Control Microbiolgico de Calidad

Tema 1
Concepto de calidad microbiolgica. Concepto de control microbiolgico de calidad. Objetivos del control de calidad: calidad higinica, calidad mercado, rendimiento. Poltica de control.

Tema 2
Niveles de control. Frecuencia de control: categoras de productos. Tcnicas de control: tcnicas microscpicas y tcnicas por cultivo. Parmetros a controlar.

Tema 3
Control de materias primas: procesos sin fermentacin y con fermentacin. Control de inculos. Control de produccin: tipos. Control de producto terminado. Control de ambiente, limpieza y desinfeccin. Control de conservantes: test de sobrecontaminacin, test de difusin en agar (discos y crown test).

Tema 4
Muestreo. Conceptos de lote de fabricacin y lote aislado: caractersticas. Nmero de muestras y eleccin de las mismas. Material de muestreo. Tcnicas para la toma de muestras. Procesado de muestras.

Tema 5
Medios de cultivo. Medios generales y especiales. Medios lquidos y slidos. Aplicaciones de los medios en control de calidad. Controles "todo o nada". Controles especficos.

Tema 6
Tcnicas de evaluacin de poblaciones microbianas. Mtodos directos: recuento de totales, recuento de viables. Mtodos indirectos: determinaciones de biomasa, constituyentes celulares y constituyentes de los medios.

Tema 7
Identificacin de microorganismos especficos. Identificacin de enterobacterias. Identificacin de cocos grampositivos: gneros Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus. Identificacin de bacilos gramnegativos no fermentadores: gnero Pseudomonas. Identificacin de hongos unicelulares y filamentosos.

Tema 8
Recuperacin de productos contaminados. Recuperacin mediante temperaturas elevadas: pasteurizacin, appertizacin, esterilizacin y termalizacin. Recuperacin por radiaciones. Recuperacin por filtracin.

Tema 9
Control de aguas de consumo y de bebida. Colimetra. Estreptometra. Clostridiometra. Mtodos alternativos de control. Normas de aceptacin de aguas de consumo y de bebida.

Tema 10
Control de productos farmacuticos. Test de esterilidad. Mtodos alternativos. Control de productos cosmticos. Test "todo o nada". Mtodos alternativos.

Tema 11

Control de alimentos. Productos frescos. Productos congelados. Conservas. Procesado especfico de las muestras.

Tema 1 CONCEPTO CONCEPTO OBJETIVOS POLTICA

DE CALIDAD MICROBIOLGICA. DE CONTROL MICROBIOLGICO DE CALIDAD. DEL CONTROL DE CALIDAD.

DE CONTROL.

Objetivos del control de calidad. El control de calidad tiene como nico objetivo el asegurar la calidad, pero lo podemos desgajar en tres objetivos particulares: asegurar la calidad higinica, asegurar la calidad mercado y asegurar el rendimiento. La calidad higinica est constituida por la ausencia de microorganismos patgenos, as como de sus toxinas. Es decir, que el producto no incida de forma perjudicial sobre el usuario. En principio, para asegurar la calidad higinica, parece adecuado que slo sea necesario controlar la ausencia de microorganismos patgenos. Sin embargo, debemos considerar que estos pueden presentar, como factor de virulencia, la produccin de toxinas, siendo necesario, por tanto, detectar tambin este factor. Los grampositivos suelen producir toxinas proteicas, que son liberadas al medio (exotoxinas), por los que la ausencia del microorganismo no indica que el producto tenga calidad, ya que puede haberse producido la liberacin de toxina previamente a la desaparicin del microorganismo. Por el contrario, los gramnegativos producen toxinas de tipo lipopolisacardico (LPS), que son constituyentes de la envoltura celular, por lo que la ausencia del microorganismo indica la ausencia de la toxina. La calidad mercado supone la ausencia de microorganismos capaces de deteriorar el producto, alterando sus propiedades organolpticas, o fsico-qumicas, lo que provocara la no adecuacin al uso. Este ltimo objetivo no es considerado, por los usuarios, como constituyente del control de calidad, ya que el usuario suele considerar el primer objetivo como esencial. El rendimiento es la ausencia de unidades defectuosas, lo que se da, normalmente, como consecuencia de la obtencin de los dos primeros objetivos. Poltica de control
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Una vez establecidos los objetivos, se tiene que desarrollar la poltica de control que nos permita conseguir los objetivos. Esta poltica de control es lo que tenemos que realizar en el control. No puede ser generalizada, ya que debe adaptarse a cada tipo de producto, o de proceso, as como a las condiciones de fabricacin, dentro de cada producto. Sin embargo, tiene una serie de aspectos que siempre han de establecerse. Estos aspectos son: niveles de control, frecuencia de control, tcnicas de control y parmetros a controlar. Esto nos indica dnde, cuanto, cmo y qu controlar, lo que si es generalizable. Tema 2 NIVELES
DE

CONTROL.
DE CONTROL

FRECUENCIA TCNICAS

DE CONTROL A CONTROLAR.

