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9. ORGANISMOS EUCARIOTAS GENETICAMENTE MODIFICADOS (OGMs) PLANTAS TRANSGNICAS.

Sumrio: Obteno de plantas transgnicas Transferncia de DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens Transferncia de DNA por bombardeamento de partculas Exemplos

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9.1 Plantas Transgnicas A obteno de plantas transgnicas implica: 1) Insero do transgene com sucesso no genoma de uma clula vegetal. 2) Regenerao de planta completa a partir de clulas transformadas. Totipotncia: capacidade de clulas indiferenciadas originarem um embrio ou um indivduo completo e frtil Citocininas e auxinas vegetais em cultura.
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Induo da diferenciao celular em clulas

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9.1.1 Objectivos

Resistncia: a doenas, herbicidas, insectos, vrus. Tolerncia: secura, ao frio e salinidade Reduo da fotorrespirao Melhorar o valor nutritivo dos alimentos. Extenso das propriedades de armazenamento de frutas e legumes. Capacidade de fixao do azoto atmosfrico. Mtodos de introduo de DNA exgeno em clulas vegetais: i) Transferncia mediada por Agrobacterium tumefaciens ii) Tecnologia de bombardeamento de partculas iii) Microinjeco iv) Electroporao
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Componentes includos no DNA que se pretende transferir: - Gene de interesse ou alvo associado a um promotor. - Gene marcador associado a um promotor. 9.1.2 Transferncia de DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens: bactria do solo que infecta dicotildoneas, penetrando atravs de ferimento, e causando tumores (crown gall)

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Plasmdeo Ti (Tumor inducing): molcula circular de DNA, em cadeia dupla, com ~200 kb, existente em A. tumefaciens T-DNA: segmento especfico de DNA (com 12-24 kb) do plasmdeo Ti que transferido, integrado e expresso no genoma das plantas. Est flanqueado por unidades de repetio designadas borders.

Plasmdeo Ti e T-DNA

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Agrobacterium tumefaciens, plasmdeo Ti e T-DNA

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Os genes vir do plasmdeo medeiam a transferncia e integrao do T-DNA no genoma de uma clula vegetal

Elementos do T-DNA:

Videira, A. 2001. Engenharia Gentica. Lidel edies Tcnicas, Lda. Lisboa

- Unidades flanqueadoras de repetio (25 pb); - Oncogenes responsveis pela formao do tumor - genes para a sntese de auxinas e citocininas; - Gene para a produo de aminocidos modificados do tipo opina (octopina - ocs e nopalina - nos).
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Infeco natural por A. tumefaciens

Insero de DNA em plantas por engenharia gentica utilizao do T-DNA: - Eliminao dos genes tumorais - Eliminao do gene para a opina - Manuteno das sequncias flanqueadoras ou limite O plasmdeo Ti o nico vector usado rotineiramente para produzir Plantas transgnicas
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Desenvolvimento de vectores: sistema binrio

No sistema binrio os genes vir e o T-DNA esto presentes em dois plasmdeos independentes.

Videira, A. (2001)

O plasmdeo com o T-DNA transferido de E. coli, por conjugao, para uma estirpe de A. tumefaciens que possui um plasmdeo Ti modificado com os genes vir, mas sem T-DNA.
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Atravs do sistema binrio obtm-se uma bactria A. tumefaciens com dois plasmdeos independentes.

Desvantagem do mtodo: A Agrobacterium tumefaciens s infecta dicotildoneas, a infeco de monocotildoneas (trigo, milho, arroz, ...) difcil.

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9.1.3 Transferncia de DNA mediada por Bombardeamento de partculas (biolstica) Consiste em disparar sobre clulas e tecidos vegetas minsculas esferas de metal, de tungstnio ou ouro, com 0,4 a 1,2 m de dimetro e revestidas com DNA.
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um mtodo utilizado para introduo de genes alvo em monocotildoneas.

