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Metabolismo do Nitrogenio

Metabolismo do Nitrog nio

Introduo A medida que crescem, as plantas aumentam em biomassa e energia. O carbono a energia so obtidos a partir da fotossntese, enquanto que os nutrientes minerais so absorvidos a partir da soluo do solo. Os nutrientes minerais acumulam-se nos diferentes compartimentos celulares podendo atuar como reguladores do metabolismo. Podem ainda ser armazenados at o momento de serem incorporados ao metabolismo celular, quando potencialmente podem vir a integrar cerca de 105 tipos de molculas orgnicas O nitrognio representa o elemento mineral exigido em maiores quantidades, sendo a sua disponibilidade freq entemente limitante ao crescimento de plantas cultivadas e nativas. Este elemento faz parte da estrutura de um grande nmero de molculas importantes para as clulas. Exemplos importantes so os aminocidos, as protenas estruturais e enzimticas, cidos nuclicos (DNA, RNA) e clorofilas. O prprio processo fotossinttico significativamente afetado pela deficincia de N uma vez que o seu funcionamento depende de protenas como a Rubisco, protenas dos fotossistemas complexos antenas e de grande quantidade de clorofilas.

O ciclo do Nitrog nio A maior parte do Nitrognio existente na biosfera no encontra-se diretamente acessvel s plantas. O nitrognio molecular (N2), apesar de ser o gs mais abundante da atmosfera (78%), no pode ser utilizado pelas plantas para a construo de suas biomolculas por ser uma molcula estvel e pouco reativa. Por outro lado, os compostos nitrogenados existentes na natureza sofrem interconverses formando o ciclo do nitrognio (Figura1). As principais fontes de N do solo so: os materiais de origem vegetal e animal (matria orgnica), fertilizantes industriais, sais de amnio e nitrato trazidos da atmosfera pelas chuvas e a fixao biolgica de N2. A disponibilidade de microorganismos, principalmente fungos e bactrias. A seq ncia de transformaes entre compostos nitrogenados no solo, a partir da matria orgnica, pode ser visualizada na figura 2. O processo de transformao de N orgnico em nitrato chamado de mineralizao, sendo integrado pelos processos de amonificao (1) e nitrificao(3 e 4). A imobilizao (2) representada pela utilizao de N mineral disponvel durante o metabolismo microbiano, ocorrendo simultaneamente mineralizao. A desnitrificao (5 e 6) resulta da respirao anaerbia de alguns microorganismos conduzidos a perdas gasosas na forma de xidos de nitrognio e N2. A amnia (NH3), liberada da matria orgnica pela ao de bactrias heterotrficas do solo, pode ser prontamente transformada em NH4+ (NH3 + H2O NH4+ + OH-). As bactrias nitrificantes so capazes de retirar a energia necessria ao seu crescimento da oxidao do NH4+ e do NO2-. Sob boas condies de aerao, o NH4+ rapidamente oxidado pelas bactrias nitrificadoras, de ampla distribuio (gneros Nitrosomonas e Nitrobacter), o que torna o NO3- a forma de N dominante no solo. O NH4+, por outro lado, acumula-se em solos alagados, pouco aerados, em solos com alto contedo de Al+3 e pH baixo (<5) devido inibio do processo microbiano de nitrificao. OU seja, quando as taxas de nitrificao so lentas, o NH4+ tende a ser a fonte de N mais abundante. Em alguns hbitat, como solos da tundra rtica, o processo global de mineralizao pode ser fortemente inibido, fazendo com que os aminocidos tronem-se as principais fontes de N para as plantas. Em solos cultivados, as concentraes de NO3- podem variar entre 0,5 e 10mM, enquanto que as concentraes de NH4+, freq entemente so 10 a 1000 vezes menores, atingido a faixa de milimolar apenas excepcionalmente, aps a adio de fertilizantes amoniacais. Assim, a forma de
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N disponvel para as plantas dependentes dos fatores ambientais que controlam a atividade dos diferentes grupos de bactrias do solo. A fixao biolgica de N2, realizada exclusivamente por organismos procariontes de vida livre ou associados com fungos e plantas, tambm representa uma fonte de nitrognio importante para os vegetais, principalmente nos solos pobres em nitrognio. Apesar da relevncia da fixao biolgica de N2, em escala global, estima-se que a assimilao de nitrato produza uma quantidade de Norgnico aproximadamente 100 vezes maior do que a fixao biolgica (15 trilh es de toneladas por ano).