PARMETROS

El primer aspecto de la poltica de control que tenemos que establecer son los niveles de control, que consisten en dnde debemos de realizar los controles necesarios para asegurar la calidad. En principio, y a lo largo de todo el proceso de produccin, debemos controlar lo que se denominan puntos crticos; es decir, aquellos puntos donde puede tener lugar la contaminacin de proceso. El establecimiento de estos puntos crticos nos permite asegurar que el proceso no se va a ver contaminado y, por tanto, el producto presentar calidad. Niveles de control Por regla general, se establecen tres niveles primarios de control, que se denominan: a) controles preventivos, b) controles de fabricacin y c) controles de producto terminado. Los controles preventivos se refieren a los controles que se realizan a nivel de las materias primas; nos aseguran que partimos de unos materiales adecuados para la obtencin del producto. Es lgico realizar estos controles ya que, en muchos casos, las materias primas utilizadas son susceptibles de ser utilizadas por los microorganismos, como fuente de nutrientes, permitiendo su crecimiento y, por consiguiente, alterando sus caractersticas, lo que provoca que los productos obtenidos no tengan calidad. Asimismo, si partimos de materias primas contaminadas, ser ms probable que obtengamos productos contaminados. Los controles de produccin, o de fabricacin, comprenden los controles realizados durante dicha fabricacin, as como del ambiente y del utillaje utilizado durante la misma. Asimismo, podemos incluir dentro de esta categora a los controles de los inculos, utilizados en procesos de
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fermentacin, o los controles de conservantes, adicionados a los productos, as como de los envases utilizados para acondicionar el semielaborado. Los controles de producto terminado estn centrados en la comprobacin de se adecuacin a las normas oficiales de aceptacin, si es que existen. Asimismo, nos permiten comprobar si en el proceso de fabricacin se han seguido las normas de buena fabricacin. Este tipo de control es el que, normalmente, el usuario confunde con el concepto de control de calidad. Frecuencia de control. El siguiente aspecto que tenemos que considerar, al establecer la poltica de control, es la frecuencia de los controles. En principio, debemos controlar todas las fabricaciones realizadas, para asegurarnos de que los productos obtenidos tienen calidad. El control de todas las fabricaciones supone un gasto considerable ya que, en algunos casos, los productos obtenidos son difciles de contaminar, o fciles de descontaminar. Por tanto, es posible realizar los controles con una frecuencia menor; es decir, realizar slo el control de algunas fabricaciones, o no en todos los niveles establecidos. Para realizar esto, se suelen establecer distintas categoras de productos, teniendo en cuenta su historial, en las que los controles se realizan de una forma particularizada en cuanto a niveles a controlar y frecuencia de los controles. Las categoras a establecer no son generalizables, dependiendo de los productos y de las condiciones de fabricacin. Lo ms corriente es establecer cuatro categoras, que vamos a denominar A, B, C y D. La categora A estara constituida por todos los productos que no tienen un historial, los productos fcilmente contaminables, aunque tengan historial, y los productos que sean ms o menos contaminables, pero que sean difciles de descontaminar. Los controles que se realizaran en estos productos