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Capitulo1- Objectivos, Conceitos bsicos, Aplicaes

O que e para que serve a biotecnologia molecular? Trata-se de uma disciplina baseada na habilidade de transferir pequenas unidades genticas de um organismo para outro, fazendo uso de tcnicas de engenharia gentica (tecnologia de DNA recombinante). O objectivo , muitas vezes, produzir um produto til ou um processo industrial. A pesquisa biotecnolgica visa a maximizao da eficincia global de reaces industriais destinadas produo de produtos biolgicos comerciais assim como encontrar microorganismos que produzam bens teis, suplementares e drogas. A biotecnologia utiliza o conhecimento de vrias disciplinas ( Engenharia Qumica, Biologia Molecular, Microbiologia, Bioqumica, Gentica e Biologia Celular) para criar um vasto leque de produtos industriais ( Drogas, Vacinas, Diagnsticos). Objectivos, Preocupaes e Consequncias Objectivos: - Providenciar oportunidade de diagnosticar e prevenir ou curar um vasto leque de doenas genticas e infecciosas; - Aumentar substancialmente o rendimento de campos de cultivo criando plantas resistentes predao, a infeces e a condies ambientais adversas; - Desenvolver organismos que produzam qumicos,antibiticos, polmeros, aminocidos, enzimas, etc; - Desenvolver animais que tenham sido geneticamente melhorados com determinados atributos; - Facilitar a remoo de poluentes e materiais txicos do ambiente; Preocupaes e Consequncias: - Iro os organismos transgnicos ser perigosos para outros organismos ou para o ambiente? - Ir o recurso a transgnicos diminuir a biodiversidade gentica populacional? - Devero os Humanos ser geneticamente modificados? - Ir o diagnstico molecular menosprezar a privacidade individual? - Ir o financiamento da biotecnologia molecular restringir o desenvolvimento de outras tcnicas? - Ir o nfase comercial significar que os benefcios desta cincia estaro apenas disponveis para pases abastados? - Ir a biotecnologia molecular agrcola prejudicar a agricultura tradicional e os seus trabalhadores? - Iro as terapias baseadas na biotecnologia suprimir os tratamentos tradicionais igualmente efectivos? - Ir a procura de patentes suprimir o livre trnsito de ideias entre cientistas?

Capitulo2- Tecnologias de DNA Recombinante


Polimerase Chain Reaction (PCR) Mtodo para isolar grandes quantidades de molculas simples de DNA. Provida de algumas sequncias conhecidas de molculas de DNA, esta tcnica pode atingir uma alta amplificao de DNA, atravs de reaces inteiramente in vitro. Essencialmente, a DNA polimerase usada para repetir a replicao de um determinado segmento. O nmero de molculas de DNA aumenta exponencialmente, dobrando em cada ciclo de replicao; assim uma quantidade de DNA significativa pode ser obtida a partir de pequenas amostras. Processo da PCR: - Dois oligonucletidos sintticos so preparados, sendo estes complementares s sequncias nas cadeias opostas do DNA alvo na posio adjacente ao final do segmento a ser amplificado (3). Estes oligonucletidos servem como primers para a replicao. - As extremidades 3 de uma sonda encontram-se orientadas de frente uma para a outra e posicionadas de forma a iniciar a sntese de todo o segmento de DNA pretendido. - O DNA isolado com a sequncia a replicar aquecido de forma a desnaturar e depois arrefecido na presena de primers em excesso (oligonucletidos sintticos). - De seguida adicionado mistura desoxinuleosidos trifosfatados (em grande quantidade), para que a replicao do primer possa ento ter inicio. - O ciclo de aquecimentos e arrefecimentos repetido 25 a 30 vezes num processador automtico, amplificando os segmentos de DNA at que eles possam ser prontamente utilizados. Esta tcnica usa uma DNA polimerase resistente ao calor, tal como a Taqpolimerase (derivada de uma bactria que vive a uma temperatura de 90C) que permanece activa aps todos os passos de aquecimento, pelo que no necessita de ser substituda. Uma escolha cuidadosa do primer a ser usado, assim como o uso de endonucleases de restrio facilita o subsequente processo de clonagem do DNA amplificado. Esta tecnologia muito sensvel: PCR consegue detectar e amplificar a mais pequena molcula de DNA numa amostra de qualquer tipo. Esta tcnica funciona optimamente se houver um conhecimento prvio da sequncia do gene a amplificar. Se no se conhecer a verdadeira sequncia pode-se correr o risco de mais emparelhamentos (Vrios locais, errados e diferentes).

Polymerase Chain Reaction (PCR)


Reaco em cadeia catalizada pela polimerase

+ DNA polimerase

dATP + Primers em + dCTP excesso dGTP dTT (Nucletidos)

1 Ciclo

2 Ciclo

3 Ciclo

Conceitos prticos sobre PCR: - Desnaturao das duas cadeias da molcula de DNA faz-se a 95C; - Emparelhamento dos primers: 50-60C (Calcular a temperatura ideal para os primers a usar); - Extenso das cadeias pela DNA polimerase faz-se a uma temperatura de 72C (Taq polimerase) Nota: A temperatura da Taq polimerase varia com o tipo de Taq que se utiliza, mas tambm com o nmero de Citosinas, isto , com o nmero de ligaes triplas presentes na molcula a amplificar. Caractersticas dos primers a usar no PCR: - ~ 20 nucletidos de DNA em cadeia simples; - Emparelhamento com o terminal 3 de cada uma das cadeias a amplificar; - Especficos para os fragmentos a amplificar; - Temperatura de emparelhamento semelhante para os dois primers do par; - No devem formar dmeros consigo prprios ou entre si;

RT-PCR Trata-se de uma tcnica derivada da PCR e que faz uso da Transcriptase reversa numa primeira fase. O uso desta enzima possibilita transcrever molculas de RNA em DNA, obtendo assim DNA complementar (cDNA) molcula de RNA. Deste modo obtm-se a sequncia codificante do gene, deixando de lado os intres, promotores e outras zonas reguladoras. Esta tcnica consiste em: - Isolamento do RNA total; - Isolamento do mRNA, tirando proveito da cauda polia, por cromatografia de afinidade usando como matriz um oligonucletido de timinas; - Sntese de cDNA (Protocolo de Gubler-Hoffman: Transcriptase reversa, DNA polimerase I e RNAse H, DNA ligase); - Amplificao por PCR utilizando primers especficos; Nota: Convm que a degradao no seja muito intensa e que o RNA clivado no se separe do DNA.O uso da DNA polimerase I faz com que haja uma substituio de RNA por DNA, utilizando os pequenos fragmentos de RNA como primers (da a importncia de clivagem sem separao). A DNAligase liga os vrios fragmentos de DNA formados. Clonagem e DNA Recombinante Um clone definido como uma populao de clulas geneticamente idnticas. A clonagem de um organismo significa a formao de um organismo geneticamente igual a outro organismo. No entanto pode-se falar tambm de clonagem de genes, ou seja a produo de mltiplas cpias de um mesmo gene. Clone de um gene: clulas contendo molculas idnticas de DNA recombinante (DNA no original daquele organismo), contendo o gene de interesse. Objectivos da clonagem de genes: - Interesse em conhecer a sequncia de DNA que codifica uma protena, no possvel saber a identidade de uma protena sem se conhecer a sua sequncia de aminocidos, conhecendo a sequncia de nucletidos que codificam essa protena possibilita essa e outras informaes; - Produo de protena recombinante ( Produo de grandes quantidades da protena codificada pelo gene inserido, com o objectivo de estud-la melhor, ou utilizala na medicina); - Insero do DNA clonado noutro organismo (produo de organismos geneticamente modificados); Utilidade da sequncia que codifica a protena: - Deduo da sequncia de aminocidos da protena; - Comparao com a sequncia de aminocidos de outras protenas; - Reconhecimento de domnios funcionais; - Previso da funo; - Previso da estrutura;

- Mutagnese: pode-se tirar concluses acerca de uma protena em estudo com o facto de se mutar uma protena numa determinada sequncia e isso inactivar a sua actividade: - Produo de anticorpos: pode-se utilizar esta capacidade de modo a produzir anticorpos especficos para protenas especficas (providencia a criao de marcadores ou sondas). Utilidade da produo de protena recombinante: - Aplicaes na medicina e biotecnologia; - Caracterizao da protena (produo de anticorpos, actividade da protena, estrutura da protena, interaces da protena com outras macromolculas, cristalizao) Nota: Protena recombinante uma protena produzida num organismo onde, naturalmente, no existiria. Como se faz a clonagem de um gene: Uma variedade de tcnicas, referidas como tcnicas de DNA recombinante , so utilizadas para clonar DNA (DNA recombinante: qualquer molcula de DNA composta de sequncias derivadas de uma fonte diferente daquelas onde se encontra). A chave para clonar o fragmento de DNA de interesse lig-lo a um vector, que se pode replicar dentro de uma clula hospedeira. Aps uma simples molcula de DNA recombinante (Vector + fragmento de DNA inserido) ser introduzida numa clula hospedeira, o DNA replica-se juntamente com o vector gerando um largo nmero de molculas de DNA idnticas. Processo enzimtico da clonagem: Apenas molculas de DNA relativamente pequenas podem ser clonadas em qualquer dos vectores disponveis. Por esta razo a grande cadeia de DNA que constitui o genoma de um organismo necessita ser clivada em fragmentos menores de modo a que estes possam ser inseridos no vector de DNA. Dois tipos de enzimas facilitam a produo das molculas de DNA recombinante enzimas de restrio e DNA ligases. As enzimas de restrio so endonuleases, produzidas por bactrias, que clivam as molculas de DNA em pequenos fragmentos. Estas enzimas reconhecem sequncias especficas de 4 a 8 nucletidos, designadas por locais de restrio. Os locais de restrio so geralmente palindromas, isto , a sequncia igual nas duas cadeia de DNA quando lidas na direco 5- 3. As enzimas de restrio provocam a formao de extremidades coesivas nas duas cadeias de DNA no seu local de restrio, formando-se ento fragmentos que possuem uma cauda em cadeia simples nas duas extremidades. A cauda formada num fragmento complementar da formada no outro fragmento pela mesma enzima de restrio( sendo estas capazes de emparelhar entre si temperatura ambiente).

O DNA isolado de um organismo individual possui uma sequncia especfica, que apenas por acaso vai conter uma srie de locais de restrio. Deste modo uma determinada enzima de restrio vai cortar o DNA numa srie de fragmentos reprodutveis (fragmentos de restrio). Os fragmentos de DNA podem ser inseridos no vector de DNA com a adio de DNA ligases. Durante a replicao normal do DNA, as DNA ligases catalizam a ligao da extremidade 3 extremidade 5 adjacentes dos fragmentos Okazaki. No caso da clonagem esta enzima promove a ligao entre as extremidades dos fragmentos de restrio e os vectores que possuem extremidades complementares. O vector e o fragmento de restrio ligam-se covalentemente por ligaes fosfodister padro.

Plasmdeos de E. coli Plasmdeos so cadeias duplas de DNA circular separadas do cromossoma da clula. Este DNA extracromossomal que ocorre naturalmente em bactrias e em eucariticos inferiores (leveduras) existe em relaes de parasitismo ou simbiose com a sua clula hospedeira. Tal como o cromossoma bacteriano o plasmdeo replicado antes de cada diviso celular. Durante a diviso, cpias do plasmdeo segregam para cada clula filha, assegurando a continuidade do plasmdeo atravs de sucessivas geraes. Os plasmdeos mais usados em tecnologia de DNA recombinante so os E. coli. Investigadores conseguiram j manipular estes plasmdeos de forma a optimizar o seu uso como vectores na clonagem de DNA. Assim, alteraes em pores desnecessrias para o funcionamento normal dos plasmdeos de E. coli produzem um vector de aproximadamente 1.2 3 kb em comprimento circunferencial, que contm trs regies essenciais clonagem: uma origem de replicao, um marcador que permite a seleco, usualmente um gene de resistncia a antibiticos e a regio de insero dos fragmentos de DNA exgenos. Enzimas de replicao da clula hospedeira promovem a replicao do plasmdeo a partir da origem (ORI, uma sequncia com 50 a

100 nucletidos). Uma vez que a replicao do DNA tenha comeado ela continua volta do plasmdeo a partir do plasmdeo circular qualquer que seja a sua sequncia de nucletidos. Deste modo qualquer sequncia de DNA num plasmdeo replicada durante a replicao deste. A figura que segue ilustra a clonagem de DNA utilizando um plasmdeo de E. coli como vector. Quando clulas de E. coli so misturadas com vectores de DNA recombinantes, sob determinadas condies, uma pequena fraco de clulas vai tomar o plasmdeo, este processo conhecido como transformao. Tipicamente uma clula em cada 10.000 incorpora um nico plasmdeo, esta clula diz-se transformada. Aps o vector ser incubado em E. coli, aquelas clulas que incorporam o plasmdeo podem ser facilmente seleccionadas do outro elevado nmero de clulas. Agora, se o plasmdeo transportar um gene de resistncia a um antibitico (p. e. ampicilina), as clulas transformadas podem ser seleccionadas fazendo-as crescer num meio contendo ampicilina, s aquelas que incorporam o gene de resistncia sobrevivem. Fragmentos de DNA de poucos pares de bases, cerca de 20 kb, so comummente inseridos no vector. Se precaues especiais forem tomadas para evitar manipulaes que possam mecanicamente partir o DNA, at longos fragmentos de DNA podem ser inseridos no plasmdeo. Quando um plasmdeo recombinante com um fragmento de DNA inserido transforma uma clula E. coli todos os genes de resistncia presentes na progenia sero transmitidos aos seus descendentes e toadas as clulas que surjam desta linha possuiro plasmdeos com os mesmos genes inseridos. O DNA inserido replicado ao longo da replicao do plasmdeo e segregado para as clulas filhas medida que a colnia cresce. Desta maneira o fragmento de DNA inicial replicado na colnia num largo nmero de cpias idnticas. Visto que rodas as clulas na colnia originaram-se de uma nica clula parental transformada, elas constituem clones da clula parental, e o segmento inserido no plasmdeo parental referido como clone de DNA, ou DNA clonado. A versatilidade de um vector de plasmdeo E. coli aumenta com a incorporao de um polilinker, uma sequncia sinttica que contm uma cpia de vrios locais de restrio que no esto presentes em mais nenhum local do plasmdeo. Quando tal vector tratado com enzima de restrio que reconhece um desses locais de restrio, o vector cortado apenas uma vez (dentro do polilinker). Subsequentemente qualquer fragmento de DNA de tamanho apropriado produzido utilizando a(s) mesma(s) enzima(s) de restrio pode ser introduzido nesta zona utilizando DNA ligase. Plasmdeos que possuem uma regio polilinker permitem ao investigador clonar fragmentos de DNA gerados com diferentes enzimas de restrio usando o mesmo plasmdeos, o que simplifica o procedimento experimental. Como evitar a re-ligao do plasmdeo Aps a clivagem com enzimas de enzimas de restrio, como referido, os plasmdeos ficam com duas extremidades complementares livres, s quais ns pretendemos adicionar o fragmento de DNA a clonar. com isto surge o problema destas duas extremidades se unirem novamente, fechando o plasmdeo. durante o processo de

transformao das clulas ns no somos capazes de distinguir os plasmdeos fechados vazios dos plasmdeos fechados com o fragmento a clonar. Assim corremos o risco de transformar bactrias com plasmdeos vazios, cultivlas (os plasmdeos vazios possuem na mesma o gene de resistncia) e depois no ter qualquer resultado. Para que isto no acontea necessrio por vezes recorrer a algumas tcnicas. 1- Clivagem com duas enzimas de restrio Provoca a existncia de duas extremidades diferentes no complementares, pelo que j no possvel a re-ligao. De notar que neste caso temos tambm de clivar o nosso fragmento com as mesmas enzimas de restrio. Este o processo mais simples para impedir a existncia de plasmdeos vazios, o nico problema que acarreta certificarmo-nos que nenhuma das enzimas de restrio digere o fragmento a clonar. 2- Tratamento com fosfatase alcalina Aps a incubao com enzimas de restrio segue-se um tratamento com esta enzima que vai clivar o fosfato no terminal 5. Deste modo a T4 DNA ligase no consegue actuar. Quando o fragmento de DNA se junta ao plasmdeo ele fornece dois grupos fosfato o que possibilita a formao de duas ligaes fosfodister. Mesmo assim o plasmdeo continua com falhas em duas outras regies. Quando se d a transformao das clulas, a prpria maquinaria celular trata de reparar estas falhas, obtendo assim um plasmdeo com o fragmento a clonar e as clulas transformadas.

3- Seleco azul e branca No se trata de um processo para evitar plasmdeos vazios, mas sim para os identificar. Usa-se um plasmdeo cujo local de clonagem esteja presente no meio de um gene (habitualmente o lacZ), e faz-se uma clonagem normal. No caso do plasmdeo integrar o fragmento de DNA, vai haver uma interrupo no gene lacZ e no vai haver produo de -galactosidase, se o plasmdeo se fechar sobre si mesmo e formar um plasmdeo vazio ento h produo normal da -galactosidase e ocorre degradao da lactose. Fazemos a cultura das clulas num meio apropriado com IPTG (um anlogo da lactose, que quando degradado forma um precipitado azul). Depois de deixar de crescer podemos ver colnias azuis e colnias brancas, as colnias azuis significam que ouve expresso de -galactosidase e por isso as clulas foram transformadas com um plasmdeo vazio. As colnias brancas significam que no ocorreu expresso da galactosidase, e por isso o plasmdeo que as transformou possua o fragmento inserido. Nota: A integrao dos plasmdeos nas clulas um processo pouco eficaz e muito lento devido a alguns aspectos mas principalmente diferena de cargas entre o DNA () e a membrana celular (apolar, com regies hidrofbicas e selectividade). Deste modo so muitas vezes usados processos artificiais para inserir os plasmdeos, como a porao elctrica ou por tratamento com CaCl2, ou pelo uso de bacterifagos que possuem uma elevada taxa de eficincia na infeco de bactrias (mais de 98%). Biblioteca de cDNA At agora sempre que se falou de tcnicas de Biologia Molecular partiu-se do princpio que j se conhecia a sequncia do gene a utilizar. Mas e se pretendermos estudar um gene ou poro dele que ainda no tenha sido estudado e por isso se desconhea a sua sequncia? Como se procura e encontra o cDNA codificante de protenas de interesses cujos genes ainda no so conhecido? Hoje, com a sequnciao do genoma de tantos organismos diferentes torna-se cada vez menos frequente esta prtica. De facto hoje a primeira coisa a fazer-se uma pesquisa da sequncia do gene ou do cDNA numa base de dados disponvel na Internet. Para a replicao do gene necessitamos no do gene em si mas da sequncia de DNA complementar do mRNA (cDNA) que codifica a protena em estudo. O cDNA difere do gene porque no possui intres. importante conhecer o gene que d origem a uma protena para sabermos como a expresso desta e como pode ser controlada, mas quando se quer apenas expressar uma protena (por clonagem, p. e.) convm ter o gene sem intres, ou seja, o cDNA. Assim, se se quer produzir cDNA a partir do mRNA presente num determinado tipo de clulas onde o mRNA

pretendido exista com alguma abundncia. No podemos pegar numa clula qualquer do corpo do organismo. Uma biblioteca de cDNA um conjunto de clones representativo de todo o mRNA de um conjunto de clulas, a dada altura do desenvolvimento. E para o desenrolar deste processo parte-se do conjunto de molculas de cDNA correspondentes a toadas as clulas de mRNA presentes neste tecido numa dada altura, criam-se todas estas molculas de cDNA a partir de transcrio reversa. Assim a construo de uma biblioteca envolve os seguintes passos: Construo e Rastreio. Nota: cDNA s se coloca esta questo quando se trata de genes eucariticos. Com as procariotas o cDNA igual ao DNA genmico, por isso, geralmente as bibliotecas de genes procariotas so quase sempre bibliotecas genmicas. (os procariotas no possuem intres) Construo: - Extraco do RNA total (Tecido ter em ateno qual) - Isolamento do mRNA - Sntese do cDNA em cadeia dupla - Ligao a um vector (bacterifago ) - Infeco de clulas hospedeiras (E. coli) Deste modo comea-se por isolar o RNA total da clula e depois extrai-se o mRNA do RNA total, por cromatografia de afinidade que tira partido da cauda de poliA para distinguir entre mRNA e os outros tipos de RNA. Colocando oligonucletidos com sequncias de timinas na matriz da coluna de cromatografia, este liga a cauda poliA e deixa todos os outros RNAs passar, ficando o mRNA retido. Depois, para desligar o mRNA da resina da coluna da cauda de poliA aumenta-se o pH na coluna por utilizao de uma soluo com muito sal. Depois de isolar os mRNA presentes nas clulas necessrio por transcrio reversa transformar estes em cDNA de modo a poder utiliz-los na biblioteca. Para isso pode-se novamente tirar partido da cauda de poliA e usar como primer um oligonucletido de timina (no esquecer que as transcriptases do DNA polimerases e por isso necessitam de um primer). Assim ficamos com uma cadeia de DNA em cadeia simples hbrida com uma molcula de RNA. Mas como a ligao do cDNA a um vector tem de ser feita com uma cadeia de DNA de dupla hlice temos de destruir a cadeia de RNA. podemos faz-lo pelo de RNAses ou de alkali, que corta a cadeia de RNA, e apenas a cadeia de RNA, em pequenos fragmentos que se vo desligar da cadeia de DNA. estes pequenos fragmentos vo ser teis porque podem depois ser usados como primers na amplificao deste fragmento. Assim fazemos PCR para ampliar esta cadeia, mas usamos DNA polimerase I, de modo a garantir que depois da sntese os oligonucletidos de RNA so retirados. , contudo, necessrio depois ligar estes cDNA a sequncias de restrio de moda a poder lig-los a vectores de clonagem. Ento necessrio ligar sequncias de restrio em ambas as extremidades do nosso cDNA, isto consegue-se usando cadeiras duplas contendo a

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sequncia de restrio e DNA ligase do bacterifago T4 que capaz de juntar cadeias de DNA em dupla hlice blunt-ended. Embora este tipo de reaco no seja muito eficaz, ns podemos aumentar a sua eficincia usando uma elevada concentrao de ligandos. As cadeias resultantes so ento tratadas com uma enzima de restrio dando origem a molculas de cDNA com sticky ends. O passo final da construo da biblioteca a ligao destes pedaos de cDNA ao vector de clonagem (plasmdeo ou vector viral) que j foi anteriormente tratado com a mesma enzima de restrio e portanto possui sticky ends complementares. O uso de bacterifagos como vectores de clonagem torna esta tcnica mais eficiente do que o uso de plasmdeos. Por isso usamos o bacterifago ao qual ligmos o nosso cDNA, inserindo-o por complementaridade dos sticky ends do cDNA a clonar e o genoma do vrus. Depois de se ligar o cDNA ao DNA viral h que construir um vrus eficiente para que possa infectar as bactrias. Para isso adiciona-se num tubo de ensaio o DNA viral modificado e as protenas que compem a cpsula viral e elas organizamse automaticamente para formar a cpsula. No final juntamos estes vrus funcionais a uma caixa de petri com bactrias em cultura. Estas vo ser infectadas pelos vrus e vo-se replicar formando colnias de bactrias em cultura. Estas vo ser infectadas pelos vrus e vo-se replicar formando colnias de bactrias infectadas de vrus (cada bactria s infectada por um vrus, e devido elevada eficincia destes, mais de 90% dos vrus infectam pelo menos uma clula). Mais tarde, devido ao elevado nmero de vrus (produzidos por ciclo ltico) dentro das clulas, elas rebentam e espalham os vrus, as zonas da colnia rebentada chamam-se placas fgicas.

O ciclo ltico de um vrus consiste na produo de mais cpias de si mesmo, isto possvel porque o genoma viral natural, assim como o utilizado, tm sequncias que codificam protenas para a cabea e cauda do invlucro do vrus. O vrus quando infecta bactrias pode integrar o seu genoma hospedeiro e reproduzir-se com a bactria (ciclo lisognico) ou ento pode tirar partido da maquinaria celular e comear a produzir vrias cpias de si mesmo (replicar, transcrever e traduzir o seu genoma) ciclo ltico , o elevado nmero de cpias geradas por este processo acabam por rebentar com a clula (lise).

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Assim, dado que cada bactria apenas infectada por um vrus, criam-se placas fgicas (clone) resultantes de apenas uma bactria me, ou seja, temos numa placa fgica vrias cpias de um cDNA inserido. E em cada placa fgica existe um cDNA diferente, pois derivam de vrus diferentes com diferentes cDNAs introduzidos. Bacteriofago em ciclo ltico

Rastreio: Primeiro o que temos de fazer transferir uma amostra de todas as placas fgicas para uma membrana, de modo a podermos manipul-las sem danificar toda a placa. Assim, coloca-se um filtro de nitrocelulose a cobrir as placas fgicas e parte destas vai ser transferida para a membrana; a partir daqui trabalharemos sempre com esta membrana. De seguira pegamos na membrana e incubamo-la numa soluo alcalina de forma a provocar a lise de todos os vrus e libertar o seu material gentico. Depois de extrado, a membrana incubada a altas temperaturas de forma a desnaturar as cadeia de DNA em dupla hlice hibridizada com uma sonda marcada com fosfato radioactivo ou com fluorescncia. Esta sonda possui uma sequncia complementar a uma zona do cDNA a detectar, por isso ela apenas se vai ligar ao nosso DNA, deste modo atravs da tcnica de autorradiografia podemos detectar qual a zona marcada radioactivamente na membrana de celulose, e por correspondncia sabemos qual a placa fgica que possui o cDNA que nos interessa. Agora podemos ir buscar o nosso cDNA directamente placa e utiliz-lo para os mais diversos fins.

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Mas se um dos objectivos desta tcnica descobrir qual a sequncia de DNA que d origem a uma protena, como construmos uma sonda complementar? possvel produzir uma sonda complementar se se conhecer uma sequncia parcial do nosso cDNA, nesse caso sintetizamos um oligonucletido complementar, caso no se conhea nenhuma sequncia parcial podemos sempre tirar partido de informaes anteriores, caso seja cDNA codificante para um factor de transcrio ou uma protena de determinada famlia que possua uma regio conservada, podemos tirar partido disto e construir uma sonda complementar a esta zona conservada. Imaginando que se trata de uma protena bastante conhecida em outros organismos como a actina, se estivermos a estudar a actina de Capivara podemos sempre fazer uma sonda partindo da sequncia conhecida de actina de ratinho, porque elas no ho-de variar muito. Caso no se tenha qualquer destes conhecimentos, a hiptese que nos resta sequenciar a protena em estudo e tentar criar uma sonda, tendo como base a sequncia da protena. Temos, no entanto, de ter vrios aspectos em ateno: o cdigo gentico degenerado pelo que um aminocido pode ter sido originado a partir de vrios codes e no sabemos ao certo qual deles foi. Por isso escolhemos uma zona em que a variabilidade de codes possvel seja menos. E tambm conveniente ter em conta a frequncia de codes utilizados por aquela espcie. Se partida j sabemos que em 80% dos casos a Capivara utiliza o codo CCA para codificar Prolina, ento usamos esse mesmo codo na nossa sonda, pois mais provvel que seja esse o correcto. No caso de construirmos a sonda atravs da sequncia de aminocidos da protena temos muitas vezes de construir mais uma sonda devido s vrias possibilidades de sequncias do cDNA. Por isso, tambm convm escolher um local e uma sequncia que no seja muito varivel, pois isso iria dar mais trabalho e dispndio de dinheiro, assim como podia no ser especfico.

Depois de sintetizar a sonda e de a marcar radioactivamente pode-se utiliz-la como descrito anteriormente. Em mais pormenor:

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Biblioteca Genmica No caso de se pretender obter o gene tal e qual ele existe no ncleo, com intres, exes e promotores, no podemos fazer uma biblioteca de cDNA, em vez disso temos que fazer uma biblioteca genmica conjunto de clones representativo de todos os genes de um organismo. A construo de uma biblioteca genmica bastante semelhantes construo de uma biblioteca de cDNA, tambm esta composta por duas partes principais: Construo e Rastreio. Construo: - Extraco do DNA - Digesto parcial com uma enzima de restrio - Ligao a um vector (bacterifago ) - Infeco de clulas hospedeiras (E. coli) A extraco do DNA processa-se de maneira diferente, pois no interessa qual o tipo celular que utilizamos dado que o que queremos o genoma completo e esse est presente em todas as clulas. Para extrair os genes o que temos de fazer clivar todo o genoma com enzimas de restrio de modo a obter fragmentos pequenos que vo ser ligados a vectores e infectar as clulas hospedeiras. A estratgia de clonagem igual em ambas as bibliotecas, clivagem, ligao ao DNA viral, infeco, construo de placas fgicas. De seguida temos de fazer o screening (rastreio) das placas para encontrar o genoma viral associado ao fragmento de DNA com o gene de interesse. O rastreio igual ao rastreio usado na construo de uma biblioteca de cDNA. A construo da sonda pode ser feita de igual maneira ou, caso j haja informao de qual o cDNA para a protena codificada por este gene, podemos ainda tirar partido desta informao. Contudo, a biblioteca no termina por aqui. ainda necessrio fazer-se um Southern Blot de modo a identificar quais as pores importantes do nosso gene. Southern blot Consiste na anlise de um genoma clivado em vrios fragmentos por enzimas de restrio, nos quais queremos saber qual(ais) o(s) fragmento(s) que correspondem ao nosso gene fragmentos aos quais a sonda se liga. Para isso, clivamos o nosso genoma (no caso da biblioteca genmica, clivamos o fragmento presente na placa fgica com resultado positivo) e corremos em electroforese, de modo a separ-los por peso molecular. De seguida transferimos o contedo do gel para uma membrana formando-se uma rplica do gel. De seguida incuba-se a membrana com a sonda usada no rastreio, esta vai ligar-se a alguns fragmentos resultantes da segunda digesto por enzimas de restrio (inicio do Southern blot), esses fragmentos so os fragmentos que correspondem ao nosso gene, os fragmentos a que ela no se ligar so exteriores ao gene.

