO

Descrever as principais aplicaes dos marcadores moleculares baseados em DNA na identificao de grupos humanos.

METODOLOGIA Este trabalho sintetiza bibliografias diversas contendo informaes agregadas de vrias fontes bibliogrficas, tais como, obras de Medicina Legal, Criminalstica e de Biologia Molecular buscando ser um roteiro para estudos de como os marcadores moleculares baseados em DNA podem ser usados como elementos de orientao na anlise de vestgios visando elucidar questes envolvidas em fatos delituosos com fins de justia e de polcia. E, assim, atender a todos que se interessam por esse tema e que encontram dificuldades em obter informaes a respeito da juno desses dois elementos, ou seja, a biologia molecular e a prtica forense. Dessa forma, a metodologia utilizada foi o levantamento bibliogrfico sobre marcadores moleculares baseados em DNA encontrados em artigos cientficos especficos da rea descritos na MEDLINE LILACS

(http://medline.cos.com/),

(http://www.bibliomed.com.br/LILACS/index.cfm?libcatid=20025) e a base de dados foram o SCIELO (http://www.scielo.org/php/index.php) e o NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), no perodo de outubro de 2009 a abril de 2010.

DESENVOLVIMENTO

Histrico da identificao: DNA e os marcadores genticos

Em 1900, data o surgimento da Gentica Humana quando Karl Landsteiner descobriu o sistema ABO (JEFFREYS, 2005) o mais importante dos grupos sanguneos. Os antgenos ABO no ficam restritos s hemcias, sendo encontrados em todas as clulas (RAPAPORT, 1990). Este foi o primeiro marcador sorolgico utilizado em percias criminais. Entretanto, o sistema ABO precisava de associao com outros grupos, tais como, MN e HLA devido a sua baixa variabilidade, resultante de apenas trs alelos (NIJ, 2000). A anlise de amostras biolgicas como provas forenses teve seu incio no sculo XX utilizando-se os grupos sangneos ABO, mas estes apresentaram uma variabilidade muito limitada, pois classificam as pessoas em apenas quatro tipos (grupos A, B, AB, O) seguidos pela utilizao do complexo HLA (Human Leucocyte Antigen Antgenos Leucocitrios Humanos), um conjunto de genes que codifica as molculas de histocompatilidade do sistema MHC (Major Histocompatibility Complex Complexo de Histocompatibilidade Humana).

Estes genes esto localizados no brao curto do cromossomo 6 e agrupados em trs sub-regies: HLA classe I (A, B e C), HLA classe II (DR, DQ e DP) e HLA classe III. Os genes do HLA so os mais polimrficos nos mamferos. Os antgenos leucocitrios humanos (HLA) com seu complexo de protenas altamente variveis esto no cerne do sistema imunolgico. Esses marcadores podem ser altamente discriminatrios, porm tem como desvantagem seu alto custo operacional (MONTE et al., 2004; ALVES et al., 2005; JEFFREYS, 2005). O nascimento da Gentica Forense surgiu com a idia da variao gentica normal nos seres vivos ser usada em provas forenses. Em 1902, Richter e Landsteiner sugeriram o uso da mancha de sangue nas investigaes criminais. Com o advento da Gentica Bioqumica no final de 1960 que permitiu estudar a variao molecular humana por meio de vrias protenas do sangue, ou seja, vrios polimorfismos permitem que estes marcadores sorolgicos e protenas sejam utilizados para resolver questes de parentesco. O apogeu da Gentica Forense foi em 1980, em questes de paternidade, visto ento como o melhor mtodo de identificao biolgica, os estudos que evoluram a partir de 1869 quando o bioqumico Johann Friedrich Miescher realizou o primeiro isolamento de DNA (JEFFREYS, 2005). Em 1953, Watson e Crick, revelaram a estrutura da dupla hlice do DNA, informao esta que permitiu a revoluo na rea molecular. Em 1973, a tecnologia do DNA recombinante permitiu o estudo em detalhe dos genes por meio da repartio do complexo genmico. Em 1977, o primeiro gene humano foi isolado (o gene da insulina) permitindo assim a descoberta de outros que se relacionam com doenas e que tambm possuem relao com a identificao humana (JEFFREYS, 2005). A ferramenta utilizada para explorar a variabilidade do DNA foram as enzimas de restrio e as sondas de DNA. Os polimorfismos dos fragmentos de restrio (RFLPs) permitiram estimar a variao do DNA de uma pessoa para outra. Porm, polimorfismos de nico nucleotdeo (SNP), permitem estimar a variao do DNA de forma individual, conseqentemente so muito laboriosos e de custo superior. Em virtude disso, em 1980, iniciaram-se os estudos das regies hipervariveis do DNA humano por serem marcadores genticos muito mais informativos (JEFFREYS, 2005). Descobriram-se regies constitudas por vrios pares de bases, repetidas inmeras vezes, com alelos variando quanto ao nmero de sequncias, denominados minissatlites (VNTR). Inicialmente, os VNTRs foram utilizados como marcadores genticos

