LA DEFICIENCIA DE TROMBOSPONDINA 1 REDUCE LA OBESIDAD ASOCIADA A LA INFLAMACIN Y MEJORA LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA EN UN MODELO DE RATN OBESO INDUCIDO POR LA DIETA

Centro de Graduados de Ciencias de la Nutricin de la Universidad de Kentucky, Lexington, Kentucky, Estados Unidos de Amrica

Resumen
Antecedentes: La obesidad en todo el mundo es frecuente y se asocia con resistencia a la insulina. Estudios avanzados sugieren que asociadas a la obesidad bajo grado de inflamacin crnica contribuye al desarrollo de resistencia a la insulina y otros complicaciones metablicas. Trombospondina 1 (TSP1) es una protena multifuncional de la matriz extracelular que est regulado en inflamacin del tejido adiposo. Un estudio reciente sugiere una correlacin positiva con la inflamacin de TSP1 obesidad, tejido adiposo, y resistencia a la insulina. Sin embargo, el efecto directo de TSP1 sobre la obesidad y resistencia a la insulina no se conoce. Por lo tanto, se investig el papel de TSP1 en la mediacin de la obesidad asociada a la inflamacin y resistencia a la insulina mediante el uso de ratones con TSP1 bloqueada. Metodologa / Principales conclusiones: ratones Macho tipo silvestres TSP1 -/- y controlados de la misma camada fueron alimentados con una dieta baja en grasas (LF) o un alto contenido de grasas (HF), dieta durante 16 semanas. A lo largo del estudio, el peso corporal y la masa grasa aument de forma similar entre los ratones TSP1-/- y los ratones tipo silvestres en condiciones de alimentacin de alta frecuencia, lo que sugiere que la deficiencia de TSP1 no afecta al desarrollo de la obesidad. Sin embargo, los ratones TSP1-/- obesos haban mejorado tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina en comparacin con los ratones de tipo salvaje obesos. La acumulacin de macrfagos y la expresin de citoquinas inflamatorias en el tejido adiposo se redujeron en ratones TSP1-/- obesos. En consonancia con la disminucin en los niveles locales de citoquinas pro-inflamatorias, la inflamacin sistmica se redujo tambin en los ratones TSP1-/- obesos. Adems, los datos in vitro demostraron que los macrfagos deficientes de TSP1 tenan disminucin de la movilidad y un fenotipo inflamatorio reducido. lConclusin: la deficiencia de TSP1 no afect el desarrollo de obesidad en la dieta alta en grasas inducida. Sin embargo, la deficiencia de TSP1 redujo la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo y protege contra la inflamacin relacionada con la obesidad y resistencia a la insulina. Nuestros datos demuestran que TSP1 puede desempear un papel importante en la regulacin de la funcin de los macrfagos y la mediacin de la obesidad inducida por la inflamacin y la resistencia a la insulina. Estos datos sugieren que TSP1 puede servir como un potencial teraputico encaminada a mejorar las complicaciones inflamatorias y metablicas de la obesidad.