Absoro do Nitrog nio

A absoro de NH4+ geralmente mais rpida que a absoro de NO3-, numa ampla faixa de condi es ambientais. AS taxas de Absoro de NH4+ e de NO3-, so afetadas pelo pH. Enquanto a absoro de NH4+ normalmente favorecida pela elevao do pH, a absoro de NO3- favorecida pelo aumento da acidez do meio. No solo a mobilidade destes dois ons muito diferente. Os ons NH4+ movimentam-se apenas por difuso, podendo ficar ligados s argilas do solo, negativamente carregadas. J os ons NO3- apresentam grande mobilidade na soluo do solo, sendo transportados por difuso e por fluxo de massa. talvez isto explique a expresso preferencial dos genes para carreadores de alta afinidade para o NH4+ e de carreadores de baixa afinidade para o NO3- em plos radiculares de tomateiros. Estes carreadores seriam do tipo constitutivo. A absoro de NO3- e NH4+ tambm medida por carreadores induzidos pela concentrao externa do substrato. Carreadores de alta afinidade para o NO3- no se expressam na ausncia do on, sendo induzidos pela presena de NO3-. A absoro de NO3- um processo ativo que ocorre contra um potencial eletroqumico, depende de carreadores que funcionam em simporte com H+ numa proporo estequiomtrica de duas ou mais molculas de H+ por molcula de NO3- absorvida. O influxo de NO3- encontra-se, assim, energeticamente acoplado ao gradiente de pH existente atravs da plasmalema. As diferenas de potencial eltrico e de pH que se estabelecem atravs da plasmalema e do tonoplasto das clulas vegetais so continuamente geradas por ATPases das membranas que operam como bombas de prtons (H+-ATPases). Outra caracterstica importante da absoro de NO3- o seu controle rigoroso pelo estado energtico (disponibilidade de fotoassimilados) e nutricional das plantas. Plantas deficientes em N absorvem NO3- mais rapidamente do que plantas bem supridas com nitrognio. Isto indica, que demanda de N pela planta tambm controla as suas taxas de absoro. Associa es com micorrizas podem ser importantes para a absoro de nutrientes pelas plantas. Em condi es naturais a infeo micorrzica essencial para o sucesso da germinao de desenvolvimento de muitas espcies de orqudeas. Alexander & Hadley (1984) verificaram que na orqudea Good era repens, crescida em associao com a micorriza endfita Rhi octonia good erae-repentis, as concentra es endgenas de P e N eram superiores s das plantas no infectadas. Os fungos micorrzicos no s aumentam a absoro de nutrientes como tambm estimulam o crescimento das plantas.

Que forma de N as plantas usam preferencialmente? De modo geral, as plantas so capazes de utilizar diversas formas de N. A utilizao depende da fonte de N disponvel. Entretanto, diferentes espcies ou at mesmo gentipos de uma espcie podem apresentar preferncias por NO3- ou NH4+ ou mesmo N-orgnico, dependendo das press es seletivas e adapta es fisiolgicas desenvolvidas em seus ecossistemas naturais. O arroz um exemplo de planta cultivada que utiliza preferencialmente NH4+ por ser adaptada a solos alagados
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(anaerbios). No outro extremo, encontram-se as espcies denominadas "nitroflicas" que acumulam grandes quantidades de NO3- em vacolos. Nestas espcies, alm de ser fonte de N, o NO3- desempenha um importante papel na osmorregulao. A acumulao de NO3- comum em certas famlias como por exemplo C cife ae, Chenopodiaceae, Compo i ae, G amineae e Solanaceae.

Assimilao do NO3

O processo de incorporao do nitrognio proveniente do NO3- em molculas orgnicas conhecido como assimilao . A assimilao do N s pode ocorrer quando o elemento encontra-se reduzido na forma de NH4+ (estado redox -3). Consequentemente, o nitrognio oxidado presente no NO3- (+5) precisa ser reduzido a NH4+ (-3) no interior das clulas vegetais antes de ser incorporado em molculas orgnicas. A assimilao de NO3- ocorre em bactrias, fungos, algas e em todas as plantas clorofiladas. Nas razes, o NO3- transportado para dentro das clulas epidrmicas e do crtex pode ter quatro destinos : sofrer efluxo para o apoplasto ou para o ambiente; entrar no vacolo e ser armazenado; ser reduzido a NH4+ pela ao seq encial das enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR); ser translocado via simplasto para o xilema da raiz atingindo a parte area das plantas. Neste caso, a reduo do NO3- se d nas folhas (Figura 3). A destinao do NO3- depende da espcie de planta, do estgio do desenvolvimento, do contedo de carboidratos, da adaptao ecolgica da planta e da concentrao externa de NO3-.