seran a todos los niveles de control y de todas las fabricaciones realizadas, debindose de bloquear el producto en cada uno de los niveles establecidos. La categora B agrupara los productos que no se contaminan fcilmente, por lo que nos indica su historial, y los productos fcilmente descontaminables. En esta categora se podra relajar el control, realizndose de todas las fabricaciones y a todos los niveles, pero sin bloquear el producto entre niveles, pero s a nivel del producto terminado. La categora C estara constituida por productos difcilmente contaminables, pudindose realizar los controles slo a nivel de producto terminado, en todas las fabricaciones. Por ltimo, la categora
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D sera la de los productos que raramente se contaminan, por lo que slo se controlara el producto terminado de algunas fabricaciones. Estas categoras, como es lgico pensar, pueden aumentarse o reducirse, dependiendo de las condiciones y caractersticas de cada producto y fbrica. Asimismo, la inclusin de un producto en una u otra categora depender de su historial. Tcnicas de control. Las tcnicas que se deben utilizar en el control de calidad son aquellas que nos permiten detectar la presencia, en el producto, de microorganismos de forma rpida, sencilla, fiable y lo ms econmica posible. Asimismo, deben permitir evaluar el tamao de la poblacin microbiana. Podemos encuadrarlas en dos categoras: a) tcnicas microscpicas y b) tcnicas por cultivo. Las tcnicas microscpicas se basan en la observacin directa de los posibles microorganismos existentes en el producto. Son tcnicas sencillas y fciles de realizar. Asimismo, son rpidas y baratas. Sin embargo tienen un inconveniente, en muchos casos insoslayable, que es el ser poco fiables pues necesitan prctica para distinguir entre microorganismos y componentes del producto, pudiendo dar lugar a confusiones frecuentes. Las tcnicas por cultivo permiten detectar, de forma fiable, la presencia de microorganismos, ya que se basan en su crecimiento en un medio de cultivo adecuado. Asimismo, tienen la ventaja de poderse determinar la viabilidad de los microorganismos y, por tanto, si son activos. Adems, posibilitan la deteccin de poblaciones muy pequeas, que mediante las tcnicas microscpicas no se detectaran. Sin embargo, tienen el inconveniente de ser ms lentas, pues se necesitan al menos 24 horas de incubacin, y son ms caras y complejas. Las tcnicas por cultivo pueden dividirse en dos categora: a) tcnicas clsicas, o tcnicas por cultivo sensu stricto, y b) tcnicas rpidas. Parmetros a controlar. Una vez que hemos establecido los niveles, la frecuencia y las tcnicas del control, debemos considerar qu es lo que vamos a controlar. En principio, controlaremos aquellos microorganismos que inciden en la calidad higinica y la calidad mercado del producto. Sin embargo, debemos considerar dos aspectos interesantes, como son la tecnologa utilizada y las caractersticas fsico-qumicas del producto. La tecnologa utilizada puede provocar la muerte de los microorganismos, por tanto debemos controlar slo los microorganismos que resistan dicha tecnologa.
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Asimismo, las caractersticas del producto van a determinar qu microorganismos pueden desarrollarse en el mismo, por lo que slo tendremos que controlar a estos. Tema 3 CONTROL CONTROL CONTROL CONTROL CONTROL CONTROL
DE MATERIAS PRIMAS. DE INCULOS. DE PRODUCCIN. DE PRODUCTO TERMINADO. DE AMBIENTE, LIMPIEZA Y DESINFECCIN. DE CONSERVANTES.

