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Extraccin y ensayo de la actividad invertasa de levadura de panadera

Manuel Tena Aldave, Jess V. Jorrn Novo
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

En la presente prctica se llevar a cabo la extraccin y ensayo de la actividad invertasa de levadura de panadera, utilizando como material de partida un preparado liofilizado de levadura comercializado por la casa Sigma. La velocidad de reaccin se determinar analizando la cantidad de azcares reductores formados (D-glucosa + D-fructosa, expresadas como equivalentes de glucosa) producida por unidad de tiempo y la actividad enzimtica se expresar como actividad especfica (p.e. kat mg-1 de protena). A tal fin, la cantidad de azcares reductores se determinar colorimtricamente por el mtodo del cido dinitrosaliclico, y la cantidad de protena presente en el extracto enzimtico se analizar por el mtodo de Bradford. Eventualmente se considerar un protocolo de purificacin parcial de la actividad extrada, mediante precipitacin con sulfato amnico. Palabras clave: azcar invertido, -D-fructofuranosidasa; Saccharomyces cerevisiae. Abreviaturas empleadas: BSA, seroalbmina bovina; DNS, cido 3,5dinitrosaliclico.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS La invertasa (-D-fructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa, EC 3.2.1.26), cataliza la hidrlisis de restos terminales no reductores -Dfructofuranosdicos de fructofuransidos. Entre los sustratos sobre los que acta el ms significado es, sin duda, la sacarosa, de ah que el enzima se designe con el nombre de sacarasa. La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la reaccin son conocidos desde antiguo como azcar invertido ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrlisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotacin ptica. Sacarosa ([]D= +66,5) + H2O D-glucosa ([]D= +52,5) + D-fructosa ([]D= -92) La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel
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importante en el catabolismo de fructanos y ms especficamente en el de la sacarosa, en especial en aquellos organismos en los que dichos azcares son utilizados como fuente de carbono y energa. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran inters tanto desde un punto de vista acadmico como de investigacin aplicada, siendo uno de los enzimas ms conocidos. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cintica se estudi en profundidad (estudios clsicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente. Para la determinacin de la actividad invertasa se utilizar un ensayo indirecto en el que los productos de reaccin sern detectados espectrofotomtricamente tras su conversin en derivados coloreados. En concreto, la extensin de la hidrlisis enzimtica de sacarosa (azcar no reductor) en glucosa ms fructosa (azcares reductores) se valorar mediante uno de los diversos mtodos existentes para la estimacin de azcares reductores. Nos referimos exactamente al mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), el cual se basa en la reduccin del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570 nm.

cido 3,5-dinitrosaliclico (amarillo)

D-Glucosa

cido 3-amino-5-nitro saliclico (rojo)

cido D-glucnico

En la presente Prctica aplicaremos el mtodo DNS a una gama de soluciones patrn de glucosa, al objeto de obtener la correspondiente curva de calibrado que, posteriormente, se utilizar bien directamente, o mediante el coeficiente de extincin deducido de la misma, para determinar los equivalentes de glucosa formados en el medio de reaccin de la invertasa y, a partir de ellos, la actividad enzimtica. Adems, para el anlisis de protenas de los extractos de invertasa, al objeto de determinar la actividad especfica de stos, se obtendr asimismo una curva de calibrado de BSA mediante la aplicacin del mtodo colorimtrico de Bradford (Bradford, 1976). Los objetivos de la Prctica son los siguientes: Construccin de una curva de calibrado y clculo del coeficiente de extincin molar para la determinacin de azcares reductores (glucosa) por el mtodo del DNS. Construccin de una curva de calibrado y clculo del coeficiente de extincin molar para la determinacin de protenas por el mtodo de Bradford.

