Introduccin Recinteme la actividad acucola, en Chile, ha tenido un desarrollo significativo en el cultivo de especies hidrobiolgicas, promoviendo un desarrollo que aspira

a ser sustentable, mediante un crecimiento econmico y simultneamente, contribuyendo a la equidad en el acceso a sus beneficios, a las sociedades locales, tambin generando oportunidades de empleo, desarrollo de la comunidad, etc. Convirtindose, as en uno de los sectores ms dinmicos e importantes de la economa chilena (Aqua, 2011). Estas ventajas estn ms representadas en la salmonicultura, la que ha mostrado mayor dinamismo y crecimiento, dentro del sector acucola. Presentando, as la mayor produccin y valor de exportacin en la acuicultura Chilena. Por su influencia en diferentes sectores productivos del pas, esta industria se ha transformado en un importante factor en la diversificacin de la economa nacional y un pilar fundamental en la estrategia orientada a transformar a Chile en una potencia mundial en materia de alimentos (Medina et al., 2009). Sin embargo, al aumentar la demanda sobre el salmn, la salmonicultura ha producido una serie de efectos ambientales, especialmente sobre los recursos pesqueros necesarios para elaborar el alimento de los salmones. El cultivo del salmn tiene adems efectos sobre el medio ambiente circundante al lugar donde se realiza la actividad misma, por ejemplo, el escape de salmones de las jaulas, cargas al medio con fosforo y nitrgeno (Buschman et al., 2005). Tales modificaciones, se han generado por las prcticas habituales que se utilizan para el cultivo de peces, impactando en el medio ambiente a travs de distintas formas, como por ejemplo, el uso excesivo de antibiticos, alimento, anti-incrustantes y pesticidas (worldwildlife.org/aquadialogues). Tales antecedentes, sumados al aumento de la biomasa de los cultivos, a las escasas normas de control frente a las patologas, ect., han tenido, como consecuencia la proliferacin de brotes de enfermedades, donde los peces han sido blanco, de patoligias de inters econmico (Cubillos et al., 1990; Surez, 1997) como: la Enfermedad Bacteriana del Rin, (BKD: Bacterial Kidney Disease); el Sndrome Rickettsial Salmondeo, (SRS: Salmonid Rickettsial Septicemia), destacando la Necrosis Pancretica Infecciosa (IPN: Infectious Pancreatic Necrosis); la Anemia Infecciosa del Salmn (ISA: Infectious Salmon Anaemia), y la aparicin de mayores brotes de parsitos, como es el caso del caligus (Caligus rogercresseyi). Como consecuencia de lo anterior, se hizo necesario tomar medidas tendientes al diagnstico de estas enfermedades y a la prevencin de las mismas. As, en el 2004, entra en vigencia, la resolucin N 61 Exenta (leychile.cl) (anexo), donde se aprueba el Programa sanitario especfico, de Vigilancia Activa (PVA), para Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces de cultivo, el que tiene por objeto, establecer los procedimientos que se debern aplicar en los centros de cultivo de peces, para obtener informacin sobre el estado sanitario de las especies.