Control de materias primas El control de materias est motivado por la necesidad de conocer cmo se encuentran, para prever la posibilidad de obtener productos con calidad. No todas las materias primas necesitan ser controladas, ya que slo se controlarn aquellas que tengan una naturaleza orgnica, por lo que pueden soportar el crecimiento de los microorganismos, y aquellas que, no soportando el crecimiento, contengan microorganismos de forma natural. Asimismo, se debe distinguir entre materias primas que intervienen en procesos sin fermentacin y las que intervienen en procesos que impliquen una fermentacin. Las materias primas de procesos sin fermentacin son controladas para detectar la presencia de patgenos potenciales, as como microorganismos que puedan alterar el producto; como interesa saber si son viables, los controles se realizarn mediante tcnicas por cultivo. Por el contrario, las materias primas de procesos con fermentacin no son controladas individualmente, pues van a entrar a formar parte del medio de fermentacin que, normalmente, ser esterilizado y, por tanto, no afectarn al producto, ni al usuario. Control de inculos El control de inculos slo es necesario, como es lgico suponer, en procesos con fermentacin con la finalidad de conocer si permanecen viables y no se encuentran contaminados con otros microorganismos, que puedan alterar el proceso. Como debemos saber si son viables, as como si estn contaminados, las tcnicas que debemos utilizar son por cultivo, ya que las tcnicas microscpicas no permiten detectar la viabilidad. Segn el tipo de inculo utilizado, tendremos que buscar distintos microorganismos contaminantes. As, si el inculo est constituido por
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hongos unicelulares, se deben buscar otros hongos unicelulares as como bacterias lcticas y acticas. Si se trata de hongos filamentosos, buscaremos hongos unicelulares y bacterias lcticas y acticas. Si se trata de bacterias, se buscan otras bacterias y bacterifagos. Control de produccin En el control de produccin, o de fabricacin, se incluyen todos los procesos que, a partir de las materias primas, nos llevan a la obtencin del producto terminado. Es decir, todos los pasos de la fabricacin. Lo mismo que en el caso de las materias primas, tenemos que considerar si el proceso implica, o no, una fermentacin. Cuando se realiza una fermentacin, tenemos que controlar el desarrollo adecuado del inculo utilizado. No se buscan contaminantes ya que, por regla general, partimos de medios de fermentacin estriles, de inculos puros y las condiciones de fermentacin estn adaptadas a las caractersticas del inculo. Asimismo, las poblaciones de ste son muy superiores a la de los contaminantes, por lo que desplazarn a estos durante la fermentacin. Como nos interesa conocer el desarrollo del inculo, las tcnicas a utilizar son microscpicas, pues nos proporcionan suficiente rapidez en la deteccin del crecimiento. En el caso de procesos sin fermentacin, los controles estn encaminados a la deteccin de patgenos potenciales y de microorganismos deterioradores. Por tanto, las tcnicas a emplear son tcnicas por cultivo. Control de producto terminado Una vez realizada la fabricacin obtenemos el producto terminado, que se podr comercializar si cumple la normativa establecida; por tanto, debemos controlarlo para saber si esto es as. Asimismo, nos permite conocer si se han aplicado las prcticas de buena fabricacin durante el proceso. Como es lgico, las tcnicas utilizadas sern por cultivo. Control de ambiente El ambiente en que se realiza el proceso es una de las fuentes de contaminacin del mismo, por tanto debemos controlarlo para asegurarnos que su incidencia en el proceso sea mnima. Lo que se busca es determinar la presencia de microorganismos viables perjudiciales, luego las tcnicas a utilizar sern por cultivo. Sin embargo, nos encontramos con dos tipos de tcnicas a utilizar: a) tcnicas cualitativas, que slo nos indican si hay presencia de microorganismos, pero no nos permiten cuantificarlos y b) tcnicas cuantitativas, que si nos permiten cuantificarlos.
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Control de conservantes En algunos productos, tales como alimentos, productos farmacuticos, cosmticos, etc., es habitual incorporar sustancias que muestran una actividad antimicrobiana, los conservantes, que tienen como finalidad el inhibir el crecimiento de los microorganismos que incorpora el usuario durante la utilizacin del producto. Como estos productos pueden se elergnicos, o txicos, para el usuario, se deben realizar controles que nos aseguren la proteccin del producto, con la menor cantidad de conservante; asimismo, se debe controlar que esta concentracin se ha conseguido en las distintas fabricaciones. Los controles que se realizan son: a) controles de sobrecontaminacin, para detectar la concentracin mnima inhibitoria y b) controles de difusin en agar, para determinar si el producto lleva la concentracin adecuada de conservante. Tema 4 MUESTREO. LOTE LOTE
DE FABRICACIN AISLADO Y ELECCIN DE MUESTRAS.

