MINISTRIO DA EDUCAAO UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN CURSO DE TECNOLOGIA EM PROCESSOS AMBIENTAIS DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA AMBIENT AL - QB54E PROFa

VALERIA MIGUELOTE KOKIS .

CAMPUS

CURJTIBA

AULA PRTICA N 5: ANLISE BACTERIOLGICA TCNICA DOS TUBOS MLTIPLOS

1. INTRODUGO

DA GUA

grupo dos microrganismos denominados "coliformes totais" inclui todos os coliformes especficos e no especficos do material fecal. um bom indicador microbiolgico da qualidade da gua, porque facilmente detectvel e quantificvel. A ausncia de coliformes totais numa gua potvel garante a sua pureza bacteriolgica. A sua presena pressupe que o tratamento da gua foi inadequado QU que a rede de distribuio no estanque e foi contaminada por guas residuais. A tecnologia actual do tratamento de guas permite, atravs do controlo cuidado da coagulao, sedimentao e filtrao, que mais de 99% dos coliformes sejam removidos. O grupo de microrganismos denominados "coliformes fecais" um subgrupo do anterior. Permite estabelecer uma correlao mais precisa entre a existncia de coliformes numa amostra de gua e a entidade responsvel pela sua libertao, que ter sido um organismo homeotrmico. De entre os coliformes que existem nas fezes de animais homeotrmicos, mais de 90% so coliformes fecais. Estes coliformes fermentam a lactose com produo de cido e gs a 44C. 2. OBJETIVOS
-

Analisar quantitativamente amostras de gua quanto presena de bactrias do grupo dos coliformes totais e coliformes fecais. Estimar o nmero mais provvel (NMP) de coliformes totais e fecais em 1OOmL de amostra de gua. Analisar os resultados da amostra de gua testada. EXPERIMENTAL

3. PROCEDIMENTO 3.1. Materiais

Amostras de gua. Tubos de ensaios com meios seletivos para coliformes totais (caldo lactosado), termotolerantes (caldo verde bile brilhante 2%) e Eschericha coli (Caldo E.C.). Placas de Petri com meio seletivo para coliformes (gar EMB). Pipetas graduadas estreis. Alas de platina. Banho-maria.

PRIMEIRO DIA 3.2. Teste Presuntivo de Coliformes Totais: caldo lactosado ou caldo lauril triptose

Inocular uma srie de 5 tubos com 10 ml de caldo lactosado ou caldo lauril triptose - DUPLO (contendo um tubo de Durham) com 10 mL da amostra. Inocular uma srie de 5 tubos com 10 mL de caldo lactosado ou caldo lauril triptose - SIMPLES (contendo um tubo de Durham) com 1 mL da amostra. Inocular uma srie de 5 tubos com 10 mL de caldo lactosado ou caldo lauril triptose - SIMPLES (contendo um tubo de Durham) com 0,1 mL da amostra. Incubar a 35C por 24-48hs.

SEGUNDO DIA 3.3. Teste Confirmativo de Coliformes Totais: caldo Bile Verde Brilhante de

bservar os tubos positivos no caldo lactosado ou caldo lauril triptose (formao gs). . ~ __ ~

Fazer a leitura e encontrar o NMP /1 OOmL presuntivo de coJiformes totais. Repicar com a ala de platina os tubos positivos para os novos tubos contendo 100mL de caldo bile verde brilhante. Incubar a 35C por 24-48hs. para Coliformes Fecais: caldo peptonado ou caldo E.C.

3.4. Teste Final ou Completo

Repicar com a ala de platina os tubos positivos no caldo lactosado ou caldo lauril triptose para os novos tubos contendo 10mL de caldo peptonado ou caldo E.C. Incubar a 44,5C por 24-48hs. de Metileno (EMB) - suspeita de Escherichia col

3.5. gar Eosina-Azul

Fazer estrias (semeadura por esgotamento) em Agar EMB a partir dos tubos positivos de caldo lactosado ou caldo lauril triptose. Incubar a 35C por 24 hs.