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Ateno: Durante a primeira clivagem com enzimas de restrio usa-se uma quantidade mnima destas enzimas de moda a que a digesto seja parcial (incompleta). Isto faz com que alguns cromossomas de umas clulas sejam cortados em pedaos mais pequenos e outros de outras clulas em pedaos maiores. Com isto o que ns podemos ter (e termos) so fragmentos do gene que nos interessa de vrios tamanhos, cada um deles proveniente de cromossomas de diferentes clulas que sofreram diferentes digestes. Ns vamos tirar partido disto, porque aps o primeiro Southern blot podemos no possuir a sequncia total do gene (muito dificilmente obteremos isso logo primeira). Assim, pegamos na informao que o primeiro Southern blot nos d e construmos uma nova sonda para uma zona que no aquela que foi usada na primeira sonda. Com esta nova sonda voltamos a fazer um rastreio da biblioteca genmica (membrana e autoradiografia), provavelmente obtemos outras placas marcadas, e fazemos novo Southern blot. Isto repete-se at se possuir toda a sequncia do gene. A este processo de percorrer o gene chama-se Chromosome Walking. Pegando e comparando a informao obtida por cada Southern blot conseguimos alinhar toda a sequncia do gene. Para conhecer os exes e intres basta comparar a sequncia do gene com a cDNA, ou ento, procurar as sequncias tpicas, presentes nos intres, reconhecidas pelo spliciossoma. Anlise dos Nveis de Expresso de uma Protena J sabemos que uma protena est presente, qual o seu cDNA e at mesmo qual o gene que a codifica, mas e a quantidade desta? Ser que ela necessria em grande quantidade ou em pequena quantidade? Existem vrias maneiras de analisar os nveis de expresso de uma protena, desde formas qualitativas at formas quantitativas. E esses estudos podem ser a nvel da prpria protena ou por anlise do mRNA que lhe d origem. Uma das formas qualitativas de o fazer por hibridizao in situ por anlise de um gene reprter, criando um organismo transgnico onde se associa o promotor dessa protena (por isso necessrio conhecer o gene que a codifica e no apenas o cDNA) a um gene essencial sobrevivncia da clula, pelo que a sua produo da protena reprter no vai ser prejudicial clula e vai-nos ser til, pois o seu nvel de expresso, ou o do seu mRNA vai ser igual ao da protena em estudo. Podemos ainda aproveitar o facto de se conhecer a sequncia do promotor para estudar em que zona se ligam os

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factores de transcrio (eliminando sequncias deste) e analisando depois a expressai do gene reprter. O uso de genes reprteres bom porque no interfere com o desenvolvimento do organismo. Outro processo para analisar os nveis de expresso por Northern blot, o processo equivalente ao utilizado em southern blot, alterando apenas o incio. Com Northern fazemos uma anlise dos RNA em ds de DNA, a sonda feita a partir de sequncias de cDNA conhecidas. Assim vemos qual a quantidade de RNA marcado e tiramos concluses.

1-Western blot No varia muito de todos os outros blots falados at agora, a principal diferena a anlise de protenas em vez de DNA (Southern) ou de RNA (Northern), a sonda usada um anticorpo especfico para a protena. Comea-se por se desnaturar as protenas, pois a protena nativa pode esconder a zona reconhecida pelo anticorpo. De seguida faz-se uma electroforese (em condies desnaturantes) e faz-se um blot (passagem do resultado da electroforese para uma membrana) e incubamos o anticorpo. Para visualizarmos incubamos esta membrana com um anticorpo secundrio, marcado radioactivamente (ou com flurforos ou com fosfatos alcalina ou enzimas reprter), especfico para o primeiro. O uso do anticorpo secundrio tem vantagens no sentido em que pode ser usado vrias vezes em vrias experincias, diminuindo o gasto econmico, assim como a produo de vrios anticorpos marcados (uma para cada experincia, cada blot). Nota: Para podermos identificar por imunodeteco importante que a nossa protena esteja a ser expressa, por isso temos de ter em ateno o tipo de biblioteca e vector em uso. 2- Identificao por Anlise Proteica o mtodo de identificao mais directo possvel, poupa muito trabalho em fases seguintes, pois s possvel identificar se a enzima estiver activa, ou seja, completa e funcional. Podemos fazer a identificao por ensaio enzimtico na prpria placa, atravs do uso de substratos modificados que emitam cor, ou luz, ou usando meios de sobrevivncia (onde s sobrevive aquela colnia que possuir a enzima activa gene todo e funcional). Depois as fases seguintes so mais fceis, porque sabendo que o gene se encontra completo naquela colnia poupa trabalhos como o gene walking. Bastando apenas cultivar aquela colnia de clulas e proceder sequnciao de genes.

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3- Complementao Funcional o mtodo mais invulgar e difcil, alm disto demora mais a ser elaborado. Numa fase inicial constri-se toda a biblioteca genmica com determinada estirpe bacteriana (+), no final transforma-se uma outra estirpe (-), a qual s sobrevive na presena do gene A+ e A-, pelo que estes sero os seleccionados.

Um outro mtodo indirecto para a quantificao de protena o uso de PCR em que as molculas de RNA so ampliadas de acordo com a sua concentrao inicial. Isto , na clula quantidades destes RNAs podem ser vestigiais e por isso no so detectadas, assim quando sujeitas a PCR elas vo ser ampliadas em proporo assim, conhecendo a expresso do RNA de uma protena podemos comparar a expresso da nossa protena. No entanto, esta tcnica trs desvantagens, como no caso das protenas terem expresses muito semelhantes, a diferena entre as duas bandas pode no ser muito notria, visto o PCR ter uma amplificao exponencial. Para contornar este problema faz-se um ajuste ao protocolo, fazendo medies da quantidade de DNA em intervalos de tempo. Sequenciao de Genes Depois do rastreio da nossa biblioteca vamos sequenciar o gene clonado de modo a podermos obter a sequncia de nucletidos e, consequentemente, a de aminocidos (caso ainda no se conhea) e a identidade da protena. Ou podemos apenas querer saber a sequncia de nucletidos a fim de podermos utilizar esta informao em trabalhos posteriores, como clonagem ou organismos transgnicos. O mtodo mais utilizado nesta sequnciao o mtodo de Sanger. Este faz uso de um primer (convm saber qualquer coisa sobre o fragmento a sequenciar, ou ento, caso se faa esta tcnica com o uso de vrus tambm podemos utilizar um primer complementar de ao DNA viral na zona de insero do cDNA primers para o vector e de ddNTPs marcados. Fazem-se quatro reaces em tubos de ensaio diferentes, onde se coloca o DNA, DNA polimerase e dNTPs normais,

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contudo tambm se adicionam dNTPs modificados, ou seja, ddNTPs. Estes possuem uma alterao no grupo OH 3, que substitudo por um H (pra a transcrio) e encontram-se marcados com fluorescncia. Assim, no primeiro tubo de ensaio coloca-se para alm dos trs componentes principais (DNA, DNA polimerase e dNTPs) coloca-se tambm ddGTP, deste modo, dado que este no possui o grupo 3OH, a transcrio pra quando este adicionado. Nos outros tubos adiciona-se o mesmo mas em cada um deles um ddNTP diferente. Assim, a cada adio de um ddNTP a transcrio pra, o que se passa no primeiro tubo ilustrado na figura ao lado, a cada adio de G modificada a transcrio pra e assim formam-se vrias molculas de vrios comprimentos. A presena de G no modificadas em maior quantidade permite que estas tambm sejam adicionadas e deste modo a transcrio no parar sempre no primeiro nucletido de G. Com isto vo haver cadeias que pararam a sua sntese na primeira G, outras que interromperam na segunda, e assim sucessivamente at quelas que foram at ao final sem serem travadas.

Depois das vrias cadeias serem sintetizadas corre-se em electroforese por tamanho molecular, as molculas mais pequenas (aquelas que foram travadas no incio) correm mais no gel, porque so mais pequenas, enquanto as maiores correm menos porque so maiores e no passam to bem nos poros. Assim, a cadeia que se deslocar mais ser aquela que parou logo no primeiro nucletido e assim sucessivamente, como mostra a figura. Neste caso foram feitas quatro reaces diferentes para cada um dos nucletidos diferentes em quatro tubos separados e correram-se em diferentes poos na electroforese. Nestes casos mais comum marcar os ddNTPs radioactivamente do que com marcadores fluorescentes, a leitura faz-se da mesma maneira consoante a posio relativa de cada banda no gel. Podemos por vezes encontrar bandas mais intensas que outras, isso depende do nmero de cadeias que foram travadas naquela posio. Ateno, para fazer a separao de fragmentos de DNA que variam to pouco (diferenas de um nucletido por vezes) tem de se usar um gel poliacrilamida. Notar que esta tcnica tem de ser feita com o DNA em cadeia simples, ou seja, depois de sintetizar as cadeia necessrio submet-las primeiro a um processo desnaturante.

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Mas e se o que queremos sequenciar muito grande? E se as diferenas entre as bandas forem to pequenas que no sejam fceis de distinguir qual est primeiro e qual est depois? Para isso usa-se a sequenciao automtica e marcam-se os ddNTPs com fluorescncia (neste caso no pode ser por radioactividade), mas pode-se fazer ocorrer todas as reaces no mesmo tubo de ensaio, juntando todos os ddNTPs. Aps a sntese estar completa desnaturam-se as molculas e procede-se um electroforese capilar que tem muito mais sensibilidade para as diferenas no tamanho das molculas, alm disso utilizam-se leitores a lazer que detectam com tamanha preciso variaes na absorvncia (cor) das bandas e possibilitam uma leitura mais eficiente electrofluorograma. Onde cada pico corresponde a um nucletido, o tamanho dos picos variam com a concentrao de molculas daquele tamanho. A leitura faz-se da esquerda (5) para a direita (3).

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Capitulo3- Bioinformtica
O que a bioinformtica? A bioinformtica a fuso da biologia com sistemas tecnolgicos de informao. o ramo da cincia que lida com anlise computadorizada de dados biolgicos. Nos programas de bioinformtica h registo de uma grande variedade de sequncias de aminocidos ou nucletidos, assim como estruturas tercirias e quaternrias de protenas. Essencialmente a bioinformtica uma base de dados e a sua consulta necessria para a realizao de grande parte das tcnicas que so abordadas nesta disciplina. A bioinformtica no pode ser vista como um captulo independente, mas sim como o ponto de partida ou base de todos os captulos da biotecnologia e de outras cincias. Basicamente a bioinformtica necessria para: - Identificar protenas; - Desenhar estratgias, ou parte delas; - Procurar homologias; O que est disponvel na Internet? EMBL EBI: Base de dados de artigos, sequncias, microarrays, servios MEROPS: Base de dados para enzimas Nota: A informao igual para as diferentes bases de dados, pois estas esto interligadas.

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Capitulo4- Produo de Protena Recombinante


1- Produo de Protena Recombinante em Procariotas
O objectivo principal da clonagem de um gene com aplicaes biotecnolgicas a sua expresso num organismo hospedeiro. No entanto, a introduo de um gene num o vector de clonagem no significa necessariamente sucesso na sua expresso. Para alm disso sempre necessrio uma expresso elevada da protena. Em resposta a esta elevada necessidade, muitas foram as estratgias de clonagem desenhadas usando e especializando diferentes vectores por manipulao gentica, estas no aumentam apenas a sua produo, como tambm a optimizam. Estas modificaes incidem sobre um variado nmero de elementos que controlam a transcrio, traduo, estabilidade proteica, limitaes ao oxignio e a segregao na clula do hospedeiro. Mais especificamente, as caractersticas moleculares a manipular incluem: - Natureza do promotor e a sequncia terminal; - Fora da ligao ao ribossoma; - Nmero de cpias do gene clonado e se este integrado num plasmdeo ou inserido no genoma do hospedeiro; - Localizao celular final da protena produzida; - Eficincia na traduo do organismo hospedeiro; - Estabilidade intrnseca do gene clonado na clula hospedeira; No existe uma nica estratgia para atingir a expresso mxima de todos os genes a clonar. A maioria dos genes clonados possuem propriedades moleculares distintas que requerem um investimento de tempo e esforo, antes de se encontrar um determinado conjunto de condies que resultem num nvel de expresso aceitvel. O nvel de expresso obtido tambm varia com a identidade do organismo utilizado na expresso. O mais comum E. coli, mesmo apesar de existir um vasto nmero de procariotas e eucariotas capazes de expressar genes estrangeiros. Contudo muitos outros organismos como a bactria Bacillus subtilis, leveduras como a Saccharomyces cerevisae, animais, plantas e clulas de insectos e mamferos em cultura. De notar que nunca uma estratgia desenhada para E. coli deve, em principio, ser utilizada nos outros sistemas. Nota: Uma protena nica e diferente de todas as outras, por isso uma estratgia corrente nem sempre funciona e podem ser necessrio uma ou mais alteraes de modo a conseguir expressar correctamente a protena em causa. Alteraes ao nvel do promotor O requisito mnimo para a expresso eficiente de um gene a presena de um promotor forte e regulvel a montante do gene a clonar. Um promotor forte um promotor com alta afinidade para a RNA polimerase. A capacidade de regular um promotor possibilita clula e ao investigador o controlo da extenso da transcrio de forma precisa. Nota: o promotor do opero Lac de E. coli tem sido altamente utilizado para a expresso de genes clonados. Contudo, outros promotores com caractersticas distintas tambm tm sido teis no controlo da expresso de protenas. 21

Desta forma, um modo fcil para aumentar a expresso de um gene seria colocar um promotor forte na regio a montante desse gene. Contudo, um nvel elevado de produo e a sua expresso contnua muitas vezes prejudicial para a clula hospedeira. A instabilidade do plasmdeo o maior problema que a expresso de protenas enfrenta, isto porque todo ou uma poro do plasmdeo que contm o gene a ser expresso continuamente pode ser perdido ao fim de algumas divises celulares, dado que as clulas sem plasmdeo crescem mais rapidamente. Para ultrapassar este obstculo necessrio o controlo da transcrio de forma a que o gene clonado seja expresso apenas em estgios especficos do ciclo de vida da clula hospedeira (baixa expresso da protena numa fase precoce do desenvolvimento, e alta quando a clula hospedeira j est desenvolvida). Isto consegue-se pelo uso de promotores fortes e regulveis. Os plasmdeos construdos para atingir esta tarefa so chamados vectores de expresso. Promotores regulveis: Os mais usados so os operes Lac e Trp de E. coli. 1- Opero lac As bactrias possuem um mecanismo geral muito simples, para coordenar a regulao de genes que codificam produtos que participam numa srie de processos relacionados. Estes genes encontram-se reunidos no cromossoma e so transcritos juntos. Muitos mRNAs procariticos so policistrnicos muitos genes num nico transcrito e o nico promotor que inicia a transcrio desta reunio , tambm, zona de regulao para a expresso destes genes. O conjunto de genes do promotor, e sequncias adicionais que funcionam juntos na regulao, chamado de opero.

Muitos dos princpios da expresso gnica em procariotas foram inicialmente definidos por estudos do metabolismo da lactose em E. coli, que pode usar a lactose como sua nica fonte de carbono. O opero da lactose (lac)inclui o gene da galactosidase (z), galactosidase permease (Y) e thiogalactoside transacetylase (A). Esta ultima parece modificar galacatosdeos txicos para facilitar a sua remoo da clula. Cada um destes trs genes precedido por um local de ligao de ribossomas, que independentemente direcciona a traduo daquele gene. A regulao do opero lac por protenas repressoras lac segue os padres delineados anteriormente. Estudos de operes lac mutantes revelaram alguns detalhes no funcionamento do sistema de regulao dos operes. Na ausncia de lactose, os genes do opero lac so reprimidos. Mutaes no operador ou noutro gene, no gene I, resultava numa sntese constitutiva dos produtos dos genes.

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Quando o gene I defeituoso, a represso pode ser restaurada pela introduo do gene I funcional na clula numa outra molcula de DNA, demonstrando que o gene I codifica uma molcula difundvel que causa a represso do gene. Esta molcula, uma protena, agora chamada o repressor lac. O operador ao qual ele se liga mais fortemente (O1) bloqueia a iniciao da transcrio. O gene I possui o seu prprio promotor (PI) independentemente dos genes do opero lac. O opero lac possui, ainda, dois locais de ligao do repressor. Um deles (O2) encontra-se na regio +410, dentro do gene que codifica a -galactosidase (Z); o outro (O3) encontra-se prximo da zona -90, dentro do gene I. Para reprimir o opero, parece que o repressor lac se liga a ambos, o local principal de ligao e um dos locais secundrios, formando um loop. Qualquer uma das combinaes bloqueia a transcrio. Apesar deste elaborado complexo de ligao a represso no absoluta. A ligao do repressor lac reduz a transcrio a uma taxa de 103. Se os locais O2 e O3 forem eliminados do opero, a simples ligao do repressor ao local O1 reduz a transcrio numa taxa de 102. Quando as clulas possuem lactose, o opero lac encontra-se induzido. Uma molcula indutora liga-se a um local especfico no repressor lac e provoca uma alterao conformacional que resulta na dissociao do repressor do operador. O indutor no sistema de represso do opero lac no a lactose por si mesma, mas a alolactose, um ismero da lactose. Aps a lactose entrar na clula por uma das poucas permeases ainda existentes, a lactose convertida em alolactose por uma das poucas galactosidases ainda existentes. Libertando o operador do repressor, permitindo ao opero lac ser transcrito, conduzindo a um aumento da expresso de permeases e galactosidases. Os mecanismos pelos quais os operes so regulados podem variar muito do modelo aqui apresentado anteriormente, de facto, o prprio opero da lactose mais complexo do que aquilo que aqui foi indicado, com um activador que contribui para o esquema global. Nota: Em biotecnologia no se utiliza lactose mas sim IPTG como indutor do promotor. Isto porque o IPTG tem o mesmo efeito anlogo da lactose e no degradado metabolicamente pela clula. Regulao positiva o opero lac As interaces operador/repressor/indutor descritas anteriormente para o opero lac providenciam um modelo satisfatrio e intuitivo para um mecanismo on/off na regulao da expresso gnica. Na verdade, a regulao de um opero raramente assim to simples. O ambiente bacteriano demasiado complexo para que os seus genes sejam controlados apenas por um sinal. Outros factores para alm da lactose controlam a expresso dos genes lac, tais como a disponibilidade da glucose. A glucose proveniente directamente da gliclise a fonte principal de energia da clula.

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Claramente a expresso de genes para protenas que metabolizem aucares tais como a lactose ou a arabinose um desperdcio quando a glucose abundante. O que acontece ao opero lac quando ambas a glucose e a lactose esto presentes? Um mecanismo de regulao conhecido como represso cataboltica restringe a expresso dos genes necessrios para o catabolismo da lactose, arabinose e outros acares na presena de glucose, mesmo quando estes acares esto presentes. O efeito da glucose mediado pelo AMP cclico (cAMP), como coativador, e uma protena activadora conhecida como protena receptora de cAMP (CRP) por vezes referida como CAP.

Quando a glucose est ausente, CRP-cAMP liga-se a um local perto do promotor lac e estimula a transcrio do RNA. CRP-cAMP , portanto, um regulador positivo responsivo aos nveis de glucose, enquanto o repressor lac um regulador negativo responsivo aos nveis de lactose. CRP-cAMP tem pouco efeito no opero lac quando o repressor lac est a bloquear a transcrio, assim como a dissociao do repressor do operador tem pouco efeito na transcrio do opero lac, a menos que a CRP-cAMP esteja presente para facilitar a transcrio; quando o CRP no se encontra ligado, o tipo selvagem de promotor lac um promotor relativamente fraco. O complexo aberto de RNA polimerase e do promotor no se forma automaticamente, necessria a presena de CRP-cAMP. CRP interage directamente com RNA polimerase. O efeito da glucose no CRP mediado pelas interaces com o cAMP. CRP liga-se ao DNA quase avidamente quando as concentraes de cAMP so altas. Na presena de glucose, a sntese de cAMP inibida e o fluxo do cAMP diminui, a ligao do CRP ao DNA, consequentemente diminuindo a expresso do opero lac. Fortes indues do opero lac so depois necessrias, ambas a lactose (para inactivar o repressor) e baixas concentraes de glucose (para desencadear o aumento na concentrao de cAMP e o aumento da ligao de cAMP ao CRP). As protenas CRP e cAMP esto envolvidas em muitos sistemas regulatrios de vrios operes.

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Concluso: Baixa glicose aumenta a produo de lactose e consequentemente IPTG -, um aumento na concentrao de cAMP e isto tudo resulta na elevada taxa de transcrio. 2- Opero do triptofano Os 20 aminocidos so necessrios em grandes quantidades para a sntese proteica, e a E. coli consegue sintetiz-los a todos. Os genes para as enzimas necessrias para a sntese de aminocidos esto geralmente reunidos num opero e so expressos sempre que haja necessidade. Quando o aminocido est em abundncia na clula, as enzimas biossintticas no so necessrias e o opero reprimido. O opero triptofano (trp) em E. coli inclui cinco genes para as enzimas necessrias para a sntese de triptofano. De notar que duas das enzimas catalizam para de um passo na vida metablica. O mRNA resultante deste opero tem um tempo de meia-vida de apenas 3 minutos, permitindo clula responder rapidamente a mudanas de necessidades para este aminocido. Quando o triptofano abundante ele liga-se ao repressor de trp, causando uma alterao conformacional que permite ao repressor ligarse ao operador trp e inibir a expresso do opero trp. O operador trp sobrepe-se ao promotor, assim a ligao do repressor bloqueia a ligao da RNA polimerase. Uma vez mais, este simples mecanismo on/off mediado por um repressor no a histria completa da regulao. - O inibidor na ausncia de trp forma um dmero incapaz de ligar ao promotor. - O inibidor na presena de trp forma um dmero que liga trp e sofre alterao conformacional, ligando-se ao promotor. - Na biotecnologia, a activao deste produtor pode ser feita por remoo de trp ou por adio de cido 3-indoleacrylic ao meio.

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Em laboratrio foram criados promotores artificiais, por exemplo foi criado um promotor que rene o melhor do opero Lac e do opero Trp, o promotor tac (3 vezes mais forte que o trp e 10 vezes mais forte que o lac). O promotor tac inclui a regio -10 do promotor lac e a regio -35 do promotor trp. Nota: Existe outro promotor hbrido entre o lac e o trp, o promotor trc. A diferena deste para o tac a distncia entre as regies -35 e -10 dos promotores trp e lac, 17 pb no caso do promotor trc e 16 pb no caso do promotor tac. Outros promotores artificiais so o promotor pL criado a partir do bacterifago e o promotor do gene 10 do bacterifago T7 pT7. Cada um destes promotores interage com repressores, o que providencia um interruptor especfico da transcrio. Alm disso todos estes reconhecem especificamente a RNA polimerase presente em E. coli. O promotor pL controlado pela protena repressora CI do bacterifago . Na prtica, um mutante do repressor CI sensvel temperatura, normalmente usado para regular directa do pL. As clulas contendo este mutante so cultivadas a 28/30C, temperatura para qual o repressor previne a transcrio directa do promotor. Com a continuao do crescimento bacteriano tambm a temperatura elevada sendo que ao atingir os 42C o repressor inactivado e a transcrio pode acontecer, isto quebra o efeito de toxicidade em estgios precoces do desenvolvimento. O promotor do bacterifago T7 necessita de uma RNA polimerase especifica. Para utilizar este promotor o gene para a RNA polimerase T7 inserido no cromossoma de E. coli, por aco de um bacterifago lisognico, sob o controlo do promotor lac. Assim pela regulao do promotor lac regula-se tambm a expresso da RNA polimerase e consequentemente a transcrio do plasmdeo com o promotor T7. IPTG Opero Lac RNAT7 Transcrio do gene Nota: O sistema pET foi elaborado de forma a explorar a fora do promotor T7. Problemas: A eficincia em desactivar o repressor e com isso activar a transcrio depende da razo entre o nmero de cpias do promotor: - Se existirem poucas molculas de repressor torna-se difcil de induzir a traduo - Se existirem poucas molculas repressoras (mesmo que em maior quantidade que o nmero de cpias do promotor) a transcrio ocorre mesmo sem induo. No caso de ocorrer transcrio sem induo, estamos na presena de um promotor Leaky. Este tipo de promotores so um problema pois podem causar resultados antes do esperado, o que pode ser prejudicial experincia ou, em casos extremos, morte celular por intoxicao. J foram especuladas muitas formas de como manter estes sistemas controlveis. Por exemplo, manter o gene para o repressor e o seu promotor em dois plasmdeos distintos com nmeros de cpias por clula diferentes. Actualmente, o gene para o repressor colocado num plasmdeo com um baixo nmero de cpias por clula (1 a 8) e o gene para o promotor mantido num plasmdeo com um elevado nmero de cpias por clula (30 a 100). Alternativamente o gene do repressor pode ser transportado em cpia nica via genoma da bactria. O promotor lac um destes casos uma vez que pode ser induzido por lactose endgena e por isso, geralmente, utiliza-se um mutante (gene lac I9) que produz muito maior quantidade de repressor, baixando o nvel de leakiness.

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Nota: Em biotecnologia sempre importante encontrar um equilbrio entre o nvel de expresso pretendido e o nmero de cpias do gene inserido. bom ter em conta o nmero de ribossomas, tRNA, O2 para a respirao e produo de ATP, metabolitos, etc alinhados com o pretendido, caso contrrio por mais estimuladas que as clulas sejam no h obteno de mais produto. Na realidade por vezes melhor uma sntese mais lenta de forma a obter maior taxa de produo. Soluo: Utilizar mltiplas cpias , geralmente 3 ( bom no exagerar seno o resultado o mesmo), num plasmdeo low copy ou no DNA cromossomal. Eficincia na traduo Colocar um gene a clonar sobre a influncia de um promotor forte e regulvel, apesar de essencial, pode no ser suficiente para maximizar a correcta produo da protena clonada. Outros factores como a eficincia na traduo e a estabilidade do novo traduzido podem tambm afectar a quantidade de produto. Em clulas procariticas muitos mRNAs no so traduzidos com a mesma fora, de facto eles podem ser expressos em nveis bastante distintos. A base molecular para esta diferena a presena de uma regio designada por Ribossome binding site (RBS) no mRNA que funciona como sinal para a traduo. O RBS uma sequncia de 6 a 8 nucletidos (UAAGGAGG) no mRNA que emparelha com uma sequncia complementar na subunidade menor do ribossoma. Geralmente, quanto mais forte a ligao desta sequncia ao ribossoma mais eficiente a traduo. Assim sendo, muitos vectores de expresso de E. coli foram desenhados de maneira a assegurar que o mRNA do gene clonado contenha um RBS forte e que se encontre distncia apropriada do codo de iniciao. Nota: No RNA o codo de iniciao AUG. No DNA a cadeia com a sequncia ATG denominada a cadeia codificante, pois igual (em sequncia de nucletidos) ao mRNA a ser traduzido) enquanto que a cadeia complementar aquela que serve de molde ao mRNA denominando-se cadeia no codificante, sendo por conveno ATG o codo de iniciao no DNA. Para alm da RBS ser forte e bem posicionada, a sequncia que inclui a RBS e que se extende at aos primeiros codes do gene, no pode possuir sequncias de nucletidos que, aps transcrio, consigam emparelhar e formar loops, diminuindo assim a interaco do RBS e mRNA com o ribossoma. Assim, para cada gene clonado importante estabelecer que o RBS esteja propriamente colocado e que a estrutura secundria do mRNA no previne o seu acesso ao ribossoma. Como fazer isto na prtica? Utilizao de um plasmdeo especial com a sequncia RBS e restantes nucletidos inseridos no prprio vector. Assim, quando se adiciona o gene a clonar adiciona-se s a sequncia a partir do codo AUG. Alm disto uma incompatibilidade celular que pode interferir com o processo o uso de codes diferentes para o mesmo aminocido por parte de organismos distintos. Em alguns casos a clula hospedeira pode no possuir tRNAs para determinado codo, ou possuir muito poucos, o que pode impedir ou atrasar a expresso de novas protenas.