En 2008, se adoptaron medidas de contingencia, frente la aparicin de brotes de ISA en la X y XI Regiones. A objeto de disminuir la incidencia y prevalencia de la enfermedad, su aislamiento geogrfico o la eliminacin de la misma y de su agente causal. Para proteger el patrimonio sanitario del pas, en octubre del mismo ao, se dicta la Resolucin N 2638 (anexo), en donde se establece un programa sanitario especfico de vigilancia y control del ISA (Sernapesca, 2009. Evaluacin de un sistema de control de la bioseguridad para monitorear en lnea factores de riesgo en la propagacin de enfermedades en la futura actividad salmonera). Estos anlisis, estn compuestos por tcnicas y procedimientos, para el diagnostico de enfermedades que afectan a los peces, autorizados por la OIE (Organizacin Mundial de Sanidad Animal), entre las cuales se encuentran tcnicas tales como, la Inmunofluorescencia indirecta (IFAT: Indirect Fluorescent Antibody Technique), Enzima inmunoensayo (ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay ) (Sernapesca3, 2009) y procedimientos de anlisis oficial, como la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR: Polymerase chain reaction) (Sernapesca2, 2009). La aplicacin de estas tcnicas, estn a cargo de laboratorios acreditados y certificados por l, Sistema Nacional de Acreditacin del Instituto Nacional de Normalizacin (INN), el que utiliza como criterio internacional la Norma Chilena ISO17025.Of2005 (anexo..), que tiene por objetivo, la acreditacin de los laboratorios en cada una de las reas de ensayo, y la acreditacin de los laboratorios de calibracin en cada una de las magnitudes. Desde esta perspectiva, se ha fortalecido la regulacin sanitaria y ambiental, teniendo en cuenta las densidades de cultivo por especie. Reglamentando as, medidas de proteccin medioambiental, para que los productores acucolas, operen en niveles compatibles con las capacidades de carga de los cuerpos de agua lacustres y martimos. Antecedentes necesarios para consolidar el resurgimiento de la industria acucola, tareas prioritarias de la Subsecretara de Pesca (Panorama Acucola, 2011). Considerando lo anterior, en el presente Informe de Prctica Profesional Final, se entregan antecedentes, de las actividades efectuadas en el rea de necropsia del laboratorio AquaGestion S.A. en la Regin de Aysn, especficamente referidos a los protocolos tendientes a la identificacin de hallazgos macroscpicos anatomopatolgicos y la toma de muestras para, programa sanitario de contingencia (ISA), programa de vigilancia activa (Alphavirus) e IPN.

Objetivo General. Describir y caracterizar los procedimientos efectuados en el Laboratorio de AquaGestion S.A., con relacin a la toma de muestras de tejido y anlisis de informacin asociada con la identificacin macroscpica de enfermedades infectocontagiosas en peces. Objetivos Especficos Descripcin de tcnicas de toma de muestras e identificacin de patgenos. Describir actividades asociadas con la elaboracin de informes y emisin de certificados. Describir y Detallar los procedimientos en las normas de bioseguridad de la empresa.

Metodologa De acuerdo a la informacin recopilada y la experiencia adquirida durante la Prctica Profesional Final, el presente informe se desglosa de la siguiente manera: I. Antecedentes Generales de la Empresa; II. Tcnicas y Procedimientos para el anlisis de enfermedades en el Laboratorio; III. Actividades efectuadas en el rea de Necropsia.

I.- Resea de la Empresa.(REDACTAR) Fundacin Chile creo unidades de negocios partiendo con Aquagestion en el rea de patologa y diagnstico alrededor del ao 2000. Alrededor del 2001 2002 se cre la unidad de GCL filial de fundacin Chile, con laboratorio de microbiologa, qumica, rea de capacitacin. En el 2005, se unificaron estas unidades de negocio en una sola, Aquagestin S.A. y Aquagestin Capacitacin S.A., y en el 2007 pasan a ser parte ntegra de Recalcine y dejamos de ser filial de Fundacin Chile. En mayo del 2009, se crea el Laboratorio de diagnostico de la empresa Aquagestin S.A, que dispone de tres reas de anlisis; El rea Necropsia, Microbiologa y Biologa molecular. Las cuales estn divididas por sub-Laboratorios. (Ver. Tabla. 1)

Tabla 1. Se indican las diferentes Sub-Laboratorio de diagnstico, de la empresa Aquagestion S.A