Introduccin

La epidemia mundial de obesidad es un factor de riesgo para diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular. La obesidad es reconocida como un estado crnico leve de inflamacin sistmica, que promueve el desarrollo de resistencia a la insulina y otras complicaciones metablicas. La obesidad est asociada con la infiltracin de macrfagos en el tejido adiposo y la desregulacin de la produccin de adipocinas. Los macrfagos del tejido adiposo (ATM) son la principal fuente de produccin de citoquinas inflamatorias en el tejido adiposo y juegan un papel clave en la obesidad inducida crnica de bajo grado de inflamacin y resistencia a la insulina. Aunque ha habido algunos avances en el estudio de ATMs en condiciones de obesidad, los mecanismos subyacentes de reclutamiento de clulas inflamatorias y la activacin no se entienden completamente. Trombospondina 1 (TSP1) es un componente importante de los grnulos alfa de las plaquetas. TSP1 acta como un gen de respuesta inmediata temprana, mostrando una induccin rpida y transitoria de factores de crecimiento y el estrs en muchos tipos de clulas incluyendo los adipocitos y los macrfagos. TSP1 existe como un componente de la matriz extracelular y como una molcula soluble que se encuentra en los diversos fluidos corporales y en el medio de cultivo celular acondicionado. TSP1 es un homotrmero 420450 kDa con subunidades de aproximadamente 145 kDa. Las diversas actividades biolgicas de TSP1 han sido asignadas a reas especficas de la molcula por la interaccin con diferentes receptores de superficie celular. TSP1 es un importante regulador de la activacin latente de TGF-b, un conocido inhibidor de la angiognesis endgena, y un regulador de la proliferacin celular y la adhesin. TSP1 tambin juega un papel en la inflamacin y la obesidad. TSP1 se ha demostrado que se expresa en el tejido adiposo visceral de ratas y seres humanos. Su expresin es notablemente regulada durante la diferenciacin de los preadipocitos en adipocitos maduros. TSP1 aumenta reguladamente el desarrollo de tejido adiposo de los ratones con dieta o con obesidad inducida genticamente. En obesos, resistencia a la insulina en humanos, TSP1 fue reportado recientemente que aumentaba reguladamente y es asociada con la inflamacin adiposa y resistencia a la insulina. Sin embargo, en estudios en vivo, examinando el papel de TSP1 en la regulacin de funcin de los macrfagos y la obesidad asociada la inflamacin y la resistencia a la insulina son insuficientes. En el presente estudio, hemos utilizado TSP1 bloqueada y ratones de tipo silvestres para investigar el papel de TSP1 en dieta alta en grasas inducida por obesidad, la inflamacin y resistencia a la insulina. El uso de este paradigma de la obesidad inducida por dieta, hemos demostrado que la eliminacin TSP1 no tuvo ningn efecto sobre el desarrollo de la obesidad. Sin embargo, estos ratones deficientes obesos TSP1 haban mejorado la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina. Esto mejora la homeostasis de la glucosa-insulina se encontr que se asocia con que disminuy significativamente la acumulacin de macrfagos y la inflamacin en el tejido adiposo. Los estudios in vitro tambin apoyaron el efecto de TSP1 sobre la movilidad y la

funcin de los macrfagos. En conjunto, estos datos demuestran que TSP1 puede jugar un papel importante en la obesidad asociada a la resistencia a la insulina parcialmente a travs de la regulacin funcin de los macrfagos y la inflamacin. MATERIALES Y MTODOS

Declaracin de la tica Todos los experimentos con ratones se ajustaban al Instituto Nacional de la Salud Gua para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Universidad de Kentucky Instituto de Cuidado de Animales y Comisin de Uso. Este protocolo fue aprobado bajo el nmero de solicitud 00966M2005. Animales de experimentacin y los protocolos Ocho semanas de edad de sexo masculino ratones TSP1-/- (en C57BL6 / J de fondo, comprados a Laboratorio Jackson) y controlados de edad similar de la misma camada se utilizaron en el estudio. Los animales fueron alojados en una habitacin con temperatura controlada aun ciclo de 12 horas de luz / oscuridad. Los ratones fueron alimentados con una baja frecuencia (kcal 10% de grasa; D12450B; dietas de investigacin, Inc, Nueva Jersey) o una dieta alta frecuencia (60% kcal de grasa, D12492, la investigacin la dieta, Inc, New Jersey) durante 16 semanas. Cada grupo contiene 10-15 ratones. Mediciones metablicas La sangre fue recolectada de los animales despus de 6 horas de ayuno. Los niveles de glucosa en plasma fueron medidos usando un glucmetro. Colesterol plasmtico total y niveles de triglicridos se midieron utilizando los kits de productos qumicos Wako. La insulina plasmtica, la leptina, IL-6, MCP-1, TNF-a, PAI-1, la resistina y la adiponectina fueron medidas usando un ratn adipocina kit de ensayo (Millipore). Tolerancia a la glucosa y pruebas de sensibilidad a la insulina Despus de 15 semanas de baja y alta frecuencia de alimentacin, la tolerancia a la glucosa se analiz en los animales despus de 6 h de ayuno. Despus de una inyeccin intraperitoneal de glucosa (1 g / kg de peso corporal), las concentraciones de glucosa en sangre se midieron utilizando un glucmetro a los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos despus de la inyeccin. Para la evaluacin de sensibilidad a la insulina, la insulina (0,5 unit/ kg de peso corporal) (Novolin R, Novo Nordisk inc.) se inyect en ratones intraperitonealmente. Del mismo modo que los niveles de glucosa en la sangre a los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos despus de la inyeccin para evaluar el efecto de la insulina. Evaluaciones de la composicin corporal, la ingesta de alimentos y el gasto de energa

A las 15 semanas, los ratones fueron puestos en cmaras Lab Master TSE (sistemas TSE) de

forma individual durante 5 das para la medicin de la ingesta de alimentos, la ingesta de agua y la calorimetra indirecta. Por otra, Echo MRI (Sistema Medico de Eco) se utiliza para evaluar el contenido de grasa corporal y grasa en los ratones tras 16 semanas de baja o alta frecuencia de alimentacin.