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Muito pouco pode ser feito para contrariar isto, no entanto este efeito pode ser revertido recorrendo sntese qumica do gene substituindo os codes raros por outros mais comuns, utilizao de outros hospedeiros ou sobrexpresso do tRNA pretendido no organismo hospedeiro atravs do uso de um plasmdeo especial o pRARE. A E. coli apesar de bem caracterizada nem sempre a melhor para a expresso de alguns genes, por isso existe investigao a fim de encontrar outro organismo gramnegativo para a substituir. No existe um vector perfeito. Existem vrios organismos, vrias influncias, vrias condies e por isso o que existe so vrios vectores com bastantes variaes. Aumentar a estabilidade da protena As protenas com tempo de meia vida maior podem ser acumuladas nas clulas e aumentar a concentrao do produto final. Sob condies normais de crescimento o tempo de meia vida pode variar entre alguns minutos e algumas horas. A base para esta diferena de estabilidade deve-se tanto exteno/fora das pontes dissulfito como a alguns aminocidos no N-terminal. Por exemplo: - adicionando arginina (Arg) ao N-terminal da protena, o seu tempo de meia vida passa a ser de 2 minutos apenas; - adicionando alanina o tempo de meia vida da protena varia para mais de 20 horas; Contrariamente a esta teoria, existe uma sequncia de aminocidos no interior da protena que a torna mais susceptvel, a regio PEST. Esta regio rica em prolina (P), glutamato (E), serina (S) e trionina (T) e encontra-se muitas vezes, mas nem sempre, rodeada por clusters de aminocidos positivos que podem actuar como marcadores da degradao da protena. Nota: A teoria do N-terminal pode ser falaciosa dado que as caudas de algumas protenas encontram-se enterradas na sua estrutura terciria e por isso a identidade do aminocido no N-terminal no tem qualquer efeito a este nvel. Outros aspectos que podem influenciar a estabilidade de uma protena so as suas modificaes ps-traducionais, por exemplo as glicosilaes e formao de pontes dissulfito. Secreo Proteica A estabilidade de uma protena clonada em E. coli muitas vezes depende da sua localizao celular. Por exemplo, a proinsulina recombinante aproximadamente 10 vezes mais estvel quando secretada (exportada) para o periplasma (espao entre a membrana citoplasmtica e a membrana externa) do que se ficasse retida no citoplasma. As protenas secretadas so tambm mais fceis de purificar. Normalmente uma sequncia de aminocidos, designada por sequncia sinal, localizada no N-terminal da protena responsvel por comandar o destino da protena, inclusive a sua secreo ou no. possvel, atravs da engenharia gentica, adicionar esta sequncia sinal de modo a aumentar/facilitar a exportao da protena em causa. Contudo esta sequncia no garante a alta taxa de exportao proteica, at porque bactrias gram-negativas como E. coli no so capazes de exportar para o meio devido parede celular que se

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revela como uma barreira fsica. Para este problema existem duas solues: utilizar bactrias gram-positivas ou eucariotas, ou fazer com que as gram-negativas consigam exportar para o meio. Uma coisa til na excreo de protenas para o periplasma afast-las de proteases endgenas. Este problema tambm se resolve pelo uso de estirpes pobres em proteases. Em E. coli as glicosilaes e a formao de pontes dissulfito so difceis de promover devido falta de complexo de golgi e falta de capacidade de gerar microambientes oxi-redox necessrios formao de pontes dissulfito. A biotecnologia consegue, em parte, resolver este problema modificando o ambiente periplasmtico para oxi-redox e provocando a excreo da protena, provocando assim um ambiente ptimo para a formao das pontes dissulfito. Protenas de Fuso Durante a expresso de algumas protenas existem problemas ao nvel da degradao e da purificao, entre outros. Uma forma de resolver estes dois problemas em conjunto ligando o gene a clonar a um gene estvel do hospedeiro. Esta construo cria o que designado por protenas de fuso e protege o produto do gene clonado do ataque de proteases da clula hospedeira. As protenas de fuso so criadas a um nvel bsico, DNA, ligando as duas regies codificantes dos genes (ORF), removendo o codo STOP de uma delas e colocando-as sob o efeito do mesmo promotor. Isto consegue-se usando um vector de fuso que possui dois locais de clonagem, um para o gene da protena nativa e outro para o gene a clonar. comum nos vectores actualmente no mercado j possuem gene da protena nativa, sendo que o processo de insero do gene a clonar no sofre alteraes significativas. A protena de fuso mais utilizada a -Galactosidase-gene lac7. Uma das questes que este tipo de clonagem nos coloca Qual das extremidades da protena se deixa livre e qual se usa na fuso com a protena nativa?. Esta questo coloca-se primeiro porque temos ambas as oportunidades e depois porque necessrio, aps a produo, purificar a protena separando-a das restantes. Para a purificao usual fazer-se uso da cauda da protena numa cromatografia de afinidade. As caudas podem ser: - 6 Histidinas; - FLAG; - Calmodulin binding protein; - Glutaniona-S-transferase-GST: - Protena A; - Maltose binding protein; A cauda de 6 Histidinas uma sequncia de 6 a 10 aminocidos que ligam facilmente Ni2+, que pode ser incorporado na matriz da cromatografia. A cauda FLAG consiste numa sequncia de aminocidos (Asp-Tyr-Lys-AspAsp-Asp-Asp-Lys) que reconhecida por um anticorpo ( a ser usado na matriz) e por uma enzima, enterocinase intestinal bovina, que facilita a clivagem entre a GLAG e a protena clonada. A Calmodulina binding protein uma protena de fuso muito usada pois tratase de um pptido com capacidade de ligar e desligar calmodulina. Na presena de Ca2+ a Calmodulina binding protein liga-se calmodulina, pelo que se faz a cromatografia com

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uma matriz com calmodulina e um meio rico em Ca2+.Quando no h Ca2+ a calmodulina binding protein desliga da calmodulina, pelo que se faz a separao da protena de fuso da matriz atravs do uso de agentes quelantes (ligam Ca2+), como o EDTA. O problema neste caso coloca-se na altura de separar a Calmodulina binding protein da protena clonada. Para isso geralmente utiliza-se uma protease para uma sequncia especfica, sequncia essa inserida previamente no local de juno das duas protenas. Pode usar-se a Trombina, Tripsina, TEV, etc. Apenas tem que se assegurar que o local de clivagem se situa no final da protena de interesse. Porm surge um problema, com a adio da protease cliva-se a fuso das protenas mas tambm se contamina o meio. Soluo: - Pode-se usar, em vez de Calmodulin binding protein, maltose binding protein. Esta liga-se maltose durante a cromatografia e pode ser logo separada com uso de uma protease, porm em quantidades inferiores. mais usada para protenas com menos de 20 kDa. Contudo embora isto reduza o problema, no o soluciona. - Utilizao de Intenas. Intenas so protenas que ligam quitina com grande afinidade, e por isso esta pode ser usada na matriz da cromatografia. As intenas possuem capacidade proteoltica intrnseca e podem-se separar da protena clonada fazendo uso dessa capacidade. Para que tal ocorra penas se tem de provocar uma alterao conformacional usando agentes redutores e baixando a temperatura para aumentar a actividade proteoltica. Esta actividade geralmente lenta e feita durante a noite. A questo que aqui se coloca que este sistema no possui uma elevada taxa de produo. Concluindo, as caudas servem para solubilizar, proteger, purificar, identificar e ajudar a enrolar. No entanto temos vrios factores a ter em conta antes de escolher uma cauda. Por exemplo: - O tamanho da protena, se for uma protena pequena no adianta adicionar uma cauda de 6 histidinas pois o efeito ser nulo, claro que o contrrio tambm se verifica, para uma protena grande no valer a pena fundi-la com uma outra de grandes dimenses uma vez que isto pode tornar-se prejudicial. - Tem que se ter em conta a qual a extremidade a fundir, pois a expresso de uma protena de fuso do lado errado no conduz a lugar nenhum. Isto , adicionar uma cauda de Histidina na extremidade N quando esta se encontra no interior da protena no tem qualquer vantagem. Pode-se sempre resolver este problema fazendo a cromatografia sob condies desnaturantes, no entanto isto pode no ser til, tudo depende do objectivo final que se pretende dar protena. Corpos de incluso Muitas das vezes que expressamos protena recombinante fazemo-lo de forma exagerada, sobreexpressando a protena. Esta sobreexpresso leva formao de corpos de incluso. Os corpos de incluso so estruturas insolveis, intracelulares de protena biologicamente inactiva. Forma-se porque a protena expressa instvel e no se consegue enrolar correctamente, pode haver exposio da parte hidrofbica da protena fazendo com que esta interaja consigo e semelhantes precipitando. Isto faz com que apesar de se expressar mais protena a taxa de produo da mesma seja bastante baixa, pois o que conta para a taxa de produo a protena activa. Na verdade existe alguma quantidade de protena activa nestes corpos, e alguns investigadores gostam de os utilizar para purificar a protena em estudo. Contudo a

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extraco um processo que custa muito dinheiro e ocupa muito tempo para solubilizar e re-enrolar a protena na sua conformao nativa. Dado que muitos dos corpos de incluso se devem a um enrolamento incorrecto das protenas foram desenhadas vrias estratgias para evitar este problema. Por exemplo, protenas de fuso contendo thioredoxina que ajuda na solubilizao e posterior enrolamento das protenas. Contudo surge o mesmo problema na hora de remover a cauda. Uma outra hiptese para evitar os corpos de incluso provocar a expresso de chaperonas (co-expresso no plasmdeo). Mesmo assim existe quem veja benefcios no uso de corpos de incluso e por isso provoca-os. A sua produo fcil e natural em E. coli, e a sua purificao tambm, basta centrifugar. A obteno de protena activa que difcil, para isso necessrio desnaturar completamente as protenas (eliminando assim as interaces proteicas). Pode-se fazer facilmente recorrendo ureia, no aconselhvel o uso de SDS. Depois necessrio renatur-las correctamente, que se torna a parte mais difcil. Para isso necessrio remover a ureia por diluio rpida com um tampo ou recorrendo a dilise (no aconselhvel porque se perde muita protena). Para renaturar ento necessrio moldar o ambiente atravs de agentes redutores oxidantes e de pH at atingir um ambiente ptimo. Isto torna-se por vezes uma utopia dado energia necessria para a formao de algumas ligaes. Exemplo da utilizao da clonagem de genes na biotecnologia Muitas hormonas, protenas sinalizadoras ou reguladoras so normalmente expressas em quantidades muito baixas, impedido o deu isolamento e purificao em grandes quantidades por tcnicas bioqumicas bsicas. O uso teraputico difuso de tais protenas, assim como pesquisas na sua estrutura e funo, depende da eficincia dos processos para produzir grandes quantidades a custo razovel. A tcnica de DNA recombinante que transforma clulas de E. coli em fbricas para a sntese de protenas pouco abundantes agora utilizada para a produo do factor VIII (factor de coagulao do sangue), factores estimulantes das colnias de granulcitos (G-CSF), insulina, hormonas de crescimento e outras protenas humanas com usos teraputicos. Por exemplo, G-CSF estimula o crescimento de granulcitos, glbulos brancos fagoctos essenciais para a defesa contra infeces bacterianas. A administrao de G-CSF a doentes com cancro ajuda reduo da produo de granulcitos provocados pela quimioterapia, protegendo os pacientes contra infeces srias enquanto eles fazem quimioterapia. O primeiro passo na produo de grandes quantidades de protenas pouco abundantes obter clones de cDNA que codifiquem para a protena em interesse, atravs do PCR. O segundo passo de fabricar plasmdeos que vo expressar largas quantidades de protenas codificadas quando inseridos nas clulas de E. coli. A chave para desenhar tais vectores de expresso adicionar um promotor, uma sequncia de DNA a partir da qual a transcrio de cDNA pode comear como, por exemplo, no processo para expressar G-CSF mostrado na figura. Neste caso, G-CSF expresso em E. coli transformada com plasmdeos que contenham promotores lac adjacentes ao cDNA que codifica para G-CSF. A transcrio do promotor lac ocorre a alta velocidade apenas quando a lactose, ou anlogos (IPTG), so adicionadas ao meio de cultura. Para ajudar a purificao de uma protena eucaritica produzida em E. coli, os investigadores muitas vezes modificam o cDNA que codifica a protena recombinante para facilitar a sua separao de protenas endgenas de E. coli. Uma modificao comum deste tipo, adicionar uma curta sequncia de nucletidos no final do cDNA, de

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modo a que a protena expressa tenha seis resduos de histidina no terminal C. As protenas modificadas deste modo ligam-se levemente a uma matriz com tomos de nquel, enquanto que a maioria das protenas endgenas no se iro ligar a esta matriz. As protenas ligadas podem ser libertadas dos tomos de nquel por um decrscimo no pH do meio. Na maioria dos casos, este procedimento retm uma protena pura recombinante que funcional, visto que a adio de pequenas sequncias de aminocidos a qualquer dos extremos de uma protena no interfere com a actividade bioqumica da protena.

2- Produo de Protena Recombinante em Eucariotas


A expresso em sistemas procariticos geralmente til para produzir protena heterloga (recombinante) a partir de cDNA eucariota. Contudo, em alguns casos, protenas eucariotas sintetizadas em bactrias ou so instveis ou tm falta de actividade biolgica. Tambm pode ocorrer, apesar dos cuidadosos processo de purificao, a contaminao da amostra final por alguns compostos bacterianos, txicos ou pirognicos. Para evitar estes problemas, os investigadores desenharam sistemas de expresso eucariticos para a produo de protena que pudessem ser usadas como agentes teraputicos em animais. Nota: Uma protena humana a ser usada com fins teraputicos tem como requisitos ser igual em termos bioqumicos e biofsicos e em propriedades funcionais, sua forma natural. A incapacidade, por vezes, de organismos procariticos produzirem verses activas de protenas eucariticas deve-se em grande parte necessidade de mecanismos adequados para gerar certas modificaes ps-traducionais. Nos eucariotas existe um elevado nmero de modificaes que podem ocorrer aps a sntese estar completa: - Formao correcta de pontes dissulfito. Esta reaco mediada pela aco de uma enzima chamada dissulfito isomerase. Uma protena mal enrolada instvel e falta-lhe actividade fisiolgica; - Clivagem proteoltica de forma percursora. Um grupo selecto de aminocidos clivado para assegurar a funcionalidade proteica; - Glicosilao. Esta reaco a maior modificao que estabelece finalmente a estabilidade de uma protena, e por vezes, as suas propriedades distintas. A glicosilao mais comum ocorre pela adio de resduos de acar especficos a serinas e treonimas (glicosilao O-linked) ou a asparginas ( glicosilao N-linked). - Adies a aminocidos nas protenas. Adies como: fosforilao, acetilao, sulfatao, acilao, miristilao, palmitilaoe y-carboxilao. Destas modificaes a glicosilao e a adio a aminocidos nas protenas so as piores para induzir em protenas expressas em sistemas procariticos. De uma forma geral nenhuma clula eucaritica capaz de desempenhar todas estas funes de forma correcta para qualquer protena heterloga. Por isso mesmo se determinada protena necessita de uma srie especfica de modificaes necessrio examinar diferentes sistemas de expresso eucariticos at descobrir um que seja capaz de produzir um produto biolgico autntico. No geral, os vectores de expresso eucariticos possuem o mesmo tipo de caractersticas que os seus companheiros procariticos: 32

- Um gene/marca de seleco eucaritico; - Um promotor eucaritico; - Sinais STOP apropriados de transcrio e traduo; - Sequncia sinal de poliadenilao do transcrito primrio (mRNA); Como agentes de clonagem eucaritica existem: leveduras (unicelulares), clulas de mamfero em cultura (In vitro e In vivo); clulas de insecto em cultura , plantas e animais transgnicos. Se o vector de clonagem para ser usado como um plasmdeo (replicao extra cromossmica) ele tem ainda de ter uma origem de replicao que funcione na clula hospedeira. Em alternativa, se for desenhado para interagir com o DNA cromossmico do hospedeiro ele deve carregar uma sequncia complementar a uma regio do cromossoma do hospedeiro, ou seja, um local de recombinao homloga. Porm como muitos processos de DNA recombinante so difceis de executar em clulas eucariticas, muitos vectores eucariticos so desenhados para serem Shuttle. Estes vectores carregam dois tipos de origem de replicao e genes de seleco, um tipo funciona para E. coli e outro que funciona melhor em clulas eucariticas. Tais vectores foram j desenhados para leveduras, insectos e mamferos. A introduo destes dois tipos permite fazer manipulaes de DNA em procariotas, pois mais fcil, e depois transferir o gene manipulado/vector manipulado para clulas eucariticas com a finalidade de expressar a protena correctamente. Por isso tambm importante um iniciador e terminador adequados tanto a eucariotas como procariotas. A introduo de DNA estranho em bactrias e leveduras chamado de Transformao. Em sistemas micorbianos, transformao descreve uma alterao hereditria devida aquisio de DNA exgeno. Contudo em clulas animais, a transformao refere-se a alteraes no crescimento das clulas quando elas se tornam cancerosas. Para distinguir o processo de biologia molecular deste utiliza-se o termo Transfeco para indicar alteraes provocadas por DNA exgeno. Existem 3 tcnicas que so normalmente usadas para transformar leveduras: - Remoo das paredes com formao de protoplastos; - Tratamento com acetato de ltio; - Electroporao; Para a transfeco de clulas animais usa-se geralmente: - Coprecipitao de DNA com fosfato de clcio (CaPO4); - Electroporao; - Microinjeco - Vrus eucariota; - Lipossomas; - Genes Gun (alvejamento gentico); Sistemas de expresso em Saccharomyces cerevisae Vantagens Por uma variedade de razes a levedura S. cerevisae tem sido extensamente usada como hospedeira para a expresso de variados genes eucariticos. Primeiro, porque um ser unicelular extremamente bem caracterizado gentica e fisiologicamente, e pode crescer rapidamente tanto em placas de cultura como em bioreactores de longa escala.

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Segundo, porque possui promotores fortes bem caracterizados, tambm devido ocorrncia de um plasmdeo natural que pode ser usado como sistema de expresso. Terceiro, ela capaz de levar a cabo muitas modificaes ps-traducionais. Quarto, geralmente excreta to poucas protenas que, quando alterado por engenharia gentica para excretar a protena heterloga, o produto pode ser facilmente purificado. Quinto, por ser to amplamente utilizada pela indstria durante anos ela um organismo GRAS (generally recognize ou safe) pela FDA. Por ser um organismo GRAS o uso deste para a produo de agentes teraputicos no requer uma experimentao excessiva at aprovao do mesmo. Muitas protenas actualmente no mercado foram produzidas em S. cerevisae. Exemplo disso so: o antignio de superfcie para a hepatite B, a vacina contra protenas de superfcie do HIV-1, a insulina, o Epidermal growth factor, etc. Vectores de expresso Existem trs classes de vectores de expresso em S. cerevisae: Epissomal, ou plasmdeo, YEP; integrativos YIP e cromossomas artificiais YAC. Destes o YEP tem sido largamente utilizado para a produo de protena tanto intra como extracelular. Contudo, tais sistemas de expresso baseados em plasmdeos so muitas vezes instveis em condies de larga produo (a partir de 10 litros). O YEP nico para S. cerevisae pois a nica levedura capaz de manter um plasmdeo, devido presena de um naturalmente. A marca de seleco usada com YEP o uso de estirpes mutantes eu necessitam de aminocidos especficos (presentes na YEP). necessrio adequar o meio de crescimento s estirpes em uso. Por vezes mais rentvel usar procaritas numa fase inicial e por isso este tambm um vector Shuttle (possui Ori C e Amp). Apesar da integrao de um vector de expresso ou unidade de transcrio no DNA cromossomal (YIP) ser uma opo experimental que assegura a estabilidade gentica do organismo, esta tcnica no tem sido muito usada. A razo o baixo nmero de cpias do gene a clonar ser limitado a uma cpia por cromossoma, o que resulta numa baixa produo da protena heterloga. Sequncias Tandem (genes vrias vezes repetidos uns a seguir aos outros) podem ser usadas, no entanto elas so geralmente instveis. Consequentemente, investigadores tm usado vectores epissomais com uma nica cpia do gene a clonar, mas tm tentado alterar a estabilidade modificando as condies de crescimento. Um YAC desenhado com fim a clonar um largo segmento de DNA (+ de 100 kb), que mantido como um cromossoma separado no organismo hospedeiro. O YAC altamente estvel e foi usado para o mapeamento do genoma humano, para a anlise de largas unidades de transcrio e para a formao de grandes bibliotecas genmicas contendo o DNA de cromossomas humanos. Um vector YAC mimetiza um cromossoma pois tem uma sequncia que actua como origem de replicao, uma sequncia semelhante do centrmero da levedura, e uma sequncia que aparece em ambos os terminais aps linearizao do DNA e actuar como telmeros de forma a manter a estabilidade. Por vezes o DNA inserido para clonagem interrompe a expresso de um outro gene, resultando num produto colorido, ou no quando a crescer num meio especializado. Alternativamente, alguns vectores YAC contm uma marca de seleco independente do local de clonagem. Contudo, at agora, YAC ainda no foi utilizado como sistema de expresso de produtos comerciais.

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Nota: Apesar de no referido no esquecer a presena de promotores e local de insero do gene associado a enzimas de restrio. Secreo de Protenas heterlogas/promotores de Leveduras Em leveduras apenas protenas glicosiladas so secretadas, assim o sistema de secreo tem de ser usado para protenas recombinantes que requerem adio de acares quer no terminal N-linked quer no O-linked, para facilitar a secreo o pptido sinal adicionado a montante da regio codificante de cDNA. Durante o processo de exportao d-se a formao de pontes dissulfito, clivagem proteoltica e outras modificaes ps-traducionais, em muitos casos a protena exportada j se encontra na sua forma activa. O pptido sinal possibilita a paragem da protena pela membrana, mas durante o processo de secreo este reconhecido por uma endoprotease que cliva o dipptido Lisina-Arginina. Os codes para a Lisina-Arginina encontram-se, portanto, posicionados imediatamente a montante da sequncia de cDNA a clonar de modo a que quando clivado o pptido sinal a protena alvo adquira a sequncia de aminocidos correcta, assim como o aminocido correcto no seu N-terminal. Alm disto outras estratgias foram desenhadas para aumentar a secreo de protena heterloga em S. cerevisae. o estudo dos seus promotores tem contribudo bastante para ajudar a desenhar estas estratgias. Geralmente as protenas expressas com o auxlio de promotores de leveduras so expressos em grande quantidade, o problema que alguns destes promotores so indutveis (controlveis), mas sim constitutivos (no se capaz de controlar to bem a sua actividade). Uma destas estratgias foi avaliar se a sobrexpresso conjunta de uma protena endgena e naturalmente secretada iria influenciar a taxa de secreo da protena heterloga. Outra tcnica foi utilizar o promotor da desidrogenase alcolica (muito estudada e utilizada pelo homem na industria) assim como o seu terminador aumentava a produo de protena. Verificou-se ainda que a sobrexpresso da protena endgena dissulfito isomerase aumentava a secreo de protenas com pontes dissulfito. Por fim verificou-se que muitas das indues elaboradas em S. cerevisae fazemse pela introduo de um lcool no sistema e que a manipulao de variadas protenas do sistema secretor pode aumentar a secreo de protenas heterlogas com diferentes necessidades de enrolamento. Desvantagens no uso de Saccharomyces cerevisae e outros sistemas A expresso de protenas recombinantes em S. cerevisae tem tido bastante sucesso com algumas protenas. Mas apesar de algumas taxas elevadas, a expresso geralmente baixa, isto porque existem limitaes: - Instabilidade o YEP: perda do plasmdeo durante o processo, mesmo quando se utilizam promotores indutveis; - Hiperglicosilao. Uma protena heterloga geralmente hiperglicosilada, contendo mais de 100 resduos de manose em cada oligossacardeo Nlinked; - Protena aprisionada no espao periplasmtico: dificulta a purificao pois necessrio recorrer lise das leveduras (processo difcil); - Produo de etanol: o etanol em grandes quantidades torna-se txico, at para as leveduras;

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Nota: Foi publicado em 2003 um artigo que revela uma forma de produzir protena heterloga em S. cerevisae sem que ocorra hiperglicosilao, atravs da deteco dos genes responsveis pela glicosilao em leveduras e insero de genes de glicosilao humanos. Tendo em conta estas desvantagens os investigadores tm examinado outras espcies de leveduras e sistemas eucariticos que possam actuar como clulas hospedeira para a expresso proteica. Os atributos que tm sido investigados incluem: - Adaptao a vrios vectores; - Sistemas de expresso de clonagem com sequncias reguladoras da transcrio e traduo especificas do hospedeiro; - Capacidade de sofrer transformao; - Elevada taxa de produo de protenas; - Capacidade para crescer sob condies industriais; Os candidatos mais bem qualificados do Pichio pastoris e Hansenula polymorpha, que conseguem usar metanol como fonte de carbono e energia. Claro que existem outros tambm j utilizados em processos industriais como Kluyueromyces lactis ou Yarecwia lipolitica que produzem lactose e crescem em meios com alcanos, respectivamente. Vantagens em Pichia pastoris A levedura metilotrfica Pichia pastoris consegue crescer fcil e economicamente em largos biorreactores. fcil fazer a expresso atravs de factores integrativos (YIP), logo a expresso mais estvel, utilizando o gene da lcool oxidase como promotor e terminador, sem que a clula perdesse a sua capacidade de diviso. A lcool oxidase na presena de metanol pode representar mais de 30% das protenas totais. O plasmdeo completo produzido para esta levedura possui: - Uma unidade AOX1p-gene-AOX1t (promotor lcool oxidase-geneterminador lcool oxidase); - Uma origem de replicao (oripp), uma origem e marca de seleco procariotas (oriE e Ampr) de E. coli; - Um segmento a jusante do terminador (3-AOX1) que facilita a integrao do DNA num local especfico do cromossoma; - Um gene funcional da histidol desidrogenase (HIS4), que codifica uma enzima capaz de sintetizar histidina e por isso funciona como marca de seleco eucaritica; De forma a evitar problemas de instabilidade, a estratgia neste sistema integrar a unidade AOX1p-geneAOX1t no genoma de Pichia pastoris. Para isto existem dois sistemas de insero: Simples e Dupla

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1- Integrao Simples A integrao simples usada tambm em S. cerevisae, mais difcil de concretizar e usam-se estirpes + e para o conseguir. A integrao simples ocorre com a insero de todo o plasmdeo no genoma da levedura. Utiliza-se o segmento de seleco como parte principal na integrao do vector. Usam-se estirpes defeituosas na produo de histidina (His 4-), depois das clulas transformadas um simples crossing-over entre os genes His4 e His4- provoca a integrao completa do plasmdeo no genoma, ficando o plasmdeo ladeado por dois genes His4, um funcional e outro no. 2- Integrao Dupla A integrao dupla caracterstica de Pichia pastoris e consiste num crossingover duplo entre o AOX1p e o gene AOX1 e a sequncia 3-AOX1 e este mesmo gene. Esta integrao leva a uma perda do restante vector, visto que apenas a sequncia AOX1p-geneAOX1t e o gene de seleco so inseridos. A seleco pode depois ser feita por crescimento num meio sem histidina (as clulas transformadas podem produzir histidina por insero do gene His4 funcional) ou por crescimento lento em metanol (as clulas transformadas tm o gene AOX1 interrompido pelo que no produzem lcool desidrogenase em grande quantidade, dado que apenas o gene AOX2 est a funcionar). Na presena de metanol o promotor AOX1p activado e d-se uma elevada expresso da protena para o citoplasma. Nota: No existe qualquer problema para a Pichia perder o gene funcional AOX1, isto porque para alm de no ser um gene essencial, existe um outro gene(AOX2) que codifica para a lcool oxidase, sendo que a nica consequncia um crescimento mais lento.

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Vectores de expresso em mamferos Apesar de bastante eficientes a expresso de protenas em leveduras nem sempre suficientemente satisfatria. Por vezes, dependendo do uso que se pretende dar protena, somos obrigados a fazer a expresso de algumas protenas em clulas de mamfero em cultura. Trata-se de um processo mais caro, com melhor taxa de produo e que leva mais tempo. No entanto certas protenas, como as que possuem fins teraputicos, tm de ser expressar nestes sistemas. Exemplo disso do: receptor CD4 do HIV, hormona de crescimento, eritropoetina, antignio de superfcie da hepatite B, etc. De notar que alguns estudos de biologia bsica tambm so feitos nestes sistema, como por exemplo na rea da neurobiologia, a fim de ter mais preciso nos resultados. Em clulas de mamfero pode-se utilizar dois tipos de sistemas diferentes: - Sistemas de expresso transiente, ou seja, transitria, que expresso a protena durante um determinado espao de tempo at que o gene seja detectado. Por exemplo a cultura de clulas de rim de macaco (COS), rim de hamster (BHK) e rim de embrio humano (HEK); - Sistemas de expresso estvel, que tm uma produo contnua de protena e o gene encontra-se estvel no genoma. Por exemplo a expresso em clulas do ovrio de hamster (CHO); A escolha de um sistema em detrimento de outro passa pelo objectivo da expresso e dinheiro disponvel. Um vector de expresso para clulas de mamferos pode ser representado de uma maneira geral como possuindo: - Origem de replicao de um vrus animal (simian vrus 40-SV40, Citomegalovrus, herpes simplex vrus, etc); - Sequncia promotor a montante do gene a clonar e do gene da marca de seleco, sendo que o promotor igual para os dois; - Sequncia terminadora (local de poliadenilao) para cada um (estes tambm derivam dos mesmos vrus, ou de genes de mamferos que se expresso naturalmente em grandes quantidades, como -actina, timidina cinase, hormona de crescimento bovina, etc); As sequncias necessrias para a seleco e propagao de vectores de mamferos em E. coli so derivados do plasmdeo standart de E. coli. A expresso em vectores de mamferos to verstil e eficiente quanto qualquer outro sistema eucaritico quando as protenas recombinantes so necessrias para fins de pesquisa, ensaios clnicos ou teraputicos. Contudo a produo industrial nestes sistemas torna-se dispendiosa. Consequentemente sistemas menos caros so favorveis, a menos que a protena autntica apenas se consiga obter com produo em clulas de mamferos.

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Marcas de Seleco Muitas protenas, dos mais variados gneros, tm sido clonados em sistemas de expresso de mamferos. Em alguns casos, para garantir a produo de protena, colocou-se um intro entre o promotor e a sequncia do gene. A razo para o aumento da produo no claro. Pensa-se que, por vezes, a sequncia interna de um gene possa conter um local de splice de intres alternativo (cryptic site) e parte da regio codificante sofra splicing, assim como a presena de um intro no gene menos provvel que o cryptic site seja reconhecido. Uma elevada taxa de produo tem sido atingida quando h coordenao da expresso de marcas de seleco com o gene em causa: existem demasiadas marcas de seleco que podem ser usadas, mas quase todas elas se relacionam com a inibio de protenas essenciais (produo ou actividade). Ou seja, colocando o gene da marca de seleco prximo e a montante do gene a clonar sendo separados por uma sequncia de splicing de intres, sob efeito do mesmo promotor faz com que a marca de seleco e a protena recombinante sejam traduzidas a partir do transcrito primrio e do mRNA que sofreu splicing. Uma outra maneira para aumentar a taxa de produo da protena atravs do uso da sequncia de Kosac (CC R CC AUG G).

Nota: Os locais s5 e 3UTR j so naturais do vector de expresso. No podemos esquecer certos aspectos referidos anteriormente como aspectos necessrios para a purificao ou endereamento da protena. Protenas Multimricas A forma activa de algumas protenas comerciais importantes consiste em duas cadeia peptdicas diferentes. Por exemplo, a hormona estimulante de crescimento da tiride possui duas cadeias polipeptdicas (heterodmero), e a hemoglobina que possui quatro cadeias polipeptdicas (tetrmero) equivalentes duas a duas.

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possvel clonar o gene ou cDNA para cada subunidade, sintetizar e purificar cada uma delas separadamente e depois mistur-las num tubo de ensaio, no entanto poucas so aquelas que se enrolam correctamente. Pelo contrrio o agrupamento in vivo mais fivel, mas muito pouco produtivo. Consequentemente foram desenhadas vrias estratgias de clonagem de modo a produzir duas protenas recombinantes diferentes na mesma clula. Destes salientam-se 3: expresso com dois vectores; expresso de dois genes num vector e a expresso por vectores dicistrnicos (resultado de manipulaes dos dois sistemas anteriores). 1- Sistema de expresso com dois vectores Utilizao de dois vectores de expresso de mamferos, cada um com um gene ou cDNA para cada uma das subunidades e marcas de seleco diferentes, cotransportados para a clula hospedeira. As clulas so tratadas com ambos os agentes de seleco, e as clulas sobreviventes so aquelas que possurem ambos os vectores. O sistema de dois vectores tem sido usado com sucesso para a produo de protenas dimricas e tetramricas. Contudo a perda de um dos vectores algo comum neste sistema. Alm disso raro que os dois vectores sejam mantidos nas clulas em igual quantidade, por isso acontece que uma das subunidades mais expressa que outra e a taxa de produo final da protena activa baixa.

Protena dimrica

2- Sistema de expresso de dois genes num vector Foi pensado para solucionar o problema do sistema anterior. Neste um vector apenas transporta os dois genes a clonar. Nalguns casos os dois genes so colocados sobre o efeito de dois promotores e locais de poliadenilao distintos. Mas isto apenas soluciona o problema da perda de um dos vectores, visto que neste sistema tambm pode ocorrer expresso diferencial das vrias subunidades.

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Este sistema til para protenas de pequenas dimenses, no entanto tambm neste caso pode ocorrer uma produo diferenciada, pelas razes j apresentadas ou por simples diferenas de afinidade da RNA polimerase.