Videira, A. (2001)

9.1.4 Seleco de clulas modificadas i) Gene marcador de seleco: frequentemente um gene para a resistncia a um antibitico ou a um herbicida Nas plantas um dos marcadores mais utilizados o gene da neomicina fosfotransferase (Npt) que confere resistncia ao antibitico canamicina (kan).
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Fonte: http://www.plantphysiol.org/content/1 45/4/1155.full

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ii) Desenvolvimento de plantas sem gene marcador

- Transformao com as duas molculas de DNA (gene alvo e gene marcador) em plasmdeos Ti independentes obteno de clulas transgnicas com os dois genes inseridos em cromossomas diferentes. Posterior cruzamento de plantas e seleco na F1, aps segregao gentica, de plantas sem gene marcador. - Remoo do gene marcador aps seleco de clulas recombinantes. O gene marcador colocado entre duas sequncias idnticas reconhecidas por uma recombinase, esta enzima catalisa a recombinao entre sequncias de reconhecimento, com eliminao do gene marcador.

9.1.5 Genes reprter para monitorizar a trangnese Monitorizar a expresso do gene ao longo da regenerao da planta e em geraes subsequentes.
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Utilizao como marcas de seleco. - Gene da -D-glucuronidase (GUS) de E. coli que transforma um substracto incolor num produto azul. - Gene da luciferase obtido do pirilampo (Photinus pyralis) que catalisa uma reaco que emite luz (luciferina + ATP AMP, CO2 e luz) - Gene da protena fluorescente verde (GPF) da medusa Aequorea victoria.

9.1.6 Insero de um transgene no genoma de cloroplasto

Os cloroplastos existem em grande nmero em cada clula da folha, sendo um alvo fcil para a transformao por bombardeamento de partculas. O fragmento de DNA utilizado inclui o gene de interesse e um gene marcador, os quais esto sob a aco de promotores tpicos do genoma de plastdeos.
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O conjunto dos dois genes est flanqueado por duas sequncias de DNA homlogas a sequncias contguas do cromossoma do cloroplasto. Estas sequncias vo mediar a integrao por recombinao homloga.
Algumas vantagens da transformao do DNA de cloroplasto: i) Os plastdeos alm de existirem em elevado nmero por clula vegetal, possuem tambm um elevado nvel de ploidia. Isto significa que possvel inserir um elevado nmero de cpias do transgene e obter nveis de expresso elevados para o transgene; A transformao com genes de origem bacteriana facilitada, o DNA do cloroplasto tem origem procaritica; A expresso do transgene estvel na prognie das plantas transformadas; No ocorrem efeitos de posio como acontece com frequncia, na insero ao acaso, durante a transformao nuclear;
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ii) iii) iv)

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v) Os plastdeos tm um hereditariedade maternal na maior parte das espcies agronmicas, significando que esto ausentes no plen. Tal torna-se uma vantagem porque permite evitar a disperso do transgene por cruzamentos imprevistos.

A transformao de plastdeos uma tcnica recente e esto ainda a ser desenvolvidos protocolos eficientes de transformao e regulao da expresso do transgene. 9.1.7 Inactivao de um gene O objectivo da transgnese passa por vezes pela anulao da expresso de um gene. Nas plantas este objectivo conseguido atravs da estratgia antisense.

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Esta estratgia consiste na transformao de uma clula com um gene que codifica para um mRNA com sequncia complementar do gene alvo RNA antisense. Quando este mRNA sintetizado em quantidades suficientes, ele vai hibridar com o mRNA sense normal e assim inibe a sntese da protena correspondente.

