MICRO 2 Laboratorial

O mbito da Microbiologia 2 o estudo de bactrias associadas a infeces. Portanto pressupe na prtica que estejamos habilitados a analisar amostras de produtos biolgicos (expectoraes, exsudados, zaragatoas) que nos cheguem ao laboratrio a fim de detectar o possvel agente patognico e ceder outro tipo de informaes se necessrio (como o antibiograma, embora hoje em dia tem pouca importncia). de especial relevncia a associao da informao que obtemos dos ensaios com os dados clnicos e o tipo de material biolgico a analisar, pois assim poderemos fazer um diagnstico certeiro e determinar com fundamento a antibioterapia adequada ao caso em questo. Estas informaes clnicas cedidas juntamente com a amostra podem orientar o microbiologista para o tipo de agente em questo e a respectiva escolha dos meios adequados para a sementeira (os provveis, ou seja, aqueles que se pensa proporcionarem o crescimento/isolamento adequado do microorganismo). Ao semearmos a nossa amostra nunca devemos usar apenas um meio selectivo; devemos usar um outro no selectivo para termos a certeza que os microrganismos esto viveis e crescem na cultura ( ou seja, no podemos semear o microrganismo em meio selectivo apenas e se no crescer, admitir que ele est ausente pois podem haver problemas com o meio, conservao e transporte da amostra que podem gerar erros de anlise!). Vamos usar por exemplo material de origem do tracto respiratrio superior e como nestes locais h uma flora microbiana tpica, poderemos fazer o estudo conjunto de vrios tipos de bactrias; a maioria das bactrias embora presentes esto num estado de equilbrio com o hospedeiro mas pode estar implicada em infeces. Temos de ter muito cuidado na sistematizao dos resultados, ou seja, temos de saber avaliar que a presena de um determinado microrganismo, que at o agente etiolgico de uma doena pode l estar mas no estar envolvido em qualquer processo infeccioso; uma das formas de nos orientarmos o confirmar o seu predomnio sobre a flora normal que devia estar numa amostra. Vamos por exemplo ver bacilos GRAM , em particular cocobacilos (Haemophilus influenzae) agente que pode estar no tracto respiratrio inferior ou superior e pode ou no estar envolvido num processo infeccioso (mas que se for a nvel inferior geralmente est associado a infeco uma vez que a nvel superior ele faz parte da flora local e no a nvel inferior). Vamos assim ter um primeiro grupo de 4 aulas; comeamos pela observao e isolamento; depois vamos realizar provas e fazemos no final uma avaliao intercalar. Algumas bactrias vo apenas ser objecto de um estudo superficial enquanto que outras sero bem caracterizadas a nvel bioqumico. Bactrias como o Staphylococcus aureus (existente na pele e tecidos moles) e o Streptococcus pneumoniae (presente no tracto respiratrio) merecem a nossa ateno.Temos de ter muita ateno porque nem todas as amostras que nos chegam para analisar permitem estudar a infeco; numa infeco no ouvido externo o otorrino. pode sacar o ps e analisar (otite externa); mas numa otite mdia aguda, no caso de uma infeco da cavidade auricular o ps no detectado a no ser que haja uma perfurao. Neste caso a terapia e diagnstico so empricas. Assim vemos que podemos ter uma otite externa ou interna com fisiopatologias diferentes. H depois tambm o factor flora normal que est implicada as mucosas tm uma flora tpica mas quando um tipo de bactria domina sobre as outras podemos estar perante um processo infeccioso; pode por vezes nos exames da amostra surgir uma certa dificuladade para saber se existe uma infeco e para isso h que jogar com os dados disponveis. Para comear vamos fazer um Gram s nossas amostras e verificar se h ou no um predomnio de determinado tipo de bactrias que junto com o isolamento poderemos ficar a saber(ou seja ao isolar vai predominar determinado tipo de colnias). Vamos nas aulas ter vrios tipos de amostras nas que esto colhidas com zaragatoa requerem que se faa primeiro o isolamento e s depois o Gram para evitar contaminaes; as que se encontram em copos de colheita requerem apenas uma tcnica assptica eficaz. As amostras foram colhidas e preservadas de maneira a manter a viabilidade dos microorganismos. A turma foi dividida em 3 grupos que avaliaram algumas amostras em comum e outras em exclusivo; era suposto toda a gente ver em placa os resultados de todos mas era difcil com as provas bioqumicas todas que tinhamos que fazer (:-/). A tabela seguinte resume os tipos de amostra, os grupos de trabalho que as vo analisar, a origem e o meio a semear:

Amostra A B C D E F G H I

Origem Urina Urina expectorao expectorao Ps de um frnculo Exsudado farngeo expectorao Zaragatoa do ouvido Zaragatoa do ouvido

Meio a semear Gelose simples Gelose simples Gelose Chocolate Gelose Sangue Gelose Sangue Gelose Sangue Gelose Sangue Gelose simples Gelose simples

Grupo a analisar Grupo 1 Grupo 2 Todos Grupo 2 Grupo 1 Grupo 3 Todos Grupo 3 Todos

O gnero Streptococcus exige meios adicionais; a gelose sangue por exemplo um meio rico e alm disso possibilita a hemlise, ou seja, cede uma caracterstica identificativa que ajuda classificao presuntiva do microrganismo. Para realizarmos a classificao dos microrganismos teremos depois de obter culturas puras proceder a vrias provas bioqumicas: - Cocos GRAM + -> fazemos a prova da catalase para distinguir Micrococaceae de Streptococaceae (ou seja colocamos H2O2 numa lmina e vemos se se formam borbulhas); dentro das Micrococaceae temos os gneros Staphylococcus e Micrococcus ( estes ltimos no daremos grande importncia) que se distinguem pelo diferente uso de glucose e portanto requerem o uso do teste de OF para micrococceas ( que requer a regenerao para expulsar o O2 do meio; o teste vai verificar se o uso do aucar se d por via fermentativa ou oxidativa; faz-se a inoculao por fio e num dos tubos cobre-se com parafina). No gnero Staphylococcus a prova da coagulase positiva permitir identificar o S. Aureus ( usa-se plasma de coelho liofilizado; mas se no tivssemos onde ir buscar e s tivessemos coelhos como fazamos? Tinhamos de tirar sangue a um coelho, adicionar anticoagulante, centrifugar e usar o plasma (sobrenadante); mas ateno: no podemos usar o citrato porque h bactrias que usam citrato e isso iria afectar os resultados pois haveria uma coagulao gerando um falso positivo porque a bactria usava o citrato e o anticoagulante deixava de l estar!!); veremos esta espcie porque o principal agente patognico do gnero. S. epidermidis e S. saprophyticcus so as outras duas espcies importantes e a sensibilidade a novobiocina vai ajudar diferenciao entre as espcies. Dentro da famlia das Streptococaceae a hemlise um dado importante: uma bactria que produza numa gelose sangue um halo tranparente poder-se- dizer que -hemoltica e que poder bem ser um Streptococcus do Grupo A ( que provocam as amigdalites; e nestes casos deve-se tratar o doente suspeito com penicilina por causa das sequelas mesmo que possa ser outro o agente da doena, ou seja, usa-se essa medida profilctica em determinados casos); se h uma destruio parcial dos eritcitos do meio havendo um halo esverdeado trata-se de uma bactria -hemoltica e isso remetenos para um Pneumococcus ( que pode ser um simples habitante ou um agente patognico) ou para o comensal S. viridans que tambm hemoltico. Todas as bactrias restantes no geram hemlise COCOS GRAM - ; e neste grupo temos a Naisseria Gonorrhaeae e a N. menigitidis ( relevante a nvel clnico); podemos tambm ter uma Moraxella catarralis, que um coco Gram -; Nos casos em que suspeitamos da Naisseria e como ela frgil devemos colher a amostra e semear de imediato e s depois efectuamos o GRAM; a anlise microscpica revela tipicamente diplococcus gram -, alguns deles dentro de PMN (polimorfonucleados) se a amostra for de um lquido cefalorraquidiano. Temos tambm depois os Bacilos GRAM +; vamos ver o aspecto das colnias e fazer o GRAM; so comensais da pele e tm um aspecto difteride (aparecem tipo em V); outro que vamos ver o Haemophyllus influenzae, um cocobacilo Gram-, que tem de ser cultivado em gelose chocolate e infeccioso! requerendo alguns factores de crescimento.