Protena dimrica

3- Sistema de expresso por vectores dicistrnicos Vectores dicistrnicos foram construdos para assegurar a igual produo de ambas as subunidades, partindo dos dois vectores anteriores e fazendo algumas alteraes sua estrutura. Neste vector esto presentes ambos os genes (1vector/2genes) separados por uma poro de DNA que contm um codo STOP e uma sequncia de ligao ao ribossoma (IRES internal ribossomal entry site). Estas sequncias IRES so encontradas em vrus de mamferos e permitem a traduo simultnea de diferentes protenas a partir de uma molcula de mRNA policistrnica. A transcrio do gene-IRE-gene controlada por um promotor e um local de poliadenilao. Um transcrito de dois genes (dicistrnico) sintetizado e a traduo inicia-se na extremidade 5 do mRNA para Protena dimrica produzir uma das cadeias, e internamente na regio IRE, para produzir a outra.

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Sistemas de expresso em clulas de insecto em cultura O estudo e compreenso da biologia dos baculovrus foi muito importante para o desenvolvimento destes sistemas de expresso. Os baculovrus so pequenos vrus que afectam invertebrados, incluindo espcies de insectos. Durante o ciclo de infeco so produzidas duas formas de baculovrus. A primeira forma consiste em simples viries que so libertados e vo infectar clulas vizinhas; A segunda forma constituda por um elevado nmero de viries aprisionados numa matriz proteica. Essa matriz proteica quase exclusivamente constituda por polihedrina e por isso o pacote de viries chama-se polihedro. Muitos polihedres so libertados pela lise celular para o ambiente, sendo os viries protegidos dos efeitos ambientas pela polihedrina. Posteriormente, aps a ingesto dos polihedres por um hospedeiro susceptvel, a matriz proteica solubiliza e os viries so capazes de infectar o organismo. Durante os estgios tardios do ciclo de infeco a protena polihedrina produzida em altas quantidades. A sntese inicia-se entre 36 a 48 horas aps a infeco e dura por mais 4 a 5 dias at morte do hospedeiro. O promotor de polihedrina excepcionalmente forte, mas a concluso do ciclo de vida no depende desta protena. Assim, ponderou-se que a substituio deste gene de polihedrina por um gene de uma protena heterloga, seguido da infeco de clulas de insecto em cultura, iria resultar numa produo em larga escala de protena heterloga, que fosse muito similar ou at mesmo autenticamente igual forma nativa da protena, devido similaridade nas modificaes ps-traducionais entre insectos e mamferos. O vrus utilizado em biotecnologia o Autogrpha californica (AcMNOV) a infectar linhas celulares de Spodopters frugiperda. Nestes casos o promotor do vrus encontra-se extremamente activo. Protocolo para o uso deste sistema de expresso - Criar um vector de transferncia: Trata-se de um plasmdeo, baseado nos de E. coli, que possui um segmento de DNA de (AcMNPV) que consiste: 1. Num promotor e regio adjacente, o que providencia um local para posterior recombinao homloga; 2. Num local de clonagem para inserir o DNA estranho; 3. Num terminador e sequncia de poliadenilao do gene polihedrina, e numa regio adjacente a estas que providencia um segundo local de recombinao homloga;

MCS

A regio codificante para a polihedrina retirada e o gene de interesse clonado entre a regio do promotor e o terminador da polihedrina, o processo desenrola-se da seguinte maneira: - Propagao em E. coli; - Infeco de clulas em cultura com AcMNPV; - Transfeco com vector de transferncia: Com este passo algumas clulas vo ficar infectadas e transformadas, nestas ocorre crossing-over duplo (ou seja,

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recombinao), e o gene com o promotor e terminador de polihedrina integrado no DNA de AcMNPV, com consequente perda do gene de polihedrina. Os viries na ausncia do gene de polihedrina produzem zonas distintas de lise celular nas quais baculovrus recombinantes podem ser isolados; Insecto

Vrus

- Deteco de clulas onde ocorreu a recombinao (pode-se usar hibridizao ou PCR); - Isolamento dos vrus recombinantes; - Infeco de novas clulas com vrus recombinantes; - No final de 30 a 40 horas temos protenas recombinantes; Contudo, este sistema tambm trs desvantagens: - caro manter clulas de insecto em cultura; - As clulas em cultura morrem passado 48 horas e necessrio fazer nova infeco, logo no h produo continua (ao contrrio das leveduras); - Corre-se sempre o risco de no haver modificaes ps traducionais correctas; Construo de um vector Shuttle E. coli-insecto A utilizao deste sistema pode ser bastante tentadora, contudo existe o problema da manipulao gentica em eucariotas no ser muito eficiente e por vezes no ser possvel de realizar. Assim, a utilizao de um vector Shuttle (vaivm) facilita o processo dado que a manipulao gentica levada a cabo em E. coli sendo apenas utilizadas as clulas de insecto na fase final do processo, para expressar a protena recombinante (transfeco apenas no ltimo processo). Este sistema uma pequena poro de plasmdeo de E. coli ladeado por segmentos de DNA, que residem fora da zona 5 e 3 do gene polihedrina, e que contm um gene de resistncia canamicina, uma sequncia de integrao inserida no gene lacZ sem perturbar as suas funes e uma origem de replicao para E. coli. O plasmdeo incorporado no genoma de AcMNPV por um evento de dupla recombinao, com consequente perda do gene de polihedrina.

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Vrus

Plasmdeo de E. coli

Bacmdeo

O crossing-over entre o plasmdeo de E. coli e o genoma de AcMNPV forma uma cadeia de DNA circular chamado bacmdeo que pode ser mantido em E. coli como se fosse um plasmdeo e que, aps a infeco de clulas do insecto, direcciona a produo de baculovirum. Nota: A construo deste vector evita grande parte do protocolo exposto anteriormente, diminuindo o custo financeiro, dispndio de tempo e nmero de infeces. Como parte do sistema bacmdeo, o gene em estudo colocado entre o promotor e o terminador da polihedrina num outro plasmdeo de E. coli chamado plasmdeo dador. Neste plasmdeo dador, o gene de resistncia gentamicina e o gene a clonar esto rodeados por sequncias de DNA, que liga ao local de insero (att) no bacmdeo e a um gene de resistncia ampicilina que reside fora dos dois locais de integrao.

Bacmdeo

Dador

Helper

Bacmdeo recombinante 44

A integrao entre os locais correspondentes do plasmdeo dador e do bacmdeo ocorre apenas na presena de protenas especficas (protenas de transposio) s quais, neste sistema, so fornecidas por um terceiro plasmdeo de E. coli plasmdeo Helper que possui um terceiro gene de resistncia para a tetraciclina. Assim as clulas bacterianas que carregam um bacmdeo so co-transformadas com os plasmdeos dador e Helper. Em algumas delas ocorre a recombinao e transposio, formando-se um bacmdeo recombinante. A integrao do segmento do plasmdeo dador com a unidade de expresso e gene de resistncia no local de integrao, destri a Reading Frame do gene lac Z. Consequentemente, as bactrias que transportarem bacmdeos recombinantes produzem colnias brancas na presena de IPGT e X-Gal. Alm disto, colnias brancas resistentes Canamicina (Kan1-) e sensveis tanto ampicilina, como tetraciclina, carregam apenas o bacmdeo recombinante, sem plasmdeos dador e Helper logo j ocorreu todo o processo. Aps todas estas manipulaes a integridade do gene clonado pode ser confirmado por PCR. Finalmente, o bacmdeo recombinante pode ser transfectado para celular de insecto em cultura, onde o gene transcrito e a protena reduzida. Curiosidade: Uma empresa publicitria na Internet faz produo de protena recombinante, recorrendo a larvas de insecto em vez de clulas em cultura. Diz que isto leva a um aumento na produo com diminuio nos custos de manuteno.

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Capitulo5- Engenharia de Protenas


Actualmente j possvel, atravs de tcnicas de DNA recombinante, isolar o gene de qualquer protena que exista na natureza para express-lo em organismos distintos ou para produzir um produto purificado que possa ser usado comercialmente. Contudo as propriedades fsicas e qumicas das protenas que ocorrem na natureza so muitas vezes pouco bem-vindas a aplicaes industriais. Assim, a capacidade de alterar algumas das suas propriedades algo muito valioso e til, recorrendo a tcnicas de mutagnese dirigida e mtodos de seleco podese criar e perpetuar um mutante que codifique uma protena com propriedades desejadas. Contudo, o nmero de mutante teoricamente possvel inimaginvel. Na prtica, algumas estratgias de mutagnese dirigida que so planeadas e elaboradas so infrutferas, dado que o mais comum que a troca de um nico aminocido faa decrescer a actividade da protena. Atravs do uso de uma srie de tcnicas que alteram aminocidos especficos codificados nos genes, podemos modifica vrias propriedades como: - Cintica enzimtica: reflecte a afinidade da enzima para o substrato (Km), assim como a velocidade mxima (Vmx) da reaco e eficincia cataltica global (Vmx/Km); - Termoestabilidade: estudos/modificaes muito rotineiras possibilita o uso da protena; - Estabilidade do pH: estudos/modificaes muito rotineiras possibilita o uso da protena, em condies que normalmente no actuaria; - Actividade a diferentes Ambientes (solventes): possibilita as reaces bioqumicas em condies no fisiolgicas; - Dispensa de co-factores: possibilita uma reaco industrial contnua, sem adio; - Resistncia a proteases: vai simplificar a purificao e aumentar a quantidade de produto recuperado. til quando se utiliza um cocktail de protenas para determinada facilidade. - Alterar a regulao alostrica: para diminuir o impacto do feedback metablico e assim aumentar o produto final;

1- Mutagnese Dirigida e Ao Acaso


No simples produzir uma nova protena com propriedades especficas predeterminadas. Contudo algo fivel a alterao de propriedades de protenas j conhecidas. Teoricamente, estas alteraes pode ser levadas a cabo quer ao nvel da protena, quer ao nvel do genoma. No entanto alteraes qumicas das protenas so geralmente violentas, no-especficas e requerem repetio (para cada pacote de protenas), e por isso prefervel a manipulao do DNA do gene a fim de criar uma protena com caractersticas conhecidas. Contudo, nem sempre possvel saber antecipadamente qual o aminocido especfico que contribui para uma propriedade qumica, fsica ou cintica especfica. Por exemplo, a propriedade particular da protena pode ser uma consequncia de dois ou mais resduos de aminocidos que se encontram separados na sequncia linear da protena, mas justapostos na sua estrutura final. No passado era usual a mutagnese convencional atravs de raios UV ou outras tcnicas, no entanto estas eram difceis de dirigir, causavam muitas mutaes, era difcil

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seleccionar qual o organismo de interesse e dava muito trabalho at obter o produto final. Num futuro no muito distante programas de computador podero fazer previses precisas acerca da funo de uma protena, tendo como base a sequncia de aminocidos, simplificando assim o processo de mutagnese dirigida. No presente, apesar de ser relativamente simples introduzir nova informao num gene clonado, ainda necessrio um largo nmero de ensaios para determinar se uma determinada propriedade foi realmente alterada. Mutagnese Dirigida Mutagnese dirigida consiste no processo para gerar modificaes nos aminocidos de codes codificantes. A mutagnese dirigida causa poucas variedades de protenas mutantes, pelo que fcil detectar estas mutaes e escolher qual o melhor para o nosso objectivo. Para determinar qual o aminocido a mutar so necessrias algumas informaes: sequncia de DNA e estrutura tridimensional obtida por anlise cristalogrfica de raios-x. Mas para muitas protenas tal informao no est ainda disponvel e por isso a mutagnese dirigida torna-se um jogo de tentativa e erro no qual so feitas alteraes aos nucletidos mais provveis de serem responsveis pela actividade enzimtica (so eles os aminocidos dos locais activos, regies reguladoras dos locais activos, regies estabilizadoras). Depois de identificada, mutada e clonada a protena h que testar para ver se realmente se gerou a alterao desejada. Um vasto nmero de tcnicas foram desenhadas para se poder colocar em prtica a mutagnese dirigida. Algumas foram desenhadas para mutar nucletidos especficos do gene clone, outras introduzem mutaes ao acaso num determinado segmento do gene criando um leque de protenas mutantes entre as quais pode estar a desejada. Utilizam-se regularmente: Bacterifago M13, Plasmdeos, PCR. 1- Mutagnese dirigida com Bacterifago M13 Esta tcnica est desenhada para produzir mutaes num ponto definido. Para isto o investigador precisa de saber: 1. O nucletido preciso a mutar e a sequncia de DNA que codifica para o mRNA onde este codo se encontra; 2. A troca de aminocidos a ser introduzida; Neste mtodo o gene a clonar inserido na cadeia dupla do genoma do bacterifago M13. A forma em cadeia simples do vector recombinante isolada e misturada com um oligonucletido sinttico. Este oligonucletido tem, excepto para um nucletido, a sequncia exactamente complementar a um segmento do gene a clonar. O nucletido diferente (mismatch) coincide precisamente com o nucletido do mRNA que alvo de mutao. O oligonucletido hibridiza melhor com a regio complementar do gene clonado se: - For adicionado em excesso em relao quantidade de DNA de M13; - O mismatch estiver perto do centro do oligonucletido; - A mistura for feita a baixas temperaturas na presena de altas concentraes de sal;

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A extremidade 3 funciona como primer para o incio da sntese de DNA que usa a cadeia de M13 intacta como molde. A replicao catalizada pelo fragmento de Klenows da DNA polimerase I de E. coli. A DNA ligase adicionada de forma a garantir que a cadeia estendida ligada extremidade 5 do primer. Dado que a sntese de DNA in vitro muitas vezes incompleta molculas em cadeia dupla parciais tm de ser removidas da mistura, a remoo feita atravs de uma mistura de sacarose e gradiente de centrifugao.

Nota: Na figura a sequncia ATT que codifica para isoleucina pelo codo AUU alterada para CTT que codifica para o codo CUU, que traduzido em leucina. Cada molcula de dsDNA completa contendo agora o nucletido mismatch introduzida em clulas de E. coli por transformao. As clulas infectadas produzem partculas virais que eventualmente lisam as clulas e formam placas fgicas. Teoricamente, como o plasmdeo de DNA replicado de forma semiconservativa, metade dos fagos formados sero mutantes e a outra metade carregar o gene original. Assim os fagos, produzidos anteriormente, iro ser propagados em E. coli seguindo-se o rastreio sob condies extremas. Usa-se como sonda o oligonucletido responsvel pela mutao. Como os fagos mutados e os no mutados diferem apenas num nucletido a hibridizao tem de ser completa e o rastreio preciso. Aps a forma de M13 em cadeia dupla ser isolado o gene excisado por enzimas de restrio e depois, para estudos futuros, a protena expressa e purificada em clulas em cultura (bactrias, mamferos, insectos, leveduras, etc.).

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Na realidade quando se usa mutagnese dirigida esperado 50% dos vrus M13 serem formas mutantes, mas tal no se verifica. Pelo contrrio, e dado uma srie de razes, apenas 1 a 5% das placas contm realmente vrus que transportem o gene mutante. Consequentemente a mutagnese dirigida por oligonucletidos (M13) tem de ser alterada em vrios aspectos de forma a enriquecer o nmero de placas mutantes que podiam ser obtidas. Por exemplo, uma modificao a introduo do vector viral M13 carregando o gene mutado, em estirpes de E. coli com duas enzimas do metabolismo gentico defeituosas: - A enzima d-UTPase (dut): clulas sem esta enzima funcional possuem um elevado nmero de dUTP, o que causa uma reduo no nmero de dUTP introduzidos durante a replicao, no lugar de dTTP; - A enzima uracil N-glicosilase (ung): na ausncia desta enzima funcional os resduos de dUTP que so incorporados no DNA no conseguem ser removidos. A cadeia simples de DNA de M13 produzida em E. coli tem aproximadamente 1% das suas timidinas substitudas por uridinas. Um oligonucletido mismatch e primer hibridizado a este DNA de M13 substituto e a segunda cadeia de M13 preparada por sntese e ligao in vitro. O bacterifago dsDNA ento introduzido numa estirpe de E. coli com o gene ung funcional. A enzima activa na clula hospedeira remove ento os resduos de uracilo do DNA em transformao. Como resultado, a cadeia original de M13 (que serviu como molde) ento degradada e apenas a cadeia mutada replicada. Desta maneira assegura-se a produo de M13 carregando o gene mutado.

2- Mutagnese dirigida com Plasmdeo de DNA O grande contratempo na mutagnese dirigida com oligonucletidos no bacterifago M13 o largo consumo de tempo em passos que so necessrios antes do gene mutado ser eventualmente isolado. Assim, como alternativa ao sistema M13, existe um variado nmero de protocolos que permitem mutagnese dirigida por oligonucletidos ser efectuada em plasmdeos em vez de M13. Com este protocolo, os passos de subclonar um gene alvo do plasmdeo para M13 e, depois, aps mutagnese, reclam-lo no plasmdeo evitado. Num dos protocolos baseados em plasmdeos, o DNA alvo inserido num local de clonagem do plasmdeo que contenha um gene de resistncia para a tetraciclina e um gene de resistncia no funcional para a ampicilina (Ampr), por substituio de um nucletido no meio da sua sequncia. Para aumentar a quantidade de DNA, o vector carregando o DNA alvo inserido em E. coli. Seguindose crescimento das clulas transformadas, o plasmdeo de DNA em cadeia dupla

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extrado e depois desnaturado por tratamento com produtos alcalinos para formar DNA em cadeia simples. Trs oligonucletidos diferentes que emparelham cada um com uma zona do DNA (gene, dois genes de resistncia) de uma das cadeias do plasmdeo desnaturado. Um dos oligonucletidos desenhado para alterar o DNA do gene alvo, o segundo desenhado para corrigir o nucletido errado no gene de resistncia ampicilina e o terceiro desenhado de modo a alterar um nucletido no gene de resistncia tetracidina, deixando-o no funcional. Os 4 dNTPs e a T4 DNA polimerase so adicionados ao meio (a T4 DNA polimerase tem a mesma actividade que o fragmento Klenow da DNA polimerase x de E. coli) e as extremidades 3 das oligonucletidos funcionam como primers para a sntese de DNA com a cadeia circular de DNA como molde. Os nicks gerados so fechados pela aco do DNA ligase. Aps sntese e ligao estarem completas a mistura usada para transportar clulas de E. coli. As clulas transformadas so seleccionadas por resistirem a ampicilina e serem sensveis tetraciclina. Atravs deste procedimento cerca de 90% das colnias seleccionadas possuem o gene mutado. Nos restantes transformados o gene alvo continua intacto porque no houve emparelhamento do oligonucletido ou ele foi perdido durante a sntese. As clulas com a mutao so seleccionadas por hibridizao. Todos os plasmdeos, estirpes, enzimas, oligonucletidos (outros que no sejam o responsvel pela mutao no gene alvo e tampes para este mtodo so vendidos em kits facilitando o seu uso e disperso. 3- Mutagnese dirigida por PCR Os investigadores continuamente tentaram desenvolver protocolos cada vez mais fceis e rpidos. Para mutagnese em local especfico, a polymerase chain reaction (PCR) pode ser explorada, tanto para aumentar a produo como para evitar o sistema do bacterifago M13. Num dos protocolos baseados no PCR, o gene alvo clonado num plasmdeo vector. Uma amostra deste plasmdeo dividida em duas partes iguais. Dois oligonucletidos especficos servem de primers ao PCR, um deles complementar

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a 100% sequncia de DNA adjacente ao gene a clonar, e o outro complementar a um outro segmento do gene a clonar, excepto para um nucletido, que ser alvo de alterao. Nos dois tubos de reaco o primer com o mismatch (1 e 3) emparelham em cadeias opostas, de modo que ambos os nucletidos do par so mutados. O segundo par de primers (2 e 4) so completamente complementares ao pequeno segmento de DNA. A posio das regies hbridas dos primers nos dois tubos de reaco tal que aps o ciclo de PCR a molcula de DNA amplificada tenha diferentes extremidades. Aps o PCR, o contedo dos dois tubos misturado, desnaturado e renaturado. Como resultado das diferentes posies das extremidades do DNA amplificado nos dois tubos de reaco, uma cadeia de um tubo de reaco hibridiza com a sua cadeia complementar do outro tubo de reaco de modo a formar uma molcula circular com dois nicks. Estes so reparados in vivo aps transformao de E. coli. Se acontecer que duas cadeias do mesmo tubo hibridizem forma-se uma cadeia linear. Em E. coli ou formas circulares so estveis e hereditrias, as formas lineares no.

Mutagnese ao acaso Como os investigadores nem sempre conhecem qual o nucletido especifico que necessrio alterar para que a(s) propriedade(s) da protena seja(m) alteradas, necessitam de usar mtodos que gerem todas as trocas de aminocidos possveis para um determinado local. Esta abordagem trs duas vantagens:

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1. No necessrio saber qual o papel de cada aminocido detalhadamente; 2. Podem-se obter mutantes inesperados com caractersticas teis e inesperadas. Se nenhum dos mutantes assegurar a protena que se pretendia necessrio recomear tudo de novo, desta vez mutando ma regio diferente do gene. Existem vrios processos para gerar oligonucletidos degenerativos, um deles atravs de um sintetizador automtico. Este possui a capacidade de inserir um determinado nucletido num determinado momento, o que se faz alterar a frequncia de insero de um determinado nucletido. Isto , em cada 100 nucletidos de Guanina que insere dois so na verdade Adenina/Citosina/Timina. Desta maneira o primer/oligonucletido sintetizado contm uma srie heterognea de DNA que ir gerar uma srie de mutaes agrupadas numa determinada zona do gene. Nota: As mutaes aqui originrias nem sempre so visveis, elas podem ser silenciosas ou podem at nunca chegar a concluir a sntese proteica. 1- Mutagnese ao Acaso com nucletidos anlogos Neste mtodo o gene alvo clonado num plasmdeo ladeado por dois locais de restrio. Estes locais so especialmente escolhidos para que aps a digesto com enzimas de restrio as extremidades 3 e 5 formadas sejam coesivas (sticky-ends).

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A enzima de E. coli exonuclease III (ExoIII) degrada DNA exclusivamente a partir de extremidades 3 recessivas. Ela no consegue degradar a partir de extremidades 3 protundentes nem a partir r qualquer extremidade 5. Quando Exo III adicionada mistura a extremidade recessiva 3 digerida, um nucletido de cada vez, durante algum tempo. Aps este tempo, esta falha (Gap) preenchida pelo fragmento do Klenow da DNA polimerase I. Uma mistura de dNTPs adicionada soluo, assim como um suplemento contendo um anlogo. As clulas de E. coli so transformadas com plasmdeos reparados, os quais possuem o anlogo em alguns pontos da sua sequncia de nucletidos. Durante a subsequente replicao do plasmdeo o nucletido anlogo substitudo por um diferente do original. Biblioteca Fgica Dyax (http://www.dyax.com) No processo de exposio fgica o novo material gentica inserido num gene fgico. A bactria processa o novo gene at formao de uma nova protena ou pptido. Esta protena ou pptido exposto na superfcie do fago. Passo 1 Insero do gene O processo inicia-se com a insero de diversos conjuntos de genes no genoma do fago. Cada fago recebe um gene diferente Geralmente Dyax insere o conjunto de genes no gene 3 do fago.

Passo 2 Exposio da protena O gene 3 modificado contem um segmento ligado (um anticorpo, uma protena pequena ou um pptido), que expresso na superfcie do fago. Cada fago recebe apenas um gene, pelo que cada fago expressa um nico tipo de protena ou pptido. Colectivamente uma populao de fagos pode expor mais de um bilio de protenas ou pptidos diferentes, cada uma ligada ao gene que a originou.

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Passo 3 Criao da biblioteca A biblioteca consiste num conjunto de fagos expondo diversas protenas ou pptidos relacionados. As vrias protenas relacionadas contm a maior parte das propriedades fsicas e qumicas das protenas ancestrais. Estas protenas so o incio do processo de terapias mdicas, que podem curar determinadas doenas.

Passo 4 Exposio ao alvo A biblioteca exposta a um alvo (molculas que causam doenas, como por exemplo receptores e enzimas) num suporte slido, como o teste de ELISA.

Passo 5 Ligao Quando a biblioteca exposta ao alvo alguns membros da biblioteca vo ligar-se ao alvo. Esta ligao ocorre atravs de uma interaco entre a molcula exposta do fago e a molcula alvo. Uma maior diversidade gentica das protenas expostas aumenta a probabilidade de um fago se ligar melhor ao alvo de interesse. Os medicamentos actuam ligando-se s molculas que causam as doenas, modificando o seu comportamento. As protenas isoladas atravs deste processo so candidatos a medicamentos devido sua ligao estreita e especifica a doenas alvo.

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Passo 6 Isolamento Aps a ligao molcula alvo, o suporte tem que ser lavado para remover possveis fagos que no se ligaram s molculas alvo.

Passo 7 Amplificao A exposio fgica permite a descoberta de medicamentos candidatos rapidamente, pois apenas capturado um fago da biblioteca. A replicao do fago na bactria aumenta para milhes rapidamente, providenciando material suficiente para a sequenciao. A sequenciao de DNA de fago possibilita saber qual o componente activo antes de se produzirem mais. Os bons candidatos sero posteriormente testados e desenvolvidos. Normalmente so recolhidos 10 a 1000 candidatos (ligandos) de uma diversidade inicial maior que 1 bilio. Dyax tem desenvolvido uma capacidade extensiva para seleccionar e testar os componentes activos atravs da automatizao.

As protenas que so criadas e isoladas pelo processo de exposio fgica Dyax tm uma interaco especfica com a doena alvo conhecida, fazendo deste um mtodo rpido, efectivo e objectivo da descoberta de medicamentos. As protena so candidatas para terapias efectivas com medicamentos.

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2- Termoestabilidade
Actualmente j existem milhares de enzimas descritas e estudadas quer a nvel bioqumico, funcional ou estrutural. Destes milhares apenas um pequeno nmero, cerca de 20, perfaz mais de 90% das enzimas utilizadas pela indstria. A principal razo pela qual no so adicionadas novas enzimas porque a actividade da enzima no organismo no bem desempenada sob condies industriais. A maioria das enzimas so facilmente desnaturadas quando expostas a determinadas condies, tais como altas temperaturas e presena de solventes orgnicos. Contudo, protenas termotolerantes podem ser isoladas a partir de microorganismos termfilos. Mas, na verdade, com a disponibilidade de mutagnese dirigida e clonagem de genes, estas sensibilidades no so mais significantes. As principais caractersticas que geralmente se alteram so: cintica, ligao ao substrato, termoestabilidade, estabilidade de pH, actividade a diferentes ambientes, dispensa de co-factores, resistncia a proteases e regulao alostrica. J se sabe como executar a tcnica de alterao, mas quais os aminocidos a escolher? Uma das primeiras consideraes a ter em conta o nmero de pontes dissulfito, alterando o nmero e posio das cistenas na estrutura primria da protena altera-se o nmero destas ligaes. Por exemplo, foi realizado um estudo onde se pretendeu alterar a temoestabilidade da lisosima T4, para tal foram realizados 6 mutantes desta protena com diferente nmero de cistenas em posies diferentes. Obteve-se os valores seguintes: 3 Wild A B C Ile Cys Cys Cys 9 Ile Cys Cys Cys 21 Thr Thr Thr Cys 54 Cys Thr Thr Thr 97 Cys Ala Cys Cys 142 Thr Thr Thr Cys 164 Leu Cys Cys Cys n de Actividade Temp S-S (C) 0 100% 41,9 1 106% 48,3 2 95% 57,6 3 0% 65,5

Estes resultados revelam que a termoestabilidade aumenta com a presena de pontes dissulfito. A perda de actividade no caso C provvel que esteja relaciona com alteraes na estrutura final da protena. Muitas vezes a engenharia enzimtica um jogo de tentativa e erro para ver se se consegue identificar o aminocido que melhor altera a caracterstica em estudo. Uma outra abordagem sobre a termoestabilidade, leva os investigadores a jogar com a carga dos aminocidos. Provocar alteraes entre os aminocidos carregados e no carregados tambm um bom processo para aumentar a estabilidade a altas temperaturas. Porm este um jogo arriscado dado que com esta alterao altera-se tambm a carga superficial da protena, o que pode levar a outras alteraes. As alteraes mais comuns so entre a aspargina e o aspartato, e entre a glutamina e o glutamato. Contudo, estas alteraes reduzem a termoestabilidade, para aument-la bom substituir este aminocido por treonina ou isoleucina. Estas alteraes de aminocidos interferem tambm com o tempo de meia-vida da protena.