Preparacin de un extracto de levadura de panadera a partir de un preparado liofilizado. Ensayo de la actividad invertasa y determinacin del contenido en protena del extracto crudo de levadura de panadera. Purificacin de la actividad invertasa cida extrada por precipitacin selectiva con sulfato amnico Evaluacin de la purificacin: clculo del rendimiento y del grado de purificacin de las fracciones 2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 2.1. De uso general Agitador magntico Balanza (sensibilidad de 1 mg) Baos termostticos (5) Bloque seco o bao de agua hirviendo Centrfuga preparativa Espectrofotmetro/Colormetro Homogeneizador pH metro Acetato sdico cido actico Amonio sulfato (slido) Columna de Sephadex G-25 para desalado (Columna PD-10) D-Glucosa Nescofilm Preparado liofilizado de invertasa de levadura Reactivo de Bradford Reactivo de DNS cido 2,3-dinitrosaliclico Tartrato sdico potsico Hidrxido sdico Sacarosa Seroalbmina bovina 2.2. De uso especfico por grupo Botes de plstico para muestras biolgicas Cubetas de plstico para el espectrofotmetro (6) Frasco lavador para agua desionizada Gradilla con tubos de ensayo de 15x1,5 cm Gradilla con tubos de ensayo de tapn de rosca 9,5x1 cm Guantes de ltex Juego de pipetas automticas (0,01; 0,1 y 1,0 ml) Juego de pipetas de vidrio (0,1; 0,5; 1,0 y 5,0 ml) Papel de filtro Pipetas Pasteur de plstico Probetas de 10, 100 y 250 ml
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Rotulador de vidrio Vasos de precipitado de 50, 100 y 250 ml Tijeras 3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Curva de calibrado de glucosa utilizando el mtodo del DNS A partir de una solucin stock de glucosa 40 mM y por dilucin con agua destilada, preparar una gama de soluciones del azcar de distinta concentracin, tal y como se indica en la Tabla 1. Hacer las diluciones en tubos de ensayo. Una vez hechas las mezclas, agitar bien para homogeneizar la solucin.
Tabla 1. Preparacin de una gama de soluciones de glucosa de diferente concentracin a partir de una solucin stock 40 mM. Concentracin Agua destilada Glucosa 40 mM Tubo (mM) (ml) (ml) 0 0 5,0 0,0 1 2 4,75 0,25 2 4 4,5 0,5 3 6 4,25 0,75 4 8 4,0 1,0 5 10 3,75 1,25 6 20 2,5 2,5 7 40 0,0 5,0

De cada tubo se toman 0,1 ml y se transfieren a un tubo de vidrio con tapn de rosca. Aadir 1 ml del reactivo DNS, incubndose posteriormente la mezcla en el bloque seco a 100 C durante 10 minutos; enfriar y determinar la absorbancia a 570 nm, utilizando como blanco la mezcla del tubo 0. En el caso de que la absorbancia de alguna muestra resultase excesiva, diluir convenientemente con agua destilada, mientras que si fuera demasiado pequea, repetir el ensayo pero con una mayor cantidad de solucin de glucosa (p. ej. 0,2 0,3 ml). Para mayor fiabilidad de los resultados, trabajar por duplicado. 3.2. Curva de calibrado de BSAmediante el mtodo de Bradford A partir de una solucin de BSA 20 g ml-1 en agua destilada y por dilucin en agua, preparar una gama de soluciones de diferente concentracin de BSA, segn se indica en la Tabla 2. Hacer las diluciones en tubos de ensayo.
Tabla 2. Preparacin de una gama de soluciones de BSA De diferente concentracin a partir de una solucin stock de 20 g ml-1. Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 Agua 2,0 3,6 3,2 2,8 2,4 2,0 1,0 0,0 (ml) -1 BSA (20 g ml ) 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 3,0 2,0 (ml) -1 Concentracin (g ml ) 0 2 4 6 8 10 15 20 de las soluciones patrn de BSA obtenidas 4

A 0,5 ml de la solucin de BSA de diferentes concentraciones, preparadas segn se ha indicado en la Tabla 2, aadir 0,5 ml del reactivo de Bradford (hacer la mezcla en la misma cubeta de medida del espectrofotmetro). Agitar la mezcla (por inversin de la cubeta, una vez se ha tapado con nescofilm) y transcurridos unos 10 minutos determinar la absorbancia a 595 nm frente al blanco (tubo 0). 3.3. Obtencin de un extracto crudo de invertasa de levadura de panadera Suspender 1 g de preparado liofilizado de levadura en 200 ml de tampn de extraccin (tampn acetato 0,1 M, pH 5,0, en NaCl 0,5 M). Agitar la mezcla durante 15 min (puede ayudarse la extraccin mediante sonicacin de la suspensin u homogeneizacin de la misma), centrifugar y tomar el sobrenadante como extracto enzimtico. El extracto enzimtico, cuando no se est utilizando, se guardar en fro (frigorfico). 3.4. Ensayo de la actividad invertasa del extracto crudo Preparar en tubos de ensayo las mezclas de reaccin (4 en total, 1 blanco de sustrato, 1 blanco de enzima y 2 problemas) que se indican en la Tabla 3.
Tabla 3. Mezcla de ensayo estndar para la determinacin de la actividad invertasa. Blanco Problema Componentes (x2) De sustrato De enzima Sacarosa 0,2 M 0,0 1,0 1,0 (ml) Tampn acetato 0,1 M, pH 5,0 2,0 2,0 2,0 (ml) Agua destilada 2,0 1,1 1,0 (ml) Extracto enzimtico 100,0 0,0 100,0 (l)