NMERO

PROCESADO Muestreo

DE LAS MUESTRAS.

Un especto importante del control es la realizacin del muestreo, ya que la recogida de muestras condicionar el resultado que obtengamos. Debemos de tener en cuenta una serie de premisas.
1. Las muestras deben de ser representativas de todo el producto a

controlar, puesto que, si nos restringimos a determinadas zonas, o unidades, del producto, no nos dan idea de cmo se encuentra ste. 2. Deben ser tomadas aleatoriamente, evitndose, as, la posibilidad de orientar los resultados que obtengamos.
3. Hay que tomarlas de forma asptica, pues debemos evitar la

introduccin de microorganismos extraos al producto, lo que podra provocar el bloqueo innecesario de los productos. Teniendo en cuenta estas premisas, tendremos que determinar el nmero de unidades a muestrear, pero esto depender de la presentacin del producto y del nivel a que estemos muestreando. Pero, antes de seguir, definiremos dos conceptos: lote de fabricacin y lote aislado, que nos van a condicionar el muestreo que realicemos.
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Lote de fabricacin Se considera un lote de fabricacin a todas las unidades obtenidas en un tiempo determinado y con unas condiciones determinadas; por tanto, nos referimos, fundamentalmente, al proceso de fabricacin. Cuando la fabricacin sea muy larga, es conveniente dividirla en sublotes, que nos permitan liberar producto ms fcilmente. Por ejemplo, si la fabricacin dura varios das, se puede establecer como sublotes el producto elaborado en cada da. Asimismo, en cada sublote se puede considerar volver a separar en sublotes, segn los cortes previstos en el da. Cada sublote debe considerarse aisladamente para realizar el muestreo. Por otra parte, si durante la fabricacin se producen interrupciones, no esperadas, deben de considerarse a la hora de realizar la toma de muestras. Lote aislado Se considera un lote aislado cuando se deben controlar unidades procedentes de distintas fabricaciones, o no se conocen sus lotes de fabricacin; por ejemplo, cuando se retiran unidades del mercado unidades para controlar su estado o su conservacin. Nmero y eleccin de muestras El nmero de unidades a extraer depende de si estamos realizando el control de un lote de fabricacin o de un lote aislado. Cuando estamos controlando un lote de fabricacin, se considera que se obtienen resultados representativos tomando entre cinco y ocho unidades de la fabricacin. Se suelen tomar cinco unidades, cuando la fabricacin es 3000 unidades, y ocho unidades, cuando es 3000. Las unidades se tomarn una al principio y otra al final de la fabricacin y el resto durante la misma. En el caso de que se hayan producido cortes significativos durante la fabricacin, es conveniente tomar muestras adicionales, antes y despus del corte, para conocer si dicho corte es el origen de la contaminacin. Cuando se controla un lote aislado, al no conocerse cmo se han fabricado las distintas unidades, se debe tomar un nmero elevado de unidades, considerndose como regla general que la raz cuadrada del nmero total de unidades, del lote aislado, nos proporciona un nmero fiable y representativo de muestras. Las muestras, en este caso, se tomarn mediante un sistema de generacin de nmeros aleatorios, habiendo numerado previamente todas las unidades.

Procesado Una vez tomadas las muestras, es necesario procesarlas. Esto depende de lo que se trate de buscar, pero por regla general necesitamos realizar cultivos, para poner de manifiesto los microorganismos, o recuentos, para evaluar el tamao de las poblaciones. En cualquier caso, cuando tenemos varias unidades de muestreo, podemos seguir dos vas distintas, dependiendo del tipo de producto de que se trate. Tema 5 MEDIOS MEDIOS MEDIOS MEDIOS MEDIOS
DE CULTIVO. GENERALES ESPECIALES. LQUIDOS SLIDOS. DE LOS MEDIOS. O NADA.

APLICACIONES CONTROLES

CONTROLES TODO

ESPECFICOS.