Fonte: http://www.alsa.org/research/about-als-research/rna-therapy.html Escola Superior Agrria de Castelo Branco Carlos M G Reis

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9.1.8 Sequncias frequentemente associadas a um transgene em plantas

Promotores Promotor constitutivo forte (expresso em todos os tecidos da planta): - Promotor (35S) do vrus do mosaico da couve-flor (CaMV 35S) Terminadores - Terminador nos: terminador (nos5) da nopaline synthase obtido de Agrobacterium tumefaciens Genes marcadores - Gene marcador (nptII) que codifica para a neomicina fosfotransferase, enzima que que confere resistncia ao antibitico neomicina
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9.1.8 Exemplos de aplicaes Melhoramento das caractersticas agronmicas Resistncia a insectos plantas Bt

A bactria Bacillus thurigiensis produz pr-toxinas que originam a morte de larvas de insectos. Subsp. kurstaki produz pr-toxina especfica para lepidpteros (borboletas) Subsp. tenebrionis produz pr-toxina especfica para colepteros (ex. escaravelho) Vantagens das pr-toxinas de Bacillus thurigiensis: - Especficas - No txicas para vertebrados - No persistem no ambiente
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Modo de aco: aps absoro a pr-toxina transformada no aparelho digestivo do insecto, por proteases especficas, numa toxina que altera a permeabilidade do epitlio o insecto desidrata e morre rapidamente. Exemplos de plantas transgnicas Bt (Monsanto) Batateira New leaf (1994) insero do gene cryIIIA da Subsp. tenebrionis Milho YiedGard - insero de gene cry da subsp. Subsp. kurstaki Algodo Bollgard insero de gene cry da subsp. Subsp. kurstaki Preocupaes: Desenvolvimento de resistncia por parte dos insectos? desenvolvimento de estratgias para evitar resistncia. Limitao da expresso do gene cryIIIA a um perodo curto Plantar reas refgio constitudas por plantas que no expressam a toxina Risco para espcies no alvo?: O caso da borboleta Monarca nos Estados Unidos.
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Resistncia a herbicidas Criao de plantas agrcolas resistentes a herbicidas produo. aumento da

Glifosato (Roundup): herbicida que inibe a enzima 5-enolpiruvilchiquimato3-fosfato sintase (EPSPS) da via de biossntese dos aminocidos aromticos, via que ocorre apenas em cloroplastos e em procariticos. O glifosato eficiente em doses baixas, atinge um largo espectro de espcies vegetais, e degradado rapidamente pelos microorganismos do solo. A primeira planta transgnica resistente ao glifosato foi a variedade de soja Roundup ReadyTM (Monsanto), obtida atravs da introduo de um gene da EPSPS proveniente da bactria Agrobacterium que codifica para uma enzima resistente ao herbicida Em 2008 70% da soja cultivada a nvel mundial era constituda por variedades transgnicas resistentes a herbicidas.
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Videira, A. (2001) Escola Superior Agrria de Castelo Branco Carlos M G Reis

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Alterao na maturao de frutos Tomate transgnico Flavr Savr TM: variedade de tomate transformada de forma a no amolecer durante o amadurecimento. Consegue-se assim evitar perdas no transporte e armazenamento, e como a colheita mais tardia os frutos so mais saborosos Esta caracterstica permite manter o tomate na planta at ficar vermelho vivo e saboroso, ao contrrio do tomate normal que colhido quando ainda est verde e no chega a desenvolver o mesmo sabor. O tomate Flavr savr produz menos de 10% do nvel normal da enzima poligalacturonase, que degrada as paredes celulares e provoca o amolecimento. A diminuio dos nveis desta enzima foi conseguida atravs da estratgia antisense, por transformao com um gene que codifica para um mRNA complementar ao mRNA da enzima.
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Outra estratgia passa pelo controlo da produo de etileno, hormona responsvel pelo amadurecimento. Foram desenvolvidas estratgias antisense para as enzimas ACC sintase e ACC oxidase, enzimas da biossntese do etileno A reduo do nvel de etileno permite prolongar o perodo de armazenamento do tomate.
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Resistncia a vrus Plantas transgnicas portadoras do gene da protena da cpsula do vrus do mosaico do tabaco (TMV), apresentam um aumento significativo da resistncia infeco pelo TMV. A estratgia de transformao com o gene da cpsula de diferentes vrus tornou possvel o desenvolvimento de variedades transgnicas resistentes a vrus de vrias espcies agrcolas. Normalmente no se consegue obter uma proteco total contra o vrus mas obtm-se nveis elevados de resistncia. Uma espcie modificada geneticamente com este objectivo a Cucurbita pepo (abbora) transformada com os genes da protena de trs vrus diferentes.