Los tubos con los blancos y problemas se incubarn a 55 C durante 15 minutos, para que la actividad invertasa presente en el extracto hidrolice la sacarosa. Pasado el periodo de incubacin, detener la reaccin sumergiendo los tubos en un bao de hielo picado. Tomar 0,1 ml de cada tubo y pasarlos a tubos de ensayo con tapn de rosca, analizndose el contenido de azcares reductores por el mtodo DNS (ver apartado 3.1). A partir de los valores de absorbancia de los ensayos problema, descontados el valor de los blancos, determinar la actividad invertasa del extracto. En el caso de que la absorbancia fuera muy pequea, repetir el ensayo DNS con una mayor cantidad de muestra de incubacin (por ejemplo 0,2 0,3 ml). En el caso de que la absorbancia sea excesiva, repetir la experiencia diluyendo el extracto enzimtico convenientemente (dilucin 1:2 1:3, etc.). 3.5. Precipitacin con sulfato amnico Dos alcuotas de 20 ml de extracto crudo se llevarn, respectivamente, al 40% y 80% de saturacin con sulfato amnico. La sal se aadir en forma finamente pulverizada y con agitacin para favorecer su disolucin. Una vez que se haya disuelto la sal, dejar en reposo y en fro durante 45 min. Pasado
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este tiempo, separar por centrifugacin el precipitado obtenido del sobrenadante, anotando el volumen de ste. Los pellas P1 (40% saturacin) y P2 (80% saturacin) se redisolvern en un volumen determinado (entre 5 y 10 ml) de tampn acetato 0,1 M (pH 5,0). Una vez completada la redisolucin, medir los volmenes obtenidos.

3.6. Desalado de las fracciones proteicas y anlisis de las mismas Alcuotas de 2,5 ml de cada una de las cuatro fracciones proteicas obtenidas de la precipitacin con sulfato amnico (soluciones de P1 y P2, y los sobrenadantes de tales precipitaciones, respectivamente S1 y S2) se desalarn mediante cromatografa en columna de Sephadex G-25 (columna PD-10), que se realizar de acuerdo con las instrucciones siguientes: 1. Retirar la tapa superior de la columna y verter el exceso de lquido 2. Retirar el tapn inferior 3. Pasar por la columna 25 ml de tampn acetato 0,1 M (pH 4,5) para equilibrarla 4. Aplicar a la columna 2,5 ml de la muestra a desalar, e incorporar este volumen a la columna, desechando el eluyente 5. Una vez incorporada la muestra en la columna, eluir con 3,5 ml de tampn, recogiendo ese volumen de eluyente 6. Lavar la columna con 25 ml de tampn de elucin 7. Aadir 2 ml de tampn y tapar los extremos superior e inferior de la columna Las muestras ya desaladas se analizarn para actividad invertasa y contenido de protena. Con estos valores se construir una tabla de purificacin, tal como se indica en la Tabla 2.
Tabla 4. Purificacin de la actividad invertasa de levadura. Fraccin Extracto crudo P1 P2 S1 S2 Vt (ml) V1 V2 V3 V4 V5 Actividad (nkat) A1 A2 A3 A4 A5 Protena (mg) P1 P2 P3 P4 P5 Rendimiento (%) 100 100(A2/ A1) 100(A3/ A1) 100(A4/ A1) 100(A5/ A1) Actividad especfica (nkat/mg) A1/ P1 A2/ P2 A3/ P3 A4/ P4 A5/ P5 Purificacin 10 [A2/ P2]:[A1/ P1] [A3/ P3]:[A1/ P1] [A4/ P4]:[A1/ P1] [A5/ P5]:[A1/ P1]