TERCEIRO DIA Leitura dos tubos positivos nos testes confirmativos, final ou completo e leitura da suspeita de Eschericha coti em Agar EMB (colnias com brilho metlico).

4. INTERPRETAGO TABELA EM ANEXO Clculo: NMP /100 mL

--

5. LEGISLAGO

APLICVEL

RESOLUO CONAMA N 274 DE 29 DE NOVEMBRO 2000 Art. 20 As guas doces, salobras e salinas destinadas balneabilidade (recreao contato primrio) tero sua condio avaliada nas categorias prpria e imprpria. de

10 As guas consideradas prprias podero ser subdivididas nas seguintes categorias:

NMP /100 mL Coliformes Fecais (termotolerantes) s 250 Excelente Muito boa 500 s 1000 Satisfatria Imprprias No atendem os valores acima ou ~ 2.500 * Em 80% ou mais de um conjunto de amostras Categorias

DECRETO-LEI 236/98 (Ministrio do Ambiente) Os critrios e normas de qualidade das guas de rega visam proteger a sade pblica, a qualidade das guas superficiais e subterrneas, as culturas que podem ser afetadas pela m qualidade das guas de rega e os solos cuja aptido para a agricultura pode ser degradada pelo uso sistemtico de guas de rega de m qualidade. Parmetro .'Zoliformes fecais Valor mximo

PORTARIA MINISTRIO DA SADE 518, DE 25/03/2004 Padro Microbiolgico de Potabilidade da gua Parmetro VMP Valor mximo ermitido A uas ara consumo humano ocos, nascentes e outras E. coli ou coliformes termotolerantes Ausncia em 100 mL A ua na sada do tratamento Coliformes totais Ausncia em 100 mL A ua tratada no sistema de distribuio E. coti ou coliformes termotolerantes Ausncia em 100 mL Coliformes totais Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por ms: ausncia em 100 mL em 95% das amostras examinadas no ms. Os sistemas que analisam menos, apenas uma amostra poder apresentar mensalmente resultado ositivo em 100 mL

6. RELATRIO Comentar os resultados obtidos. Comente a qualidade da gua analisada. Enumerar as razes que fazem com que os coliformes sejam bons ind icadores de contaminao fecal da gua.

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
PEPPER, I.L.; GERBA. C.P. Environmental San Diego: Academic Press, 2004. BENSON. Microbial Applications: McGraw-Hill, 2001. Microbiology - A laboratory manual. 2a ed.

Laboratory manual in general microbiology.

aa

edio.

Manuela Abelho

Inoculao de tubos mltiplos e determinao do NMP

o mtodo da inoculao de tubos mltiplos e determinao do nmero mais provvel (NMP) pode ser usado para estimar o nmero de microrganismos viveis presentes numa determinada populao. A amostra diluda (diluies sucessivas ou inoculao de volumes 10 vezes inferiores para a ruesma quantidade de meio") inoculando-se um meio de cultura lquido, especfico para o microrganismo a pesquisar, com um volume preciso dessas diluies. Desta forma, presume-se que os meios de cultura inoculados com as ltimas diluies no vo apresentar qualquer crescimento (resultados negativos) e que ocorrer crescimento nos tubos que tenham,pelo menos, um microrganismo vivel. Se a amostra e as diluies forem homogneas e se houver um nmero suficiente de repeties, possvel tratar estatisticamente os resultados e generaliz-los amostra inicial. Por cada diluio da amos~oculam-se, geralmente, 3, 5 ou 10 sries de tubos com o referido meio de cultura (repeties). A prpria deslgiiao do mtodo aponta claramente para o carcter probabilstico que lhe .deve ser atribude. O nmero de tubos positivos - nes-quais ocorreu crescimento - em cada diluio utilizado para determinar o Nmero Mais Provvel (NMP) desse microrganismo na amostra de gua analisada=consultando uma tabela estatstica (tabela de McGidy) semelhante Tabela 3.10.Tabela 3.10. Tabelade McCradypra a determinao do nmero mais provvel (NMP) de-micrw:ganismos com basesesn5 repetises e"'cadadiluio.