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Aumentar a actividade Ocasionalmente, uma protena quando expressa menor activa que o esperado, nesses casos fazemos uso da engenharia de protenas. Como por exemplo caso o interfero Humano, que quando expresso em E. coli apresentava apenas 10% da sua actividade antiviral. E apesar da grande quantidade que era produzida, a maioria concentrava-se em dmeros ou outros oligmeros. A anlise da sequncia de DNA de -interfero revelou que a protena nativa possua trs resduos de cistena, pelo que um deles ou mais, podia estar envolvido na formao destes oligmeros em E. coli mas no em humanos. Foi, ento, pensado e decidiu-se substituir um dos resduos cistena por um resduo de serina, isto porque toda a estrutura do aminocido igual com a excepo da serina possuir 0 em vez se S, impossibilitando assim a formao a pontes dissulfito. Esta deduo provou estar correcta. No houve formao de estruturas multimtricas com a produo mutante ser-17 -IFN e, alm disso, a sua actividade subiu para valores equivalentes ao interfero em clulas humanas. O exemplo de uma enzima modificada a Tirosil tRNA sintetase, esta enzima normalmente adiciona tirosina ao seu tRNA correspondente, numa reaco de dois passos: Tyr + ATP Tyr-A + PPi / Tyr-A + tRNAtyr Try-tRNAtyr + AMP

Ambas as reaces tm lugar quando os substratos se encontram ligados enzima. O que se fez foram vrios mutantes, alterando o aminocido na posio T1 local activa e pretendia-se saber o quanto isto afectava a cintica enzimtica. Viu-se, atravs de estudos, que a cintica das protenas dependia em grande escala dos aminocidos no centro activo. As modificaes desta enzima em E. coli ajudam na expresso de protenas eucariticas na mesma. Dispensa de co-factores As subtilisinas so um grupo de proteases que so secretadas para o meio por bactrias gram-positivas e so amplamente utilizadas pela indstria nos agentes de limpeza. Todas as subtilisinas ligam fortemente Ca2+. A ligao do clcio estabiliza a enzima. Infelizmente outros produtos tambm so usados na indstria, alguns deles quelantes (consumidores de Ca2+), que tornam a subtilisina rapidamente inactiva. Para contornar este problema primeiro necessrio retirar a necessidade de Ca2+ da enzima e depois alterar a estabilidade da enzima modificada, a fim de aumentar a sua actividade, quando na ausncia de Ca2+. O primeiro passo foi, por mutagnese dividida eliminar todos os aminocidos que faziam parte do ncleo ligador de Ca2+, esta foi a tarefa fcil e, surpreendentemente, a enzima mantinha a sua estrutura final. O segundo passo desenvolver uma forma estvel que apesar da ausncia da ligao de Ca2+ mantivesse a sua actividade. Os investigadores partiram do pressuposto que teria de ser um dos dez aminocidos que interagia com o clcio o responsvel pelo aumento na actividade da protena. Mas como eles no sabiam priori qual teve de ser usada, a mutagnese foi feita ao acaso. As mutaes realizadas incidiram em quatro zonas da protena: terminal N e trs regies internas. Aps mutagnese durante o rastreio registaram-se sete mutaes nas dez posies pretendidas. Quando estas mutaes foram combinadas num nico

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gene, a enzima produzida possua propriedades cinticas semelhantes da subtilisina. Mais do que isso, a forma mutada era cerca de 10x mais estvel que a forma nativa na ausncia de Ca2+ e, surpreendentemente, 50% mais estvel do que a mesma na presena de Ca2+. Decrscimo na sensibilidade a proteases A streptocinase uma protena produzida por bactrias patognicas e uma protena que degrada cogulos sanguneos. A streptocinase forma um complexo com o plasminognio protease que degrada fibrina dos cogulos sanguneos. Infelizmente, o plasminognio rapidamente degrada a streptocinase, sendo necessrio adicion-la em intervalos de 30 a 90 minutos. Dado que indivduos que sofreram ataques de corao necessitam de assistncia rpida, uma streptocinase mais duradoura era til e podia contribuir para salvar muitas vidas. De modo a tornar a streptocinase menos susceptvel protelise ou resduos de lisina nas posies 59 e 386 alvo de digesto por parte do plasminognio foram alterados para glutamina, atravs de mutagnese dirigida. Foi recolhida a glutamina, pois o tamanho da sua cadeia lateral semelhante ao da lisina e no carregado positivamente. Estudos de actividade revelaram que os mutantes criados mantinham a mesma actividade que a enzima nativa mas que eram cerca de 21x mais resistentes aco das proteases, com um tempo de meia-vida significantemente superior.

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Capitulo 6- Diagnstico Molecular


O sucesso da medicina e agricultura moderna muitas vezes depende da habilidade dos trabalhadores de campo para detectarem a presena de vrios organismos especficos em humanos, animais, plantas, solo, gua, etc. por exemplo, a preveno, controlo ou tratamento de muitas doenas infecciosas geralmente facilitado pela identificao precoce e precisa do organismo patognico em causa. No entanto a identificao de muitos destes agentes patognicos requer a cultura destes, sendo por isso cara, demorada e requerendo condies apropriadas, isto torna o trabalho de campo muito mais difcil. Os mtodos de diagnstico usados normalmente envolvem: 1. Observao microscpica rpida mas requer grande percepo e sensibilidade por parte do observador, sem falar que apenas detecta agentes patognicos visveis ao microscpio; 2. Inoculao de animais ratos ou culturas celulares, envolve a injeco de uma amostra do paciente (soro, sangue) no animal ou na cultura de clulas e observa-se o resultado. um mtodo lento e pode falhar; 3. Deteco de anticorpos 4. Deteco de DNA Por hibridizao ou PCR, estas so actualmente as mais usadas no campo. Actualmente os grandes avanos na rea do diagnstico molecular so provenientes do estudo analgico, o que antigamente se resumia a uma biopsia (onde era necessrio actuar uma pessoa com experincia), hoje resume-se a uma anlise protemica (espectometria de massa) ou genmica (microarrays). A questo que hoje se coloca se a diferena gentica entre dois indivduos no ser razo para o mesmo tratamento no ser adequado para ambos. E por isso mesmo inteno que num futuro no muito distante se possa fazer um screaning do paciente (padro gentico e protenas activas) a fim de cruzar os dados e desenhar um tratamento especfico para cada indivduo. Porm existem vrios argumentos contra este tipo de estudo (genoma do individuo), principalmente por parte de entidades de biotica. Isto porque as entidades de biotica defendem que tal processo invaso de privacidade do doente, a sua divulgao no deve estar disposio de qualquer um como empresas empregadoras ou companhias de seguro, e principalmente porque para tal tcnica ser aplicada seria necessrio termo de comparao logo seria necessrio o screaning de vrios indivduos saudveis. At que ponto isto no algo muito confidencial e que ningum deveria ter acesso? Alm disso, at que ponto saudvel saber os riscos que corre? Assim, hoje em dia, tentam-se desenvolver tcnicas de diagnstico: 1. Simples, para fcil utilizao no campo ou no laboratrio; 2. Sensveis, para detectar aspectos em pequenas quantidades de dados e no gerar falsos negativos; 3. Especficos, para no detectar coisas alheias infeco e gerar falsos positivos; Assim hoje utilizam-se vrias tcnicas de diagnstico molecular, mas quase todas elas se baseiam em dois mtodos bastante especficos: Imunodeteco e deteco de DNA (hibridizao/PCR).

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1- Diagnstico Imunolgico
Muitos dos ensaios imunolgicos so sensveis, especficos e simples. Eles podem ser usados num vasto nmero de aplicaes incluindo deteco de drogas, cancros, metabolitos e outras identificaes. Contudo estes apresentam limitaes, se o alvo uma protena, necessrio que o gene que codifica a protena/local da protena lavo esteja presente, e no caso de estar necessrio que no esteja mascarado ou bloqueado de alguma maneira. No princpio, o diagnstico tradicional tentava identificar molecular libertadas pelo agente patognico a fim de o identificar. No entanto saber se determinada molcula estava presente na amostra constitua um problema, muitas vezes esta identificao residia na identificao directa atravs de diferentes reaces bioqumicas. O problema deste mtodo era se isto no iria conduzir a uma srie de sistemas de deteco individualizados para cada organismo. Assim deu-se preferncia a um mtodo standartizado para marcar qualquer molcula chave, independentemente da sua natureza qumica. Como os anticorpos ligam especificamente um local na molcula alvo (antignio), tcnicas baseadas especificamente na deteco do complexo antignio-anticorpo tm abolido a necessidade de usar dispositivos de identificao nicas para cada molcula-chave. ELISA Enzime-linked imunosorbent Assay Existem vrios mtodos diferentes para determinar se um anticorpo se encontra ligado ao seu antignio. O mtodo ELISA o mais frequente. Este mtodo consiste em: 1. Ligar a amostra em estudo a um suporte slido; 2.Ligar o anticorpo primrio amostra em estudo fixada no suporte, de seguida lavar; 3. Adicionar o anticorpo secundrio, que liga especificamente o anticorpo primrio e no a molcula alvo. Ligado ao anticorpo secundrio existe uma enzima, como a fosfatase alcalina que consegue catalizar uma reaco que converte um substrato incolor num produto colorido. Por fim lava-se o anticorpo secundrio; 3. Adiciona-se o substrato incolor; 4. Observa-se, regista-se e mede-se a quantidade de produto; Caso o anticorpo primrio no se ligue amostra, a primeira lavagem remove-o. Consequentemente o anticorpo secundrio e a enzima anexada no tm ao que se ligar e por isso so removidos na segunda lavagem, logo o resultado final da mistura permanece incolor. Dado que os anticorpos secundrios esto amplamente comercializados, apenas necessrio desenvolver o anticorpo primrio a cada novo diagnstico. A caracterstica principal de ELISA a ligao especfica do anticorpo primrio ao local da molcula alvo. Se a molcula alvo , por exemplo, uma protena, ento uma preparao purificada desta protena usada para produzir os anticorpos que sero usados em ELISA. A mistura de anticorpos resultantes encontrados no soro (antisoro) do animal inoculado contem um nmero de anticorpos diferentes que vo ligar diferentes zonas da molcula alvo (eptoles). Tal mistura de anticorpos chamado de preparao policlonal. Para certos ensaios o uso de anticorpos policlonais trs dois contratempos:

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1. A quantidade de anticorpos diferentes numa preparao pode variar entre diferentes aplicaes; 2. Anticorpos policlonais no podem ser usados para distinguir entre dois alvos semelhantes. Contudo estes problemas podem ser ultrapassados, porque actualmente possvel criar uma preparao de anticorpos dirigida contra um nico local no antignio, os anticorpos monoclonais.

Anticorpos monoclonais Na resposta a alteraes imunolgicas, cada clula produtora de anticorpos sintetiza e secreta um anticorpo que reconhece um local especfico (eptole). Como um antignio geralmente possui diferentes eptoles existe, normalmente, um conjunto de clulas em que cada uma produz diferentes anticorpos contra diferentes eptoles. Tais conjuntos de anticorpos que respondem a diferentes eptoles do mesmo antignio so chamados anticorpos policlonais. Contudo, como j referido, anticorpos policlonais no so bem-vindos s aplicaes biotecnolgicas, pois podem alterar os resultados atravs de falsos positivos e intensidade incorrecta na resposta. Assim, algo fundamental para a aplicao de anticorpos, como agentes de diagnstico ou componentes de agentes teraputicos, era descobrir como criar uma linhagem celular que pudesse crescer em cultura e produzir um nico tipo de anticorpo monoclonais com uma alta afinidade para a molcula alvo. Infelizmente, os linfcitos B no se reproduzem em cultura. No entanto, verificou-se que um tipo celular hbrido pudesse resolver o problema. Esta iria ter o genoma de linfcito B, produtor de anticorpos, e as funes de diviso celular de uma clula competente capaz de crescer em meio de cultura. Era conhecido que linfcitos B por vezes se tornavam cancergenos (mielomas) e adquiriam a capacidade de crescer em cultura enquanto retinham muitos atributos das clulas B. Assim, clulas de mieloma, especialmente as que no produzem molculas de anticorpo tornaram-se candidatas fuso celular com linfcitos B. Em meados dos anos 70 tal tornou-se uma realidade. Nota: A especificidade de um anticorpo em reconhecer determinado eptole est relacionada com a sua zona varivel.

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Formao e seleco de clulas Hbridas O primeiro passo na produo de anticorpos monoclonais (1) inoculao do animal com o antignio. Aps inoculao peridica, durante algumas semanas, realizam-se testes de ELISA para comprovar que o rato desenvolveu resposta imunitria. Se eles responderem positivamente, ento (2) os ratos so sacrificados e as clulas produtoras de anticorpos so isoladas. (3) A suspenso de clulas obtidas misturada com uma suspenso de clulas mieloma que so geneticamente defeituosas para HGPRT. (4) mistura adicionada polietileno glicol por uns minutos e depois elas so transferidas para um meio de cultura. O tratamento com polietileno glicol facilita a fuso entre as clulas A fuso vai ocorrer ao acaso Mieloma Mieloma, Mieloma Linfcitos, Linfcitos Linfcitos e clulas no fundidas, contudo, o meio onde crescem (HAT), permite apenas fuso Mieloma Linfcito crescer. Cerca de 10 a 14 dias depois, estas clulas so transferidas para placar com meio de crescimento, sem HAT, e deixam-se proliferar. Identificao O passo seguinte consiste na identificao das clulas hbridas (hibridomas) que produzem os anticorpos contra o antignio. Um mtodo muito usado retirar o meio das placas e coloc-lo em novas placas que haviam sido anteriormente incubadas com o antignio alvo. Se o meio contiver o anticorpo (anticorpo 1) que reconhea o eptole de antignio ele vai ligar-se e no vai sair com a lavagem. Um segundo anticorpo depois adicionado e ele vai ligar-se, caso l se encontre, ao anticorpo primrio, esta ligao vais possuir o tipo de manifestao j referenciada (radioactiva, flourescente, enzimtica...). Os poos da primeira placa, cujo resultado (na segunda placa) tenha dado positivo podem conter uma mistura de clulas fundidas. Estas clulas so posteriores diludas com meio de cultura e semeadas em novos poos, a fim d estabelecer linhagens celulares (clones). Aps o cultivo destes poos a sua resposta novamente avaliada para ver qual destes produzem anticorpos monoclonais.

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2- Deteco de DNA especfico (hibridizao ou PCR)


O material gentico de um organismo contm a informao essencial que contribui para as suas vrias facetas e caractersticas. Por exemplo, a patogenidade bacteriana pode dever-se presena de genes especficos ou um conjunto de genes. Da mesma maneira alteraes num gene podem provocar doenas humanas hereditrias. Em teoria, a sequncia de nucletidos que contribui para uma caracterstica biolgica partcula uma assinatura distinta que, se detectvel, pode ser usada como diagnstico determinante definitivo. A hibridizao de cidos nuclecos a base para ensaios rpidos e rentveis. A base fsica para estes sistemas exactamente o emparelhamento de nucletidos e as pontes de hidrognio entre eles. Em esquema, bastante geral: 1- Ligar ssDNA a um suporte; 2- Ligar ssDNA marcado (sonda), sob determinadas condies de temperatura e fora inica, a fim de promover a ligao entre o target e a sonda; 3- Lavar o excesso da sonda; 4- Detectar a sequncia hbrida formada entre a sonda e o DNA alvo; Um teste de diagnstico por hibridizao de DNA tem sempre trs elementos essenciais: sonda, DNA alvo, sinal de deteco. Este tipo de deteco pode ser, ao mesmo tempo, extremamente especfico e altamente sensvel. A habilidade de levar a cabo ensaios de diagnstico com sondas de cidos nuclecos em disponveis algo extremamente desejado, especialmente em ensaios clnicos. Estes ensaios tm sido usados em muitas amostras fecais, sanguneas, urina, tecidos, etc. no caso da sequncia alvo ser rara na amostra, o PCR pode amplia-la. Em todos estes processos tem que se assegurar: - Sonda de DNA o mais especfica possvel; - Deteco o mais especifica possvel, para resultar mesmo na presena de quantidades muito reduzidas; Pode-se detectar diferentes organismos, estirpes e genes, usar sondas de DNA e RNA (pequenas ou grandes, sintticas ou naturais). Nota: Actualmente mais de 100 testes j desenvolvidos (vrus, bactrias, fungos, protozorios, etc) e o teste de ELISA no consegue reconhecer infeces antigas das actuais, pois amas possuem anticorpos presentes, neste estudo marca-se a diferena pois so detectados cidos nuclecos, apenas presentes com o organismo. Diagnstico da Malria Um exemplo de um protocolo de diagnstico que usa sondas de DNA o processo desenvolvido para a deteco de Plasmodium falciparum. Neste caso necessrio um teste simples, sensvel e no muito caro para identificar o parasita em vrios locais, para ter acesso aos programas de irradiao e para facilitar o tratamento precoce. Correntemente, a infeco da malria diagnosticada por exames microscpicos de amostras de sangue (esfregaos) e consome muito tempo e trabalho intensivo, especialmente dado o nmero de amostras a analisar. Apesar de ensaios imunolgicos para a deteco do Plasmodium tais como ELISAs serem rpidos e susceptveis automatizao, no conseguem distinguir entre infeces presentes e passadas, especialmente porque esto direccionadas para detectar anticorpos anti-Plasmodium.

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Um processo de diagnstico de DNA que mea selectivamente apenas infeces correntes, isto , a presena de DNA do organismo, foi largamente desenvolvido atravs do uso de DNA repetitivo do Plasmodium falciparum. Para isso fez-se um estudo que envolve a sequenciao dos genomas de vrias espcies de Plasmodium e leitura do grau de hibridizao de diferentes zonas do genoma de Plasmodium falciparum com os restantes. Foi escolhida como sonda uma zona que no hibridiza com o genoma de nenhuma das espcies no patognicas, a fim de no criar falsos positivos. Esta sonda muito sensvel. Teste imunocromatogrfico Consiste num exame fcil de executar em campo. necessria uma placa de papel com um marcador em suspenso. Quando a amostra de sangue do paciente colocada na extremidade do papel o marcador reage. Por capilaridade a amostra vai migar pelo papel e atingir novas barreiras com anticorpos imobilizados, a acumulao destes anticorpos numa determinada zona permite-nos a visualizao mais eficiente dos resultados. Na outra extremidade da placa de papel existe uma segunda barreira que serve como controlo positivo. A este novo diagnstico d-se o nome de now malria. Deteco de Tripanossoma cruzi Este protozorio o causador da doena de chagas. Este parasita altamente virulento e infeccioso bastante comum na Amrica Latina, onde dispersada por insectos e onde este tipo de diagnstico mais necessrio. O diagnstico desta doena geralmente feito por exame microscpico de amostras de sangue fresco (esfregao). Alternativamente, existe uma tcnica que, apesar de demorar mais tempo, assegura que o parasita no escapa aos olhos humanos, esta consiste na alimentao de insectos com o sangue do paciente e observamos o contedo do intestino deste passado 30 a 40 dias. Ambos os testes referidos so laboratoriais e despendem tempo e dinheiro. A doena das chagas pode tambm ser detectada por testes imunolgicos, contudo estes so famosos, neste caso, por resultarem em falsos positivos. Assim como alternativa a estes processos pouco satisfatrios, vrios processos baseados na tcnica PCR foram desenvolvidos. No presente diagnstico por PCR usado para complementar testes imunolgicos, para tal usam-se sondas de 188pb de uma sequncia nica de T. cruzi que hibridizam com o genoma do parasita. A presena deste oligonucletido ampliado relativamente simples atravs de electroforese. Processos de deteco no radioactivos Na maioria dos laboratrios, a hibridizao de cidos nuclecos normalmente detectado pela marcao da sonda com radioactividade, geralmente usando-se o istopo Fsforo-32. De um modo standart, a sonda marcada radioactivamente misturada com o DNA alvo que se encontra ligado a uma membrana. Esta mistura/suporte lavada e a presena de radioactividade revelada por raio-X. Contudo, o fsforo-32 um istopo potencialmente perigoso e de vida curta, alm de que requer um laboratrio com capacidade e material para lidar com este tipo de sistemas. Deste modo, mtodos no radioactivos tambm foram desenvolvidos.

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Os sistemas no radioactivos atingem uma amplificao de sinal atravs de uma converso enzimtica, tanto cromognica quanto quimioluminescente. Os substratos cromognicos alteram a cor quando processados enzimaticamente, e os substratos quimioluminescentes so os que emitem luz. Estes sinais so detectados, na maioria dos casos, por incorporao de biotina ligada a um nucletido da sonda de DNA e seguindo um processo mais ou menos standart. 1- Hibridizao da sonda marcada com biotina com o DNA alvo; 2- Adio da streptoviclina, uma molcula bacteriana que liga biotina; 3- Adio de biotina marcada com fosfatase alcalina ou peraxidose; 4- Adio de substrato para a fosfatase alcalina (cromognio) ou para a peraxidose (quimioluminescente). Com este mtodo verifica-se uma ampliao de sinal porque a relao no unidireccional (1 biotina 1 cadeia) mas multidireccionais (1 sonda 3 biotinas marcadas).

PCR com caudas fluorescentes Para esta tcnica baseada na reaco de PCR, o produto ampliado marcado com fluorescncia por ligao de uma marca fluorescente extremidade 5 do primer. Estas marcas podem ser fluorcena que d um tom verde ou rodomina que possui um tom avermelhado. Aps amplificao por PCR os primers so separados do produto amplificado e a presena de fluorescncia detectada e quantificada.

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Balizas de DNA Um mtodo moderno e so radioactivo para a deteco de DNA envolve o uso de sondas chamadas Balizas de DNA. Uma molcula tpica composto por 25 nucletidos, os 15 do meio complementares ao DNA alvo e os 5 de cada extremidade complementares uns com os outro, e no com o DNA alvo. Um cromforo fluorescente (fluorforo) anexado/ligado extremidade 5 e um cromofro no fluorescente (quencher) e capaz de absorver a luz do fluorforo da extremidade 5 adicionado extremidade 3. temperatura ambiente, a conformao das Balizas assegura que o fluorforo e a quencher estejam prximos um do outro, de modo luz do fluorforo ser absorvida (quenched). Por outro lado, quando os 15 nucletidos do meio hibridizam com a molcula alvo, o flourforo deixa de ser quenched e j emite luz. Com este mtodo necessrio ter o cuidado de manter a reaco sempre temperatura ambiente, pois temperaturas elevadas podem levar desnaturao da Baliza e obteno de falso positivo. Este processo pode ter maior sensibilidade se o DNA alvo for ampliado por PCR.

DNA Fingerprinting Por vezes necessrio, no quotidiano, fazer a identificao (distino entre dois indivduos) e para isso recorre-se gentica molecular. A distino de indivduos por anlise de DNA chamada DND fingerprinting. De uma maneira geral, existem duas estratgias para determinar relaes entre seres humanos. Uma delas reside na hibridizao de DNA a minisatlites no degradados. Alternativamente, na presena de amostras de pequenas dimenses/volumes ou DNA degradado, uma srie de primers de PCR pode ser usada para determinar qual das duas amostras tem as mesmas bandas de amplificao que o sujeito em estudo. Para o mapeamento dos minisatlites, uma amostra de DNA clivada com enzimas de nutrio e os fragmentos so separados um, gel de agarose e transferidos por blot para uma membrana. A membrana sequencialmente hibridizada com 12 sondas distintas, cada uma delas reconhecendo uma zona distinta no DNA. Aps hibridizao com todas as sondas, as bandas s quais a sonda ligou so visualizadas por autorradiografia e o padro para cada amostra registada. Antes da prxima sonda ser usada, a anterior completamente removida da membrana. Uma srie de sondas muito comuns para este tipo de anlise consiste nos minisatlites de DNA. Estas sequncias ocorrem pelo genoma e consistem em tandem repeat sequences, elas so diferentes para cada indivduo. Em alternativa ao southern blot tambm se utiliza PCR para fazer a identificao.

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RAPD Random amplifies Polymophic DNA Os padres de bandas do DNA no so apenas importantes em anlises forenses, elas tambm so teis na distino entre plantas de diferentes cultivares. Marcadores de Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) podem ser usados para estes propsitos. Neste processo um primer arbitrrio de oligonucletidos com cerca de 9 ou 10nucletidos adicionado amostra do DNA cromossomal da planta; virtualmente qualquer sequncia de oligonucletidos deste gnero (pequena, sem sequncias polindrmicas e com grandes quantidades de G e C) vai emparelhar com qualquer zona de qualquer DNA primer generalista e nada especifico. Sempre que um primer possa hibridizar com ambas as cadeias de DNA na orientao correcta e dos dois lados a cerca de 100 a 3000 pb de distancia, ento a regio de DNA intermdia vai ser amplificada e um fragmento de DNA com tamanho caracterstico pode ser visualizada em electroforese. Assim, RAPDA de diferentes cultivares de plantas pode ser comparado quando o mesmo conjunto de oligonucletidos usado. Lembrar que uma pequena diferena, como a troca de bases nestes primers, vai desencadear uma resposta completamente diferente. Apesar desta tecnologia ter sido inicialmente desenhada para plantas, ela tambm pode ser usada para distinguir diferentes microorganismos. Assim, ao contrrio do DNA fingerprinting onde se utilizavam primers especficos, esta tcnica baseia-se na sua generalidade e aleatoriedade de amplificao de DNA. No final destas anlises obtemos perfis genticos e isso possibilita-nos a construo de rvores filogenticas. Em comparao com outros processos este tem vantagens ao nvel: - No so necessrios primers especficos, e o mesmo primer pode ser usado para vrias espcies. - No necessrio grande tecnologia de rastreio. - Rpido o processo pode ser automatizado. - Como se faz uso da tcnica PCR no necessrio grandes quantidades de DNA molde.

3- Diagnstico Molecular de Doenas Genticas


A habilidade de diagnosticar a ocorrncia de doenas genticas hereditrias especficas torna possvel aos indivduos saberem quais os riscos que podem correr. A anlise de DNA pode tambm ser usada na identificao de portadores de doenas genticas, diagnose pr-natal e fazer um diagnstico prvio de uma doena (tal como a susceptibilidade do individuo a uma determinada doena). Os teste ao nvel do DNA so definitivos para determinar a existncia de uma mutao especfica. Antigamente, os testes incidiam quase exclusivamente na deteco de um produto do gene. Anemia Falciforme Anlise de Restrio A anemia falciforme uma doena gentica resultante de uma troca de nucletidos no codo para o sexto aminocido da cadeia da hemoglobina. A anemia causada pela falta de capacidade da hemoglobina mutante para transportar oxignio. A expectativa de vida de um homozigtico para esta doena (S/S) bastante baixa. Indivduos heterozigticos (A/S) so apenas portadores da doena, eles produzem

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glbulos vermelhos normais em forma de faia e no apresentam qualquer sintoma, amenos que sujeitos a condies extremas, como altas altitudes e temperaturas baixam o O2 disponvel. A pequena troca de nucletidos, que provoca a alterao de uma valina para uma glutamina, altera uma sequncia de restrio clivada pela ConI. Esta enzima reconhece a sequencia CCTNAGG e cliva o DNA entre o C e o T. no gene para a hemoglobina normal a sequncia CCTGAGG, enquanto que no gene mutante a sequncia CCTGTGG. Aps a ligao de dois primers de oligonucletidos cuja sequncia ladeia os locais de restrio ConI, o DNA ampliado por PCR. Depois, este dirigido com Cn ConI e analisado em electroforese. Se a sequencia se encontrar presente (gene normal) observam-se fragmentos de DNA caractersticas, mas um diferente aspecto adquirido quando o local de restrio est ausente. Por este teste um mapeamento gentico de uma pessoa pode ser feito de uma forma simples, fcil, rpida e directa. Alm disto, este ensaio no necessita de nenhuma reaco com qualquer tipo de sonda, sendo apenas necessrio corar o DNA.

Obviamente, nem todas as doenas genticas produzem alteraes em locais de restrio. Por isso mesmo, outras tcnicas para detectar pequenas alteraes de nucletidos tm sido desenvolvidas. Tais como: - PCR/OLA - Sondas Padlock - Genotipagem por PCR - Microarrays de DNA PCR/OLA Oligonucleotide Ligation Assay Assumindo que num gene normal um par de nucletidos especficos (digamos n106) a ligao adenina-timina, e numa forma mutante guanina-citosina. O conhecimento da sequncia de nucletidos de ambos os lados da cadeia na posio 106 possibilita a construo de duas pequenas sondas (com cerca de 20 nucletidos) adjacentes, que so complementares a uma das duas cadeias de DNA nativas a serem sintetizadas. A caracterstica principal deste par de oligonucletidos que um deles (sonda X) tem o seu ultimo nucletido (3) complementar ao nucletido na posio 106 da sequncia normal. A outra sonda (Y) comea na posio 5 com o nucletido complementar ao nucletido imediatamente a seguir ao da posio 106. Quando estas duas sondas so hibridizadas com o DNA alvo (o qual foi ampliado por PCR) contendo a sequncia normal, o nucletido na extremidade 3 da sonda X emparelha com o DNA e a sonda alinha-se de modo a que a sua extremidade 5 fique adjacente extremidade

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3 da sonda X. A adio da DNA ligase promove a ligao covalente destes dois oligonucletidos e formao de uma s sonda com 40 nucletidos. Pelo contrrio, quando na presena de DNA mutante onde o nucletido da posio 106 alterado, o nucletido da extremidade 3 da sonda X no emparelha enquanto que a sonda Y emparelha normalmente. Neste caso a DNA ligase no vai provocar qualquer ligao e forma-se uma gap.

A fim de determinar se ocorreu ligao entre as duas sondas, dois compostos de baixo peso molecular so anexadas a elas e servem como indicadores da ligao ao anticorpo, so eles a biotina e a digoxigenina. Aps, os passos anteriores estarem completos o DNA desnaturado para libertar as sondas do DNA alvo, e a mistura transferida para um poo de plstico onde foi previamente imobilizada estreptaridina. O poo ento lavado e a mistura removida, de modo que apenas a sonda ligada biotina permanea no poo devido ligao com a estreptaridina imobilizada. De seguida anticorpos para a digoxigenina ligados fosfatase alcalina so adicionados. Aps adio e posterior lavagem dos poos para remover anticorpos um substrato cromognico adicionado. O aparecimento de cor no poo significa que o anticorpo para a digoxigenina se ligou e que por isso a digoxigenina est presente, ou seja, a sonda Y, marcada com digoxigenina encontra-se ligada sonda X. Se no aparecer substrato colorido porque no houve ligao e est-se na presena de um gene mutante.

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De uma maneira geral o sistema PCR/OLA um sistema rpido, sensvel e altamente especfico. Ele foi mesmo adaptado a um mtodo mecanizado e automtico. Sob estas condies mais de 1200 ligaes podem ser ensaiadas por dia. Sondas PadLock Consiste na utilizao de um oligonucletido com cerca de 80 a 90 bases, nas quais 5 a 20 nucletidos em ambas as extremidades so completamente complementares com a regio do DNA a hibridizar, enquanto os restantes 50 nucletidos do meio no emparelham. Estes 50 nucletidos possuem ligadas molculas reprter que vo ajudar na identificao da mutao. O nucletido na extemidade 5 da sonda e o da extremidade 3 tm de ser complementares a dois nucletidos adjacentes no DNA a pesquisar. Assim ao adicionar a sonda estas duas extremidades aproximam-se de modo a que, tal como antes, caso se verifique total hibridizao a DNA ligase possa ligar as duas extremidades, caso no se verifique o emparelhamento de um deles a ligao no ocorre. O facto de no ocorrer ligao das duas extremidades faz com que a sonda adquira uma conformao que no permite a hibridizao prolongada da sonda, desligando-se rapidamente do DNA alvo. No final imobiliza-se o DNA em pequenos poos, lavando-se de seguida. Se a sonda hibridizar permanentemente fica retida no poo ligada ao DNA, seno sai com a lavagem. Por utilizao de molculas que reagem com a molcula reprter atravs da alterao de cor ou outras, pode-se verificar qual o resultado obtido.