Medios de cultivo Para el crecimiento de los microorganismos, necesitamos un soporte que les proporcione las fuentes de nitrgeno, carbono y energa necesarios, as como oligoelementos y cualquier otro factor que necesiten. Los medios podemos clasificarlos en distintas categoras, atendiendo a distintas caractersticas de los mismos. As, si nos fijamos en su utilizacin podemos agruparlos en dos categoras: a) medios generales y b) medios especiales. Asimismo, si se utiliza su presentacin como factor de clasificacin, nos encontramos con: a) medios lquidos y b) medios slidos. Tambin podemos utilizar su composicin para clasificarlos en: a) medios no definidos, en los que conocemos slo su composicin general, pero no conocemos los componentes exactos de los mismos, y b) medios definidos, porque se conoce su composicin exacta y, por tanto, son siempre repetibles, en contraposicin de los primeros. Medios generales Los medios generales son aquellos que permiten obtener el desarrollo de cualquier microorganismo; por lo general, son medios no definidos y se utilizan para obtener masa celular. Entre estos nos encontramos con el caldo comn, el caldo tripticasena-soja (TSB), el agar nutritivo, o el agar tripticasena-soja (TSA).
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El TSB, como el TSA, son medios generales en los que se han separado las fuentes de carbono y nitrgeno, que en los otros medios citados son proporcionadas por un nico sustrato, para que no se establezca competicin por el consumo de las mismas. Para ello, se utilizan glucosa, como fuente de carbono y la tripticasena, junto a la peptona de soja, como fuente de nitrgeno. Asimismo, la utilizacin de dos fuentes de nitrgeno, una de fcil utilizacin y la otra de difcil, permite el crecimiento de microorganismos exigentes. Medios especiales Estos medios se utilizan para conseguir el crecimiento de determinados microorganismos, inhibiendo el crecimiento de otros, o para determinar cmo se comportan los microorganismos frente a determinados sustratos. Dentro de estos medios nos encontramos con los que seleccionan a determinados microorganismos de una muestra, por lo que se denominan selectivos, o aquellos que permiten diferenciar unos microorganismos frente a otros, segn su comportamiento frente a un sustrato determinado, por lo que se denominan diferenciales. Asimismo, podemos tener medios que comparten ambas caractersticas. Los medios selectivos se caracterizan porque estn constituidos por un medio base, que permite el crecimiento de todos los microorganismos, al que se adiciona un agente selectivo, que inhibe el crecimiento de algunos microorganismos. Por tanto, slo los resistentes al agente selectivo pueden crecer. Slo se utilizan para seleccionar a los microorganismos que pueden crecer, a partir de una mezcla. No deben utilizarse para identificar, ya que podemos encontrar microorganismos que pueden crecer sobre estos medios aunque, en teora, deberan ser inhibidos. Estos medios slo nos sirven para tener una orientacin sobre qu tipo de microorganismos constituyen una mezcla. Los medios diferenciales estn diseados para conocer cmo se comportan los microorganismos frente a un determinado sustrato. Estn constituidos por un medio base, que permite el crecimiento de todos los microorganismos, al que se aade el sustrato a estudiar, pero que no inhibe el crecimiento de ningn microorganismo. Son utilizados para estudiar el metabolismo de los microorganismos y, por tanto, poderlos identificar. A diferencia de los medios selectivos, necesitamos trabajar con cultivos puros. Asimismo, podemos encontrarnos con medios selectivos y diferenciales, que comparten las propiedades de ambos. Cualquiera de los medios anteriores, pueden presentarse en dos formas: a) medios lquidos y b) medios slidos. Los medios lquidos presentan
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una mayor disponibilidad de nutrientes, que los medios slidos, aunque ambos presentan la misma composicin, con la nica diferencia de que los ltimos contienen un agente solidificante que proporciona un soporte para el crecimiento de los microorganismos. Aplicaciones de los medios en control de calidad Las aplicaciones de los medios dependen de su presentacin; as, los medios lquidos son utilizados para: a) enriquecimiento de las poblaciones existentes, facilitando su deteccin; b) recuento de las poblaciones, lo que permite evaluar el tamao de las mismas; c) deteccin de la presencia de contaminacin y d) identificacin de la contaminacin. La deteccin de la contaminacin con medios lquidos presenta una limitacin, que consiste en que las muestras no deben ser turbias de por s, o producir turbidez en el medio, ya que deteccin de crecimiento se basa en la aparicin de turbidez en el medio, despus de incubar. Los medios slidos comparten todas las aplicaciones de los medios lquidos, excepto que no pueden ser utilizados para realizar el enriquecimiento de las poblaciones presentes. Asimismo, presentan una aplicacin adicional, consistente en el aislamiento de las distintas poblaciones de una mezcla. Controles todo o nada Los controles todo o nada nos permiten poner de manifiesto la existencia de contaminacin, en un producto, por pequea que sea. Por tanto, constan de una fase de enriquecimiento y una fase de deteccin. Ambas fases pueden realizarse utilizando un medio general lquido, pero las muestras no deben ser turbias, ni producir turbidez al adicionarlas al medio, ya que no podramos observar el crecimiento. En este caso, debemos de utilizar un medio lquido, en la primera fase, y un medio slido, en la deteccin. Asimismo, algunos productos contienen conservante, que pueden interferir en el crecimiento de poblaciones pequeas, por lo que es necesario realizar un bloqueo previo de dichos conservantes. El bloqueo puede realizarse independientemente del enriquecimiento, o simultneamente al mismo. La ltima forma es la ms adecuada de forma general, ya que, si lo hacemos independientemente, podemos perder alguna poblacin que se encuentre en muy baja proporcin, puesto que se est realizando una dilucin previa al realizar el bloqueo y el enriquecimiento de forma independiente. El protocolo que se suele emplear, por todo lo anterior, consiste en:
1. Inocular 1 g o 1 ml de la muestra en un medio general (TSB)

adicionado con el agente bloqueante (tween 80/lecitina de soja).