PCR en tiempo real

El ARN total se aisl de tejido de grasa epididimal de ratones TSP1-/- y del tipo silvestres controlados usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsband, CA) y tratados con DNaseI (Roche, Indianapolis, IN). El ARN tratado fue limpiado usando RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA). Del ARN total de 2 mg fue utilizado para la sntesis de cDNA utilizando Kit alta capacidad de de cDNA transcripcin inversa (Invitrogen,Carlsband, CA). En tiempo real los anlisis de PCR se realizaron utilizando SYBR Green PCR kit Mix Master con un MyiQ en tiempo real termociclador de PCR trmico (Bio-Rad). Todas las reacciones se realizaron por triplicado en un volumen final de 25 ml. Las curvas de disociacin se llevaron a cabo para detectar la amplificacin inespecfica y se confirm que los productos solo fueron amplificados en cada reaccin. Las cantidades de cada gen de prueba y de control interno ARN 18S se determin a partir de la curva estndar usando el software del MyiQ System y los niveles de expresin de ARNm de los genes de la prueba fueron normalizando los niveles de ARN de18S. Las primeras secuencias se muestran en la Tabla 1.

La tincin inmunohistoqumica Tejido adiposo epididimal fue fijado y embebido en parafina. El tejido adiposo fijado con parafina fue cortado en secciones mm 4-5 y colocados sobre los portaobjetos. Las secciones fueron desparafinadas en xileno, y fueron rehidratadas en mezclas clasificadas de etanol/agua. Actividad perxidasa endgena fue bloqueada con 3%

H2O2 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se colocaron en tampn PBS que contena 5% de BSA durante 30 minutos. Un marcador de macrfagos de ratn F4/80 (AbD Serotec, Raleigh) se aplic durante 1 hora a temperatura ambiente. Un control negativo se incluy sustituyendo el control IgG para el anticuerpo primario. Despus del lavado con PBS, el anticuerpo secundario biotinilado se aplic durante 30 minutos. Despus de otro lavado de minutos 15, un complejo avidinabiotina-peroxidasa fue aplicado al portaobjetos durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavaron una vez ms con PBS antes de que el desarrollo del color con DAB con el sistema Vectastain ABC(Vector Lab). Macrfagos estudios de la funcin Los estudios utilizaron clulas derivadas de mdula sea. Las clulas derivadas de la mdula sea que se aislaron fueron de fmur y la tibia de ratones macho tipo silvestres y TSP1-/- como se describe anteriormente. Durante siete das, estas clulas se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 20% de SFB, 25 ng/ml M-CSF (Sigma) y penicilina/ estreptomicina para permitir la proliferacin y diferenciacin en macrfagos maduros. Los macrfagos se sembraron entonces y se trataron con o sin lipopolisacridos (LPS: 100 ng/ml) durante 3 horas. Despus del tratamiento, las clulas fueron cosechadas y la expresin de citocinas proinflamatorias fue determinada por PCR en tiempo real. La migracin de macrfagos y el ensayo de adhesin. Ratones (macho TSP1-/ -, CD36 - / , y el de ratones tipo salvajes controlados) fueron sacrificados y los macrfagos fueron cosechados por lavado de la cavidad peritoneal con PBS estril. Las clulas se lavaron una vez con suero libre de DMEM media, se contaron y se utiliza inmediatamente en una migracin o ensayo de adhesin celular. Para el ensayo de la migracin: los macrfagos peritoneales (1 x 106) de ratones machos de tipo salvaje o ratones TSP-/fueron cargados en las cmaras superiores, mientras que las inferiores estaban llenos de DMEM que contienen purificada TSP1 (5 mg / ml, de R & D system) o MCP1 (50 ng / ml). Placas Transwell fueron incubadas a 37 C durante 5 horas. Media fue retirado de la cmara alta, y las clulas en la cmara inferior se fijaron en metanol y se tien con solucin Giemsa (Dade Behring, Marburg, Alemania). Los recuentos de clulas se llevaron a cabo por dos observadores diferentes que desconocan el diseo del estudio. Para el ensayo de adherencia. Para evaluar la propagacin de clulas, los macrfagos se sembraron en cuatro cmaras, portaobjetos LABTEK (Nunc Nalge Internacional; Naperville, IL) sin recubrimiento o recubiertas con TSP1 purificada o fibronectina durante 6 horas. Las clulas fueron lavadas con PBS, fijadas con formaldehdo al 4% nominal, permeabilizadas con 0,1% Trixton X-100, y se bloquearon con BSA al 1% durante 30 minutos antes de la tincin con Alexa-Fluo 568-conjugada o FITC conjugado con faloidina (Molecular Probes, Eugene, OR). Los portaobjetos fueron montadas en ProLong anti-fade reagent (Molecular Probes). Imgenes al azar de al menos 25 clulas de tres o ms experimentos independientes fueron capturados digitalmente usando un Leica TCS SP microscopio confocal (Reino Unido Centro de Imagen).Las celdas individuales se describieron y el rea total de clulas se cuantific usando el software Metamorph.