II.- Tcnicas y Procedimientos para el anlisis de enfermedades en el laboratorio. Las muestras que son derivadas al laboratorio, para su posterior anlisis, vienen con una ficha de ingreso y derivacin de muestras (anexo). En donde se describe los antecedentes, de la empresa y los anlisis solicitados por esta. Posteriormente, se verifica la calidad de la muestra y que corresponda a lo sealado en la ficha de ingreso. Se describen las tcnicas utilizadas por el laboratorio de Aquagestion S.A, Tinciones, IFAT, Test de ELISA, PCR, e Histologa. en Aysen:

1) Tcnicas a) Tincin de Gram. Esta tcnica de tincin de Gram, se realiza en el rea de Microbiologa, el cal, permite identificar la morfologa de la clula bacteriana en bacilos gram positivos y gram negativos segn la estructura de su pared celular Esta tcnica se basa, en la diferenciacin estructural de la pared celular de las bacterias, caracterstica dada por la presencia o ausencia de un compuesto llamado Pptido Glicano. En una primera etapa, se utiliza una solucin de Cristal violeta, la cual difunde al interior de la clula tindola de color azul. Si la bacteria posee Pptido Glicano, en su pared celular, disminuye la permeabilidad de la clula, por lo cual, al ser sometida a la accin de una solucin decolorante, este compuesto no permite la salida del Cristal Violeta de la bacteria (Gram positiva). Si por el contrario, no posee Pptido Glicano, en su pared, su permeabilidad aumenta permitiendo la salida del primer colorante y su posterior tincin con el segundo colorante, Safranina, por lo que la bacteria se ve de color rojo (Gram negativa).

De esta manera, se pueden diferenciar bacterias gram positivas y gran negativas, como sigue (tabla.. ).

BACTERIAS GRAM POSITIVAS Poseen una pared celular interna y una pared de peptidoglucano. *Peptidoglucano: es un exoesqueleto que da consistencia y forma esencial para replicacin y supervivencia de la bacteria. No tiene membrana externa

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Poseen una pared celular ms compleja: -pared celular interna -pared de peptidoglucano - bicapa lipdica externa

Membrana externa: forma un saco rgido alrededor de la bacteria, mantiene estructura y es barrera impermeable a macromolculas, ofrece proteccin en condiciones adversas Espacio periplasmtico: espacio entre la

No tiene espacio periplasmtico

superficie

externa

de

la

membrana

citoplasmtica y la interna de la membrana externa. La red de murena est muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas La penicilina mata a las gram positivas, ya que bloquea la formacin de enlaces peptdicos entre las diferentes cadenas del peptidoglucano No contiene LPS La penicilina no mata a las Gram negativas, a causa de la capa de lipopolisacridos situada en la parte externa de la pared celular. Contiene LPS: estimulador de respuestas inmunes: activa clulas B, liberacin de IL, FNT, IL 6 por macrfagos. En la tincin de Gram, retienen la tincin azul Conservan el complejo yodocolorante Quedan decoloradas. Pierden el complejo yodocolorante Pueden ser anaerobios o aerobios Son esporulantes y no esporulantes, como Streptococcus, respectivamente. Poseen otros componentes: cidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacridos complejos. Poseen elevadas. protenas con concentraciones Cisteria, Frankia, La red de murena presenta una sola capa

b. Inmunofluorescencia indirecta (IFAT). La determinacin de muestras infectadas, en el rea de microbiologa, tambin se puede realizar mediante la Inmunofluorescencia Indirecta.Se aplica a todas los frotis de muestras de rganos tales como rin, bazo, hgado, cerebro, lesin, entre otros. Es una tcnica de observacin, que utiliza un anticuerpo especfico de la poblacin que se va a analizar y un segundo anticuerpo, que reconoce el primero, unido a una sustancia fluorecente. El proceso consta de dos etapas: en la primera, se fijan sobre un portaobjetos, los antgenos que constituyen el substrato conocido especfico (clulas que contiene

virus, parsito, bacterias, etc.) sobre l se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos especficos, si la reaccin es positiva se dar formacin de complejo antgenoanticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado. En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina marcada, que reaccionar con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene

as: de una mezcla de varios sueros normales, se precipitan las globulinas (anticuerpo), estn globulinas son inoculadas a un organismo (antgenos), el organismo producir antiglobulinas que se marcan con fluorescena o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se unir al anticuerpo no marcado de la primera etapa que en este momento se puede considerar como un antgeno, dando reaccin positiva de fluorescencia.