No que diz respeito ao trabalho h algumas consideraes a tecer: para fazer-se a sementeira em meio slido a partir da zaragatoa, usa-se a tcnica assptica para colocar no 1 quadrante a colheita espalhando ligeiramente com o algodo; em seguinte com a ansa esterilizada espalha-se melhor o primeiro quadrante, no esteriliza e faz o segundo quadrante indo buscar 2-3 vezes cultura; 3 e 4 quadrante fazemse sem esterilizar tambm e sem ir buscar mais cultura aos outros quadrantes; aproveitar ao mximo a rea do meio. A fixao das lminas tem como objectivo fazer aderir as bactrias ao vidro; sendo assim para a realizar eficazmente passar lentamente na diagonal a lmina no BB (bico de Bunsen) de modo a aquecer mesmo a lmina e no os dedos; isto faz-se aps secagem a calor leve do BB e que vai imobilizar as bactrias; a fixao garante a sua adeso lmina (a secagem imobiliza). Depois ento de preparar os GRAMs procedeu-se observao ao M.O. Os resultados esto na tabela abaixo, estando a negrito o tipo de bactrias dominantes (nos casos em que acontece) em cada preparao. Amostra Bactrias Observadas Cocos GRAM + A

Cocos GRAM +

C Cocos GRAM (estafilo)cocos GRAM + cocobacilos GRAM+; Cocos Gram +; Bacilos Gram + Estreptococos / Diplococos GRAM + Coco em ttradas Flora polimorfa com predomnio de Gram + Estreptococos GRAM + Cocos GRAM+ Cocos GRAM Cocos GRAM Estreptococos/diplococos Gram + Cocos GRAM + (diplo e estrepto com clulas grandes) (estafilo com clulas pequeninas) Cocos GRAM -

D E F G H

I Diplobacilos GRAM + ; Bacilos GRAM Diplococos Gram raros Cocos Gram + Observaes: h que considerar desta tabela basicamente se so cocos ou bacilos e o Gram porque o agrupamento pode no ser bem ntido a no ser que exista mesmo uma boa evidncia; por exemplo por vezes tenho na tabela estafilococos mas tem significado apenas ser um coco; o agrupamento seria posteriormente confirmado; de qualquer forma pode ser um dado orientador mas no muito valioso em determinados casos. Estas tabela regista os resultados do que foi visto nas nossas aulas.