El anlisis estadstico Los datos son el promedio SE. Las diferencias entre grupos se determinaron mediante ANOVA seguido de Turqua despus de las pruebas especiales o exmenes de los estudiantes, segn corresponda. El nivel de significancia fue de p < 0,05.

RESULTADOS

Deficiencia de TPS1 no afecta el desarrollo de la obesidad inducida por dieta

Para determinar si la deficiencia de TSP1 afecta al desarrollo de la obesidad, ratones machos TSP1-/- y de tipo salvaje controlados fueron alimentados con un bajo contenido de grasa (LF, 10% grasa) o alta en grasas (HF, 60% de grasa) dieta durante 16 semanas. El peso corporal se midi semanalmente. Anterior al final del estudio, la composicin corporal se analiz mediante EchoMRI. Los resultados mostraron que el peso corporal y la masa grasa fueron similares entre los ratones TSP1-/- y de tipo salvaje controlados bajo condiciones de alimentacin baja en grasas o alta en grasas (Figura 1). Adems, la alimentacin rica en grasas aument significativamente los niveles plasmticos de triglicridos en ratones del tipo salvaje y TSP1-/-. Sin embargo, los niveles plasmticos de triglicridos fueron menores en los ratones TSP1-/- alimentados con mucha grasa que en los ratones de tipo salvaje alimentados con mucha grasa (Tabla 2). El Nivel de colesterol total se increment de manera similar en ambos casos ratones de tipo salvaje y TSP1-/- alimentados con mucha grasa (Tabla 2).Tambin se midieron parmetros metablicos tales como la ingesta de alimentos, consumo de oxgeno y la actividad fsica, y no se observa una diferencia entre los ratones de tipo salvaje alimentados con mucha grasa y ratones TSP1 -/- alimentados con mucha grasa (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugieren que la deficiencia de TSP1 no afecta al desarrollo de la obesidad.

Figura 1. Deficiencia de TSP1 no tuvo ningn efecto sobre el desarrollo de la obesidad en una dieta alta en grasas inducida a un modelo de ratn obeso. Ratones Macho TSP1-/- y silvestres controlados de la misma camada tipo fueron alimentados con la dieta baja en grasas o alta en grasas durante 16 semanas. A): Los grficos que muestran el aumento de peso corporal a travs del tiempo en la alimentacin.

B): masa grasa y masa sin grasa de los diferentes grupos de animales. Los datos se representan como el promedio SE (n = 10 ratones / grupo).