A reduo do NO3- um processo que ocorre em suas etapas. Na primeira delas, catalisada pela nitrato redutase (NR), o NO3- reduzido a NO2- com o consumo de eltrons. A fonte de poder redutor para a NR pode ser o NADH ou NAD(P)H, dependendo da isoenzima. Na seq ncia 2 , nitrito redutase (NiR) catalisa a reduo NO2- a NH4+ com um gasto de 6 eltrons fornecidos pela ferredoxina.

1) NO3- + 2H+ + 2 2) NO2- + 8H+ + 6

NO2- + H2O (Enzima NR) NH4+ + 2H2O (Enzima NiR)

A NR uma enzima citoplasmtica enquanto que a NiR localiza-se nos cloroplastos de tecidos clorofilados e nos plastdios de tecidos aclorofilados. A reduo de NO3- em clulas fotossintticas pode ser considerada um processo genuinamente fotossinttico por consumir poder redutor diretamente do fluxo fotoqumico de eltrons, atravs de ferredoxina. Em tecidos fotossintticos no escuro ou aclorofilados como as razes, o poder redutor necessrio para a reduo do NO3- e do NO2- gerado pela oxidao de carboidratos na via glicoltica e na respirao aerbia. Uma das caractersticas mais interessantes da assimilao do NO3- a sua regulao. Alm do prprio NO3- , outros fatores como luz, citocianinas, nveis de CO2 , ritmo circadiano, compostos de
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carbono e nitrogenados como a sacarose e a glutamina desempenham um papel regulador. O NO3representa um sinal primrio na induo da expresso dos genes de seus carreadores especficos na plasmalema, da NR e NiR.

A Nitrato Redutase A NR uma enzima complexa formada pela associao de duas subunidades idnticas. Cada subunidade contm 3 grupos protticos redox: - FAD, heme (citocromo b) e um cofator de molibdnio - que nesta ordem transferem cataliticamente dois eltrons do NAD(P)H para o nitrato (Figura4). A expresso da NR podes ser regulada na transcrio, ps-transcrio e ps-traduo por sinais externos e endgenos que atuam ajustando a atividade da enzima a variaes ambientais e metablicas. Do ponto de vista fisiolgico, esta regulao fundamental para evitar desperdcio de poder redutor, esqueletos de carbono ou o acmulo de nveis txicos de NO2- ou NH4+ . O NO3desencadeia a expresso do gene da NR, mas a luz modula a quantidade de RNAm transcrita. Quanto maior a intensidade luminosa, maior a expresso quantitativa dos genes que codificam a NR e NiR em tecidos foliares. O processo de regulao ps-traduo envolve a fosforilao da NR que um mecanismo rpido e reversvel. A atividade da NR rapidamente reduzida 3 a 10 vezes quando as plantas so transferidas da luz para o escuro ou para ambientes com baixa concentrao de CO2 . Ao serem retornadas para a luz ou para nveis normais de CO2 a atividade da NR restaurada. Estudos bioqumicos sugerem que a ativao da NR pela luz envolve a desfosforilao atravs da ao de fosfatases. A ativao e desativao atravs da fosforilao parecem envolver, alm das fosfatases, a atividade de quimases e tambm a participao de uma protena inibidora, ocorrendo em intervalos de tempo compreendidos entre 2 a 15 minutos. Vrias enzimas do metabolismo do carbono e do nitrognio so controladas atravs de fosforilao reversvel, processo que por sua vez envolve a regulao de quinases e fosfatases. O controle neste nvel parece ser fundamental para o balano global de C/N na planta e nas interaes fonte/dreno.

Assimila o de NH4 + O NH4+ , gerado pela reduo do NO3- absorvido diretamente pelas razes ou gerado endogenamente por diversas reaes metablicas, no pode ser acumulado nos tecidos. O NH4+ txico para as clulas vegetais por atuar como desacoplador entre o fluxo de eltrons e a fosforilao oxidativa ou fotofosforilao. Logo aps ser formado ou absorvido, o NH4+ imediatamente incorporado em esqueletos de carbono, gerando os aminocidos glutamina e glutamato, atravs de duas reaes seq nciais e interdependentes [equaes (3) e (4)]. Estas duas reaes so catalisadas pelas enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase (GOGAT, glutamina 2-oxoglutarato aminotransferase), respectivamente. Deve-se observar que a formao de uma molcula de glutamina exige o gasto de 1 ATP e a de glutamato requer poder redutor na forma de NADH ou derredoxina, dependendo da isoenzima. Estes dois aminocidos atuam como importantes doadores de N para numerosas reaes celulares incluindo a biossntese de aspartato e asparagina. 3) glutamato + NH4+ + ATP glutamina + ADP +Pi (En ima GS) 2 glutamatos (En ima GOGAT)