Aula 2 Nesta segunda aulas visualizamos as colnias obtidas e alm disso, realizamos as provas bioqumicas de modo a confirmar as nossas classificaes presuntivas baseadas na observao microscpica e macroscpica. Um dos objectivos da aula foi mesmo observar algumas colnias tpicas. Na amostra G (expectorao) estariam presentes cocos Gram de Moraxella catarrhallis; as colnias so amareladas, brilhantes e convexas e com um pouco de ateno possvel visualizar um mamilo (imagem ao lado). Outro tipo de colnias que era suposto vermos eram as de bacilos Gram + que so colnias tpicas franjadas e brancas baas que estariam na amostra I (zaragatoa de ouvido). Ao lado temos uma imagem que no corresponde bem ao que vimos mas d para ter ideia ( na imagem o meio de cultura diferente e elas aparecem vermelhas, mas o aspecto da colnia tipico e semelhante ao que vimos. A partir de cocos Gram + que vamos realizar as nossas provas bioqumicas. Devemos antes de fazermos qualquer tipo de provas confirmar, se necessrio, o Gram porque s vezes o comportamento do isolamento diferente do do exame directo (um dos motivos poder ser o de a bactria ser sensvel e no crescer no isolamento por exemplo; por outro lado pode haver uma contaminao). Sendo assim h que antes de mais confirmar o GRAM! O isolamento deve estar estreitamente relacionado com o Gram; s assim poderemos avanar com certezas para as provas bioqumicas; dados antagnicos entre isolamento e Gram (do estilo termos colnias tpicas de bacilos Gram + e termos no gram cocos Gram +) leva-nos a voltarmos atrs e refazer isolamento e novo Gram (desculpem ser repetitivo mas isto importante!). A partir do momento em que confirmamos que no isolamento temos colnas das bactrias que predominavam no Gram inicial (com novo Gram) vamos usar um modo sistemtico de os identificar. O esquema geral adaptado o que OF se apresenta. A prova da catalase vai separar as famlias. Neste teste No fermentador vamos colocar numa lmina para cada bactria a identificar 2 gotas Micrococcus sp. de H2O2 uma para identificar a bactria e outra para fazer o branco com a ansa esterilizada; teremos de fazer numa terceira o controlo positivo com gelose sangue para confirmar um resultado negativo. Se tivermos Catalase estaremos em presena da famlia das Streptococaceae, culturas essas que tiramos de gelose sangue; temos de ter o cuidado de no arrefecer a ansa no meio de cultura para no obtermos um falso positivo. Confirmado o negativo catalase temos de ver que tipo de hemlise temos: , ou . Se verificarmos que h -hemlise ( halo transparente bem visvel em gelose sangue) poderemos estar perante um Streptococcus -hemoltico do GRUPO A de Lancefield; para confirmarmos isso fazemos o teste de

Fermentador

MAXTED (sensibilidade bacitracina 0,04 unidades, que uma baixa concentrao de antibitico e nos d uma Classificao Presuntiva); se se revelar sensvel podemos confirmar definitivamente usando soros especficos (3aula) que uma pesquisa directa usando anticorpos anti-streptolisina O (a Streptolisina O oxidvel e por isso ao rasgarmos a gelose sangue a -hemlise mais eficaz visto haver ausncia de O2 que a favorece; como antignica podemos us-la para diagnstico indirecto pesquisando anticorpos no soro do doente, que pode ser til numa fase em que j no h leso ou sinais clnicos evidentes). Se houver -hemlise (h degradao parcial dos eritrcitos havendo um halo esverdeado tpico) podemos estar perante um Pneumococcus ou um S. Viridans; a teremos de fazer o teste de sensibilidade optoquina (etilhidrocuprana); se for sensvel o primeiro (pneumo.) e se crescer ser o segundo (viridans). H que ficar com a ideia de que h mais testes para diferenciar os grupos de Streptococcus: um deles que a prof. referiu o PYR test que se baseia na presncia/ausncia de uma enzima que os diferencia. Para o caso de termos -hemolticos podemos estra perante S. Grupo D de Lancefield ou Enterococcus. Nesta designao cabem bactrias que podem mesmo no ter hemlise ou apresentar tambm as outras hemlises j descritas dando no entanto resultados opostos s outras provas que se fazem para as outras hemlises, o que permite distingu-las. Para confirmar que estamos ento perante -hemolticos podemos contar com os testes das outras hemlises no positivos e iremos fazer a prova da Bilis-Esculina e do Cloreto de Sdio a 6,5% (porque queremos verificar que estamos perante bactrias adaptadas a ambientes entricos). No meio de Cloreto de sdio vemos se as bactrias conseguem crescer num meio com muito sal e podemos depois, se elas crescer confirmar com um Gram o resultado; a prova da Blis-esculina permite saber se a bactria cresce na presena de blis e capaz de hidrolisar a esculina, o que se observa pelo aparecimento de uma colorao preta. Por outro lado poderemos ter um positivo prova da catalase pelo aparecimento do borbulhar tpico. A estaremos perante a famlia das Micrococaceae. Para dintinguir os gneros teremos de ver se as bactrias so fermentativas ou oxidativas no uso de Hidratos de Carbono teste OF. Neste teste temos um meio semi-slido que inoculado por picada central e apresenta como indicador o prpura de bromocresol que se torna amarelo na presena de cidos; mesmo que tenha um aspecto lquido poder ser inoculado sem problema; j se sabe que se fazem dois tubos e um deles leva parafina para criar condies de anaerobiose. No caso de a bactria ser fermentadora ambos os tubos aparecem amarelos, se apenas usar o aucar oxidativamente apenas o tubo sem parafina ter uma colorao amarela que pode no ser total (porque a parte mais funda do tubo no tem O2 como obvio e ele pode no difundir desde a superfcie). Ento se a bactria se mostrar fermentadora estamos perante o gnero Staphylococcus; caco contrrio, se ela for no fermentadora (utiliza oxidativamente os HC) pertence ao gnero dos Micrococcus. Vamos lidar apenas com o caso das fermentadoras. Logo depois de se saber que so fermentadoras vamos separar as espcies pelo teste da coagulase (plasma de coelho que para ser considerado positivo deve ter um cogulo que com um fio no se liquefique ou com batimentos se destaque inteirinho); se der coagulase positivo estaremos perante um Staphylococcus aureus; se for coagulase negativo teremos de ir averiguar de que espcie se trata; isso faz-se pelo teste da sensibilidade Novobiocina; se a nossa bactria for sensvel tartar-se- do S. epidermidis; se for resistente ser o S. saprophyticus. Agora, a ttulo de exemplo, poderamos por exemplo ter interesse em usar um meio selectivo para as bactrias do gnero Staphylococcus; poderamos usar o Manitol Salt Agar, que um meio salgado e colocvamos j um disco de novobiocina; teramos assim um meio selectivo e diferencial (as manitol distinguem-se das manitol+) e assim no cresce tudo mas apenas aquelas bactrias que desejamos; este processo aceleraria a identificao. Estando praticamente toda a explicao da cascata bioqumica de identificao dada, faremos um breve resumo dos resultados prticos que obtivemos com as nossas placas. Veremos primeiro o percurso que seguimos com as amostras com que trabalhamos e depois relataremos os resultados dos outros grupos da turma L6. A anlise das nossas amostras foi a seguinte.