Ratones TSP1-/- muestran una mayor tolerancia a la glucosa y el aumento de la sensibilidad de insulina en comparacin con los de tipo salvaje controlados en condiciones de alimentacin alta en grasas Estudios recientes sugieren que los niveles de tejido adiposo TSP1 se asoci inversamente con la sensibilidad a la insulina en sujetos obesos. Aunque nuestros datos indican que la deficiencia de TSP1 no afecta al desarrollo de la obesidad, no se sabe si la deficiencia de TSP1 afecta la obesidad asociada con la resistencia a la insulina. Por lo tanto, los niveles de glucosa en sangre en ayunas y los niveles de insulina fueron medidos. Prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) y determinacin de la sensibilidad a la insulina (ITT) se realizaron en ratones alimentados con niveles de baja grasa y de alta grasa. Los resultados mostraron que los niveles de glucosa sangunea se incrementaron de manera similar tanto en la alimentacin de alta en grasas ratones TSP1-/- y de tipo salvaje controlados. La alimentacin alta en grasas tambin aument los niveles de insulina en los dos genotipos. Sin embargo, la insulina se increment en un grado significativamente inferior en ratones TSP1-/- (Tabla 2). Adems, las pruebas de tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina demostr que los ratones TSP1-/- alimentados con alto contenido en grasas haban mejorado la tolerancia a la glucosa (Figura 2A) y prueba de sensibilidad a insulina (Figura 2B).

HF-fed TSP1-/- mice have decreased macrophage accumulation in adipose tissue and decreased inflammation Estudios recientes sugieren que los macrfagos en el tejido adiposo (ATMs) desempean un papel crtico en la obesidad asociada a inflamacin crnica y a insulino resistencia. Por lo tanto, determinamos el efecto de la deficiencia de TSP1 en la acumulacin de macrfagos en tejido adiposo mediante el uso de tcnicas de tincin inmunohistoqumica y de PCR en tiempo real. Como se muestra en la figura 3, una alimentacin alta en grasas incrementa significativamente la acumulacin de

macrfagos y de estructuras como la corona (CLS) en el tejido adiposo de los ratones salvajes (WT). Sin embargo la acumulacin de ATM (macrfagos en el tejido adiposo) se increment en menor medida en ratones HF-fed TSP1 -/-. (ratones TSP1 homocigticos recesivos con una dieta alta en grasas), situacin representada en la figura 4. Tambin observamos esta relacin en la expresin de CD11c (anticuerpo) en el tejido adiposo de dos genotipos. Nuevamente los ratones TSP1 -/- obesos tienen una baja significativa en los niveles de CD11c en el tejido adiposo al ser comparados a los ratones obesos de control de tipo salvaje (figura 4). El CD11c es un marcador perteneciente a un subconjunto de clulas inmunes proinflamatorias. Se ha mostrado que este marcador juega un rol importante en la resistencia a la insulina resistencia inducida por la obesidad. Otras citoquinas inflamatorias como iNOS, IL-6,TNF-alfa, PAI-1 y la TGF-beta tambin se redujeron en el tejido adiposo de ratones TSP1 -/- obesos. Adems, en ratones de tipo salvaje, los niveles de PAI-1 en el plasma se incrementaron significativamente y los niveles de IL-6 tuvieron una tendencia a incrementarse en ratones de tipo salvaje (WT) con una dieta alta en grasas en comparacin con ratones del mismo tipo salvaje pero alimentados a base de una dieta baja en grasas. Sin embargo, en ratones TSP1 -/-, ni los niveles de plasma ni los niveles de IL-6 cambiaron en ratones TSP1 alimentados con una dieta alta en grasas en comparacin con ratones TSP1 -/- alimentados con una dieta baja en grasas (figura 5). Junto a ellos, los datos indican que la obesidad en ratones TSP1 -/- tuvo una disminucin significativa en la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo y redujo los niveles de citoquinas inflamatorias sistmicas y locales. Los macrfagos de ratones TSP1 -/- tienen una reduccin en el fenotipo inflamatorio y en la habilidad migratoria. La obesidad est asociada con un incremento en la concentracin sistmica de cidos grasos y endotoxinas (lipopolisacrido) que permite la induccin de la respuesta inflamatoria. Para promover la determinacin del rol de TSP1 en la funcin de los macrfagos las clulas derivadas de la mdula sea fueron aisladas de ratones de tipo salvaje y de ratones TPS1. Estas clulas fueron diferenciadas en macrfagos y tratadas con lipopolisacridos por un periodo de 3 horas. La expresin de genes en citoquinas inflamatorias fueron determinadas por PCR real time. Aqu hubo una disminucin significativa en la expresin de genes de IL-6, TNF-alfa, MCP-1 y PAI-1 en macrfagos tratados con lipopolisacridos (LPS) desde ratones TPS1 -/- (Figura 6). Esto sugiere que los macrfagos de los ratones TPS1 tuvieron una reduccin del fenotipo inflamatorio. Tambin determinamos que el efecto de la TPS1 en la adhesin y la migracin de los macrfagos. Como se muestra en la figura en la figura 7A y B, la adicin de la TPS1 purificada tuvo un incremento significativo en la migracin y adhesin de clulas macrfagas. Los macrfagos de ratones TPS1 -/- mostraron una disminucin en las capacidades de migracin y adhesin comparadas con macrfagos provenientes de ratones de tipo salvaje (WT) (figura 7 C y D). El efecto de TPS1 en la migracin de macrfagos puede ser independiente de TPS1 dado que no se encontraron diferencias en los niveles de MCP-1 en el plasma ni en el tejido adiposo entre ratones de tipo salvaje (WT) y ratones TSP1 -/-. (figura 8). Adems, CD36, un receptor de TPS1 no podra estar involucrada en TPS1 mediando la migracin de macrfagos (Figura 9). Juntos, los datos sugieren que TPS1 es un importante regulador de la funcin macrfaga.