Genotipagem por PCR com primers fluorescentes Esta , provavelmente, a tcnica de deteco de alteraes na sequncia de bases mais simples. Ela consiste na elaborao de um PCR no qual entram dois primers marcados com dois fluorforos diferentes e um no marcado. Constroem-se dois primers, um complementar da sequncia do gene normal e marcado com um fluorforo (por exemplo rodopsina) e outro complementar da sequncia do gene mutante e

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marcado com um fluorforo diferente (por exemplo fluorceina), por ultimo o terceiro primer complementar da cadeia oposta e no tem qualquer tipo de marcao. De seguida processa-se o PCR normalmente. A questo que a amplificao no acontece se o primer no hibridizar a 100%, pelo que s um dos primers marcados vai emparelhar e ser amplificado. Assim, no final da reaco e aps lavagem da mistura a fim de se remover o que no emparelhou, a soluo vai tomar ma das duas cores, que ser aquela que manifestar a natureza do gene (normal ou mutante)

Nota: Geralmente o nucletido em causa posicionado na extremidade 3 do primer, para garantir que no h formao de pequenos loops interiores e consequente extenso dos primers falseando os resultados. DNA Microarrays Esta tcnica permite a anlise global de DNA e RNA num ou mais tecidos ao mesmo tempo, atravs de chips de DNA (microarrays). Para fazer esta tcnica preparase uma placa onde se depositam milhares de sondas (DNA complementar um tipo de sonda por diviso) para todos os mRNAs. De seguida por transcrio reversa convertese o mRNA celular em cDNA, durante esta transcrio marca-se o cDNA com fluorforos, que vai incubar a nossa placa. Estes cDNAs vo-se ligar s sondas l inseridas, e vo manifestar cor verde ou vermelha caso ligue apenas cDNA proveniente de um dos tipos celulares, ou amarelo case ligue cDNA proveniente de ambos os tecidos. Assim sabemos se determinado RNA produzido unicamente num tipo celular (tecido, estirpe, espcie, estado de desenvolvimento) ou se em ambos. Muitas vezes a anlise de microarrays feita por computadores, pois tornava-se impossvel a leitura de to grande quantidade de dados e de to reduzidas dimenses a olho nu. Alm disso, o computador capaz de detectar pequenas variaes na fluorescncia indicando que um RNA pode ser altamente transcrito num tipo celular e muito pouco noutro tipo, no causando por isso grande variao de cor para o amarelo.

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A produo das placas usadas em microarrays, assim como das sonda l hibridizadas, feita pela industria, bastando ao investigar encomendar e comprar.

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Capitulo7- Organismos Transgnicos


1- Produo de Agentes Teraputicos
A produo de agentes teraputicos , talvez, a maior rea de actuao da biotecnologia, a par com a tecnologia agro-pecuria, existem hoje em dia mais de 80 drogas a provadas e cerca de 750 em testes clnicos. Uma das primeiras substancia a serem produzidas com fim teraputico foi a hormona de crescimento humana, ela produzida por E. coli e igual sua forma nativa produzida no homem. Esta administrada a crianas com falta desta hormona, doentes com insuficincias renais e indivduos com sndrome de Turner, pois a hormona estimula o desenvolvimento de tecidos (incluindo osso), a sntese proteica e a reteno mineral e decresce o armazenamento de molculas gordas. Estratgias de desenho molecular como a shuffling ou a mutagnese dirigida so muitas vezes aqui aplicadas para aumentar ou restringir a aco de determinado agente. No caso concreto da hormona de crescimento humano, ela liga receptores de hormonas de crescimento e receptores de prolactina. A fim de digerir a sua actuao, por vezes necessrio restringir a protena a uma das ligaes. Enzimas 1- DNAse I A enzima DNAse I est envolvida no tratamento da fibrose cstica, uma das doenas hereditrias fatais mais comuns na Europa. Indivduos com esta doena so altamente susceptveis a infeces bacterianas nos pulmes e vias respiratrias. O tratamento desta doena com antibiticos leva seleco de bactrias resistentes, a presena de bactrias (vivas ou lise bacteriana) causa a acumulao de um fino muco nos pulmes dos doentes, dificultando a respirao e criando condies para a instalao de novas infeces. Este muco o resultado da acumulao de alginatos secretados pelas bactrias vivas e DNA bacteriano e de leuccitos mortos durante a defesa imunitria. Para controlar este problema, investigadores da Genentech isolaram o gene humano da desoxinuclease I (DNAse I) e subsequentemente clonaram-no em clulas de ovrio de hamster (CHO). Esta enzima capaz de clivar DNA bacteriano em pequenos oligonucletidos. A enzima entregue em forma de aerossol a pacientes que sofram desta patologia, diminuindo a viscosidade do muco e facilitando a respirao. Contudo este processo no funciona a 100%, pois juntamente com a lise bacteriana encontra-se tambm a lise de leuccitos, surgindo ento o problema, isto porque esta lise liberta para o meio, entre outras substncias, actina. A actina funciona como um inibidor da DNAse I. Assim estudou-se qual e porque o efeito da actina na DNAse I, procedendo-se a uma troca de aminocidos (alanina 144 para arginina ou tirosina65 para arginina), pois esta troca diminui a interaco entre a actina e a DNAse I e aumenta a actividade enzimtica. Ainda no foram feitos estudos a nvel de combinar estas duas mutaes numa nica protena e os ensaios clnicos para o uso de um destes mutantes tambm ainda no terminaram, pelo que no mercado actual continua a forma nativa da enzima.

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2- Alginase O alginato um polmero presente no muco secretado por Pseudomonas aeruginosanas vias respiratrias humanas. O alginato composto por duas cadeias aucaradas, a -D-manurato (ou cido-D-manurnico) e a -L-gluronato (ou cido-Lglurnico). Em adio ao tratamento com DNAseI a despolimerizao do alginato, que contribui em muito para a viscosidade do muco), iria ajudar bastante na desobstruo das vias respiratrias. O gene da alginase foi isolado em Flavobacterium sp., uma bactria gramnegativa. A biblioteca deste gene foi elaborada em E. coli e o rastreio consistiu em colocar estas colnias num meio com alginato. Aps o crescimento das colnias, as placas que possuem o gene activo so seleccionadas pela presena de um aro transparente a rodear essa (s) colnia (s). Aps a adio de Ca2+ todo o alginato se torna opaco, a nica excepo a zona a rodear a placa +, e que por isso no possui alginato a rode-la. Uma anlise da regio codificante deste gene revelou uma ORF codificando um pptido com cerca de 69 kDa. Estudos bioqumicos indicaram que este pptido era apenas a forma percursora da alginase. Aps o percursor ser produzido uma enzima protelitica vai clivar o N-terminal da enzima em cerca de 6KDa. Este pptido formado com 63kDa capaz de clivar tanto alginatos bacterianos como ficidais. A clivagem deste pptido forma dois pptidos com 23kDa e 40 kDa que despolimerizo alginatos de algas e de bactrias, respectivamente. De forma a produzir maior quantidade do pptido que promove a despolimerizao de alginatos de bactrias, a poro do gene codificante ampliada por PCR e depois clonada em Bacillus subtilis com plasmdeo de fuso para a -amilase, de modo a dirigir a secreo desta enzima, sob o controlo do promotor da penicilase. Outro tipo de testes demonstraram a eficincia desta enzima em liquefazer os alginatos presentes no muno das vias respiratrias. Estudos adicionais so necessrios para determinar a eficincia teraputica desta substncia, estes j esto a decorrer mas a alginase ainda no se encontra no mercado.

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Anticorpos Monoclonais como Agentes teraputicos Antigamente, o tratamento de algumas doenas infecciosas era feito por inoculao de cavalos com o agente patognico e recolha do antisoro produzido por este. Este antisoro era, ento, administrado aos pacientes. Mas este tratamento era perigoso e dispendioso (custo da morte do cavalo), sem contar que uma segunda dose era, muitas vezes, mortal devido presena de anticorpos antigos choque anafiltico. Hoje em dia, no advento da metodologia com hibridomas, os anticorpos esto novamente a serem vistos como agentes teraputicos. De facto, o nmero de anticorpos monoclonais que foram aprovados para tratamento de doenas humanas cada vez maior (13 e 12 espera de aprovao dados de 2003), destes pelo menos 6 relacionam-se com o tratamento do cancro (por ligao a receptores celulares), 5 a doenas inflamatrias, 3 com a aceitao de transplantes (baixando a reactividade do rgo a vrias protena/organismos), 2 com doenas cardiovasculares e um com doenas infecciosas. So exemplos de anticorpos monoclonais envolvidos na reduo da resposta imunolgica (imunossupressores) envolvidos na rejeio de rgos transplantados: - O KT3 (1986) imunossupressores de uma forma geral. - Zenapax (1997) reduz a rejeio de rins. - Herceptin (1998) tratamento de metstases do cancro da mama. Estrutura de um anticorpo Uma molcula de anticorpo (imunoglobina) consiste em duas cadeias leves e duas cadeia pesadas, ligadas por pontes dissulfito. A regio N-terminal das cadeias L e H juntas formam o local de reconhecimento do antignio de cada anticorpo. Os anticorpos podem ser facilmente manipulados porque as vrias funes do anticorpo resumem-se a domnios discretos. Os locais de reconhecimento de ligao ao antignio consistem em trs regies so as zonas variveis, cada cadeia H possui uma regio constante com trs domnios constantes.

Nota: CDR 1,2,3 so trs zonas na regio varivel que so complementares ao local de ligao no antignio.

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Anticorpos Monoclonais como sistema As drogas por vezes so muito mais eficientes quando testadas in vitro usualmente em cultura de clulas do que quando aplicadas in vivo. Esta aparente perda de potencial devido s drogas no atingirem o alvo nas concentraes suficientes para terem o efeito desejado. Aumentar a dose da droga no resposta para o problema, porque altas concentraes de uma droga so muitas vezes deletrias. Para alm disso, de modo a evitar efeitos secundrios indesejados, muitas drogas so administradas a concentraes mais baixas que as desejadas, diminuindo a eficcia. Existe um inmero nmero de estratgias que podem ser usadas para aumentar a concentrao da droga que chega ao local alvo: 1- Podem ser encapsadas em lipossomas; 2- Alguns genes txicos podem ser incorporados em linfcitos infiltrantes de tumores; 3- A droga pode ser acoplada a um anticorpo monoclonal que especfico para as protenas que se encontram apenas na superfcie daquele tipo celular; 4- Administrar uma prodroga que necessita de ser activada para que possa ter algum efeito e um anticorpo acoplado com a enzima activadora, este dirigido para clulas especificas e deste modo garante que a forma activa apenas de encontra presente neste tipo de celular, muito til quando a droga em uso txica para o organismo; Para que este ltimo sistema teraputico seja suficiente, o anticorpo monoclonal, ou a cadeia do anticorpo que est complexada com a enzima conversora da prodroga, deve estar disponvel em quantidades ptimas e numa forma relativamente pura; deve ligar a uma protena relativamente especifica da clula alvo; ser estvel quando sujeita a condies fisiolgicas, mas rpida e claramente removida da circulao sangunea; e, quando necessrio, ser capaz de penetrar na massa de clulas tumurais de modo a que todas as clulas possam estar igualmente expostas droga. A maioria das mortes naturais que ocorrem na Amrica e na Europa devem-se a ataques de trombose. A trombose consiste numa rede de fibrina, um agente coagulante, que formado na resposta a um dano na parede do vaso sanguneo. Sob condies naturais, a plasmina produto da activao do plasminognio, uma protease de serina degrada a fibrina do coagulo, dissolvendo-o. Em muitos casos a trombose ocorre quando este sistema biolgico no eficiente. Assim, razovel que o plasminognio seja usado como agente teraputico de forma a induzir altos nveis de plasmina, que por sua vez remove eficientemente cogulos sanguneos.

Activador do plasminognio

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Plasminognio

Plasmina

Fibrinognio

Fibrina

Degradao

Degradao

No entanto, a plasmina tambm capaz de degradar o fibrinognio, o qual o percursor da fibrina; desta forma a terapia acima apresentada poderia levar a uma hemorragia interna grave, devido aos baixos nveis de fibrinognio e fibrina. Consequentemente, agentes trombolticos capazes de degradar exclusivamente a fibrina presente nos cogulos tm sido investigados. Os cientistas desenvolveram um anticorpo que fosse especfico para a fibrina e que estivesse covalentemente ligado ao activador do plasminognio. Aps a ligao, este complexo iria originar um baixo nvel de fibrina apenas naquela regio, devido activao do plasminognio em plasmina.

1- Anticorpos Humanos Monoclonais Apesar dos estudos iniciais com agentes imunoterputicos serem promissores, esta tecnologia acarreta alguns contratempos acerca da ligao qumica e uso de anticorpos no-humanos. No s no haveria segurana no nmero de molculas que se ligavam como a ligao ocorreria em locais aleatrios, alm disso a ligao qumica podia inactivar a actividade enzimtica do activador de plasminognio, ou outra protena associada. Por fim se a teraputica requer tratamentos mltiplos, o anticorpo devia ser de fonte humana a fim de evitar reaces imunitrias cruzadas e sensibilidade do paciente. o entanto difcil criar anticorpos monoclonais humanos, ou no humanos, que no desencadeiem reaces imunitrias cruzadas, porque: - Os cromossomas humanos em clulas de hibridoma so altamente instveis e por isso raro a formao de clulas produtoras de anticorpos humanos monoclonais;

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- Ainda no se descobriu nenhuma linha de mielomas humanos capaz de substituir as clulas de mieloma de ratos durante a formao de hibridomas; - Mesmo que fosse possvel a formao de hibridomas humanos, controversa a aceitao de normas para a pesquisa mdica para a injeco de pessoas com m agente no teraputico a fim de produzir uma esplenectomia parcial e recolher as clulas produtoras de anticorpos; Deste modo outros sistemas tm vindo a ser desenvolvidos outros sistemas para produzir anticorpos humanos: - Fuso de linfcitos B com vrus Epstein-Barr, permite o crescimento de linfcitos B em cultura, contudo a quantidade de anticorpo produzido menor e os anticorpos possuem pouca afinidade de ligao; - Utilizao de ratos imunodeficientes (Scid mouse), aos quais se adicionam clulas germinais humanas do sistema imunitrio. Os ratos adquirem estas clulas como suas e os anticorpos produzidos so tipicamente humanos; - Criao de ratos transgnicos com os genes de imunoglobulina humana; - Quimeras rato/humano; 2- Anticorpos Humanos Hbridos (Quimeras) A natureza modular da funo do anticorpo torna possvel a converso de um anticorpo monoclonal de rato num que possua partes humanas, mas que preserve a especificidade de ligao ao antignio. Esta molcula hbrida chamada um anticorpo quimera ou um anticorpo humanizado, consoante o caso. A primeira poro do anticorpo de rato que alvo de substituio a zona Fc. Esta zona foi escolhida porque funciona de maneira fraca como efector da resposta imunolgica em humanos, ao mesmo tempo que a regio mais provvel para induzir a produo de anticorpos. De forma a introduzir as capacidades desta zona, a sequncia de DNA codificante para a regio Fr de ambas as cadeia L e H de imunoglobulina humana foi substituda pela sequncia de FvDNA de um anticorpo monoclonal especfico de rato. Esta substituio de regies pode ser acompanhada pelo uso de oligonucletidos e replicao in vitro ou por clonagem de genes.

Quando um anticorpo quimrico contendo um local de ligao contra o cancro do clon foi tratado em pacientes com esta patologia, o anticorpo manteve-se na corrente sangunea cerca de 6 vezes mais tempo que um anticorpo 100% rato, aumentando ento o tempo de aco do anticorpo. Para construo destes anticorpos utilizado um vector de clonagem DNA constructs, partindo do gene de imunoglobulinas humanas com a zona Fv substituda. Os anticorpos humanizados avanaram um pouco mais que os anticorpos quimeras por substituio de todo o anticorpo, exceptuando as zonas CDR que

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permanecem de roedor. Devido a esta modificao os anticorpos humanos tm afinidades de ligao ao antignio semelhantes s dos originais roedores, assim eles podem ser agentes teraputicos mais eficientes.

A tcnica de construo destes anticorpos baseia-se na amplificao por PCR das zonas CDR de ratos utilizando primers complementares numa extremidade a estas zonas e na outra extremidade s zonas Fv humanas. Depois, fazendo novamente uso do PCR estes oligonucletidos so adicionados ao gene para anticorpos humanos e so extendidos, substituindo assim os CDR humanos.

Produo de anticorpos em E. coli As clulas de hibridoma, como a maioria das clulas animais em cultura, crescem muito lentamente, no atingem altas densidades (grande numero populacional) e requerem meios de cultura complexos e caros. O custo na sua produo um impedimento sua distribuio mais alargada, para circunscrever este problema tm sido feitas tentativas para modificar geneticamente plantas, animais e microorganismos de modo a funcionarem como bioreactores. Para uma entrega a funo eficiente de alguns agentes imunoteraputicos apenas a regio que liga o antignio necessria, ou seja a regio Fc dispensvel. A produo de anticorpos em E. coli possvel graas a uma elaborada srie de manipulaes: 1- Sntese de cDNA a partir de mRNA isolado de linfcitos B humanos; 2- Preparao e amplificao por PCR de cDNA das cadeias H e L; 3- Cada uma das preparaes de cDNA amplificadas por PCR clivada com um conjunto de enzimas de restrio especfico e clonadas num vector de bacterifago ; 4- O cDNA de uma cadeia H e o de uma cadeia L clonado num simples vector de combinao, permitindo ao bacterifago expressar ambas as cadeias, formando uma associao Fv; 4- As cadeias H e L so expressas durante o ciclo ltico do bacterifago , deste modo uma biblioteca de bacterifagos combinatrios pode ser rastreada para a presena de actividade da ligao ao antignio (ELISA);

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Dado que uma biblioteca fgica pode ser rastreada cerca de 7 a 14 dias com a especificidade desejada enquanto que uma linha celular de hibridissomas leva meses, este torna-se um processo, muito mais rentvel, fcil e rpido. Devido lise celular, o bacterifago no muito til na produo de grandes quantidades de protenas. Para resolver este inconveniente, o vector foi geneticamente modificado de modo s sequncias H e L serem inseridas num local ladeado por sequncias de DNA de plasmdeo. Estas sequncias podem ser excisadas do vector bacterifago de modo a transformar E. coli. Como parte de um plasmdeo, largas quantidades de fragmentos FV podem ser produzidos em E .coli. Como alternativa ao bacterifago , bacterifagos filamentosos como o MB tm sido usados para a produo de bibliotecas combinatrias. Estas tm um procedimento igual ao Phage display com fuso proteica e rastreio por tcnica de ELISA, com imobilizao de um antignio ao poo.

3- Anticorpos de cadeia simples Em adio produo dos fragmentos Fv, os investigadores desenvolveram uma protena de cadeia nica que consiste na juno dos fragmentos VL e VH formando uma molcula ligadora de antignio. Para tal uma simulao informtica revelou que seria necessrio a existncia de um pptido linker entre os dois domnios para que ambos mantivessem a sua actividade. Assim aps expresso em E. coli dos dois domnios ligados por um pptido linker, a protena foi purificada e tanto a sua especificidade como a afinidade foram medidas tendo-se determinada que eram iguais ao do anticorpo original. Deste modo anticorpos de cadeia nica podem ser usados em varias aplicaes teraputicas e de diagnstico, onde a funo da zona Fc no necessria e o tamanho reduzido uma vantagem. Por exemplo, devido s grandes dimenses dos anticorpos originais a sua eficincia na penetrao de grandes massas tumurais reduzida. Alm

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disto, a esta sequncia pode-se ligar uma sequncia de um pptido (reprter, toxina, agente teraputico, etc.) de forma a criar uma molcula com dupla funo. Num outro estudo, em vez de ligar as cadeias VL e VH com um pequeno pptido, alguns aminocidos na zona intermdia de ambas as cadeias foram modificadas de modo a estabelecerem pontes dissulfito entre as duas cadeias. A eficincia de uma destas molculas acoplada a uma toxina foi comparada com a eficincia de uma das molculas em cadeia simples acoplada mesma toxina contra o cancro. Concluso: ambas possuem a mesma actividade e especificidade, mas a molcula de cadeia simples muito mais estvel que a outra. Isto pode sugerir que em alguns casos a molcula estabilizada por pontes dissulfito ser mais til (devido instabilidade).

cidos Nuclecos como Agentes Teraputicos Muitas vezes os humanos sofrem de doenas que resultam da superproduo de uma determinada protena. Sistemas teraputicos baseados no uso de sequncias de nucletidos esto a ser desenvolvidos para tratar estes tipos de condies. Teoricamente, uma simples sequncia de oligonucletidos pode hibridizar com um gene ou RNA especfico e diminuir a taxa de transcrio ou traduo, respectivamente, baixando com isto a quantidade de protena produzida. Um oligonucletido desenhado para hibridizar com um gene chamado oligonucletido antisense. Alm disto, ribozimas, que so sequncias de RNA com actividade cataltica que se ligam e clivam molculas de RNA especfico, podem ser geneticamente modificadas, de forma a dirigir a sua especificidade para determinada molcula de RNA, reduzindo a quantidade de protena produzida. Finalmente, uma descoberta recente RNA de interferncia (siRNA) so pequenas molculas em cadeia dupla que dirige a degradao de um RNA. 1- Ribozimas As ribozimas so molculas de RNA que ocorrem naturalmente e possuem actividade cataltica separada do domnio de ligao ao substrato. O local de ligao ao substrato combinado com a complementaridade de nucletidos e provavelmente a no formao de ponta de hidrognio com a sequncia alvo. A poro cataltica cliva a molcula de RNA em locais especficos. Por alterao de domnio de ligao ao substrato, a ribozima pode ser geneticamente modificada, para clivar qualquer sequncia de mRNA.

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As ribozimas possuem estrutura secundria especfica e j descrita, pelo que apenas necessrio olhar a sequncia de ligao ao substrato, esta estrutura secundria o principal responsvel pela actividade cataltica da molcula.

Para fins teraputicos, tanto a ribozima hammerhead (cabea de martelo) e hairpin, assim nomeados pelo aspecto da sua estrutura secundria. O uso e sntese destas molculas passa pela criao de um oligonucletido com um domnio de ribozima no centro ladeado pela sequncia completa da molcula alvo. Na prtica, os nucletidos ditos N no esquema e que emparelham com o substrato, so substitudos pelo nucletido a designar pela sequncia a degradar. 2- RNA e oligonucletidos Antisense A fim de ser um agente teraputico eficiente, o RNA antisense tem de ligar um mRNA especfico e impedir a traduo do mesmo em protena (as propriedades do uso desta tecnologia no tratamento de algumas patologias tem sido muito investigado). Para tal, inserimos um vector de expresso na clula que vai transcrever o mRNA (a partir do cDNA invertido) inverso antisense molcula de mRNA em causa. Estas duas molculas vo hibridizar e formar um mRNA em cadeia dupla, isto vai por si s bloquear a traduo porque os ribossomas vo ser capazes de ler cadeias duplas de mRNA. O mesmo acontece com a terapia de oligonucletidos antisense, mas estes em vez de emparelharem com todo o mRNA transcrito vo emparelhar com uma pequena regio do mesmo. Isto e mais a resistncia degradao por endonucleases e a rpida entrega/chegada s clulas so a base do sucesso desta terapia. Estes oligonucletidos possuem entre 15 a 25 nucletidos, trata-se de um nmero suficiente para garantir a especificidade. A questo que se coloca neste tipo de terapia qual a regio a hibridizar. At agora no existe nenhuma regra acerca deste local ao certo, e todos os oligonucletidos, dirigidos para a extremidade 3, ou 5 ou para regies intermdias tm sido eficientes. Contudo, a mais usada a regio 5 por ser o primeiro a ser transcrito. As desvantagens neste tipo de tratamentos so a eficcia a nvel da especificidade principalmente nos oligonucletidos antisense e as dificuldades de integrao, tanto do vector de expresso como de pequenas molculas antisense. Deste modo, e principalmente para tratamentos com terapia oligoantisense (oligoantisense therapy) tem-se usado integrao via lipossomas (mais ou menos complexa conforme os casos), pois tal como qualquer tipo de cidos nuclecos estes

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oligonucletidos possuem carga e por isso no so fceis de fazer entrar dentro da clula. Assim, a construo por engenharia gentica ou enzimtica de lipossomas com variaes na constituio lipdica e proteica facilita a integrao e direccionamento das oligonucletidos antisenses. O problema reside no facto de que quando o lipossoma entra em contacto com a clula h o desencadear de uma srie de respostas moleculares e, enquanto que algumas levam integrao dos lipossomas, outras conduzem degradao do material no interior destes. Isto leva a um outro tipo de modificaes nos oligonucletidos que no sero aqui discutidos.

3- RNA de interferncia Nos ltimos anos surgiu uma tcnica alternativa para inactivar um gene: RNA de interferncia (iRNA). Com esta tcnica verificou-se que uma molcula de RNA em cadeia dupla capaz de inactivar genes com grande eficincia (mais de 90%). Nas plantas isto surge como uma defesa contra ataques retrovirais. O RNA de cadeia dupla quando entra na clula clivado pela aco de RNAses em cadeias mais pequenas (small interference RNA siRNA) que vo levar degradao do mRNA devido s associaes que criam com um complexo proteico (RISC). Este complexo possui endonucleases e helicases que vo fazer com que as cadeias de siRNA se desliguem formando siRNA em cadeias simples ligadas ao complexo RISC. O complexo resultante vai ligar-se a molculas de mRNA com

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sequncia complementar ao siRNA e provocar a sua degradao por parte de endonucleases. Assim, pode-se silenciar genes de uma forma rpida e barata por insero de iRNA ou ento podese combinar duas tcnicas e transfectar as clulas com DNA codificante de iRNA. Esta tcnica foi desenvolvida por engano, enquanto se tentava injectar oligonucletidos antisense e por engano adicionaram-se oligonucletidos em cadeia dupla. Contudo, este engano mostrou-se muito mais eficaz. Sabe-se que se trata de um fenmeno natural em alguns organismos (moscas, trypanossomas, minhocas, hidras, zebra fish e ratos) mas ainda h alguma obscuridade relativamente ao seu processo. Uma das dvidas consiste em saber se a formao do complexo RISC ocorre antes ou depois da hibridizao do iRNA com a cadeia de mRNA, embora tudo indique que tal ocorra antes. Esta tcnica est a ser estudada como base para muitos tratamentos com silenciamento de genes, mostrando-se mais eficaz do que as descritas anteriormente. Esta tcnica tambm vem de certo modo substituir o uso de ratinhos knock-out, sendo mais barato e fcil de utilizar. (Para mais informao sobre este tema aceder ao site Nature insight, onde existem vrios artigos de reviso disponveis). Nota: Todas estas tcnicas referidas no so teis apenas para terapias animais, tendo tambm mostrado alguma eficcia na agricultura em relao ao controlo anti-pragas, transgnicos e outros. Vacinas A vacinao protege um indivduo de um agente patognico estabelecendo uma resistncia imunolgica infeco. Uma vacina, quer oral quer injectada, induz uma resposta no hospedeiro de forma a este gerar anticorpos contra o organismo patognico, desta forma durante infeces futuras o agente inactivado (neutralizado ou morto), a sua proliferao prevenida e o estado de doena evitado. As vacinas modernas consistem, tipicamente, no agente morto (ou inactivo) ou vivo no virulento (atenuado). Tradicionalmente, faz-se crescer o agente em cultura, purifica-se e ou inactivado ou atenuado, mas sem perder a capacidade de evocar uma resposta ao sistema imunitrio. No obstante do sucesso atingido, existe um largo nmero de limitaes a este tipo de produo: - Nem todos s agentes infecciosos podem crescer em cultura; - A produo de vacinas para vrus animais e humanos necessita de cultura de clulas animais, mas isso caro; - A taxa de produo (ou mesmo a sua presena final) de vrus animais em cultura muitas vezes baixa, consequncia disto um aumento no custo de produo da vacina;

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- So necessrias medidas de segurana apertadas para assegurar que nem o investigador nem o laboratrio exposto ao agente patognico; - Inactivao ou atenuao sem ser totalmente eficaz pode provocar a presena de indivduos virulentos na vacina administrada, disseminando inadvertidamente a doena; - Estirpes atenuadas podem reverter. Esta possibilidade causa necessidade de testar continuamente a vacina a fim de verificar que a virulncia no readquirida; - Nem todas as doenas so prevenidas atravs do uso das vacinas tradicionais; - A maioria das vacinas possuem um tempo de vida limitado e por isso necessrio refrigerao para a sua conservao. Isto gera um problema nos pases com pouca distribuio elctrica; Na ltima dcada a tecnologia de DNA recombinante providenciou a criao de uma nova gerao de vacinas, as vacinas recombinantes. A disponibilidade da clonagem de genes disponibilizou um vasto role de novas estratgias: - Os genes virulentos podem ser delectados do organismo patognico, que retm a habilidade de estimular o sistema imunitrio. Estes agentes depois podem por si mesmos serem usados como parte integrante das vacinas; - Sistemas vivos no patognicos que carreguem antignios determinantes de um agente patognico podem ser criados (quando apenas uma protena no chega ara desencadear a resposta Autocarro transportador de antignios); - Alguns agentes no conseguem ser cultivados, nesse caso, clonam-se os genes e depois so sobreexpressados num hospedeiro alternativo (E. coli ou clulas de mamferos). Este hospedeiro, ou apenas os genes/protenas podem ser parte integrante da vacina; - Existem alguns agentes infecciosos que no danificam as clulas hospedeiras directamente, em vez disso o prprio sistema imunitrio que ataca as suas clulas infectadas, e deste ataque resultam as manifestaes de doena. Para este tipo de doena possvel criar um sistema direccionado para matar clulas especficas, removendo assim a fonte de respostas imunolgicas adversas. Nestes casos constri-se um gene de protena de fuso, uma parte liga clula infectada enquanto a outra mata a clula infectada; Desta forma j existem vacinas recombinantes para animais no mercado, contudo para humanos ainda esto em fase de ensaio clnico e ainda nenhuma est disponvel no mercado. 1- Vacinas de subunidades As vacinas geralmente consistem em formas do agente patognico, morto ou atenuado. Os anticorpos desenvolvidos para estes agentes inactivos ligam-se s protenas na superfcie exterior do agente. Assim ser que as vacinas necessitam mesmo de possuir todo o agente inflacionrio, ou ser que apenas parte dele seria suficiente? Para vrus que causam doenas, j foi demonstrado que protenas da superfcie externa purificadas (capsdeo ou envelope) eram suficientes para produzir anticorpos capazes de neutralizar o organismo infectante. Vacinas que utilizem subunidade do patogneo em vez do organismo completo so chamadas Subunit Vaccines. Este tipo de vacinas possui um lado positivo e outro negativo. No lado positivo est o facto de que usando protena(s) purificada(s) em vez do organismo inteiro assegura a segurana e estabilidade da vacina, deixando de lado a presena de outras

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protenas estranhas e cidos nuclecos capazes de iniciar efeitos secundrios indesejveis. No lado negativo h o facto de que a purificao de determinada protena pode ser cara e em alguns casos a protena purificada pode no ter a mesma conformao que in situ, alterando o anticorpo. Herpes simplex Vrus O vrus herpes simplex dos agentes que causa mais doenas em humanos cancro, DSTs, infeces oculares e encefalites. Assim, a descoberta de uma vacina contra este agente seria algo muito til. O primeiro requisito para criar uma vacina de subunidades a identificao do(s) componente(s) do agente infeccioso que desencadeia a produo de anticorpos, contra a forma intacta (viva) do agente. O HSV-1 possui como tal componente uma protena do invlucro lipdico (gO). O gene para a glicoprotena D (gD) foi ento isolado, clonado e expresso em clulas CHO, ficando depois retida na membrana destas clulas, dificultando a purificao. Consequentemente, o gene gD foi mutado a fim de remover a poro que codificava para a poro transmembranar. Deste modo realizou-se nova clonagem, expresso e purificao utilizando o gene mutado. Desta vez o produto foi excretado e a protena usada pode ser usada na vacinao de ratos. O efeito de inoculao de ratos com esta protena modificada foi a proteco delas contra o vrus do herpes simplex. A vacina resultou em ratinhos de laboratrio mas ainda muito tem de esperar at estar disponvel para humanos.