4) gluamina + oxoglutarato + NADH ou ferredoxina redu ida

As enzimas GS/GOGAT desempenham um papel fundamental no metabolismo das plantas, pois

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alm de representarem a principal via de entrada de nitrognio orgnico novo, proveniente do ambiente (assimilao primria), tambm perticipam da reciclagem do NH4+ gerado em diversos processos metablicos tais como a fotorrespirao, o "turnoyer" de protenas, o catabolismo de aminocidos carreadores de N, reaes de biossntese envolvendo amino scidos e a biossintese de lignina - converso de fenilalanina em cianamato catalisada pela enzima fenilalanina amnia liase. A molculas de nitrognio incorporadas glutamina e ao glutamato no ciclo GS/GOGAT so inicialmente distribudas atravs do metaboolismo por reaes de transaminao, formando novos aminocidos. Normalmente reaes de transamina o ocorrem entre um ceto-cido e um aminocido, sendo catalisadas por enzimas genricamente denominadas aminotransferases. Todas as aminotransferases necessitam de piridoxal fosfato (vitamina B1) como grupo prosttico, razo pela qual a esta vitamina essencial para a vida. Um exemplo importante de transaminao ocorre entreo glutamato e o oxaloacetato, produzindo -cetoglutarato (ou oxoglutarato) e aspartato, numa reao catalisada pela aspartato aminotransferase (5). Os grupamentos amida da glutamina e amina do glutamato so intensamente transferidos para o cido oxaloactico formando o aminocido aspartato (5) ou para o prprio aspartato formando asparagina, reao catalisada pela asparagina sintetase (6). 5) glutamato + o aloacetato 6) aspartato + glutamina 2-o oglutarato + aspartato (aspartato aminotransferase) glutamato + asparagina (asparagina sintetase)

Antes das descobertas das enzimas GS/GOGAT acreditava-se que a enzima glutamato desidrogenasa (GDH) era aprincipal responsvel pela incorporao do NH3 em molculas orgnicas (7). A enzima glutamato desidrogenase catalisa aminao do oxoglutarato a gutamato (NADHGDH) e a desaminao do glutamato a oxo glutarato. Entretanto, o elevado Km desta enzima em relao ao NH3 (baixa afinidade) conduziu hiptese de que esta enzima teria apenas um papel secundrio na assimilao do NH3 . A GDH seria importante na assimilao de NH3 apenas em situaes de emergncia, caracterizadas por elevadas concentraes de NH3 nos tecidos vegetais. 7) 2-o oglutarato + NH3 + NADH glutamato + NAD + H2O (glutamato desidrogenase)

A GDH est presente em quase todos os organismos vivos, tendo sido detectada em todos os tecidos de plantas superiores examinados. A distribuio generalizada desta enzima e a atividade relativamente elevada encontrada em alguns tecidos, principamente nas razes e rgos em senescncia sugerem um papel especfico para a GDH nos tecidos begetais. Acredita-se que a GDH tenha um apepel duplo: a GDH-NADH (aminativa) atuaria na presena de altas concentraes de NH + de origem endgena e exgena enquanto que e aGDH-NAD+ (desaminao oxidatica)
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funcionaria fornecendo energia e esqueletos de carbono. Evidncias experimentais sugerem que a GS e a GDH apresentam uma regulao inversa. A luz exrce um efeito positivo sobre a expresso dos genes que codificam as enzimas da assimilao de NH4+ (GS2 e Fd-GOGAT) e negativo sobe os genes que codificam a GDH e a AS. Glutamina, glutamato, asparagina e aspartato servem como importantes carreadores de N, tendo um papel fundamental na exportao e distribuio de nitrognio nas plantas. Estes aminocidos so tambm precursores no s das principais famlias de aminocidos proticos, como tambm de outros compostos nitrogenados fundamentais como a clorofila, os cidos nuclicos e as poliaminas. Juntamente com a GS/GOGAT, as enzimas glutamato desidrogenase (GDH), asparato aminotransferase (AspAT) e asparagina sintetase (AS) so responsveis pela sntese destes aminocidos (figura 5). Estes quatro aminocidos podem corresponder a 60-64% do contedo total de aminocidos li res exidtentes nas folhas de Arabidopsis . Estudos bioqumicos e moleculares tm revelado a existncia de mltiplas isoenzimas para cada uma das enzimas envolvidas na assimilao e distribuio de N. Anlises moleculares evidenciaram que cada uma destas enzimas codificada por uma famlia gnica na qual cada
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membro codifica uma iso enzima distinta. Cada isoenzima regulada de modo diferenciado por estmulos ambientais, metablicos, do desenvolvimento e pela especificidade do tipo de clula ou tecido. Um nmero crescente de trabalhos vm demonstrand que a disponibilidade de carbono celular exerce efeito regulador sobre os genes da assimilao de N. Este fenmeno reflexo da estreita inter-relao entre os metabolismos de carbono e de nitrognio nas plantas. Segundo Hupe & Turpin (1994), at 55% do carbono das plantas pode estar comprometido com o metabolismo e assimilao de N em alguns tecidos. A sacarose, por exemplo, pode substituir o efeito da luz no controole da expresso dos genes da NR, NiR, GS2 , Fd-GOGAT, GDH e AS. Os genes que codificam as enzimas NR, NiR, GS2 , Fd-GOGAT so normalmente estimulados pela luz, enuanto que os genes responsveis pela GDH e AS so inibidos pela luz. A sacarose atua do mesmo modo no controle da expresso destes genes De modo mais amplo, os genes regulados por acares possibilitam no s a interao entre as respostas celulares e o transporte de carboidratos (veiculando informaes sobre a disponibilidade de carboidratos na planta como um todo), como tambm coordename a utilizao e alocao de recursos nas clulas. O genes regulados por carboidratos tambm contribuem para a otimizao do investimento de C, N e P entre diferentes processos e partes da planta.