c. Test de ELISA. La tcnica de ELISA, es un procedimiento de ensayo inmunoenzimtico, cuyo nombre resulta de la asociacin de las iniciales de su denominacin inglesa (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay). Primeramente fue usado en medicina humana y recientemente, ha sido empleado para el diagnstico de muchas enfermedades de animales, incluyendo virus, bacterias, micoplasmas, parsitos, micotoxinas, deteccin de drogas, hormonas, protenas, etc., volvindose un procedimiento frecuente de laboratorio, escogido para monitorear anticuerpos y antgenos en poblaciones de peces. La tcnica es simple, especfica, sensible, rpida, automatizada y permite trabajar con una gran cantidad de muestras al mismo tiempo. Es una reaccin serolgica, que se basa en el uso de antgenos y anticuerpos marcados con enzimas. El test de ELISA, comprende de 4 fases: 1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica. 2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o

antgenos se realiza con facilidad a la superficie de los pocillos tratados que tienen gran afinidad por las protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa. 3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido

a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la interaccin antgeno-anticuerpo y el color no ser

evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgeno-anticuerpo tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todas las

molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra. El producto colorimtrico formado puede ser visualizado o medido con el auxilio de un fotocolormetro o de un espectrofotmetro (Abbas y col., 1997).

d).- Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). La reaccin en cadena de la polimerasa, ya ms conocida como PCR, es una tcnica que permite replicar, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodologa a la investigacin bsica en biologa molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requera largas y tediosas jornadas. El principio bsico de la PCR es, mediante la DNA polimerasa, que realiza la extensin del partidor utilizando la cadena complementaria como molde. Se basa, en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalizacin". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucleridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucletidos, a los que se denomina "partidores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonuclesidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer paso est condicionada por aqulla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers. En el caso de virus ARN, es necesario que el material gentico sea convertido en ADN complementario por la enzima Transcriptase Reversa (RT-PCR), antes de iniciar el proceso de PCR (Madigan y col, 2000).

Para el caso de virus, el procedimiento se aplicar a muestras de RNA purificado, a partir de muestras provenientes de rin, fluido ovrico, fluido seminal, sangre y/o alevines, provenientes de especies hidrobiolgicas. Los virus producen copias de DNA complementario a partir de RNA usado como molde. El hbrido cDNA-RNA es desnaturado a alta temperatura para separar las hebras, los partidores se aparean, luego el partidor es extendido por el enzima Taq DNA Polimerasa, constituyndose en una copia complementaria del cDNA molde. Este proceso de denaturacin, apareamiento y extensin conforman un ciclo que se repite un determinado nmero de veces, obtenindose en cada ciclo el doble de copias del ciclo anterior. Y para bacterias es aplicable a todo el material gentico (DNA) extrado de los diferentes tejidos (e.g rin, bazo, cerebro, entre otras.), proveniente de especies hidrobiolgicas.

III. Actividades efectuadas en el rea de Necropsia. Para familiarizarse y adquirid conocimiento, en los procedimientos que se realizan, en la determinacin de las patologas, se procede a una induccin, de todas las reas de anlisis y obtencin de las muestras. En el rea de Necropsia, en donde se realiza un examen anatomopatolgico, de los peces, mediante la observacin y posterior descripcin de la presencia de hallazgos relevantes, vistos en rganos externos e internos. Obtenida todas las observaciones externas e internas del pez, se toma las muestras de estos, para su posterior anlisis en las distintas reas. El proceso de obtencin de muestra consta de las siguientes actividades: a) Limpieza y sanitizacin de superficies de trabajo; b) Anlisis Morfomtrico del pez; c) Descripcin macroscpica de los hallazgos externos de los peces; d) Descripcin macroscpica de los hallazgos internos de los peces; e) Obtencin de la muestra, para anlisis.

a.