informativos, pois estes so compostos por 100 ou mais alelos com diferentes comprimentos na populao humana. Outros marcadores altamente polimrficos foram encontrados no genoma humano, os Microssatlites (STR). Os STRs so repeties curtas de 1 a 5 pares de bases encontrados em eucariotos. Tais repeties so encontradas tanto em regies codificantes quanto no codificantes cuja funo ainda desconhecida (JEFFREYS, 2005). Em 1983, Kary Mullis e colaboradores desenvolveram a tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction Reao em Cadeia de Polimerase) permitindo que pequenas quantidades de DNA fossem amplificadas, de maneira que fragmentos muito curtos de DNA, como no caso dos microssatlites, pudessem ser utilizados (JEFFREYS, 2005). Em 1984, nasceu a impresso digital do DNA depois de um experimento chave entre amostras de um trio (pai/me/filho), um babuno, uma foca, uma vaca, um rato e uma planta de tabaco. Este experimento fez comparaes entre as amostras e detectou fragmentos altamente variveis de DNA. Observaram que pai e me eram diferentes, porm, o filho parecia ser a unio de padres de DNA dos pais. Tal sistema funcionou em outras espcies tambm. Este experimento resultou em um mtodo de DNA (uso de minissatlites) que capaz de individualizar e estabelecer relaes familiares. Em 1985, tem-se o relato do primeiro caso de emprego do perfil de DNA para solucionar um problema de imigrao com o uso da tcnica de Southern blot para determinar o perfil de hibridao em minissatlites, em uma famlia de cidados do Reino Unido originalmente de Gana. O filho mais novo tinha visitado Gana e ao retornar para Londres com passaporte adulterado foi questionado sobre a relao familiar. A famlia passou por uma srie de exames, tipagem sangunea com marcadores sorolgicos emprego do sistema HLA, porm os resultados foram ambguos. Foi realizada a prova da impresso digital do DNA e revelado que o menino era membro pleno direto da famlia e que tinha o mesmo pai como as outras crianas. A evidncia foi apresentada ao Ministrio Pblico Britnico que analisou os dados, arquivou o processo e concedeu residncia ao menino no Reino Unido, permitindo que ele permanecesse com a sua famlia. Em 1986, o perfil de DNA auxiliou a elucidao de um assassinato em Leicester. Por vrios anos, houve um intenso debate sobre cada aspecto do perfil de DNA, estabelecendo-se a necessidade de procedimentos que visem manuteno da qualidade e a garantia do processo para a confiabilidade da evidncia forense nos tribunais em todo o mundo (JEFFREYS, 2005).

Os microssatlites (STR) foram utilizados pela primeira vez em 1989, em uma investigao de restos sseos exumados no Brasil referentes a Mengele, mdico nazista do conhecido campo de concentrao de Aushwitz. Outro fato importante no emprego de microssatlites ocorreu em So Petersburgo, em restos recuperados de uma sepultura e suspeitas de pertencer a uma famlia (czar Nicolau, esposa e trs filhos) assassinada em 1917 pelos bolcheviques. A anlise pelos microssatlites confirmou que se tratava de um grupo familiar, mas, para determinar o parentesco foi necessrio o uso de outra tecnologia: o DNA mitocondrial (DNAmt). Esse DNA pequeno em tamanho e encontrado nas mitocndrias herdado estritamente de me para os filhos. Descendentes da linhagem matrilinear do czar e czarina foram traados correspondendo aos previstos para a famlia real (JEFFREYS et al., 1992; JEFFREYS, 2005).