Amostra G tivemos uma flora poliforma com pelo menos 3 tipos de colnias diferentes mas nenhuma delas predominava sobre as outras; um exemplo de flora

polimorfa est na imagem ao lado; Amostra I Verificado o Gram (embora sem necessidade) que deu positivo; aqui interessava apenas o aspecto das colnias de bacilos Gram + ( parecido com no.4 da fig.); Amostra H Confirmamos o Gram positivo; e deparamos com dois tipos de colnias: umas brancas cremosas maiorzinhas (que pertenciam a cocos pequeninos Gram +) e umas colnias mais pequeninas com mesmo aspecto (que pertenciam a cocos grandes Gram +)(parecidas com o no. 12 da fig); ou seja, ao GRAM as colnias grandes tinhas cocos pequenos e as colnias pequenas tinham cocos grandes (interessante no ?); prosseguimos com estas duas para as provas bioqumicas; Amostra F em meio de gelose sangue tivemos dois tipos de colnias; umas grandes gram que seriam contaminantes e umas colnias mais pequeninas que se confirmou serem cocos Gram +; alm disso apresentavam -hemlise em todo o redor das colnias pequenas . Amostra C nesta amostra apareceram dois tipos de colnias em que nenhuma delas predominava sobre a outra e que poderiam fazer ento parte da flora normal de uma expectorao; o objectivo era verificar a presena de Haemophillus influenza que apresenta umas colnias tpicas, como temos na imagem ao lado numa gelose chocolate, j que uma bactria fastidiosa; todos faremos depois o teste do satelitismo a esta bactria mas no a vamos estudar como s outras. Aps termos ento verificado os Grams das amostras F e H, fomos proceder cascata das provas para efectuar a sua identificao. Amostra H comeamos por fazer a prova da catalase nos dois tipos de colnias pequenas (1) e grandes (2). Ambas deram positivo exemplo da imagem ao lado; Semeamos os meios OF para cada tipo de cultura, realizamos tambm o teste da coagulase e o teste da sensibilidade novobiocina. Os resultados esto na Tabela seguinte:

Teste OF Coagulase Sens. Novobiocina

Colnias 1 (pequenas) Anaerbias facultativas Fermentadoras Positivo Sensveis

Colonias 2 (pequenas) Anaerbias facultativas Fermentadoras Positivo (deveria ser -)

Sensveis

Perante isto podemos dizer que se trata de um S.aureus ; no entanto como podem dois tipos de colnias diferentes dar os mesmos resultados? Provavelmente houve contaminao no teste da coagulase ; portanto denota-se neste caso que importante partirmos para as provas bioqumicas com culturas bem puras, ou seja bons isolamentos para no termos erros deste tipo. As nossas concluses foram, perante os dados de outros grupos que as colnias 1 seriam S.aureus e as colnias 2 seriam S. epidermidis que uma bactria sensvel novobiocina ( mas que foram na prova da coagulase contaminadas com colnias 1); apesar de sabermos que uma prova coagulase positiva classifica logo S.aureus tivemos de realizar as provas posteriores todas para numa s aula podermos tirar concluses e por acaso o S.aureus tambm sensvel novobiocina, o que at ajuda a confirmar os resultados mas no se faz na pesquisa sistemtica (ver esquema); lembramos que a prova da novobiocina serve para distinguir S. epidermidis de S. saprophyticus. Amostra F A nossa amostra F revelou na confirmao do Gram cocos Gram + e a placa apresentava junto das colnias pequenas uma -hemlise marcada. Passamos ao teste da catalase que deu negativo como era de esperar (usaram-se as colnias pequenas, que eram as nicas que acompanhavam a hemlise). Inoculamos um meio de gelose sangue com um disco de bacitracina para realizarmos o teste de MAXTED ( no colocamos o disco da optoquina porque j tnhamos confirmado a hemlise; caso no tivssemos tido essa oportunidade no meio iam dois discos: um de optoquina e um de bacitracina porque assim cobrimos todos os tipos e hemlise para dar resultados de uma vez s). O resultado foi o aparecimento de um halo de inibio de crescimento, ou seja, sensvel bacitracina. Por isto tudo podemos dizer que temos um Streptococcus hemoltico do GRUPO A de Lancefield. Um pequeno detalhe: se susceptvel bacitracina nao cresce volta do disco e haver tambm uma inibio da hemlise nesse lugar ficando vermelho; no entanto se incubar durante muito tempo h difuso das hemolisinas e esse halo de inibio da hemlise pode no aparecer. Vistas as nossas amostras fomos ver os resultados e concluses dos nossos colegas com outras amostras diferentes: Amostra B A E D Catalase + + OF F (+) / + / Coagulase / + / Novobionina resistente / sensvel / Hemlise / / Blis esculina / +(preto) / / NaCl 6,5% / +(turvo) / / Espcie S. saprophyticus Enterococcus sp. S. aureus S. viridans