Limpieza y sanitizacin de superficies de trabajo.

Antes de realizar cualesquier actividad en el rea de trabajo, se procede a verificar temperatura del laboratorio, la que debe tener, temperaturas inferiores a 16 C, para as seguir la cadena de frio y mantener preservada la muestra. Las ventanas y puertas deben ser mantenidas cerradas hermticamente para reducir al mnimo las corrientes. La actividad se registra en el registro RITE DPAY - 01 - 04 de este documento. (Anexo.) Transcurrido a la verificacin de la temperatura, se procede a sanitizar todas las superficies, para prevenir una contaminacin cruzada. El piso se barre inicialmente para eliminar el polvo y otras suciedades, luego se limpia con un pao para piso hmedo con agua tibia y detergente. Se sanitiza con solucin de hipoclorito de sodio (0,1%) (Esto lo realiza el personal de aseo, antes de ingresar al rea). Los mesones se limpian, con una solucin de VirkonS (1%), se deja actuar por mnimo 5 minutos y se saca el exceso con una toalla absorbente. Posteriormente se roca alcohol (70%). La actividad se registra en el registro de Limpieza y sanitizacin de las superficies de trabajo. (Anexos..)

El personal al ingresar al rea de extraccin, tiene que estar con la indumentaria, es cubre calzado, cubre cabello, guantes y mangas desechables siempre que se procesen muestras. Mascarilla durante la extraccin o preparacin de muestras destinadas a procesamiento bacteriano y celular. Para el manejo de muestras de mayor tamao (peces de ms de 1 kg u otro) se debe utilizar delantal desechable. Se establece que las mangas, guantes y delantales plsticos se deben cambiar y desechar entre casos o segn necesidad durante el caso.

b.

Anlisis Morfomtrico del pez.

Al ingresar las muestras, se observa, si estas, vienen en las condiciones adecuadas para su previo anlisis, en particular, respecto a la temperatura que se registra en el muestreo. Se verifica con un termmetro de laser (fig..), garantizando la mantencin de la cadena de frio, desde el centro en donde se obtienen los peces para muestrear, hasta el laboratorio. Este no debe exceder los 10C, ya que esta es la temperatura permitida. Para mantener dicha temperatura las muestras son enviadas en coleman, que contienen gelpacks, previamente congelados. Una vez tomada la temperatura, se procede a realizar la planilla de muestreo, donde quedara certificado que se realizo el proceso (Vase anexo (16.1 y 16.3)). Para el manejo de muestras, se debe utilizar delantal desechable. Se establece que las mangas, guantes y delantales plsticos se deben cambiar y desechar entre casos o segn necesidad durante el caso. Luego de la desinfeccin del rea y los materiales de trabajo se procede a determinar la longitud del pez en forma individual con ayuda de una regla metlica, con divisin en milmetros y a pesar los peces individualmente. Teniendo en cuenta dos puntos de referencia: b.1).- Punto de inicio o punto cero: la boca del pez. b.2).- Punto final: el ngulo de la horquilla de la Aleta Caudal.

El peso se determina una balanza de precisin, utilizando el siguiente criterio: Peces hasta 600 g, utilizar balanza de 0,1 600 g. Peces desde 600 g, utilizar balanza de 0 15 Kg.

Se ubica el pez sobre el papel kraft, posicionando la cara lateral derecha sobre la zona de trabajo, de tal manera que la cabeza del pez quede hacia la izquierda y la aleta caudal hacia la derecha. El orden de los peces se determina por el primer pez a disponer sobre el papel, el cul debe ser ubicado en el ngulo superior izquierdo, y los siguientes peces en orden descendente.

c.