4. RESULTADOS ESPERADOS Las Figuras 1 y 2 muestran resultados representativos correspondientes a las curvas de calibrado de azcares reductores y protena, respectivamente.
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Azcares Reductores: DNS

1,2 y = 0,0283x + 0,0028 1 0,8 A570 0,6 R = 0,9985
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[Glucosa] (mM)
0 2 4 6

A570
0,00 0,040,01 0,100,01 0,170,02 0,240,02 0,310,03 0,580,06 1,120,08

0,4

8
0,2

10
0 0 10 20 30 40 50

20 40

[Glucosa] (mM)

Figura 1. Curva patrn para el anlisis de glucosa por el mtodo de DNS. Muestras (0,1 ml) conteniendo las concentraciones de glucosa indicadas en la Tabla inserta recibieron 1 ml de reactivo de DNS y, tras calentamiento a 100 C durante 10 min, se analizaron espectrofotomtricamente a 570 nm. Los valores representados son medias DE de muestras por duplicado de seis experiencias independientes.

De la Figura 1 puede concluirse que se cumple la ley de Lambert-Beer en todo el rango (0-40 mM) de concentraciones de glucosa ensayado, pudindose deducir un coeficiente de extincin molar (m) de 0,0283 mM1cm1.
Protena: Bradford
0,6 y = 0,0261x + 0,0448 0,5 0,4 A595 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 [BSA] (ug/ml) R = 0,974
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[BSA] (g ml-1)
0 2 4 6 8 10 15 20

A595
0,00 0,080,02 0,160,02 0,230,02 0,280,03 0,330,03 0,450,04 0,530,05

Figura 2. Curva patrn para el anlisis de protena por el mtodo de Bradford. Muestras (0,5 ml) conteniendo las concentraciones de BSA indicadas en la Tabla inserta recibieron 0,5 ml de reactivo de Bradford y, tras mezcla y reposo durante 10 min, se analizaron espectrofotomtricamente a 595 nm. Los valores representados son medias DE de muestras por duplicado de nueve experiencias independientes.

De la Figura 2 puede concluirse que, de forma menos satisfactoria que en el caso anterior, se cumple la ley de Lambert-Beer en todo el rango (0-20 g ml1) de concentraciones de BSA ensayado, pudindose deducir un coeficiente de extincin especfico (s) de 0,0261 g1 ml cm1.
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Para el extracto crudo, el ensayo de actividad correspondiente a un experimento tipo origin lecturas de A570 de 0,81 0,08 (frente al blanco de sustrato) y de 0,77 0,04 (frente al blanco de enzima). Usando la media de ambos valores, la actividad del extracto puede cifrarse en 11267,4 nkat ml-1. Para la determinacin de protena, 25 l del extracto crudo anterior, tras su dilucin a 0,5 ml con agua desionizada, produjo en el ensayo de Bradford una lectura de A595 de 0,35 0,02. De los datos anteriores se deduce una actividad especfica del extracto de 5,42 kat Kg-1 protena. 5. DISCUSIN Y COMENTARIOS La prctica tiene como finalidad la estimacin de la actividad invertasa total y especfica del extracto de levadura, expresndose tales valores de actividad en unidades apropiadas. En segundo lugar, pretende explorar la utilidad de la precipitacin fraccionada con sulfato amnico como mtodo de purificacin preliminar de la invertasa extrada y sugerir, a partir de los resultados de fraccionamiento obtenidos (Tabla 4), posibles mejoras en el protocolo de fraccionamiento. Como aspectos tericos a ser desarrollados por los alumnos, como complemento de la prctica, se podran apuntar los siguientes: 1. Poder reductor de los azcares: Consideracin de las caractersticas estructurales de los azcares reductores y no reductores, ilustrando con ejemplos concretos de azcares de uno y otro tipo. 2. Pruebas de azcares reductores: considerar el fundamento de al menos dos adicionales a la del DNS utilizada en la prctica. 3. Fraccionamiento de protenas por precipitacin de protenas con sulfato amnico: fundamento de la tcnica. 4. Filtracin molecular: descripcin de la tcnica y de sus posibles aplicaciones. Mtodos alternativos de desalado a la filtracin molecular. 5. Diferencias entre ensayos enzimticos directos, indirectos y acoplados. Como aspectos prcticos complementarios, a considerar como puntos de estudio adicionales en el desarrollo de la prctica, se podran indicar los siguientes: 1. Espectro de absorcin en el visible de los productos de reaccin de la glucosa con el reactivo DNS. Discusin de a qu longitudes de onda podra realizarse el ensayo DNS de azcares reductores y si la utilizada en la prctica (570 nm) parece apropiada y por qu. 2. Como aditivos opcionales al reactivo DNS suelen emplearse sulfito sdico (0,5 g l-1) y fenol (hasta 2 g l-1). El primero elimina el oxgeno disuelto, que se ha descrito que puede interferir con la oxidacin de la glucosa por el DNS. El segundo se ha indicado que intensifica la intensidad del color desarrollado, incrementando la sensibilidad del mtodo. En consecuencia, se podra comparar el reactivo DNS estndar con DNS+Sulfito o DNS+Fenol, en el primer caso frente a soluciones de glucosa aireadas y en el segundo caso frente a