H amostras que merecem um pouco de ateno: Amostra A esta amostra foi semeada em gelose sangue j com disco de optoquina e de bacitracina, e no revelou hemlise evidente ou sensibilidade a qualquer um dos discos colocados; a prova da blis esculina (realizada na aula com um meio em rampa com esculina e cloreto frrico) deu positiva com aparecimento de uma colorao negra em meio de cor parecido a gelose simples; isto significa que a bactria cresceu na presena de blis e conseguiu hidrolizar a esculina; da hidrlise da esculina resulta dihidroxicumarina que complexa com citrato frrico formando uma composto de cor escura com capacidade de difuso. O facto de turvar em meio com grande concentrao de sal confirma que se tratam de Enterococcus; se no crescesse seriam S. do grupo D que no tm habilidade de crescer num meio com esta quantidade de sal (ou seja Nacl 6,5 % distingue Enterococcus de S. Grupo D). Amostra D - foi a nica amostra que apresentou -hemlise em gelose sangue aparesendo um halo esverdeado resultante da degradao parcial dos eritrcitos e consequente oxidao de compostos derivados da porfirina agarrados s membranas; o teste realizado da sensibilidade optoquina, segundo o esquema de identificao mostrou que a bactria era resistente e da se concluir pela presensa de S. viridans. Nas culturas I e G tnhamos respectivamente Bacilos Gram + e Moaraxella Catarrhalis cujo propsito era observar as suas colnias e no foram sujeitas aos testes. No entanto na Cultura C tinhamos visto at aqui que se tratava de Haemophilus influenzae e que procederamos a um teste do satelitismo.O H. influenzae um cocobacilo Gram que no tem habilidade de crescer num meio normal de MacConkey ou numa gelose sangue; no entanto j cresce numa gelose chocolate. Para verificar a sua presena, a prpria sementeira em gelose sangue e gelose chocolate e o aparecimento de crescimento de colnias cinzentas chatas apenas nesta ltima um forte indcio desta espcie de bactria. Por este motivo vemos que o H. influenzae se trata de uma bactria que requer nutrientes adcionais para crescer. A prova do satelitismo pe isso em evidncia: a designao desta prova baseia-se no facto de que o H. influenzae necessita para crescer de dois factores adicionais factor X que corresponde a hemina e est presente num meio de gelose sangue e o factor V (NAD) que no est presente neste meio; numa cultura em gelose sangue esta bactria no cresce mas se semearmos juntamente com S. aureus ela cresce em volta das suas colnias, uma vez que este lhe fornece o factor V que no h no meio e da satelitismo. A prova do satelitismo pode ser feita de duas maneiras: num meio de gelose sangue colocar uma tira com factor V e verificar o crescimento da bactria ou num meio nutritivo colocar uma tira impreganda dos dois factores (XV) e verificar o crescimento apenas nessa zona (imagem). Por si s esta prova permite identificar o H. influenzae. Um aspecto muito importante no que se refere identificao saber a origem da amostra porque elimina

algumas coisas partida e orienta a identificao. Um exemplo termos um exsudado farngeo: no podemos ter um enterococcus ou um streptococcus do grupo D (mesmo que este apresente qualquer tipo de hemlise) uma vez que no o local fisiolgico onde se encontra. Do mesmo modo que se temos uma expectorao no faz sentido se temos uma -hemlise pensar em S. grupo D ou Enterococus mas sim logo em Pneumococcus ou S. viridans (comensal). Portanto ateno ao tipo de amostra. Uma das coisas que ficou para demonstrao no final destas aulas foi a pesquisa de Ag. da parede de S. -hemolticos do grupo A com antisoros especficos e que permitiria fazer a sua classificao definitiva. O uso de um Kit comercial para fazer isso torna as coisas simples e de fcil manipulao: o kit traz uma enzima especfica capaz de colocar o antignio especfico para o Ac susceptvel ao seu ataque (clivando alguma zona da bactria e pondo-o acessvel); aps se colocar a enzima em contacto com a suspenso da nossa bactria durante um determinado tempo obtemos o extracto enzimtico; este extarcto enzimtico posto em contacto numa placa escura especial comuma soluo de esferas de ltex revestidas com o Ac esopecfico para o Ag que queremos pesquisar; o aparecimento de aglutinao corresponde a um teste positivo ( o da esquerda na imagem). A bula deste tipo de teste est em http://www.remelinc.com/IFUs/IFUZL51GB.pdf . No caso de no se conseguir ver bem pode-se confirmar com uma visualizao ao microscpio por exame directo a fresco. A ltima coisa que fizemos nesta parte das aulas foi uma leitura de API. O procedimento est esquematizado abaixo: O API um sistema que contm microescala vrias provas bioqumicas cujo fundamento equivalente aos tradicionais mtodos. Apresenta a facilidade de poder ser automatizado na leitura e geralmente perante resultados negativos e positivos (por colorao ou turvao) recorremos a uma tabela que exibe de imediato a espcie de bactria que temos. FIM