2- Vacinas de Pptidos A questo levanta-se quando pequenas pores (domnios) de uma protena actuam como subunidades de vacinas e podem desencadear a produo de anticorpos neutralizantes. Intuitivamente, de esperar que apenas as pores ou domnios da protena que se encontram expostas e acessveis ao anticorpo sejam importantes de u ponto de vista imunolgico e que aquelas pores que se encontram inacessveis podem ser ignoradas, desde que no contribuam para a conformao do domnio imunolgico. Se este argumento est correcto, ento vlido que pequenos pptidos possam mimetizar eptopos que possam ser usados em vacinas. Contudo, pequenos pptidos so geralmente degradados com alguma rapidez a menos que se encontrem ligados a largas molculas transportadoras. No entanto h outros aspectos a ter em conta, como a exposio dos vrios eptopos nesta molcula e a

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sua conformao correcta. Ambos os problemas so resolvidos pela fuso das regies codificantes com o gene da molcula transportadora, atravs do uso de pequenos pptidos linkers.

Nota: H casos em que apenas um eptopo suficiente para desencadear a resposta imunitria, mas tambm pode por vezes ser necessrio o uso de combinaes de eptopos. Limitaes deste tipo de vacinas: - Para ser eficiente o eptopo tem de ser constitudo por uma pequena sequncia de aminocidos contnuos, o que nem sempre acontece; - O pptido te de ter a capacidade para adquirir a mesma conformao que o pptido na partcula viral intacta; - Apenas um eptopo pode no ser suficientemente imunognico; 3- Vacinas de DNA Vacinas de DNA so uma nova estratgia que desencadeia a resposta imunolgica de produo de anticorpos sem haver a introduo do antignio. Neste caso o gene que codifica para a protena do antignio incorporado nas clulas do animal alvo, onde o antignio sintetizado. Nos primeiros ensaios, micoesferas de ouro foram revestidas com plasmdeos de E. coli que carregando o gene do antignio sob o efeito de um promotor de um vrus animal. Num outro ensaio o cDNA clonado foi injectado em plasmdeos directamente em clulas musculares de rato. Uma caracterstica distintiva da imunizao gentica que as questes de purificao, a criao de um veculo de transporte, o tempo e o custo econmico no se colocam. Alm disto as protenas produzidas por este tipo de tcnica tm maior probabilidade de enrolarem correctamente do que as produzidas em organismos estranhos. Este tipo de estratgia foi estudado em detalhe. Num grupo de estudos forma injectados plasmdeos de E. coli carregando cDNA de uma nucleoprotena do vrus Influenza sob a influncia de um promotor de citomegalovrus, em ratos. Os resultados foram a expresso da protena em baixa quantidade (detectada) e um elevado nmero de anticorpos detectados. Em comparao com ratos controlo, os ratos injectados estavam significativamente protegidos contra os efeitos letais da infeco com o vrus Influenza. Mais do que isso, eles estavam tambm protegidos contra outras estirpes dos Inflenza vrus. Esta proteco

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contrasta com a vacinas tradicionais, as quais so dirigidas contra antignios da superfcie de modo que cada vacina especfica para uma estirpe. Dado que estas protenas tm elevado grau de mutao no h actualmente no mercado vacinas eficientes contra o vrus Influenza, sendo desenvolvidas vrias todos os anos. Uma outra vantagem desta tcnica o facto de a resposta ser activada apenas contra a protena codificada pelo plasmdeo e no pelo plasmdeo propriamente dito. Deste modo o mesmo vector pode ser usado para integrar diferentes protenas ao mesmo tempo, ou repetio do mesmo gene vrias vezes. Em adio so necessrio cultivar o antignio ou o agente patognico. Como desvantagem deste sistema apresenta-se a Biotica e grupos ideolgicos que afirmam haver perigo de isto provocar mutaes no DNA ou integrao destes sistemas no genoma, o que no seria assim to mau pois haveria produo de anticorpos mais eficazmente, o problema em que local do genoma vai ocorrer a integrao. 4- Vacinas Atenuadas Em alguns casos a engenharia gentica pode ser usada para construir organismos modificados (bactrias ou vrus) que so usados em vacinas recombinantes. Estas vacinas so construdas com organismos no patognicos que foram modificados para expressar determinados genes de agentes patognico ou estirpes modificadas do organismo patognico no qual foram eliminados os genes que conferem a virulncia. Este tipo de vacinas esto mais desenvolvidas para o uso veterinrio que humano, pela simples razo de ser economicamente mais rentvel. Vacina da Clera De um modo geral mais vantajoso o desenvolvimento de vacinas vivas, pois estas geram maior nmero de anticorpos que as vacinas atenuadas ou de subunidades. O maior pr-requisito para uma vacina viva a ausncia de formas virulentas no material inoculado. Com este objectivo em vista desenvolveu-se a vacina da clera. A bactria Vibrio cholerae coloniza o intestino delgado e secreta grandes quantidades de uma toxina hexmera, que na verdade o agente patognico. A subunidade A desta toxina tem dois domnios funcionais: o pptido A1 que contem a actividade txica e o pptido A2 que promove a ligao subunidade B. A vacina da clera gera apenas proteco moderada que dura 3 a 6 meses. Estudos anteriores indicam que vacinas de subunidades utilizando hexmeros inactivos no so eficientes, deste modo e sabendo que estas colonizam a mucosa intestinal pensou-se que uma vacina eficiente teria de ser dirigida sua estrutura e administrada oralmente. Assim uma estirpe deficiente na cadeia A1 da enterotoxina foi criada, sendo esta no patognica e uma boa candidata a uma vacina viva. Para isso criou-se uma estirpe com a sequncia para o pptido A inactiva pela insero do gene de resistncia tetraciclina, sendo esta insero feita no DNA cromossomal da bactria. Apesar do gene A1 ter sido funcionalmente interrompido, esta estirpe no foi aceite pela medicina pois havia o risco do gene de resistncia se excisar espontaneamente restaurando a toxidade. Deste modo foi necessrio modificar geneticamente um plasmdeo para que o transportasse uma sequncia defeituosa para o pptido A1 que no fosse capaz de reverter.

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Procedimento: 1- Um plasmdeo contendo a sequncia de DNA para o pptido A1 foi digerido com duas enzimas de restrio ClaI e XbaI, que clivam dentro da sequncia codificante; 2- Para se circularizar o plasmdeo adicionou-se um linker Xba ao local clivado com ClaI; 3- Usou-se a T4DNA ligase para promover a ligao das extremidades; 4- Por conjugao o plasmdeo contendo a deleco em A1 foi transferido para uma estirpe com o gene de resistncia tetraciclina; 5- Ocorre recombinao (crossing-over duplo) entre a regio restante do gene para o pptido A1 no plasmdeo e as regies complementares no gene interrompido com o gene de resistncia tetraciclina; 6- Aps um certo nmero de geraes o plasmdeo extracromossomal, instvel em Vibrio cholerae, perdido; 7- As clulas com o pptido A1 defeituoso foram seleccionadas pela sua sensibilidade tetraciclina. As clulas pretendidas no eram mais resistentes tetraciclina mas carregavam um gene A1 defeituoso.

Desta forma encontrou-se uma estirpe no patognica candidata a ser usada como vacina viva. Quando esta estirpe foi testada clinicamente os testes foram inconclusivos, dado que mais de 90% dos voluntrios mostraram melhoras substanciais mas tambm apresentaram alguns efeitos secundrios. 5- Vacinas para Vrus As vacinas para vrus, na forma de vacina viva, irradicao da varola (usando o vrus da vaccinia). A vaccinia um membro da famlia poxvrus e possui um genoma de DNA de dupla hlice com 187 Kb e que codifica aproximadamente 200 protenas. O vrus vaccinia replica-se dentro do citoplasma de clulas infectadas. A replicao ao nvel do citoplasma possvel porque a vaccinia codifica protenas envolvidas na

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replicao, como DNA e RNA polimerases e enzimas de cap, metilao e poliadenilao. Deste modo, o gene para uma protena estranha inserida no genoma da vaccinia vai ter uma expresso independente das funes enzimticas e reguladoras da hospedeira. A vaccinia tem uma vasta lista de organismos hospedeiros, bem caracterizada a nvel molecular, estvel anos aps liofilizao (congelamento) e geralmente vrus benigno. Por estas razes ele um forte candidato como vector biotecnolgico. As caractersticas importantes de um vector em vacinas so a entrega e expresso do gene que expressa antignios capazes de desencadear a produo de anticorpos neutralizantes. Infelizmente, o genoma de vaccinia muito grande e falta-lhe zonas de restrio, pelo que no pode haver introduo directa de nenhum gene. Quando necessrio procede-se recombinao homlogo in vivo. Procedimento: 1- A sequncia de DNA codificante para determinado antignio inserida no plasmdeo imediatamente a jusante do promotor clone do vrus vaccinia e no meio de um gene no essencial, tal como o da timidina cinase; 2- O plasmdeo usado para transformar estirpes de clulas animal timidino-cinase negativas, que foram previamente infectadas com o tipo selvagem do vrus vaccinia; 3- A recombinao entre as sequncias de DNA que ladeiam o promotor e o gene a clonar com o genoma viral resulta na incorporao do gene no genoma viral (trata-se de um fenmeno raro); 4- A seleco faz-se por hibridizao de uma sonda o gene do antignio;

Para evitar a disrupo de algum gene de vaccinia ou a necessidade de rastreio para marcas de seleco, um novo sistema foi desenvolvido, no qual todos os vrus recessivos que podem formar uma placa vo conter e expressar o gene alvo (o tipo selvagem de vaccinia contendo o gene op37, que responsvel pela formao das placas quando os vrus crescem numa monocamada de clulas animais). Delectando o gene op37 e substituindo-o por um gene de seleco de E. coli, cria-se uma estirpe mutante do vrus que no cria placa 2 a 3 dias aps crescimento. O gene alvo introduzido no vrus por recombinao homloga com um vector que transporta tanto op37 como o gene em causa. Se ocorrer a recombinao entre o vector e o genoma do vrus no formador de placas, ento os vrus que formarem placas so recombinantes.

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Algumas vantagens destes sistemas: - Simples e directos, aplicvel clonagem e expresso de qualquer gene, no requer nenhum gene de seleco extra, nem disrompe nenhum gene do vrus (este ltimo); - O vrus vaccinia tem baixa virulncia, mas um elevado nvel de replicao; - Antignio autntico e amplificado; - H integrao do gene no genoma do vrus, o que provoca uma expresso independente do hospedeiro; As desvantagens deste tipo de sistema so poucas e resumem-se a factores econmicos, de salientar que um dos contratempos que a utilizao de vrus vivos pode causar alguma infeco e efeitos adversos em indivduos imunodeprimidos. 6- Vacinas contra Bactrias Desde a descoberta e disperso dos antibiticos, apenas uma modesta quantidade de investigadores tem direccionado a sua investigao para o desenvolvimento de vacinas para bactrias. Contudo, existem boas razes para se investir nisto: - Nem todas as doenas bacterianas so tratadas com antibiticos; - O uso de antibiticos nos ltimos 40 anos levou proliferao de estirpes resistentes; - A necessidade de refrigerao para o armazenamento de antibiticos no est disponvel na maioria dos pases trpicas especialmente os mais pobres; - difcil assegurar que uma pessoa que receba tratamento por antibitico o leve at ao fim; Dada a necessidade de produzir vacinas eficientes contra doenas bacterianas coloca-se a questo: Qual a estratgia mais eficiente? Em alguns casos, como naqueles em que o agente patognico no cresce bem em cultura, a construo de estirpes atenuadas no um mtodo eficiente, e pode causar infeco em imunodeprimidos. Vacina da Tuberculose A tuberculose uma das doenas infecciosas mais importantes a nvel global e causada por M. tuberculosis. De maneira a detectar qual o modo mais seguro e eficiente para desenvolver uma vacina, uma grande extenso de protenas imunoprotectoras extracelulares estimuladas por esta bactria, foram estudadas. A seguir ao crescimento em cultura, seis destas protenas as mais abundantes foram purificadas. Cada uma delas foi separada das outras e depois imunizadas em porcos. Estes foram depois sujeitos a infeco por parte de M. tuberculosis e estudadas as respostas de cada grupo. (Multiprotein Subunit Vaccine)

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Basicamente o que se faz : Deixa-se de procurar molculas patognicas nos organismos e comea-se procura de evidncias no sistema de diagnstico do que produzido por estes patognicos. Para tal necessrio saber bem o mecanismo de infeco do organismo em estudo, o que pode dificultar muito o trabalho do investigador. Neste caso podemos procurar o que sintetizado pelo organismo e que pode ser usado com antignio de determinado patognio. Em teoria, um sistema de entrega de um antignio que providencie a proteco eficaz contra a tuberculose devia ser: 1- Apto para se multiplicar em clulas de mamfero (organismo hospedeiro); 2- No patognico; 3- Apto para expressar e secretar o antignio; Produo de Vacinas Comestveis Produo de organismos comestveis (batata, ovo, etc.) trangnicos e no antignicos que expressem protenas que vo estimular a resposta imunitria.

2- Plantas Transgnicas
Esforos considerveis tm sido feitos para desenvolver variedades de plantas que produzam quantidades aumentadas de um produto ou possuam um valor nutricional acrescentado. Apesar de muitos destes avanos terem sido dirigidos para trs grandes grupos de plantas (milho, arroz e outros cereais) programas destes tm sido aplicados, com sucesso, a outras plantas hortcolas ou ornamentais. Existe um grande nmero de sistemas de entrega de DNA eficiente e sistemas de vectores que funcionam com um largo tipo de clulas vegetais. Para alm disto, a maioria das clulas vegetais so totipotentes, so capazes de regenerar uma planta inteira a partir de uma nica clula, facilitando assim a produo de plantas trangnicas. Deste modo se estas plantas florescerem e originarem sementes frteis podem passar a modificaes a geraes futuras. Existem trem grandes razes para a produo de plantas transgnicas: 1- Adio de genes para melhoramento a nvel agrcola, hortcola ou ornamental; 2- Actuao destas como biorreactores para a produo barata de protenas ou metabolitos importantes a nvel econmico; 3- A produo de transgnicos oferece um bom alvo de estudos do desenvolvimento e outros processos biolgicos; Algumas das caractersticas/modificaes que podem ser introduzidas nas plantas por adio de um simples gene ou conjunto de genes inclui: 1- Actividade de insecticida; 2- Proteco contra agentes virais; 3- Resistncia a herbicidas; 4- Proteco contra agentes patognicos, como fungos ou bactrias; 5- Atraso na senescncia; 6- Tolerncia a stresses ambientais; 7- Alteraes na pigmentao floral; 8- Qualidades nutricionais das sementes melhoradas; 9- Auto-imcompatibilidade;

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Para alm disto plantas transgnicas podem ser feitas para produzir uma variedade de compostos incluindo agentes teraputicos, polmeros e ferramentas de diagnstico tais como anticorpos. Metodologias 1- Transformao com plasmdeo Ti (tumor inducing) de Agrobacterium tumefaciens A bactria do solo Agrobacterium tumefaciens uma gram-negativa fitoparasita que, como parte normal do seu ciclo de vida, transforma clulas vegetais. Esta transformao leva ao aparecimento de tumores que interferem com o crescimento normal da planta. Esta doena afecta exclusivamente dicotiledneas. O tumor deve-se transferncia, integrao e expresso de genes de um segmento especfico do plasmdeo da bactria, chamado T-DNA (DNA transferido), no genoma da planta. O T-DNA de facto parte do plasmdeo Ti (tumor inducing) que transportado pela maioria das estirpes de A. tumefaciens. Estirpes de A. Tumefaciens que no possuam este plasmdeo so incapazes de formar tumores. O passo inicial no processo de infeco a ligao das bactrias planta num local da ferida exposta, na base do caule. Inicialmente pensava-se que as bactrias infectavam plantas injuriadas, pois as barreiras fsicas nestas plantas foram quebradas, facilitando assim a entrada.

No entanto, sabe-se que afinal estas bactrias respondem a certos compostos fenlicos produzidos pelas plantas na altura em que so danificadas. Estes compostos agem de forma a induzir a virulncia, activando os genes vir presentes no plasmdeo Ti. Os genes vir localizam-se fora da zona do T-DNA. Os produtos destes genes so essenciais para a transferncia e integrao do T-DNA no genoma vegetal. Aps uma estirpe de A. tumefaciens transportadora de plasmdeo colonizar a planta hospedeira e os genes vir serem activados, o T-DNA transferido por um processo semelhante ao que acontece durante a conjugao bacteriana. Neste modelo o T-DNA transferido como uma cadeia simples e linear que eventualmente integrada no genoma da planta. A extremidade 5 da cadeia simples do T-DNA transporta o limite direito e na extremidade 3 encontra-se o limite esquerdo. A formao da cadeia simples e linear deve-se ao corte da cadeia especfica a transferir nos dois limites. A integrao desta no genoma vegetal deve-se homologia dos limites direito e esquerdo com determinadas zonas do genoma. A maioria dos genes que se encontram na zona do T-DNA so activadas apenas aps a insero no genoma, os produtos destes genes so os verdadeiros responsveis pela formao do tumor. A regio do T-DNA inclui genes de auxinas e citocininas.

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Ambas estas hormonas so reguladoras do crescimento e desenvolvimento vegetal, mas quando em excesso so capazes de originar tumores como o que acontece aps infeco. Alm destes genes o T-DNA carrega tambm m gene para uma molcula chamada opina.

2- Sistemas de vectores derivados do plasmdeo Ti A forma mais simples de explorar a habilidade do plasmdeo transformar plantas seria introduzindo a sequncia de DNA a clonar na regio T-DNA e depois utilizar o plasmdeo e a bactria para entregar e inserir o gene no genoma da planta. Contudo, apesar de serem eficientes como vectores naturais, eles tm srios problemas como vectores de clonagem: - A produo das filohormonas por clulas transformadas a crescerem em cultura previne as clulas de poderem ser regeneradas em plantas maduras. Por isso os genes de Auxinas e Citocininas tm de ser removidos de qualquer vector Ti; - Um gene codificando a produo de opina no til para uma planta transgnica e pode diminuir a produo dividido os recursos disponveis. Logo necessrio a remoo deste gene; - O plasmdeo Ti grande e, para fenmenos de engenharia gentica, so preferveis verses menores. Logo, pores no codificantes e no importantes do DNA do plasmdeo tm de ser removidas; - Como o plasmdeo Ti no se replica em E. coli necessrio uma adio de uma origem de replicao que possa e ser utilizada em E. coli, de modo a poder ser manipulada geneticamente (dado que E. coli est bem caracterizado, as manipulaes nesta bactria so mais eficientes); De forma a ultrapassar estes problemas, a tecnologia de DNA recombinante foi usada criar uma srie de vectores baseados neste plasmdeo. Estes vectores tm uma organizao semelhante e possuem os seguintes componentes: - Uma marca de seleco que confira resistncia nas clulas transfectadas. No entanto necessrio colocar o gene, muitas vezes trata-se de um gene de seleco procariota (neomicina), sob contedos eucariotas. promotor (sinais de regulao da transcrio), local de poliadenilao; - Adio de um local de origem de replicao que funcione em E. coli. Em alguns vectores um local de origem de replicao de Agrabacterium tambm adicionado; - Principalmente o limite direito tem de estar presente, contudo a maioria dos vectores possui ambos os limites;

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- Um polylinkes (MCS Multiple Cloning site) inserido de modo a facilitar a insero do gene na regio do T-DNA; Como estes vectores de clonagem tm falta dos genes vir, eles no so capazes por si prprios de transferir e integrar o T-DNA nas clulas infectadas. Deste modo desenvolveram-se dois sistemas: o sistema de clonagem binrio e o vector cointegrativo. O sistema de vector binrio contm uma origem de replicao para E. coli e outra para A. tumefaciens, ou seja, trata-se de um vector shuttle ou vaivm e no possui gene vir presente. Todos os passos de clonagem do levados a cabo em E. coli e depois o vector introduzido em A. tumefaciens. A estirpe receptora do plasmdeo modificado transporta um plasmdeo Ti inactivo (possui todos os genes vir mas falta-lhe parte ou toda a zona do T-DNA). Isto garante que h infeco porque as bactrias possuem genes oir, garante que o T-DNA transferido pretendido e garante que o T-DNA transferido o pretendido e garante, tambm, que quando manipulamos E. coli os genes vir no interfiram com o processo.

Uma segunda abordagem, chamada vectores co-integrados, possui um vector com uma marca de seleco vegetal, o gene alvo, o limite direito, uma origem de replicao de E. coli e um gene de seleco procaritica. O vector cointegrativo recombina-se com um vector inactivo e todo o vector recombinante integrado nas clulas vegetais. Para tal, ambos os vectores cointegrativo e helper (inacto) possuem sequncias de DNA Homlogas que providenciam um local para a recombinao in vivo geralmente estas sequncias localizam-se dentro da regio T-DNA. Notas: Um problema prtico na utilizao dos vectores binrios o seu grande tamanho, por isso tm sido desenvolvidos vectores mais pequenos, como o vector minibinrio pcB301. O plasmdeo co-integrado basicamente igual a um plasmdeo natural mas, incrivelmente, mais fcil de manipular. Geralmente no se utilizam os genes de virulncia directamente no vector (lembrar vectores binrios) porque no conveniente que haja uma infeco muito brusca, convm ter uma relao fcil de detectar e, no esquecendo os passos iniciais, quando se fazem manipulaes do vector em bactrias j necessrio utilizar mtodos de seleco.

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3- Transfeco de Monocotiledneas A transfeco de plantas com A. tumefaciens no eficiente para a maioria das plantas (especialmente monocotiledneas e conferas). Nestes casos somos obrigados a recorrer a mtodos alternativos, como a balstica de DNA. Nesta tcnica microesferas de ouro ou tungstnio so revertidas com cadeias de DNA, que so projectadas a altas velocidades com um aparato chamado pistola de partculas, este usa como fonte de propulso altas presses geradas por Hlio comprimido. Os projcteis so capazes de penetrar na parede das clulas vegetais sem danificar muito as clulas. A extenso da penetrao destas partculas depende da intensidade da presso gerada. Uma vez dentro clulas o DNA removido das partculas e, em alguns casos, integrado no genoma este mtodo tambm tem sido utilizado para integrar genes nos cloroplastos e mitocndrias , a menos que o DNA seja inserido no genoma ele degradado. A transfeco das clulas mais eficaz quando utilizado DNA linear em vez de circular. 4- Uso de Genes Reprter para Identificao de clulas Transfectadas essencial saber como detectar DNA estranho que foi integrado no genoma, de modo a que as clulas transfectadas possam ser identificadas. Mais do que isso, em estudos de sinais de regulao transcripcionais e funcionamento desses sinais em diferentes rgos, entre outros estudos, por vezes importante medir o nvel de expresso do gene. Para tal, muitas vezes usada a presena de genes reprter como -Dglucoronidose (GUS), Firefly (and bacterial) Luciferase (LUC) e Green Flourescent Protein (GFP), que podem ser detectados in situ. O gene GUS um dos mais populares e pode ser detectado pela presena da cor azul aps hidrlise de um substrato incolor. O

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gene GFP fcil de detectar por luz azul ou ultravioleta atravs da fluorescncia verde sem necessitar adio de qualquer substrato ou co-factor. Muitas vezes genes de seleco so tambm usados como genes reprter (neomicina ou streptomicina). Nota: Quando se pretende saber o porqu da expresso local de determinada protena, faz-se o reconhecimento do promotor desse gene e a ele associa-se a sequncia do gene reprter. Quando a necessidade apenas identificar clulas transfectadas geralmente associa-se ao gene reprter um promotor endgeno de uma protena com elevada expresso de modo a facilita a deteco da protena reprter. Aplicaes O principal objectivo da biotecnologia vegetal a criao de novas variedades de cultivares. A introduo de genes que confiram resistncia a insectos, vrus, herbicidas, stresses ambientais e senescncia tm tido grandes aplicaes. Mais recentemente. Mais recentemente alguns trabalhos tm incidido: - No aumento do contedo nutricional; - Na manipulao de vais bioqumicas da pigmentao floral; - Na modificao dos produtos das plantas; - No uso como biorreactores para a produo de agentes teraputicos, anticorpos monoclonais e vacinas; 1- Plantas resistentes a Insectos A manipulao gentica de plantas de modo a faz-las produzir resistncias a insectos previne a necessidade de usar/espalhar insecticidas regularmente nos campos de cultivo, alm disto a manuteno de espcies resistentes fica consideravelmente mais barata que a manuteno do tipo selvagem (em 2000 quase 5 milhes de dlares foram gastos em insecticidas). Sem falar que os insecticidas biolgicos so altamente especficos para determinado numero de espcies animais. Assim, alm da reduo dos danos causados por insectos, decresce tambm os danos causados por fungos que estes transportam. Vrios tipos de estratgias tm sido usados para conferir resistncia contra insectos predadores: 1- Introduo de um gene para uma protoxina produzida por Bacillus thuringiensis (Bt milho Bt); 2- Utilizao de genes de protenas vegetais como inibidores da -amilase, inibidores de proteases e lectinas, tendo se mostrado todos eficientes contra grande variedade de animais. Aps algum insecto ingerir um destes inibidores deixa de ser capaz de digerir o alimento (plantas), pois os inibidores interferem com a hidrlise de protenas vegetais e outros compostos. Assim, o insecto morre fome, num mar de comida; Mecanismos de actuao A planta transformada produz a forma inactiva da toxina (protoxina) que ser depois activada no sistema digestivo do insecto devido clivagem por parte de algumas

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proteases e ao meio altamente alcalino que se regista no interior do estmago dos insectos. Assim, aglomerados da protoxina so ingeridos pelo insecto e uma vez no estmago estes aglomerados dispersam provocando a clivagem da protoxina, tomando esta a forma activa. Nesta forma activa a toxina vai inserir-se na membrana celular das clulas do aparelho digestivo do insecto e formar poros, causando a morte do animal. A empresa multinacional Monsanto a detentora da maioria das sementes destas plantas transgnicas e praticamente a nica a explorar este mercador a nvel econmico. As principais aplicaes fazem-se em algodo, tabaco e muitos cereais. Esta empresa defende o seu mercado atravs da comercializao de sementes estreis (garante que todos os anos haja compradores) salvaguardando assim a no invaso de espcies transgnicas e cm isto a diversidade biologia natural. Desvantagens: - A toxina pode apresentar especificidade relativamente ao insecto (pode ser visto como desvantagem ou vantagem); - Pode-se estar a criar, indirectamente, insectos resistentes toxina; Para combater a resistncia dos insectos toxina utiliza-se: - A expresso de inibidores; - A fuso de duas pores activas de diferentes toxinas (aumentando a variedade de insectos afectados e diminuindo com isso a possibilidade de resistncia); - Cotransfeco com duas toxinas; - Expressar nveis baixos de toxina (sendo apenas eficaz com determinadas espcies mais sensveis e necessitando de grandes ingestes para causar problemas a espcies no susceptveis). A expresso de uma toxina no genoma de cloroplastos ou mitocndrias tambm uma estratgia usada pois: - Aumenta a produo da mesma (elevado nmero de cloroplastos por clulas); - Permite uma boa expresso de algumas toxinas de origem procaritica, como Bt, pois o sistema de expresso destes organitos semelhante ao das bactrias; - Previne a disperso da mutao pois os cloroplastos no so transmitidos pelo plen (que sofre disperso) mas pelo ovo (que permanece na planta e consequentemente no campo de cultivo). No entanto existem ainda algumas questes contra aplicao desta tecnologia, tais como a diversidade biologia/gentica da espcie (perigo de no ser 100% estril ou formao de hbridos), presses selectivas incidentes nos insectos. Nota: Convm que quando se transforma geneticamente uma planta tenha-se em ateno factores como a susceptibilidade das plantas ao ataque dos insectos. A grande utilizao de insecticidas espalhados por avio, como DDT, tem contribudo ara a criao de insectos como moscas, formigas, abelhas resistentes a estes. Por isso a importncia dos transgnicos. 2- Plantas resistentes a Vrus Os vrus filopatognicos causam, muitas vezes, considerveis danos a vastas plantaes e reduzem significantemente a produo do agricultor. Podem-se atingir resistncias naturais por diferentes vias: bloqueio da transmisso viral, preveno do estabelecimento do vrus na planta e resistncia ou atenuao dos sintomas. Deste

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modo, plantas transgnicas tm sido construdas a fim de serem resistentes aos vrus. Vrios mtodos j foram desenhados. Quando a planta transgnica expressa a protena do envelope viral (geralmente a mais abundante) do vrus que geralmente infecta essa planta, a capacidade de infeco por esse vrus geralmente decresce. Apesar do mecanismo que conduz a esta reduo pela simples expresso da protena do envelope no ser bem, conhecido j claro que tal providncia uma proteco bastante eficaz. Tanto em eucariotas com procariotas, uma molcula de RNA que seja totalmente complementar molcula de mRNA para determinada protena chama-se antisense, enquanto que a molcula transcrita (mRNA), por analogia, designada sense. A presena de RNA antisense pode reduzir a sntese de um determinado produto por formao de um molcula em cadeia dupla. A cadeia dupla de RNA antisense/mRNA rapidamente degradada. Teoricamente seria possvel prevenir a replicao de um vrus numa determinada planta, construindo uma planta transgnica que sintetizasse RNA antisense complementar do mRNA da protena do envelope viral. Num dos vrios estudos sobre a eficcia da expresso da protena viral e de RNA antisense clonou-se o cDNA da protena do invlucro do Cumcuber Mosaic Vrus (CuMV) em plantas do tabaco em suas orientaes (sense e antisense, cada uma das orientaes em plantas diferentes) e de seguida testou-se a sensibilidade destas plantas infeco viral. Para criar plantas transgnicas que tanto expressem a protena como o RNA antisense procedeu-se do seguinte modo: 1- Isolou-se o RNA 4 (um dos fragmentos do genoma do vrus codifica a protena do envelope). 2- Converso enzimtica in vitro numa dupla cadeia de cDNA. 3- Adio de linker ao cDNA. 4- Introduo de toda a cadeia de cDNA nos vectores em ambas as direces. 5- Formao de plantas transgnicas separadas carregando sequncias de cDNA numa das duas orientaes possveis. Os resultados foram que as plantas que expressaram a protena do invlucro encontravam-se protegidas contra a acumulao de partculas virais e no mostravam sintomas de infeco viral, independentemente da infeco dos vrus ser em elevada ou baixa concentrao, no entanto as plantas com RNA antisense constituam apenas proteco contra baixas concentraes do vrus. Estas duas tcnicas mostraram proteco tambm contra vrus semelhantes, o que naturalmente ou por outro mtodos no se verifica, sugerindo que se calhar no necessria alta especificidade na escolha da protena cujo gene se vai expressar.