Marcadores moleculares minissatlites empregados na anlise forense

A anlise forense utilizando DNA foi desenvolvida por Alec Jeffreys, geneticista britnico que em 1985 publicou o artigo na revista Nature: Identificao Genmica ou DNA Fingerprinting, aps analisar que um curto trecho de DNA repetitivo que aparecia espalhado por todo o genoma, em uma sequncia curta, praticamente idntica com cerca de 15 nucleotdeos. Jeffreys usou essa sequncia como sonda, marcada com uma molcula radioativa em todo o genoma e ao revelar usando um filme de raios X sob a folha de nilon, registrou os padres dos pontos radioativos e observou que havia variao entre uma amostra e outra, sendo possvel distinguir um indivduo do outro. E escreveu: o perfil nos fornece um fingerprint especfico de cada indivduo (WATSON, 2005; JOBIM et al., 2005; JEFFREYS, 2005). Essas regies hipervariveis ou sequncias hipervariveis do DNA so denominadas VNTR (Variable Number Tandem Repeats), ou sequncias adjacentes que se repetem em nmero varivel. Posteriormente, foram denominadas de Minissatlites, ou seja, regies constitudas de 15 a 30 pares de bases repetidas inmeras vezes com diferentes alelos variando o nmero da sequncia, tornando-os extremamente informativos (JEFFREYS, 2005). Esta variao no nmero de elementos repetidos possivelmente devido a fenmenos como permuta no-equivalente ou escorregamento (slippage) na replicao de DNA, ou converso gnica. O deslizamento (slippage) da DNA polimerase durante a replicao do DNA tida como a principal causa da variao no nmero de repeties

nesses loci. Os diferentes nmeros de repeties caracterizam os diferentes alelos, que podem ser detectados em uma eletroforese (OLIVEIRA et al., 2005; ANMARKRUD et al., 2008). As sondas moleculares unilocais reconhecem um ou dois fragmentos de DNA em cada indivduo. Tais fragmentos de DNA so comparados com aqueles do controle que possui a massa molecular em kilobases (kb) permitindo assim clculos estatsticos especializados. As sondas multilocais analisam vrios loci ao mesmo tempo com grande polimorfismo na mesma reao, com grande quantidade de fragmentos de DNA existentes (JOBIM et al., 2005). As limitaes com testes com minissatlites decorrem da necessidade de amostras com concentraes elevadas de DNA, apresentam dificuldade de anlise de amostras com material degradado e o procedimento lento e oneroso (JOBIM et al., 2005).

O avano tecnolgico os microssatlites.

Os STRs ou microssatlites apresentam polimorfismos muito similares aos VNTRs, a diferena est no tamanho das unidades de repeties consecutivas. Ambos so teis para a identificao humana (KOCH; ANDRADE, 2008). Hoje os STRs (repeties curtas consecutivas) substituram os polimorfismos de comprimento dos fragmentos de restrio (RFLPs) como principal mtodo de identificao genmica. So sequncias curtas que variam de 2 a 4 bases que podem se repetir at dezessete vezes e so comumente amplificadas por PCR (WATSON, 2005). Uma das mais promissoras das tcnicas envolve a amplificao de locus contendo Short Tandem Repeats (STRs). Os STRs esto dispersos por todo o genoma, de modo que h um potencial quase ilimitado para mais loci serem descobertos e validados para uso forense. Alelos STR geralmente podem ser identificados individualmente (COMMITTE, 1996). Os STRs tambm so baseados em unidades de repetio, tm uma alta taxa de mutao (porm se comparada com alguns VNTRs no to alta), possui um nmero bastante grande de alelos e geralmente so capazes de identificao de alelos exclusivos (COMMITTE, 1996). Os microssatlites so classificados de acordo com o tipo de seqncia que se repete: a) perfeito: a sequncia das bases se repete e no ocorre interrupo; b) imperfeito:

h presena de nucleotdeo diferente da estrutura repetitiva; c) interrompido: pelo menos uma das repeties apresenta nucleotdeos intercalados; d) ou composto: apresenta mais de um tipo de repetio em srie adjacente (BHARGAVA; FUENTES, 2010).