Descripcin macroscpica de los hallazgos externos de los peces.

En la descripcin macroscpica, se realiza la evaluacin del aspecto externo del organismo, observando el estado de los ojos, las aletas, la presencia de hemorragias, parsitos externos, abultamiento abdominal, lesiones externas producidas por otros peces, pjaros o el mismo manejo, entre otros. Las descripciones de los hallazgos externos se anotan en el registro de examen anatomopatolgico de peces (anexo).

A su vez, se debe considerar que algunos aspectos del organismo que pueden parecer las causas de su muerte, y ser producto ocasionadas luego de que el organismo ya estaba fallecido (lesiones post-mortem). Por ejemplo puede haber rasgos de canibalismo por parte de los dems organismos de la misma especie o aves cuando el pez se encontraba flotando en superficie. Para obtener la descripcin de la branquias, se cortar los oprculos a fin de dejar las visibles, as examinando su coloracin. En el momento en que se termina de estudiar el organismo externamente, se toman todos estos datos por escrito y dems; se puede comenzar con las incisiones a fin de tomar muestras para los diferentes anlisis.

d.

Descripcin macroscpica de los hallazgos internos de los peces.

Realizada la descripcin de hallazgos externos, se procede a desinfectar el pez al momento de realizar la apertura de la ventana de necropsia, a excepcin de muestras para frotis fresco y tincin Gram de piel. La apertura en ventana consiste en realizar una incisin con el bistur en la zona ventral del organismo (Ver Fig. 1), Realizando un primer corte, el que se realiza desde la zona anal subiendo por el dorso lateralmente (desde el ano hasta el oprculo), sin sobrepasar la lnea lateral. Y un segundo corte, que va entre el oprculo y la aleta pectoral, abriendo as la ventana de necropsia. Una vez abierto se debe observar tamao, forma y color del bazo, el rin, el hgado, el corazn, las gnadas (y tambin su estado de desarrollo). Por otro lado se deben estudiar la presencia o ausencia de ascitis (lquido en la cavidad abdominal), y a su vez si esta ascitis es de lquido transparente o sanguinoliento. Tambin debe comprobarse la existencia de hemorragias en los msculos, ndulos en los rganos, parsitos musculares y del sistema digestivo. Luego de realizada toda la observacin, anlisis primario y toma de datos por escrito, se comienza la toma de muestras para los dems estudios.

Fig. 1. Esquema del ingreso a la cavidad abdominal para anlisis anatomopatolgico en un pez con simetra bilateral.

En la diseccin del crneo, se procede a desinfectar la zona de superior de la cabeza con ayuda de una solucin de alcohol al 70%. Realizando un corte longitudinal, con ayuda de un bistur,

partiendo desde el borde lateral externo de la cabeza, pasando por sobre la rbita del ojo, de manera de eliminar la parte superior sea del crneo. (Fig. 2) Se expone el cerebro, levantando la capa sea con ayuda de una pinza.

Fig. 2. Esquema de Diseccin del Cerebro en el anlisis anatomopatolgico en un pez con simetra bilateral.

e.

Obtencin de la muestra, para anlisis.

Las muestras destinadas para anlisis histolgicos se obtendrn a partir de peces vivos o con pocos minutos de muertos. La seccin del tejido u rgano que se desea analizar, debe ser obtenida con ayuda de una pinza y de un bistur con hoja nueva, de manera de evitar los desgarros o sangrado excesivo y debe ser manipulada de tal manera de evitar tiramientos o compresiones de los rganos que puedan alterar su estructura. Estas sern obtenidas por rgano y debern tener como mximo 0.5 cm. de grosor y 1.5 cm de largo o ancho. En la obtencin de muestras de rganos para anlisis virales para anlisis deben ser tomadas, de acuerdo al tipo de muestra: P.V.A. (Alphavirus), Contingencia ISAv, IPNv.