soluciones diluidas, discutindose las posibles ventajas de los reactivos de DNS con las adiciones indicadas. 6. BIBLIOGRAFA COMENTADA Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248254. Chaplin MF (1986) Monosaccharides. En Chaplin MF, Kennedy JF (eds.): Carbohydrate Analysis: A Practical Approach. IRL Press (Oxford, England) pp. 1-36. Descripcin muy simple pero bastante completa de los principales mtodos de anlisis de monosacridos. ANEXO 1: SOLUCIONES EMPLEADAS Reactivo de Bradford. Se utilizar un preparado comercial Sigma (Ref. B6916). Reactivo de DNS. Acido 3,5-dinitrosaliclico (C7H4N2O7; PM 228,1) al 0,1 % (p/v), tartrato sdico potsico [NaK(COO)2(CHOH)24H2O; PM 282,23] al 30 % (p/v) en NaOH (PM 40) 0,4 M. Disolver 1 g de cido 3,5-dinitrosaliclico y 300 g de tartrato sdico potsico en 200 ml de hidrxido sdico 2 M (16 g de NaOH en 200 ml de agua destilada) y diluir hasta 1000 ml con agua destilada. El reactivo debe guardarse en bote oscuro (color topacio), siendo estable durante varias semanas. Solucin de glucosa (C6H12O6, PM 180) 40 mM en agua destilada. Disolver 1,8 g de glucosa en 250 ml de agua destilada. La solucin, cuando no se est utilizando, se guardar en fro (frigorfico). Solucin de BSA 20 g ml-1. Disolver 10 mg en 500 ml de agua destilada y agitar la mezcla hasta que se haya disuelto toda la protena. Solucin de sacarosa (C12H22O11; PM 342,3) 0,2 M en agua destilada (68,5 g l-1). La solucin de sacarosa, cuando no se est utilizando, se guardar en fro (frigorfico). Tampn acetato 0,1 M, pH 5,0 (148 ml de A y 352 ml de B se diluyen a un volumen de 1000 ml). A: Solucin de cido actico 0,2 M (11,55 ml en 1000 ml). B: Solucin de acetato sdico 0,2 M (16,4 de sal anhidra 27,2 g de sal trihidratada en 1000 ml). La solucin del tampn, cuando no se est utilizando, se guardar en fro (frigorfico). Tampn acetato 0,1 M, pH 5,0; en NaCl 0,5 M. Mezclar 148 ml de A y 352 ml de B, aadir 29,2 g de NaCl (PM 58,44) y diluir a un volumen de 1000 ml. Las soluciones A y B son las descritas precedentemente. La solucin del tampn, cuando no se est utilizando, se guardar en fro (frigorfico).

ANEXO 2: Gramos de sulfato amnico a aadir a 1 l de solucin a 0 C

% Molaridad Saturacin Inicial 0,0 10,3 20,5 30,8 41,1 51,3 61,6 71,9 82,2 92,4 100,0 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 3,6 3,9 Molaridad Final 1,6 2,0 2,4 234 176 118 59,1 0,0 302 243 183 122 61,4 0,0 375 314 252 190 127 63,9 0,0

0,0 0,0

0,4 54,0 0,0

0,8 111 55,4 0,0

1,2 170 114 57,1 0,0

2,8 453 391 328 264 199 133 66,7 0,0

3,2 539 475 409 343 276 208 139 69,8 0,0

3,6 632 566 499 430 360 290 218 146 73,2 00

3,9 707 639 570 499 428 355 381 207 132 56,1 0,0

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