Tcnicas de Southern blot e PCR utilizadas na identificao de marcadores moleculares baseados em DNA

Os marcadores moleculares esto sendo utilizados pelos pesquisadores para desvendar sequncias de DNA para vrios fins. Existem dois tipos de marcadores moleculares: os que hibridam, tais como, o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) e os Minisatlites. Os minissatlites ou loci VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) utilizam enzimas de restrio permitindo a anlise de polimorfismo de comprimento de fragmento de DNA por meio da tcnica de Southern blot (COUTINHO et al., 2006). Mais recentemente, os que amplificam em cadeia utilizam os princpios do PCR que emprega uma DNA polimerase termoestvel e incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA); SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions); STS (Sequence Tagged Sites) Microssatlites ou SSR (Simple Sequence Repeats) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (COUTINHO et al., 2006). Os marcadores que hibridam possuem uma grande desvantagem, ou seja, o seu elevado custo e a demanda de tempo para execuo. Como vantagem, esses marcadores possuem uma consistncia nos resultados em termos de reproduo (COUTINHO et al., 2006). Em 1975, Edwin Southern desenvolveu uma importante tcnica utilizada em anlises de DNA que ficou conhecida como Southern blot cujo processo completo de digesto de DNA, eletroforese, transferncia de membrana e hibridao so procedimentos usados rotineiramente em biologia molecular, bioqumica, gentica e diagnstico clnico de DNA. Nesse sentido, no h diferena na aplicao forense. A tcnica consiste no tratamento de uma amostra de DNA que cortada por uma enzima de restrio e os fragmentos so separados por eletroforese, identificados com uma sonda marcada que contm sequncias de bases nitrogenadas complementares a unidade de repetio dos VNTRs. Os VNTRs so sequncias que so repetidas no DNA e alguns polimorfismos de

VNTR tm um pequeno nmero de alelos e os padres dos fragmentos de restrio representam cada um dos alelos em um locus que pode ser facilmente distinto. Os loci VNTR so altamente polimrficos com cerca de 50-100 alelos ou at mais. Cada fragmento de restrio compreende um fragmento e o padro de fragmentos gerado praticamente nico para cada indivduo, assim como, a impresso digital (COMMITTEE, 1992; MOXON; WILLS, 1999). A tcnica de Southern Blot pode ser utilizada na identificao de polimorfismos que determinam a alterao do padro de clivagem e esta pode ter ocorrido devido a mutaes pontuais em stios de restrio, obtido a partir de uma determinada regio do DNA (Restriction fragment length polymorphism RFLP). Esses diferentes padres so detectados utilizando-se a prpria regio potencialmente polimrfica como sonda. Padres de RFLP obtidos com uma determinada sonda podem ser utilizados no estabelecimento de um perfil de DNA, que permite a diferenciao entre indivduos. Esta tcnica utiliza DNA genmico total, exigindo que o DNA esteja em bom estado de conservao, ou seja, que as molculas estejam intactas (KOCH; ANDRADE, 2008). Tcnica de PCR foi desenvolvida em 1983 por Kary Mullis e colaboradores na Cetus Corporation, a reao em cadeia de polimerase (PCR - polymerase chain reaction) uma tcnica poderosa para aumentar pequenas quantidades de DNA. A reao em cadeia da polimerase (PCR) permite a amplificao exponencial do DNA (LANDER & WATERMAN, 1995; WATSON, 2005). A PCR permite obter uma impresso genmica por meio de quantidades diminutas de DNA, tornando assim o mtodo preferido dos cientistas forenses, para amplificar segmentos especficos de DNA (WATSON, 2005). O processo de PCR possui vrias vantagens sobre os procedimentos que utilizam os VNTRs. Dentre essas vantagens pode-se citar que um mtodo relativamente simples e facilmente realizado em laboratrio, alm de obter os resultados em um curto espao de tempo, capacidade ilimitada para amplificao de quantidades muito pequenas de DNA (nanogramas) para anlise. Porm, tem como desvantagens: que qualquer procedimento que utiliza a metodologia de PCR suscetvel a erro por contaminao; tem menos locus que os VNTRs e, por isso, necessita de mais loci para obter o mesmo grau de discriminao de DNA de pessoas diferentes; e alguns loci amplificados por PCR esto associados aos genes funcionais, que podem estar sujeitos a seleo natural ocasionando as maiores diferenas entre os subgrupos da populao (COMMITTE, 1996).