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Esterilidade masculina As plantas com esterilidade masculina produzem plen invivel. Esta caracterstica til quando se pretende produzir semente hbrida F1, a qual resulta do cruzamento de duas linhas puras. Tradicionalmente linha pura que funciona como progenitor feminino tm de ser retirados os estames (emasculao) para evitar a autofecundao. A existncia de uma linha pura androestril til porque permite poupar recursos. A esterilidade masculina tem sido obtida por insero de genes de origem bacteriana, especialmente em cultivares de milho, j que a maioria das cultivares comercializadas so hbridos F1. Resistncia a fungos Plantas transformadas com gene para a protena quitinase.

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Resistncia a bactrias Plantas transformadas com gene para a protena lisozima do fagoT4 Tolerncia a condies ambientais adversas Resistncia intensidade luminosa elevada Resistncia s baixas temperaturas Resistncia secura Resistncia salinidade Melhoramento da qualidade nutritiva Aumento dos nveis de metionina As leguminosas apresentam um baixo teor em aminocidos sulfurados (metionina e cistena).
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Tm sido tentadas vrias estratgias no sentido de atravs da engenharia gentica aumentar o teor de metionina de leguminosas.

Aumento dos nveis de vitamina A e Ferro no arroz (Oryza sativa) O arroz a principal fonte de alimento de bilies de pessoas no Sudeste Asitico. Contudo a dieta baseada em arroz pobre em vitamina A e ferro. O Swiss Federal Institute tem procurado desenvolver uma cultivar de arroz com nveis elevados de -caroteno e ferro, visando a sua distribuio gratuita aos agricultores carenciados. O endosperma do arroz no possui qualquer pr-vitamina A, sendo o ltimo percursor o geranilgeranilpirofosfato GGPP. No endosperma do arroz no existem as enzimas necessrias para a converso do GGPP em caroteno.

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O arroz dourado foi criado aps cotransformao com Agrobacterium, tendo sido introduzidos genes envolvidos na sntese do -caroteno: 1.psy (fitoeno sintase) obtido da planta Narcissus pseudonarcissus 2.crt1 - obtido da bactria do solo Erwinia uredovora.

Viso simplificada da biossinttica do -caroteno.

via

As plantas geneticamente transformadas apresentam os gros de arroz de fentipo amarelo, da a designao de arroz dourado.
Fonte: http://classic.the-scientist.com/article/display/55926/;jsessionid=FAA9626275E374F81FCE075251987FCE Escola Superior Agrria de Castelo Branco Carlos M G Reis

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O endosperma do arroz possui tambm baixos nveis de ferro. Alm disso no endosperma existem elevadas concentraes de fitato (inibidor da absoro de ferro) e uma falta de protenas ricas em enxofre que melhoram a absoro do ferro. A estratgia de melhoramento da qualidade do arroz na nutrio do ferro tem envolvido: 1) 2) 3) O aumento do contedo em ferro utilizando um gene da ferritina (protena acumuladora de ferro de Phaseolus vulgaris); A reduo dos nveis de fitato utilizando um transgene para a fitase proveniente do fungo Aspergillus fumigatus; A sobre expresso de uma protena do prpro arroz rica em cistena.

As plantas transgnicas obtidas at ao momento possuem o dobro do nvel do ferro, um aumento dos nveis de cistena e alta actividade da fitase (enzima que degrada o fitato).
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