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Figura 5.
EnIace fosfodister entre
nucIetidos.
Tema 6. cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Entre el ADN y el ARN, existen tres diferencias claras:
Oel azcar integrante del ARN es la ribosa
Oel ARN contiene uracilo en lugar de timina
Oel ARN est formado por una nica cadena
Adems, existen tres tipos diferentes de ARN, cada uno de los cuales desempea una
funcin diferente, el mensajero (ARNm), el transferente (ARNr) y el ribosmico (ARNr).
Podemos distinguir varios niveles estructurales en los cidos nucleicos. La estructura
primaria o secuencia indica el orden en que se encuentran los nucletidos. La
ordenacin regular y estable que adopten los nucletidos puede denominarse
estructura secundaria, la ms conocida es la estructura de la doble hlice del ADN,
descubierta por Watson and Crick en 1953.
Estructura primaria. Secuenciacin de cidos nucleicos
Una vez definido si el cido nucleico es un ADN o un ARN, la secuencia de
nucletidos o estructura primaria solo vara segn las bases. Por eso un cido
nucleico puede representarse por la secuencia de bases, cada base representa al
nucletido que la porta.
En 1977 se desarrollaron dos mtodos para la secuenciacin de DNA, que nos
permiten secuenciar fragmentos de entre 200 y 400 pb:
O Mtodo de Maxan y Gilbert...............................Hidrlisis qumica parcial
O Mtodo de Sanger, Niklen y Coulson................Sntesis parcial
Para el desarrollo de ambos casos es necesario proceder segn una serie de pasos
comunes.
Secuenciacin de cidos nucleicos etapas comunes a ambos mtodos
-DesnofuroIi;ocion poro seporor Ios hebros deI DMA
-Morcoje deI exfremo deI DMA de formo que puedo visuoIi;orse. MormoImenfe se
morco eI exfremo b' usondo
3Z
P, un rodioisofopo que emife porfcuIos befo.
Reducir el DNA a cuatro sets de fragmentos marcados.
Tema 6. cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Despus se hace una electroforesis de acrilamida de alta concentracin que
permite separar fragmentos de cidos nucleicos que se diferencian tan slo en un
nucletido. El gel de secuenciacin es un gel de poliacrilamida muy largo y muy fino
que se corre a unos 70C para evitar hibridaciones.
En el Mtodo de Maxan y Gilbert esto se consigue dividiendo la muestra de DNA
monocatenario y marcado en cuatro partes. Cada una de estas porciones de
muestra se trata con procedimientos qumicos que permiten la rotura de la cadena
por un tipo de base, eliminando dicha base. Esto genera una serie de fragmentos
que pueden separarse por electroforesis, solo se visualizarn aquellos que
contienen el extremo 5`marcado. Las cuatro porciones de fragmentos que han sido
hidrolizadas para la identificacin de cada una de las cuatro bases que componen el
DNA se someten a electroforesis en 4 calles de un gel de secuenciacin.
El mtodo de Sanger (Figura 6) consiste en hacer la sntesis de la cadena
complementaria en presencia de la DNA polimerasa e introduciendo un nucletido
malo de forma que la polinucleasa termina y no contina la sntesis de la cadena
complementaria. Como nucletido defectuoso suele usarse el dideoxinucletido. El
dideoxinucletido no posee el grupo 3`hidroxilo por lo que no puede enlazarse con
el siguiente nucletido y la sntesis se detiene. La polimerasa necesita un primer,
que se marca con radioactividad o fluorescencia; en la sntesis se utilizan pequeas
cantidades del nucletido defectuoso con lo que la sntesis se ir parando en
diferentes puntos. El resultado, si utilizamos la citosina defectuosa dideoxycitosina,
ser la obtencin de fragmentos de diferente longitud y marcados, terminados en
citosina. Despus de separar los fragmentos en un gel de acrilamida capaz de
diferenciar fragmentos cuyo peso molecular se diferencie en una sola base,
podemos obtener la secuencia complementaria a la cadena que se desea
secuenciar. Al igual que en el mtodo de MaxamGilbert tendremos cuatro porciones
en cada una de las cuales utilizaremos un nucletido "malo, y cada porcin de
fragmentos de oligonucletidos se correr en una calle diferente. El gel se lee
desde abajo, donde estarn los fragmentos ms pequeos y por lo tanto ms
prximos al extremo 5`, hacia arriba; la secuencia leda directamente del gel ser la
complementaria de la cadena que queremos secuenciar.