A partir da reao em cadeia da polimerase (PCR), todos os tipos de marcadores moleculares passaram a ser detectados a partir de quantidades menores de amostras e em um curto espao de tempo. um mtodo in vitro rpido e verstil para a amplificao de seqncias-alvo de DNA definidas, presentes em uma preparao de DNA. Vrios mtodos de PCR, particularmente os que usam os STRs, esto sendo cada vez mais usados (KOCH; ANDRADE, 2008). O desenvolvimento da tipagem de DNA revolucionou a cincia forense e tornou-se um instrumento dominante na aplicao da lei. Desde ento, as seqncias de DNA humano em repeties in tandem foram os principais alvos para a anlise de DNA forense. Essas seqncias de repetio so classificadas em minissatlites (ou VNTR) e microssatlites (ou STRs) (MOXON; WILLS, 1999; TAMAKI; JEFFREYS, 2005; FRUMKIN et al, 2010).

Marcadores usados na identificao humana STR, SNP e DNAmt.

A identificao de indivduos tem sua importncia no mbito social, mdico (situaes clnicas e genticas, como o diagnstico e mapeamento de genes) e em casos forenses. A justificao para uma inferncia de que dois perfis de DNA idnticos vm da mesma pessoa baseia-se em clculos de probabilidade que utilizam princpios da gentica de populaes. A anlise de DNA, quando adequadamente realizada e interpretada, uma ferramenta forense muito poderosa (COMMITTE, 1996). Marcadores STR so sequncias menores que os VNTRs e trazem muitas informaes mesmo quando se tem DNA degradado ou em quantidade limitada. Os STRs esto espalhados por todo o genoma humano, de modo que h um potencial quase ilimitado de locus para serem descobertos e validados para uso forense (COMMITTE, 1996). Devido variao no nmero de repeties, os microssatlites mostram extenso polimorfismo do comprimento, por isso so muito eficazes como marcadores genticos. Os STRs so detectados usando PCR e os produtos resultantes so separados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose (BUZS; VARGA, 1995). Os principais marcadores STR utilizados pelo sistema CODIS (Combined DNA Index System) na identificao criminal de indivduos so: TPOX (cromossomo 2), D3S1358 (cromossomo 3), FGA (cromossomo 4), D5S818 e CSF1PO (cromossomo 5),

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D7S820 (cromossomo 7), D8S1179 (cromossomo 8), TH01 (cromossomo 11), VWA (cromossomo 12), D13S317 (cromossomo 13), D16S539 (cromossomo 16), D18S51 (cromossomo18), D21S11 (cromossomo 21), AMEL (cromossomo X) e AMEL (cromossomo Y). Esses marcadores genticos que formam a base do CODIS foram selecionados em novembro de 1997 e, a partir de ento, so utilizados na base de dados nacional de DNA. Aps vrios estudos de desempenho e validao de uso dos STRs foi ento estabelecida a base de dados da populao americana e a aplicao forense do sistema STR foi realizada em vrias investigaes. Alm da determinao da localizao fsica das diversas seqncias de DNA, o mapa citogentico foi integrado com a seqncia do genoma humano para permitir uma aproximao mais precisa dos fragmentos gerados (BUDOWLE; MORETTI, 1999; BUTLER, 2006). Um perfil STR uma seqncia de repeties que fornece uma identificao gentica nica de uma amostra testada. Sequncias de STR so responsveis por cerca de 3% do genoma humano total (BUTLER, 2006). Com os avanos na pesquisa de marcadores STR estudiosos reconheceram mais marcadores teis para cincia forense: marcadores Y-STR e mini-STR. Marcadores Y-STR tambm podem ser teis em investigaes de pessoas desaparecidas, testes de paternidade, investigaes histricas e genealogia gentica. Essas aplicaes se devem ao fato de que a maioria dos cromossomos Y (exceto mutao) passada de pai para filho sem alteraes. O MHL (minimal haplotype loci) inclui os marcadores STR mapeados nas vrias posies do cromossomo Y: DYS19 (10,12 Mb), DYS389I (13,05 Mb), DYS389II (13,05 Mb), DYS390 (15,71 Mb), DYS391(12,54 Mb), DYS392 (20,97 Mb), DYS393 (3,17 Mb), DYS385 a/b (19,19 e 19,23 Mb), DYS438 (13,38 Mb) e DYS439 (12,95 Mb), segundo Butler as posies em megabases (Mb) ao longo do cromossomo Y foram determinadas com NCBI - National Center for Biotechnology Information (BUTLER, 2006). J os marcadores STR de tamanho reduzido ou, MiniSTR, esto sendo desenvolvidos para uma melhor recuperao de informaes de DNA degradado. Os "mini-STRs" flanqueiam regies curtas da seqncia de repetio melhorando a eficincia da amplificao (BUTLER et al., 2003; DIXON et al., 2006; BRETTELL et al., 2009). Os marcadores SNP so regies do genoma em que uma nica base varia entre os alelos. Estes marcadores so considerados a classe polimrfica mais abundante identificada