DISCUSIN TPS1 es una protena multifuncional dela matriz celular que est sobre regulada en la inflamacin del tejido adiposo de ratones y humanos obesos. Estudios previos sugieren que la TSP1 desempea un importante rol en la obesidad y en la insulino resistencia. En este estudio, examinamos el efecto de la deficiencia de TSP1 en el desarrollo de la obesidad y en la insulino resistencia en una dieta alta en grasas inducida en el modelo del ratn obeso. Utilizando estos principios, en primer lugar demostramos que la eliminacin de TPS1 reduce la inflamacin y mejora la sensibilidad a la insulina en estado de obesidad. La mejora del equilibrio insulinaglucosa esta asociada significativamente a un decrecimiento en la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo y un decrecimiento en la inflamacin de este tejido. Estudios in vitro apoyan aun mas el efecto de TSP1 en la movilidad y funcin de macrfagos. En conjunto, estos datos demostraron que la TSP1 es un regulador clave en la funcin de los macrfagos y en la influencia que estos tienen en el estado inflamatorio contribuyendo a la obesidad asociada a la insulino resistencia.

Figura 2. Ratones TSP1-/- Obesos haban mejorado tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina. Ratones Machos TSP1-/- y tipo silvestres controlados de la misma camada fueron alimentados con la dieta baja en grasas o alta en grasas durante 16 semanas. La Tolerancia a la glucosa por va intraperitoneal (A) y prueba de sensibilidad a la insulina (B) se midieron. Los cambios en los niveles de glucosa en la sangre fueron monitoreados en el tiempo. Los datos se representan como el promedio SE (n = 10 ratones / grupo). * P <0,05 vs grupo WT HF. AUC: rea bajo la curva.

Figura 3. Ratones TSP1-/- obesos han disminuido la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo. Imgenes representativas del tejido epididimal adiposo de cuatro grupos de ratones se tieron con anticuerpos antiF4/80 para identificar la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo. La punta de la flecha azul indica la estructura como corona. Las tinciones positivas mostraron color marrn. La barra de escala representa 100 mm.

Nuestro actual estudio demuestra que la TSP1 no afecta el desarrollo de la obesidad inducida por una dieta alta en grasas, adems basados en este estudio encontramos que ratones con deficiencia de TSP1 tienen mejoras significativas en cuanto a la tolerancia a la glucosa y a la sensibilidad a la insulina en comparacin a los ratones de control obesos de tipo salvaje (WT: WILD TYPE). Esta discrepancia puede ser debida a varios factores como la duracin de la alimentacin, la edad del ratn, composicin de