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No entanto, comum que os campos de cultivo se encontrem expostos a infeco por parte de vrios vrus. Idealmente as plantas transgnicas deviam ser resistentes a mais do que um tipo de vrus. Com isto em mente foram construdos vectores binrios de plasmdeos Ti para trs tipos de protenas do invlucro de trs vrus distintos. Sob condies de laboratrio as plantas transgnicas que continham os genes para as trs protenas do invlucro eram resistentes a infeces por parte dos trs. Por outro lado plantas expressando apenas um tipo destas protenas eram mais susceptveis a sofrerem infeces virais. Claramente, o uso de mais do que uma protena do invlucro viral uma boa estratgia e devia ser usada na construo de plantas transgnicas resistentes a todas as infeces mais comuns de determinada cultura.

3- Plantas resistentes a Herbicidas Aproximadamente 10% da produo global perdida por infeco de plantas daninhas todos os anos e, para mais, muitos herbicidas no so capazes de distinguir plantas de cultivo ou ervas daninhas. A produo de plantas geneticamente modificadas para a resistncia a herbicidas uma estratgia para contornar este problema. Muitas so as manipulaes possveis: - Inibir a entrada de herbicidas. - Sobre expressar a protena alvo do herbicida de modo a que aps aco deste ainda haja protena disponvel necessria maior quantidade para inibir a funo. - Reduo da habilidade/afinidade da protena alvo de ligar ao herbicida ( necessrio maior quantidade de herbicida para bloquear a actividade da protena. - Produzir plantas com capacidades metablicas para degradas o herbicida (round up). Tm sido desenvolvidas plantas resistentes ao gliphotase um herbicida amigo do ambiente porque degradado pouco depois de entrar no solo que inibe EPSPS. Foram criadas plantas transgnicas resistentes a este herbicida por transformao com gene da EPSPS isolados de uma estirpe bacteriana resistente ao gliphosate.

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4- Resistncia a Fungos e Bactrias Anualmente doenas provocadas por fungos ou bactrias destroem extensas reas de cultivares, um dos maiores exemplos o arroz cuja perda chega a atingir 5 bilies de dlares por ano. As plantas naturalmente respondem a invases bacterianas ou fngicas ou outros stresses ambientais transformando cido saliclico conjugado em cido saliclico, o qual induz a sntese de um grupo de protenas geralmente denominadas pathogenisis-related (PR) quitinases, glucanases, inibidores de proteases, etc. O systemic acquires resistence (SAR) resulta como consequncia deste mecanismo e estende-se a outros tecidos das plantas que se localizam longe do local onde se deu a infeco. Para desenvolver plantas resistentes a estas infeces os investigadores tentam utilizar partes do sistema SAR. Por exemplo, plantas transgnicas que continuamente expressam altos nveis de uma ou mais protenas PR, tais como a quitinase que hidrolisa quitina presente na parede dos fungos, j foram feitas. Outro mtodo para modificar plantas que tambm j foi desenvolvido foi a induo da sobre expresso do cido saliclico que vai induzir a produo destes PR. Este tipo de tcnicas faz com que as plantas aparentem seres normais mas que possuam elevada resistncia tanto a agentes fngicos ou bacterianos, h ainda estudos na elaborao de plantas que expressem lisozimas para degradar bactrias. Alguns destes estudos esto ainda para serem testados no campo. 5- Tolerncia ao Stress e Envelhecimento Ao contrrio de muitos animais, as plantas no so capazes de evitar/fugir a muitos stresses provocados por condies ambientais, com luz UV, altos nveis de luz visvel, irradiao, calor, altas concentraes de sal, seca, etc. Estas condies criam stresses como o stress oxidativo, stress salnico, stress ao calor ou seca. E por sua vez estes stresses, a um nvel molecular levam muitas vezes produo de radicais de oxignio livres. Assim os investigadores questionaram-se sobre a hiptese de criar plantas tolerantes a estes sistemas. Dentro de uma clula sob condies normais h uma produo regular destes radicais assim como h sistemas que equilibram esta produo, eliminando-os. Nestes sistemas intervm enzimas como o superxido dismutase que converte estes radicais em perxido de hidrognio que por sua vez so quebrados em gua mais oxignio atravs de complicadas reaces por parte de catalases. Assim a introduo de genes para estas protenas sob influncia de um promotor fonte de vrus levou a uma reduo dos donos causados por radicais livres. O2 O2 Superxido dismutase H2O2 Catalase H2O + O2

O importante nestes sistemas identificar os genes envolvidos na tolerncia, clona-lo(s) e transferi-los para a planta com um correcto nvel e local de expresso mantendo uma funo correcta.

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6- Stress Salnico Muitas plantas, actualmente, vivem em ambientes onde o crescimento severamente prejudicado pela seca e altos nveis de salinidade. Com a crescente necessidade de irrigao dos campos e o crescente uso de salinao do gelo das estradas no Inverno, o aumento da salinidade do solo tornou-se um srio problema. Para sobreviver a estas condies muitas plantas sintetizam osmoprotectores que so molculas de pequeno peso molecular que facilitam a subida de gua e estabilizam e protegem macromolculas de danos infligidos por altos nveis de sal. Alguns destes osmoprotectores mais conhecidos so aucares, lcoois, prolina e compostos amnio quaternrios. Para criar planas tolerantes alguns investigadores criaram plantas superprodutoras destes compostos, mas isso no interessa para esta disciplina. De facto, outros investigadores tiveram a ideia de torna as plantas tolerantes por sequestramento de ies Na+ em largos vacolos intracelulares. A estratgia consistia na sobre expresso de uma protena endgena que funcionava como antiporte Na+/H+, transportando ies Na+ para dentro do vacolo usando um gradiente electroqumico de protes gerado pelo transporte vacuolar de enzimas de translocao. Quando testadas, estas plantas mostraram-se super protegidas (usaram-se concentraes de 200mM de NaCl).

A pesquisa de protenas que ajudem neste tipo de tolerncia tambm tem sido bastante aprofundada no que diz respeito utilizao de protenas originrias de organismos extremfilos. O conceito por detrs destas pesquisas est na possibilidade de plantas culturas em reas geogrficas e pocas anuais diferentes da normal. Outro dos conceitos, este mais relacionado com o stress salnico, a hiptese de irrigao dos campos com gua do mar. Mais um dos impulsionadores deste tipo de investigao poder prolongar o tempo que medeia entre o apanhar do produto e a venda do mesmo. 7- Manipulao do processo de envelhecimento dos frutos Um dos maiores problemas no crescimento de frutos o amadurecimento precoce destes durante o transporte. Este amadurecimento faz parte do processo natural de envelhecimento. Antigamente a preveno deste problema passava por adiantar a colheita para uma altura em que os frutos no estejam ainda completamento maduros, alargando assim o tempo em que estes podem ser comercializados. Contudo o amadurecimento durante o transporte implicava uma certa perda de sabor e consistncia, pois como se trata de um processo natural est dependente de factores ambientais e portanto este processo de colheita precoce no favorvel. Claro que existem produtos hortcolas que resistem mais ao transporte que outros, por exemplo o tomate resiste

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pouco ao transporte e por isso muitas das investigaes a este nvel tm sido concretizadas com esta planta. Em termos moleculares, o amadurecimento dos frutos trata-se de um processo gradual, iniciado por hormonas como o etileno, que leva ao aparecimento de caractersticas tpicas (paladar, cor, textura). A biotecnologia aproveitou estes conceitos moleculares e identificou alguns genes responsveis pela codificao de enzimas intervenientes nestes processos, celulases e poligalacturonases. Foi assim postulado que interferindo com a expresso de um ou mais destes genes poderia atrasar-se o amadurecimento. Esta interferncia podia ser atingida pela criao de plantas transgnicas que expressem RNA antisense. A reduo da expresso de poligalacturonases em tomates inibiu o amadurecimento destes. Estes tomates transgnicos ficaram conhecidos como Flaur Saur (flavor saver), pois mantinham o sabor. Estes tomates tinham por vezes um sabor igual ou mais intenso porque ficavam mais tempo na terra, e portanto acumulavam maior concentrao de metabolitos. Posteriormente para se proceder ao amadurecimento dos frutos, estes so pulverizados com etileno. Estratgias para impedir o Amadurecimento Geralmente tenta-se impedir a formao de etileno atravs da inibio de enzimas envolvidas na biossntese do mesmo. Por exemplo, verses de RNA antisense das enzimas SAM sintetase, ACC sintetase ou ACC oxidase so bons candidatos diminuio da expresso do etileno. Metionina SAM sintetase SAM ACC sintetase ACC ACC oxidase Etileno Glutamil ACC transferase G-ACC M-ACC Malonil ACC transferase

Uma outra estratgia transformar uma planta com a enzima bacteriana ACC desaminase, que converte ACC em -Ketobutirato.

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SAM ACC desaminase -Ketobutirato ACC oxidase Etileno Cada uma destas modificaes resulta num decrscimo do nvel de etileno aumentando assim a vida dos frutos em armazm. 8- Manipulao da Pigmentao Floral A indstria floral est continuamente a tentar melhorar a aparncia e tempo de vida das flores. As tcnicas tradicionais foram capazes, ao longo de vrios anos, de criar uma grande variedade de plantas que divergiam na cor, forma e arquitectura. Contudo as tcnicas tradicionais so lentas e limitadas pool de genes de determinada espcie. Como alternativa, por manipulao de genes de enzimas envolvidas na via metablica de antocianinas podem-se criar flores com cores nicas e variadas. As antocianinas so o pigmento floral mais comum, elas so sintetizadas a partir da fenilalanina atravs de uma srie de reaces. Atravs da manipulao de tipos e propores destas antocianinas expressar pode-se regular, criar e manipular o aparecimento de flore. Muitas vezes a estratgia utilizada envolve a expresso de RNA antisense para bloqueio de enzimas na via biossinttica ou a adio de genes de outras plantas a fim de obter novos compostos. 9- Modificao do Contedo Nutricional das Plantas Com o decorrer do tempo, agricultores e cultivadores ornamentais tm tido elevado sucesso na optimizao de propriedades teis (protenas ou leos) assim como no aumento de produtividade de um largo nmero de plantas. Contudo trata-se de um processo lento e limitado. Pelo contrrio a engenharia gentica permite aos cientistas acelerarem estes processos e desenvolver caractersticas que seriam, de outra maneira, difceis de obter. Trata-se de: - Aumentar qualidades nutricionais; - Modificar a produo de cidos gordos; - Alterar o sabor dos frutos, por exemplo introduzindo o gene para a monelina (protena com um sabor doce); - Expressar -caroteno; - Expressar ies ou molculas metlicas, como o ferro; - Aumentar os nveis de vitaminas; Aminocidos As protena presentes como fonte de armazenamento em sementes contm um nmero limitado de aminocidos, e por isso o valor nutricional destas sementes geralmente baixo, falta-lhes lisina e metionina essenciais para a sade humana. ACC CO2 + NH3 + H2COOACC sintetase

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Deste modo o contedo em aminocidos pode ser alterado por sobreexpresso de determinados aminocidos e consequente mutao dirigida de protenas de forma a estas utilizarem estes aminocidos sobreexpressos na sua composio. Contedo Lipdico Esta uma tcnica tambm muito usada devido necessidade destes leos para fins alimentares, cosmticos e aromoterapias. No entanto o que se faz, na maioria das vezes, alterar a produo destes lipdos provocando expresso de lipdos foraelciros ou modificando os j existentes para formar mais resistentes ao calor ou com menor grau de insaturao a fim de serem usados na alimentao. Este tipo de manipulaes so mais frequentes em plantas como o girasol, soja, palma, etc. e consegue-se por adio de protenas/enzimas que extendem o tamanho da cadeia lipdica (estabilidade ao calor) e alteram o grau de insaturao (reduzem /aumentam o nmero de ligaes triplas entre carbonos). 10- Modificao do Contedo de -Caroteno Apesar de cerca de metade da populao mundial se alimentar de alimentos com arroz, este alimento uma fraca fonte de nutrientes e vitaminas incluindo a vitamina A e este facto causa muitas doenas. Assim um modo de circunscrever este problema seria a criao de plantas de arroz transgnicas que expressem -Caroteno (percursor de vitamina A). Existem vrias estratgias para promover esta modificao, mas apenas uma delas utilizada: a adio de enzimas de origem bacteriana. Para a transformao destas plantas utilizou-se transformao mediada por Agrobacterium e plasmdeos Ti. 11- Plantas como Biorreactores As plantas so fceis de cultivar e podem gerar grandes quantidades de biomassa. Com isto em mente os investigadores tm tentado descobrir se as plantas podem produzir produtos qumicos e comerciais. Ao contrrio das bactrias recombinantes, que necessitam de crescer em largos biorreactores e necessitam de pessoal especializado para a sua manuteno, a produo de protenas recombinantes a nvel industrial em plantas seria um processo muito mais simples. As plantas tm sido usadas para produzir: - Anticorpos monoclonais; - Agentes teraputicos; - Polmeros (plsticos biodegradveis); Por este processo leva-se mais tempo a obter o produto de clonagem, mas tambm por expresso desse produto em folhas pode-se obter muito maior quantidade de produto e provavelmente com melhores modificaes ps-traducionais, uma vez que este tipo de modificaes nas plantas mais parecido com as dos mamferos do que as modificaes em leveduras. Vantagens deste sistema: - A integrao do novo gene no DNA vegetal d-se de forma estvel, enquanto que em microrganismos e linhagens celulares pode no ser estvel;

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- Modificaes ps-traducionais semelhantes dos mamferos (perigo apenas de adio de glcidos vegetais especficos, contudo continua a ser mais semelhante que as leveduras); - Armazenamento destas modificaes de longa durao (sementes); 12- Produo de Agentes Teraputicos A produo de agentes teraputicos em plantas tem grandes vantagens em relao produo dos mesmos em microrganismos ou linhagens celulares animais. A maioria delas j foi referida, como as modificaes ps-traducionais e a hiptese de elevada expresso quando esta dirigida para rgos como folhas e principalmente se se tratar de folhas largas como algumas plantas possuem, como por exemplo o tabaco. Na realidade grande parte desta tecnologia tem sido dirigida e aplicada na planta do tabaco. Produtos como anticoagulantes, agentes teraputicos (de aplicao em doenas como anemia, hepatite C e D, cirrose, nanismo, SIDA, fibrose cstica, etc.) e anticorpos contra os mais variados antignios so apenas alguns exemplos prticos do potencial das plantas a este nvel. As plantas so tambm usadas como produtoras de fibras de polmeros biossintticos e biodegradveis. Estes so de difcil e cara produo em bactrias, para alm de que possui uma produo interrompida. Deste modo por insero dos genes codificantes destas fibras nos cloroplastos das clulas vegetais obtm-se uma elevada e correcta produo deste material, j que as fibras so originariamente procariticas, logo so melhore expressas nestes organitos. 13- Vacinas Comestveis Mesmo apesar dos grandes e variados avanos na rea da biotecnologia existem ainda alguns problemas que esta disciplina no consegue ultrapassar, como por exemplo a falta de meios para armazenar e administrar uma vacina por parte dos pases mais pobres. Nestes casos seria bastante proveitosa a hiptese de poder administra uma vacina para a qual no fossem necessrias tcnicas de dosagem e administrao em de armazenamento, como se fizessem parte de um vegetal ou de outro alimento. As vacinas administradas oralmente conseguem estimular directamente o sistema imunitrio. Muito do trabalho desenvolvido com plantas comestveis tem sido direccionado para a batata. As batatas foram inicialmente escolhidas por serem fceis de manipular. Contudo nunca foi inteno torn-las em vacina comestveis pois necessrio cozinhlas antes de as comer e o processo de cozedura (altas temperaturas) geralmente destroem (inactivam) a maioria dos antignios. As plantas actualmente consideradas so: bananas, tomate, cenouras, amendoins, etc.

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3- Animais Transgnicos
A tecnologia para criar animais transgnicos foi desenvolvida para melhorar animais. Este melhoramento resume-se basicamente a animais com aplicaes industriais (frangos) e agrcolas (cavalos, vacas). No entanto, este melhoramento no algo recente, desde a domesticao dos vrios animais que os tratadores tentam seleccionar as caractersticas que consideram mais favorveis atravs de cruzamento selectivo que levou criao, distino e apuramento das vrias raas. No entanto, este um processo demorado, que trs problemas de consanguinidade e que pode tambm conduzir a problemas de seleco de caractersticas indesejadas. Na actualidade, as novas tecnologias permitem a utilizao de tcnicas de DNA recombinante a fim de seleccionar/introduzir/modificar determinadas caractersticas. Para isso, geralmente necessrio: - Transfeco de um gene num zigoto. - Implementar o zigoto numa nova mo. - Seleco dos descendentes, com algumas caractersticas ou manifestaes dela e cruzamento destes (ateno estes descendentes so tetrazigticos pelo que no se consideram transgnicos). - Seleco de indivduos transgnicos e cruzamento dos mesmos a fim de criar populao com tamanho aceitvel. Mas nos dias que correm e dado disponibilidade tecnolgica, muitos so os mtodos que podem ser usados, um pequeno ajuste ao anterior resulta: - Extraco do gene (isto tambm est includo no anterior embora no tenha sido referido). - Injeco do gene no ovo fecundado. - Implementao do ovo na fmea que ir gerar descendncia. - Cruzamento e seleco de indivduos sob o mesmo aspecto terico e prtico que anteriormente. Esta produo de transgnicos, para alm do valor econmico a nvel do gado e agricultura , tambm, uma mais valia como modelos de investigao bsica regulao gnica, desenvolvimento, cancro, doenas genticas humanas, etc e sistemas de produo proteica como produo de agentes teraputicos. Outro tipo de utilidades participao em ensaios clnicos em fases iniciais. O mtodo para a insero do DNA estranho numa clula de ovo ou ocito pode ser: - Vectores retrovirais. - Microinjeco. - Manipulao gentica de stem cells. Mtodos de insero de DNA 1- Mtodo por Vectores Retrovirais Trata-se de um dos mtodos mais usados e est disponvel para vrios organismos. Para que consiga introduzir o gene no genoma do hospedeiro ele necessita de um helper vrus a fim de facilitar na replicao do genoma viral. Contudo e apesar de altamente disperso este sistema infecta apenas clulas em diviso e a sequncia no pode exceder os 8Kpb, pelo que isto limita o uso deste mtodo. A maior das desvantagens a possibilidade de infeco do hospedeiro por parte da estirpe do helper vrus.

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A seleco das clulas transfectadas pode ser feita por PCR a partir da anlise de tecidos do animal e verificar se o produto ampliado corresponde sequncia selvagem ou modificada. 2- Mtodo por Microinjeco de DNA Devido s desvantagens do mtodo anterior, a microinjeco do DNA hoje em dia o mtodo preferido para produzir transgnicos. O mtodo consiste em (1) provocar a superovulao na fmea de forma a aumentar a quantidade de ovos disponveis, (2) os vulos so injectados com o proncleo masculino transgnico, (3) os ovos so injectados na fmea hospedeira, (4) a fmea gera descendncia. Como referido, este mtodo trata-se do mais usado mas nem por isso o mais eficaz. De facto, apenas cerca de 5% dos ovos injectados de desenvolvem em ratos adultos, isto acontece por diferentes factores como mecanismos intrnsecas de proteco contra DNA estranho, danos causados pela manipulao ou mesmo devido a interferncias com o gene estranho. 3- Mtodo de Manipulao Gentica de Stem Cells As stem cells ou clulas embrionrias so clulas totipotentes capazes de se diferenciarem em qualquer tipo de clulas de qualquer tipo de tecidos, incluindo clulas da linha germinal e que se encontram, entre outros locais, no blastocisto. Numa primeira fase de utilizao desta tecnologia necessrio proceder-se manipulao destas clulas, atravs do uso de vectores retrovirais ou lisossomas. As clulas tranfectadas so posteriormente adicionadas a um blastocisto que permite o desenvolvimento destas num rato adulto. Estes ratos vo ser quimeras, pois em todo o seu corpo possuem clulas com diferente informao gentica. Seguem-se os cruzamentos para obter transgnicos. Uma das vantagens deste sistema a possibilidade de insero do gene num local concreto do genoma por recombinao homloga. Deteco Positivo/Negativo Uma outra vantagem no uso destes sistemas a capacidade que as clulas totipotentes tm de proliferarem em cultura. Possibilitando a seleco das clulas transfectadas antes da transferncia para blastocisto. Esta seleco tem de ser feita de modo a poder distinguir aquelas clulas que foram transfectadas das que no foram e aquelas onde a insero do gene ocorreu no local correcto do genoma. Para tal utiliza-se a chamadas seleco positiva/negativa. A sequncia do DNA inserido no vector possui um gene de sensibilidade ao ganciclovia, um gene de resistncia, dois locais de recombinao homloga e o gene alvo. O gene de resistncia funciona da mesma maneira que exposta anteriormente, ou seja, codifica para determinado produto que confere resistncia quando na presena de certos compostos. Por exemplo, o gene Neor confere resistncia neomicina (procariticas) ou G418 que um composto citotxico. Enquanto que o gene de sensibilidade traduz para uma protena, por exemplo timidina cinase, que quando presente reage com determinado composto tornando-o txico e matando as clulas. Deste modo geralmente inserido o gene Neor e TK1 e TK2 na sequncia de DNA a clonar, educando os genes TK fora da zona onde supostamente ocorre a

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recombinao homloga de forma a que quando a insero ocorre especificamente os genes no so inseridos no conferem sensibilidade mantendo as clulas vivas, pelo contrrio quando o gene se insere aleatoriamente no h esta separao e os genes de sensibilidade so tambm adicionados matando as clulas quando o produto no txico adicionado ao meio. Testes adicionais, para certificao da insero correcta podem ser feitos recorrendo tcnica de PCR. Ratos Knockout Ratinhos Knockout so um tipo de ratos geneticamente modificados onde se inactiva a expresso de determinado gene. Este procedimento geralmente feito para estudos de cincia bsica onde se estuda a funo de determinado gene. A anlise destes organismos feita por inactivao do gene e verificao de diferenas a nvel de desempenho de determinadas funes. Por vezes esta tcnica corre mal porque a expresso do gene essencial a outros nveis bsicos de desenvolvimento, ou porque o animal modelo escolhido no o ideal para o estudo daquela funo. Estes estudos tambm podem ser levados a cabo por sobreexpresso do gene em questo. O mtodo mais comum na inactivao do gene a insero de pedaos de DNA no meio da regio codificantes (ORF) ou na zona do promotor. Para tal, precede-se do seguinte modo: - Utilizao de um vector com regio promotora, finalizadora e extremidades do gene iguais (homlogas) e na zona intermdia do gene retira-se a ORF (ou abre-se apenas) e coloca-se no seu lugar um gene de resistncia. - Procede-se transfeco de clulas. - Seleco das clulas utilizando o composto para o qual a insero confere resistncia. - Criao do ratinho transgnico/knockout por microinjeco ou stem cells. J existem mais de 250 ratos knockout disponveis para venda por parte de indstrias biotecnolgicas. Eles so construdos essencialmente para estudos na rea da medicina para caracterizao de doenas genticas humanas (sabendo qual a funo do gene consegue-se combater melhor a doena por ele provocada quando no se encontre um correcto funcionamento). Geralmente e por esta razo utilizamos genes (inseridos ou inactivados) que possuam alguma homologia com os genes humanos. Nota: No esquecer que os genes apresentam alelos e polimorfismo, pelo que por vezes isto pode alterar o correcto funcionamento deste sistema, interferindo essencialmente com a insero por recombinao homloga. Vectores de grande capacidade So vectores utilizados pela biotecnologia principalmente para produzir organismos transgnicos, embora tambm possam servir para expresso proteica mas muito raramente so utilizados para este fim. Geralmente os organismos transgnicos derivam de inseres de cDNA do gene a inserir, no entanto a expresso destes genes assim como a sua regulao fraca. Por isso comum utilizarem-se sistemas como BACs, MACs, YACs, etc. (alguns deles j referidos). Este sistema permitem a expresso de genes ou sequncias de DNA que variam entre os 100 e os 1000 Kpb e so geralmente introduzidos nas clulas mor

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microinjeco. Uma aplicao destes vectores na expresso de anticorpos em ratos transgnicos. Aplicaes de Animais Transgnicos A tecnologia envolvida no processo de produo de ratos transgnicos foi transferida e aplicada na construo de animais transgnicos de maior porte, como gado e outros animais de agropecuria. Nestes animais utilizaram-se os mesmos princpios e linhas de pensamento j aplicadas anteriormente e decidiu-se utiliz-los para a produo de determinadas protenas com utilidade para a indstria/medicina/tecnologia. Alguns exemplos so a expresso da lactoferrina humana em gado bovino, drogas anti-cancro em gado caprino e hemoglobina humana em gado suno. Esta expresso leva expresso de maior quantidade de agentes teraputicos do que quando produzidos em linhagens celulares ou microorganismos, promovendo tambm modificaes ps-traducionais correctas. No entanto estas modificaes no se aplicam apenas ao nvel de agentes teraputicos para fins mdicos mas tambm se aplicam ao nvel industrial. Por exemplo, a sobreexpresso da hormona de crescimento em vacas, no propriamente para fins teraputicos, mas para aumento do porte, produo e rentabilidade econmica (carne, leite, pele, etc). Processo de produo de gado transgnico: 1- Recolha de ocitos; 2- maturao dos ocitos in vitro; 3- Fertilizao in vitro; 4- Centrifugao dos vulos fertilizados para concentrar o material de reserva num dado ponto, pois este previne a visualizao do proncleo masculino quando visto o vulo ao microscpio; 5- Microinjeco do DNA estranho no proncleo masculino; 6- Desenvolvimento dos embries in vitro; 7- Implantao dos vulos no tero da fmea hospedeira atravs de mtodos no cirrgicos; 8- Screaning da descendncia procura de animais transgnicos; 1- Utilizao como biorreactores A utilizao destes animais como biorreactores algo muito utilizado e estudado. O uso de alguns animais, como por exemplo vacas, torna as protenas exgenas mais fceis de purificar, aumentando a sua quantidade e a qualidade. Exemplos so a produo destas protenas induzindo a sua expresso a nvel da bexiga, clulas renais e glndulas mamrias, facilitando o isolamento a partir da urina e do leite, respectivamente. De notar que a excreo na urina torna o processo de isolamento mais fcil bastando o tratamento por diluio ou dilise, enquanto que a expresso no leite necessita de meios mais complexos de purificao devido existncia de protenas no leite. Contudo a nvel de expresso de protenas na urina tem de ser mais reduzido. A utilizao de gado caprino (ovelhas e cabras) resume-se basicamente ao mesmo que a utilizao do gado bovino. 2- Porcos Transgnicos A utilizao de porcos transgnicos pouco comum porque a taxa de sucesso muito baixa. Contudo estes animais tm sido amplamente utilizados no que respeita

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produo de rgos para transplante (vrios tipos de rgos humanos, principalmente coraes). A produo de rgos no requer nenhum tipo de modificaes genticas, o que a biotecnologia tente nestes caos alterar a produo de antignios expressos de modo a assemelha-los aos humanos, de forma a diminuir o nvel de rejeio. Apesar da elevada importncia mdica, as pesquisas a este nvel foram interrompidas por falta de financiamento. Este corte oramental deveu-se ao impacto e taxa de incidncia da peste suna. 3- Aves Transgnicas Este grupo de animais poucas novidades trs para a tecnologia e aplicaes de animais transgnicos. Contudo existe uma novidade importante agregada a este grupo: a produo de agentes teraputicos ou benficos para a sade, como produtos com valor nutricional acrescentado, em produtos animais (neste caso, em ovos). Basicamente este processo no novidade e entra na linha de pensamento da produo de protenas/agentes teraputicos no leite das vacas, mas os ovos como grande recurso alimentar torna-se numa mais valia. A metodologia aqui semelhante s descritas anteriormente, recorrendo-se preferencialmente infeco retroviral. De salientar que situaes como o melhoramento animal (ligado directamente produo de ovos) e a produo de resistncia a doenas so algo que no se exclui nem nestes, nem nos outros animais. 4- Peixes Transgnicos A rea de produo de peixes transgnicos uma rea vastamente desenvolvida. Esta essencialmente aplicada a peixes que crescem em culturas e incidem principalmente na alterao do rito de crescimento de modo a aumentar a rentabilidade do investimento. Exemplo disso o salmo que cresce cerca de 10 vezes mais rpido em cativeiro (geneticamente manipulado) que no estado selvagem. Estes animais so produzidos por microinjeco e a eficcia deste procedimento razoavelmente maior: cerca de 35 a 80% dos vulos sobrevive microinjeco e destes 10 a 70% nascem e so transgnicos. A nvel esttico tambm tem sido aplicada esta tecnologia, por exemplo, a truta salmonada no nada mais que uma truta com um gene de uma alga que lhe confere uma cor avermelhada. Esta truta nada tem a ver com o salmo. Clonagem de Mamferos Este aspecto foi apenas abordado a nvel ldico como a produo de clones de animais de estimao. Este tipo de aplicaes j foi feito e existe uma empresa Genetic Saving &Cloning, inc que afirma fazer este tipo de trabalhos, congelando clulas do animal ainda vivo e recuperando-o depois a pedido dos donos. Existem vrios mtodos como o de Rosellin desenvolvido pelo Instituto de Rosellin na Esccia e o mtodo Honnolulo desenvolvido na universidade do Hawaii. Clonagem Humana - 2001: 6 embries clonados pela Advanced Cell Technology; - 2002: Embries clonados pelo Dr. P. Zavos (ginecologista italiano);

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- 2002/2003: primeiro nascimento de um clone pela Clonaid, supostamente;

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