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no genoma humano. Suas caractersticas so de interesse na medicina para diagnstico de doenas genticas e na rea forense. O interesse se faz desde testes de paternidade a anlises de origens geogrficas das amostras a partir das aplicaes dos SNPs localizados nos cromossomos autossmicos e Y (SOBRINO et al., 2004; BULL, 2000-2005). Polimorfismos de nucleotdeo nico (SNPs) ou elementos de insero Alu so mais susceptveis de serem utilizados para estimar a origem tnica, devido a sua menor taxa de mutao e a probabilidade de que um alelo particular tornar-se fixo em uma determinada populao. Os SNPs podem ter um papel til em aplicaes, tais como, o DNA mitocondrial (mtDNA), Y-SNPs e ascendncia de marcadores informativos (AIMS), prevendo caractersticas fenotpicas, em casos forenses e em outras aplicaes (BUTLER, 2006; BUTLER et al., 2007). Os marcadores Y-SNPs so teis para ajudar as estimativas de origem tnica. Os marcadores so: SRY+465, SRY10831a,b, SRY9138, M130 (RPS4Y), M2, DYS391, M168, M170), M182, Tat, M174, M172, M201, M198, M175, M207, M3, M5, P3, M153, M9, M11, M18, M31, M32, M33, M35, M37, M52, M119, M137, M124, M123, M122, M166, M112, M146, M42, M45, M157, M150, M60, M75, M69, M87, M89, M94, M95, P4, P25a, P25b, P25c (VALLONE & BUTLER, 2004). As primeiras tcnicas forenses de identificao humana eram convenientes apenas para anlise de DNA de evidncias biolgicas que contivessem clulas nucleadas. Atualmente, com a implementao do seqenciamento do DNA mitocondrial, essa limitao tem sido superada (LEE; LAAD, 2001). O DNA mitocondrial (DNAmt) difere do DNA nuclear em sua localizao, sua quantidade na clula, seu modo de herana e sua seqncia. O DNAmt localiza-se na matriz mitocondrial como um genoma pequeno de, aproximadamente, 16.569 pb. O teste de DNA mitocondrial pode ser obtido de uma variedade de amostras que de outra forma seriam inacessveis. Essas amostras incluem manchas altamente degradadas, ossos, saliva, unhas e fios de cabelo. Outra vantagem do DNAmt que este uma herana materna. Por isso, mesmo parentes maternos distantes podem fornecer uma amostra de referncia comparativa. As aplicaes forenses de DNA mitocondrial esto bem estabelecidas. Atualmente, o teste de DNAmt envolve reao em cadeia da polimerase (PCR) e seqncia de duas regies hipervariveis (HV1 e HV2) na regio de controle que a nica parte do DNAmt que no codifica genes, cerca de 610 pb de informao. Estas regies so altamente variveis na populao devido a taxa evolutiva do DNA mitocondrial (ISENBERG, 2002).

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Existem 13 tipos HV1/HV2 adicionais que ocorrem em nveis de 0,5% ou mais na populao. Atualmente, o Federal Bureau of Investigation (FBI) e outros usam o Grupo de Trabalho Cientfico sobre Mtodos de Anlise de DNA (SWGDAM) para estimar a relativa raridade de um perfil de mtDNA (MILLER; BUDOWLE, 2001).

Casos de identificao de grupos humanos usando os STRs.