una dieta rica en grasas y a los mtodos de medida de la tolerancia a la glucosa y a la medida de la sensibilidad de la insulina. En nuestro estudio, alimentamos por ocho semanas a una camada de ratones machos deficientes en TSP1 y a otra camada de ratones salvajes (WT) con una dieta baja en grasas y luego con una dieta alta en grasas por un periodo de 16 semanas; mientras que Voros et al alimento por cinco semanas a ratones machos deficientes en TSP1 o a ratones salvajes con una dieta alta en grasas por 15 semanas. Adems, realizamos pruebas de tolerancia a la glucosa y de sensibilidad a la insulina en animales despus de 6 horas de ayuno mediante una inyeccin intraperitoneal de glucosa (1mg/g de peso del cuerpo) o insulina (0,5 unidades/kilogramo de peso del cuerpo). Un informe reciente de Andrikopoulos indic que diferentes periodos de ayuno variaciones de concentraciones en inyecciones de glucosa pueden afectar drsticamente las pruebas de tolerancia a la glucosa en los ratones. Adems, demostraron que las concentraciones de glucosa en la sangre despus de 6 horas de ayuno son la mejor representacin de los niveles de glucosa en la sangre a lo largo del da. Por lo tanto, la variacin y/o variacin de glucosa pueden explicar la diferencia entre nuestro estudio y el estudio de Voros.

Figura 4. La obesidad inducida por la inflamacin se redujo en el tejido adiposo de ratones TSP1 -/-. La expresin relativa de mRNA de los macrfagos y los marcadores de inflamacin en el tejido epididimal adiposo de ratones WT o TSP1-/ - alimentados con una dieta LF o HF fue determinada por PCR en tiempo real. Los datos se representan como el promedio SE (n = 3 ratones / grupo). * P <0,05 vs WT grupo HF. ** P <0,01 vs grupo WT HF

Figura 5. La obesidad inducida por la inflamacin sistmica se redujo en ratones TSP1-/ -. Se midieron los niveles de IL-6, TNF-a, y el PAI-1 Plasmticas como se describe en Materiales y Mtodos. Los datos se representan como la media SE (n = 6 ratones / grupo). * P <0,05 vs grupo WT HF.

Figura 6. Los macrfagos de TSP1 / - ratones tenan un fenotipo inflamatorio reducido. Derivados de mdula sea Los macrfagos (BMDM) de ratones WT o TSP1-/- fueron tratados con o sin LPS (100 ng / ml) durante 3 horas. Despus del tratamiento, las clulas fueron cosechadas y la expresin gnica relativa de citoquinas inflamatorias, fue determinada por PCR en tiempo real. Los datos se representan como la media SE (n = 3 ensayos). * P <0,05 v/s grupo WT LPS.

Figura 7. Efecto de la TSP1 en la migracin de macrfagos y adherencia. Los macrfagos peritoneales fueron aislados para ratones WT o TSP1-/- tal como se describe en Materiales y Mtodos. (A). La habilidad de los macrfagos WT a migrar hacia TSP1 purificada (5 mg / ml) o MCP-1 (50 ng / ml) usando una cmara de Microquimiotaxis Boyden modificada. (B). La habilidad de los macrfagos WT para difundir en portaobjetos LABTEK recubiertas con TSP1 purificada (5 mg / ml) se determin como se describe en Materiales y Mtodos. El rea de la superficie celular fue cuantificada. (C). La migracin de WT o TSP1-/ - macrfagos hacia la MCP1 (50 ng / ml) fue determinada. (D). Difusin de WT o los TSP1-/- macrfagos sobre portaobjetos recubiertos de fibronectina se determin y el rea de la superficie celular se cuantific. La grfica muestra el promedio SE de tres experimentos independientes. * p, 0.05.

Figura 8: Niveles de MCP-1 en plasma y en tejido adiposo a partir de cuatro grupos de ratones. (A). Niveles de MCP-1 medidos usando un ratn adipokine assay kit (from millipore); (B). Niveles de RNA mensajero del MCP-1 en tejido adiposo proveniente de cuatro grupos de ratones determinados en tiempo real a partir de PCR.