Tema 6. cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Secuenciacin automtica. La secuenciacin de DNA est realmente automatizada
usando una variante del mtodo de Sanger, en la que los dideoxinucletidos estn
marcados con una cola fluorescente de distinto color. Los cuatro ddNTP se aaden
en el mismo tubo y los fragmentos resultantes se separan por tamao en una
electroforesis capilar (un refinamiento de la electroforesis en gel que es ms
rpida). Todos los fragmentos de un determinado tamao migran por el capilar como
un solo pico y el color asociado a cada fragmento se detecta usando un lser. La
informacin se pasa directamente a un ordenador que determina la secuencia. Esta
tecnologa permite secuenciar miles de nucletidos en pocas horas. El proyecto
genoma humano que acaba de ser completado (Febrero 2001) por la empresa
Celera es el ms ambicioso de los proyectos de secuenciacin que ha secuenciado
35000 genes y unos 3000 millones de pares de bases con esta tecnologa.
Figura 6.
Secuenciacin de cidos
nucIeicos. Mtodo de
Sanger.
Tema 6. cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Estructura secundaria de los cidos nucleicos
Los diagramas de rayos X realizados a principios de los 50 por Rosalind
Franklin y Wilkins, indican que las moIcuIas de ADN son largas cadenas
helicoidales con dos periodicidades a lo largo de su eje. Su anlisis qumico pone
de manifiesto diversos aspectos. La composicin en bases nitrogenadas es la
misma para todas las clulas de una especie. En los ADN, la proporcin molar de
adenina es siempre igual a la de timina, y anlogamente la proporcin molar de
citosina es equimolar con la de guanina. Por lo tanto el nmero total de bases
pricas es igual al de bases pirimidnicas (Regla de Chargaff). Basndose en estos
datos, J. Watson y F. Crick propusieron un modelo estructural para el ADN. La
principal caracterstica de este modelo es que una molcula de ADN consta de dos
cadenas helicoidales de polinucletidos, que a su vez se hallan enrolladas
alrededor de un mismo eje, formando una doble hlice destrgira de cadenas
antiparalelas, como muestra la Figura 7. Las unidades de desoxirribosa y los grupos
fosfato, que forman el esqueleto de las cadenas polinucleotdicas, constituyen la
parte externa de su estructura, mientras que las bases (parte hidrfoba) se sitan de
forma perpendicular al esqueleto carbonado y se encuentran situadas en su interior.
Figura 7.
Estructura deI DNA. Doble
hlice y disposicin espacial
de los componentes
moleculares del DNA.
Tema 6. cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Las dos cadenas, que forman la doble hlice, estn unidas entre s por puentes de
hidrgeno, entre bases especficas de cada cadena. As, la guanina de una cadena
est siempre unida a la citosina de la otra (a travs de tres puentes de hidrgeno), y
la adenina a la de timina (por dos puentes de hidrgeno), como se muestra en la
Figura 8. Esto explicara el que molculas de ADN con mayor % G+C son ms
difciles de separar en hebras. Debido a la gran longitud de la molcula de ADN,
existen numerosos enlaces por puente de hidrgeno entre las dos cadenas, y
aunque este enlace es dbil, hacen que en conjunto el ADN sea una molcula muy
estable. La disposicin de parte hidrfoba hacia el interior y los fosfatos y ribosas
hidrfilos hacia el exterior tambin contribuye a estabilizar la estructura. Las dos
cadenas son antiparalelas. Una en el sentido 5`F 3`y la otra en el sentido 3`F 5`.
Las medidas de la doble hlice son muy concretas y pueden estudiarse por
difraccin de rayos X. La distancia entre las cadenas es constante e igual a 1.9 nm.
Figura 8.
EnIaces entre Ias bases
deI ADN. Puentes de
hidrgeno TA y GC.
Tema 6. cidos nucleicos Bioqumica y Biologa Molecular
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Hay 10.5 nucletidos por vuelta y el paso de rosca son 3.4 nm. Se aprecia un surco
mayor y uno menor.
Este modelo explica bien los procesos de replicacin y transcripcin, y se ha
comprobado experimentalmente su validez, la estructura de Watson and Crick del
DNA se conoce tambin con el nombre de BDNA y es la estructura ms estable,
pero tambin se han caracterizado otras variantes. Algunas secuencias del ADN
adoptan ciertas estructuras inusuales como los palndromes o regiones o simetra
rotacional.