Corach e colaboradores (1997) utilizaram marcadores de DNA para a identificao de restos de esqueletos mal conservados de pessoas mortas durante a ltima ditadura na Argentina (1976-1983) e h poucos registros oficiais sobre a identidade das vtimas ou o local dos sepultamentos. Um pequeno nmero de indivduos foi identificado pelos mtodos tradicionais forenses e um grupo familiar por meio de anlise de DNA mitocondrial (mtDNA). Ento, foram utilizados dois mtodos de rastreamento gentico do cromossomo Y-STR (DYS19, DYS385, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393) e amplificao de microssatlites autossmicos. Estes mtodos puderam complementar exclusivamente dados matrilineares da seqncia do DNAmt na identificao de pessoas desaparecidas. Segundo Simms e colaboradores (2008), o arquiplago das Bahamas foi influenciado por um vasto leque de colonos. No entanto, Bahamas permanece insuficientemente caracterizada geneticamente e pouco se conhece sobre a contribuio de cada grupo para a cadeia de ilhas. O estudo foi realizado analisando 15 loci STR autossmicos rotineiramente utilizados em aplicaes forenses. E, quando comparado este conjunto com grupos Africanos, revelaram perfis genticos similares as populaes do Oeste Africano e Angola. Kayser e colaboradores (2001) observaram no estudo que realizaram sobre a variao gentica por meio de sete hapltipos Y-STR de indivduos do sexo masculino dispersos globalmente. Foram estudados 986 indivduos, foram observados 598 hapltipos diferentes dos quais 437 foram encontrados em um nico indivduo. E concluram atravs deste estudo, que os dados mostraram que hapltipos Y-STR cromossmicos so uma ferramenta ideal para o estudo das afinidades genticas entre grupos de indivduos do sexo masculino e para a deteco da estrutura da populao.

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Casos de identificao de grupos humanos usando os SNPs.

Dixon et al. (2005) analisaram o emprego de sistema multiplex para polimorfismo de nucleotdeo nico (SNP) desenvolvido para amostras de DNA altamente degradadas e de baixo nmero de cpias, simulando a identificao de pessoas em cenrios de desastre em massa. O resultado do estudo de reprodutibilidade mostrou concordncia entre os perfis de SNP para tipos de amostras diferentes, tais como, sangue, saliva, smen e plos, para o mesmo indivduo. Estudos realizados por Westen e colaboradores (2009) permitiram afirmar que os marcadores SNP tri-allico so adequados para a anlise de DNA degradado e permitir a deteco de uma fonte de DNA em uma segunda amostra. Foram selecionados 31 SNPs com potencial tri-allico no banco de dados Database SNP (dbSNP) NCBI. A natureza triallico foi confirmada para 15 SNPs que residem em 14 cromossomos diferentes. Realizados os ensaios com multiplex Snapshot , as freqncias allicas de 16 SNPs foram determinadas em amostras da Holanda e Antilhas. Alm disso, compararam a eficincia de marcadores SNP tri-allicos com STR atravs de anlise com amostras de DNA artificialmente degradado de 30 ossos e de dente.

Casos de identificao de grupos humanos usando o DNAmt.

Kline e colaboradores (2005) observaram no estudo que fizeram que os testes de rastreio da regio controle e regio de codificao do DNAmt podem ser usados para diferenciar de forma eficaz indivduos no aparentados. Nesse trabalho os autores descreveram a utilidade de dois novos testes de rastreio disponveis para excluso rpida de amostras no correspondentes (LINEAR ARRAY mtDNA HVI/HVII RegionSequencing Typing Kit - Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Utilizaram esse kit em 666 indivduos caucasianos, africanos e hispnicos. As amostras apresentaram hapltipos de DNAmt caucasianos mais comuns e foram subdivididas com uma amplificao multiplex e ensaio de deteco de onze polimorfismos de nucleotdeo nico no genoma mitocondrial. Esses tipos de testes permitem uma avaliao mais rpida de amostras em trabalhos de casos forense de tal forma que somente as amostras no excludas estariam sujeitas a uma caracterizao mais aprofundada por meio da anlise completa das seqncias HVI e HVII do DNAmt.

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Hall e colaboradores (2005) descreveram um sistema automatizado de ionizao por electrospray, mtodo de espectrometria de massa, que pode detectar certo nmero de SNPs agrupados dentro de um amplicon sem conhecimento a priori das situaes especficas dos SNPs e pde faz-lo quantitativamente. Este ensaio pode ser expandido para avaliar a variao gentica na regio da codificao do genoma mitocondrial e podem ser automatizadas para facilitar a anlise de um grande nmero de amostras, como aquelas encontradas aps um desastre em massa.