Interao entre o metabolismo do carbono e do nitrog nio Conforme j mencionamos anteriormente, as vias metablicas do carbono e do nitrognio esto interligadas de vrias maneiras. Ambas as vias utilizam a energia, os esqueletos de carbono e o poder redutor disponveis no metabolismo celular. Estudos recentes tm demonstrado que o metabolismo do carbono e do nitrognio so modulados de forma paralela e coordenada nas plantas superiores. Fatores ambientais tais como a disponibilidade de luz e CO2 assim como o estado nutricional tm um impacto profundo sobre o suprimento de energia, esqueletos de carbono e outros substratos que suportam a assimilao de carbono e de nitrognio.

Dinmica do Nitrog nio ao longo do desenvolvimento da planta Nas sementes germinando, o desenvolvimento do embrio suprido pelo catabolismo das substncias de reserva. Nos tecidos de reserva, as protenas so hidrolisadas por proteases e pepteases gerando aminocidos e amidas que so transportados at o eixo embrionrio. Tais substncias sero a base de construo das protenas do embrio em desenvolvimento. medida que a plntula desenvolve-se, atinge a autotrofia de carbono e passa a absorver NO3- e NH4+ atravs do sistema radicular em expanso. Durante a fase de crescimento vegetativo mais intensa, grande parte das molculas orgnicas nitrogenadas incorporada estrutura e ao metabolismo da planta. Os cloroplastos contm cerca de 75% do nitrognio foliar; metade da protena foliar encontra-se nos cloroplastos, principalmente como parte da Rubisco. Quando inicia-se a fase reprodutiva, grande parte do nitrognio integrante dos tecidos vegetativos transferido para os frutos em desnvolvimento, num processo denominado de remobilizao. Em muitas plantas, a sustentao dos frutos depende da degradao e senescncia da partes vegetativas. Molculas como a Rubisco e clorofilas passam a ser hidrolisadas e transportadas, na forma de glutamina, asparagina, glutamato e aspartato, para os tecidos reprodutivos. A formao dos frutos depender da remobilizao de N-orgnico da planta e da assimilao corrente da NO3ou NH4+ (figura 6). No caso de plantas associadas organismos fixadores de N2, como as leguminosas noduladas, uima parter do N-orgnico suprimida pela fixao de N2 em curso (Figura 7).

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Sntese das principais rea es de assimilao de N nas plantas: Enzima Nitrato Redutase (NR) Nitrito Redutase (NiR) Glutamina Sintetase (GS) Glutamato Sintetase (GOGAT) Glutamato Desidrogenase (GDH) Asparagina Sintetase (AS) Rea o NO3NO2NO2NH4+ glutamina 2 Redutor NADH / NADPH Ferredoxina reduzida Ferredoxina reduzida NADH/NADPH Fonte de energia ATP

Glutamato + NH4+

a-cetoglutarato + glutamina glutamatos a-cetoglutarato + NH4+ glutamato Gluamina + aspartato

NADH

asparagina

ATP

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