- '.=,--

--"'t"

~ Nmero de tubos positivos nas ~:MP I diluies 100 mL de amostra 10 mL. 1 mL 0.1 mL

o o o o o o o o o
1
1 1 1

o o o
1 1

o
1

o
2 4 2 4 6 4 6 b 2 4 6 8 4 6 8 6 8
10

o
1

o
2 2 3

o
1

o o o o
1 1 1

o o
1

2 3

1 1 1
1

o
1

1
1

2 2 2

o
1

Nmero de tubos posltivos nas diluies 0.1 mL 10 mL 1 mL o o 4 1 o 4 2 o 4 o. 4 3 1 o 4 1 1 4 2 1 4 2 o 4 2 1 4 2 2 4 o 4 3 1 4 3 2 4 3 04 4 1 4 4 2 4 4 o 4 5 1 4 5 2 4 5

NMe/ 100 mL de amostra 13 17 20 25 17 20 25 20 25 30 25 35 40 35 40 45 40 50 55

A utilizao de inculos de 10 mL, 1 mL e decimais sucessivas dessa amostra.

0.1

mL semelhante a inocular a amostra e duas diluies

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Nmero de tubos positivos nas diluies 10 mL 0.1 mL 1 mL 1 o 3 1 1 3 1 o 4

_2 2 2 2 2 2 2 2

o o
o

2
3

o
1 1 1

o
1

2 2
2

2 2 2

o
1 2

:3
3

o
1

2 2 3 3 3 3 3
~.

o
o
1

o
o

o
1 1

o
1

3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 1. 2 2 2
3

2 3 01

3-o
1 o 1 o

....-.

3 4
'~~

NMPI 100 mL de amostra 8 10 11 5 7 9 12 7 9 12 9 12 14 12 14 -,15 8 11 13 1,1..,14 17 20 14 17 20''" 17 20 20 25 25

Filtrao por membrana

Nmero de tubos positivos nas diluies 0.1 mL 1 mL 10 mL o o 5 __ o 1 5 2 o 5 o 3 5 o 5 ti b 1 5 i 1 5 2 1 5 1 3 5 1 4 5 o 2 5 1 2 5 2 2 5 2 3 5 2~ 4 5 2 5 5. o 3 5 1 3 5 2 3 5 53 3 5 4 3 5 5 3 o 5 4 1 5 4 2 5 4 '3 5. -j"" 5 4 5 5 4 o 5 5 1 5 5 2 5 5 5 3 5 5 5 4 5~ 5 5

r-

NNtp I 100 mL de a~ostra 25 30 45 60 75 35 45 65 85 115 50 70 95 120 150 175 . 80 110140 175 200 ..250 13F' ~170 225 275 350 425 250 350 550 <)00 1600 1800+

O mtodo da filtrao por membrana efectuado atravs da filtrao de um volume conhecido de amostra atravs de um filtro de 0.15 um, que retm os microrganismos na sua superfcie. A membrana depois colocada num meio slido e levada a incubar. O sucesso do mtodo depende na utilizao de um meio diferencial ou selectivo, efectivo para o microrganismo que se quer pesquisar.

Protocolo 3. 1
Norma aplicvel:

Recolha de amostras de gua

EN 25667-2 I ISO 5667-2:1991

na colheita devem estar limpas. Os recipientes para colheita das amostras de gua devem ser de material transparente e incolor (vidro, polietileno ou polipropileno) e estar esterilizados mediante: esterilizao em auto clave (mnimo de quinze minutos a 121C), esterilizao a seco (mnimo uma hora a 160C - 170C) ou ser constitudos por recipientes irradiados recebidos directamente do fabricante. As amostras devem ser claramente identificadas com tinta indelvel no recipiente e no formulrio relativo amostra.

As mos e a roupa dos intervenientes

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