Ancestralidade por meio de marcadores moleculares baseados em DNA.

No Brasil alguns estudos foram realizados usando STRs. Rodrigues e colaboradores (2007) utilizaram os marcadores D3S1358, Vwa, D2S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, TH01, TPOX, D16S539, CSF1PO, D8S1179 e FGA para estudar uma amostra de 325 indivduos da cidade de Belm, formada pela miscigenao de europeus, africanos e amerndios. E concluram que estes marcadores so adequados para a anlise forense bem como para teste de paternidade realizado para a populao amaznica. Wetton e colaboradores (2005) observaram que diferenas marcantes em freqncias allicas Y-SNP entre populaes continentais podem ser usadas para prever a origem biogeogrfica da linhagem ancestral paterna de um homem e que Y-SNP tambm est fortemente correlacionada com a sua aparncia fsica. Segundo Mizuno e colaboradores (2010) as informaes sobre as origens ancestrais e geogrficas das amostras de evidncias biolgicas podem ser teis para investigao criminal e assim diminuir os possveis doadores da amostra. Utilizaram o mtodo para anlise simultnea de sete marcadores biallicos Y-STR (M130, M131, M57, M125, M175, M122 e M134) desenvolvido para aplicao forense. Este mtodo pode ser usado para atribuir um haplogrupo de ambas as amostras degradadas de DNA masculino e amostras de DNA contendo uma mistura de DNA feminino e masculino. Phillips e colaboradores (2007) desenvolveram um sistema multiplex para 34 loci de SNP para a atribuio de origem ancestral, escolhendo marcadores de ascendncia informativo (AIMS) apresentando distribuies de freqncia do alelo altamente contrastantes entre os trs principais grupos de populao Europia, Africana e Asitica. E concluiu que este estudo mostra que, escolhendo SNPs que exibem diferenas

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marcantes na freqncia de alelogrupos entre a populao uma prova prtica forense para atribuir a ascendncia mais provvel e pode ser alcanado a partir de um nico ensaio multiplex.

Discusso e Concluso

No h dvida de que o DNA uma das ferramentas mais poderosas que so utilizadas pelas cincias forenses. H elevada probabilidade de discriminao de que um determinado perfil de DNA obtido de uma amostra seja do indivduo com o perfil correspondente quando comparado com outros perfis genticos. O surgimento de estudos cientficos e questes legais levou formao, em 1989, do National Research Council Committee on DNA Technology in Forensic Science (NRC). Acredita-se que as questes esto na relao da cincia e o direito, e envolvem discusses cientficas e jurdicas na utilizao de evidncias cientficas nos tribunais ou mesmo na dificuldade de acomodar as diferentes tradies nas duas reas. Por isso, a NRC recomendou polticas para qualidade de informaes de perfis genticos, que envolvem desde mtodos de tipagem molecular, formulao e aplicao de protocolos, teste de proficincia, garantia e programas de controle da qualidade, credenciamento de laboratrios, maior financiamento investigao, educao e desenvolvimento, bancos de dados disponveis gratuitamente, dentre outras recomendaes. Estas normas e recomendaes que regem a qualificao necessria para o funcionamento de laboratrios e formao continuada de peritos garantem que os vestgios biolgicos sejam interpretados de maneira correta oferecendo um leque de possibilidades de anlises criminais promovendo, assim, uma formao de convico mais correta por parte do juiz a partir de provas cientficas. O verdadeiro poder do teste de DNA reside no polimorfismo dos loci individuais e o nmero de locus testados (MANAMPERIL et al., 2009). Assim, os marcadores moleculares baseados em DNA podem ser usados como elementos de orientao na anlise de vestgios visando elucidar questes envolvidas em fatos delituosos com fins de justia e de polcia. Ao atender os postulados da unicidade, imutabilidade, perenidade,

classificabilidade e praticabilidade, a identificao humana se faz necessria em circunstncias como desastres em massa, catstrofes, crimes com seco de partes

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corpreas, carbonizao dentre outras. A identificao genmica possibilita informaes sobre a individualidade humana de maneira cientfica.
Agradecimentos Agradeo em especial Sir Alec Jeffreys, John Butler, Gustavo Dalton (Perito Criminal PCDF).

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