Una importante conclusin de nuestro estudio es que ratones con obesidad deficientes en TSP1 tiene importantes mejoras en cuanto a la tolerancia a la glucosa y a la sensibilidad a la insulina. Otra cosa importante son las mejoras en el equilibrio glucosainsulina observadas en ratones obesos con deficiencia en TSP1 aunque estos ratones exhibieron niveles similares de obesidad en comparacin a los ratones salvajes (ratones de control). Adems nuestros resultados sugieren que las mejoras en los perfiles metablicos de ratones deficientes en TSP1 son parciales debido al efecto de inflamacin generado por la supresin del gen TSP1. Encontramos tambin que la inflamacin del tejido adiposo y del tejido sistmico es reducida significativamente en ratones obesos deficientes de TSP1 en comparacin con los ratones salvajes de control. Esto est asociado con un decrecimiento en la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo. Estudios en ratones y en humanos sugieren que los macrfagos del tejido adiposo desempean un papel crtico en la obesidad asociada a una inflamacin crnica y a la insulino resistencia. Otros estudios encontraron que la obesidad est asociada fuertemente con la acumulacin de macrfagos proinflamatorios (clulas F4/80+) que expresan clulas CD11 (un marcador celular dendrtico) en tejido adiposo. Estas clulas, F4/80+ y CD11+ estn en la mdula sea derivadas de macrfagos del tejido adiposo y localizan selectivamente a la corona como la estructura alrededor de los adipocitos muertos. Estas clulas cumplen un rol muy importante en cuanto a la obesidad asociada a perfiles metablicos. Nuestros datos sugieren una importante funcin de TSP1 en la infiltracin de macrfagos e inflamacin cuando se regula la clula CD11+. Esto est basado en las siguientes observaciones: 1) Resultados inmunohistoqumicos que mostraron la frecuencia con la que la corona y los macrfagos F4/80 se redujeron drsticamente en el tejido adiposo de ratones obesos con deficiencia de TSP1. 2) La expresin de genes para F4/80 y para clulas CDC11+ se redujeron significativamente en tejido adiposo en ratones obesos con deficiencia de TSP1.

3) Los niveles de RNA mensajero de citoquinas proinflamatorias tales como IL-6, TNF-alfa y PAI -1 disminuyeron considerablemente en el tejido adiposo de ratones obesos con deficiencia de TSP1. 4) Los macrfagos de TSP1 derivados de la mdula sea en ratones exhibieron una reduccin en el fenotipo inflamatorio. Adems, nuestros datos in vitro demuestran que la TSP1 estimula la migracin y la adhesin de macrfagos. Este resultado es acorde con estudios previos que mostraron que la TSP1 puede actuar como un monocito quimio atrayente. Estudios previos han demostrado que la TSP1 no estimula la liberacin de MCP-1 que proviene de las clulas monocticas U397 humanas diferenciadas. Como sea, ellos encontraron que los niveles de PAI-1 en monocitos o macrfagos aumentaron significativamente por la TSP1, sugiriendo que el efecto de la TSP1 en la migracin de los macrfagos poda ser independiente de MCP-1 pero dependiente de PAI-1. Continuamente, no encontramos diferencias en los niveles de MCP-1 tanto plasma como en tejido adiposo entre ratones WT y ratones TSP1. Al usar CD36 por deficiencia de macrfagos, demostramos que este receptor de TSP1 no est involucrado en la migracin de macrfagos. Adems de la regulacin de la migracin macrofgica, otro estudio demostr que las TSP1 deficientes en macrfagos demuestran un incremento en la capacidad de fagocitosis mediada por FccR. Por lo tanto, en un estado de obesidad es posible que TSP1 deficientes en macrfagos podran limpiar rpidamente adipocitos muertos contribuyendo a disminuir la inflamacin. Tambin la TSP1 puede tener influencia en otra clula de inmunidad, tal como la clula T, contribuyendo a la obesidad induciendo la inflamacin del tejido adiposo.

Figura 9: Efecto de TSP1 en la migracin y adhesin de macrfagos de ratones WT y de ratones con marcador CD36. Macrfagos peritoneales fueron aislados de ratones WT y de ratones con CD36. (A) Capacidad de los macrfagos para migrar hacia TSP1 depurados (5 microgramos/ml) y (B). Capacidad de los macrfagos para propagarse con TPS1 depurado.

En resumen, los resultados de este estudio demostraron una importante rol de TSP1 en la regulacin de la funcin del macrfago y en la obesidad inductora de inflamacin y de insulino resistencia. El agotamiento de la TSP1 bajo un estado de obesidad previene la acumulacin de macrfagos en el tejido adiposo y la expresin de citoquinas proinflamatorias en tejidos perifricos, dando como resultado una mejora en la sensibilidad a la insulina. Un efecto directo de la TSP1 en la motilidad y funcin del macrfago fue tambin demostrada en nuestros estudios actuales. Los resultados de este estudio junto con el reporte de un incremento de TSP1 en humanos obesos sugieren que esta TSP1 puede ser un potencial blanco de complicaciones inflamatorias y metablicas.