As como actualmente se produce la insulina recombinante, es posible producir a escala masiva y con mtodos biotecnolgicos distintas hormonas.

Una de estas hormonas, muy importante para el tratamiento de diversas patologas asociadas con el desarrollo, es la Hormona del Crecimiento Humana, HGH (Human Growth Hormone). En el siguiente ejercicio tienes que clonar el gen de dicha hormona en un plsmido y seleccionar las colonias de bacterias que la expresan. Abajo se muestra el mapa de un plsmido comercial que permite seleccionar molculas recombinantes mediante el sistema de alfa complementacin. En el mapa se sealan diferentes zonas importantes, tales como el sitio de Origen de replicacin (ori), el gen LacZ y su promotor (promLacZ), el gen de resistencia a ampicilina (ApR) y los sitios mltiples de clonacin (MCS, multiple cloning sites). Como se indica, el tamao del plsmido es de 2,686 pb, las cuales se empiezan a contar a partir del final del ori en contra de las agujas del reloj. Los nmeros indican la posicin de los distintos sitios de restriccin en el plsmido (por ejemplo, el sitio BamHI se encuentra a 2500 pb y EcoRI a 460 pb). A partir de una biblioteca de cDNA, aislaste el fragmento que contiene el gen de la HGH. Abajo se encuentra el mapa de dicho fragmento, la seccin en amarillo indica donde se encuentra el gen, adems se muestran entre parntesis las posiciones de los distintos sitios de corte para diferentes enzimas de restriccin.

Con base en lo anterior: a) Indica que enzima(s) de restriccin elegiras para clonar el gen de la HGH en el plsmido pUC19 en la orientacin correcta y explica brevemente por qu.

Enzimas de restriccin: Sma I y Pst I Eligiria estas ya que solo cortan la region codificante removiendo aminocidos innecesarios. Ademas se encuentran en la regin de polilinker del vector. b) Dibuja un esquema en donde muestres el proceso de corte y ligacin del gen con el plsmido de acuerdo a los sitios de corte de la(s) enzima(s) que elegiste, e indica las bases que reconoce(n) dicha(s) enzima(s) para hacer la digestin.

El siguiente paso consiste en transformar una cepa adecuada con el vector de clonacin y seleccionar aquellas en las que se haya clonado el inserto que codifica a la HGH. Considerando que el gen est clonado dentro de un segmento de DNA del gen lacZ que codifica el a pptido, explica: c) Qu cepa bacteriana elegiras para transformarla con el producto de la ligacin?

Se sugiere utilizar la cepa E. coli JM 119 d) Cmo identificaras a las bacterias que contienen al plsmido? y cmo a aquellas que contienen al plsmido con el inserto del gen de la HGH? Se prueba la resistencia al antibitico ampicilina ya que el vector puc19 que utilizamos confiere resistencia a esta como marcador de transformacin. Se debe tener cuidado con las colonias satelite. Conforme a lo anterior, seleccionaste una bacteria que contiene al plsmido con el gen de la HGH. Una manera de verificar que realmente esa bacteria contiene el vector con el inserto clonado es mediante digestin con enzimas de restriccin. Los productos de la digestin se corren en un gel de agarosa y se observa si el patrn de bandas (el nmero y tamao de las bandas que aparecen en el gel) corresponde a lo esperado. Tomando en cuenta esto: e) Propn dos enzimas de restriccin para hacer dos digestiones que permitan determinar que el gen de la HGH est clonado en pUC19. Utilizaria Sma I y Pst I para un gel confiable. f) Representa un gel en donde dibujes dos carriles con las bandas esperadas, de acuerdo a los sitios de restriccin y el tamao de los productos de cada digestin, comparndolos con los patrones obtenidos en las digestiones de plsmidos que no contengan el inserto.

g) Si quisieras probar tendras que disear? analizas los productos como molde el pUC19 empleas como molde el

esto mismo con una reaccin de PCR qu primers Has un esquema de una electroforesis en donde que obtendras en una reaccin en la que empleas vaco en comparacin con una reaccin en la que pUC19 conteniendo el gen HGH?

>gi|20809248:63-716 Homo sapiens growth hormone 1 (GH1), transcript variant 1, mRNA ATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCC CTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATA TCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAA ACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTT CGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGC TGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAG AACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTG TGGCTTCTAG

Los primers necesarios seran GTCGAGGATCTTCGGTGTCG GACGTCATGGCTACAGGCTC

2) Se desea modificar genticamente al genero Gossypium para que sea capaz de crecer a partir de aguas tratadas con altos niveles de fosfatos, nitratos, pesticidas y residuos organicos.
Para esto se propone seguir la siguiente metodologa usando el mecanismo natural de

infeccin de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens

1. Primero se extrae el material gentico de donde se quiera obtener los genes de resistencia y crecimiento con altas cantidades de agua del genero Eichhornia. Conocido ampliamente por su crecimiento en aguas residuales, estancadas y como agente depurador en esta clase de espejos de agua. 2. Se utilizaria PCR normal para amplificar el genoma completo identificando los genes que confieren dichas caracteristicas mencionadas anteriormente. 3. Se liga el gen con el plsmido Ti de Agrobacterium con un gen de resistencia a algn antibitico, se prepara agrobacterium para transformarla, y se transforma usando transformacin con cloruro de calcio. 4. Se cultiva Agrobacterium con el plsmido modificado. 5. Se crecen callos de especies de Gossypium, el tejido se infecta con el Agrobacterium esperando sea transformado y cultivar en otro tipo de medio que induzca la el crecimiento de la planta con el antibitico para seleccionar slo los productos transformados