2. Incubar a 37 C, durante 24 horas, para enriquecer. 12

3. A partir del medio anterior, inocular dos placas de medio slido

(TSA/ tween 80/lecitina de soja)

4. Incubar una placa a 37 C, durante 24-48 horas, y la otra placa a

22 C, durante cinco das. Si aparece crecimiento en alguna de las dos placas, se debe repetir el control con las mismas muestras utilizadas, realizando simultneamente un recuento y una identificacin de los microorganismos contaminantes. Controles especficos Los controles especficos estn encaminados a poner de manifiesto la presencia, o ausencia, de un determinado tipo de microorganismo. Asimismo, podemos necesitar la evaluacin del tamao de la poblacin especfica. Estos controles se realizan utilizando medios selectivos para los microorganismos buscados. Por lo tanto, slo estaremos seguros de la ausencia, pues la presencia de colonias en el medio selectivo no es indicativa de los microorganismos especficos, salvo en el caso de una selectividad alta. Tema 6 TCNICAS MTODOS
DE EVALUACIN DE POBLACIONES MICROBIANAS. DIRECTOS: DE TOTALES. DE VIABLES:

RECUENTO RECUENTO NMP. NMERO DILUCIN MTODOS

MNIMO DE DILUCIN. Y SIEMBRA EN PLACA.

INDIRECTOS: DE BIOMASA.

DETERMINACIONES CONSTITUYENTES CONSTITUYENTES

CELULARES. DE LOS MEDIOS.

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Un aspecto importante en los controles es el evaluar el tamao de las poblaciones, ya que la presencia de microorganismos no patgenos, en muchos casos, no implica la ausencia de calidad, debido a que lo importante es el nmero de los mismos por lo que tendremos que realizar recuentos. Asimismo, al controlar los procesos de fabricacin con fermentacin, necesitamos saber si el biocatalizador se desarrolla adecuadamente, por lo que deberemos evaluar el aumento de tamao de la poblacin. Existen diversas tcnicas para este fin, que podemos agrupar en dos categoras segn las realizamos. As tenemos tcnicas en las que evaluamos el propio crecimiento de la poblacin (mtodos directos), o podemos evaluar cmo vara una caracterstica asociada al crecimiento, cuyo aumento implica un aumento de la poblacin (mtodos indirectos). Mtodos directos En los mtodos directos nos encontramos con dos tipos de tcnicas, segn lo que consideremos para evaluar la poblacin. Podemos fijarnos en todos los microorganismos presentes en la muestra, sin distinguir entre los que estn vivos o muertos, obteniendo un recuento de totales. Por el contrario, podemos fijarnos slo en aquellos que son capaces de multiplicarse, obteniendo un recuento de viables. Recuento de totales: Es la forma ms sencilla de realizar un recuento, ya que consiste en contar, mediante microscopa, todas las clulas presentes en un determinado volumen de la muestra. Tiene el inconveniente que no podemos diferenciar las clulas viables de las no viables, por lo que obtenemos recuentos superiores a los obtenidos con el mtodo de viables. Sin embargo, podemos obviarlo, en cierta medida, utilizando colorantes vitales que tien las clulas de forma diferencial, segn su estado fisiolgico. Asimismo, se pueden realizar recuentos de totales utilizando sistemas electrnicos de medida, tal como contadores de partculas (Coulter counter) o la citometra de flujo. Los recuentos totales mediante microscopa suelen realizarse utilizando cmaras de recuento o preparaciones teidas. Las cmaras de recuento consisten en portas especiales con una excavacin que lleva una retcula tallada. Al colocar un cubre, se forma una cmara de volumen conocido, que nos permite contar el nmero de clulas en ese volumen. Por tanto, si contamos el nmero de clulas de varias celdillas, podemos determinar el nmero medio por celdilla y calcular su nmero por volumen. Los recuentos mediante preparaciones teidas pueden realizarse de varias formas; por ejemplo, mediante extensiones de un volumen
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determinado sobre una superficie calibrada, o mediante la utilizacin de suspensiones de clulas a la que se han adicionado bolitas de ltex. En el primer caso, se realiza la extensin de un pequeo volumen (0.01 ml) en una superficie conocida (1 cm2). Se fija y se tie la preparacin, contndose el nmero de clulas en varios campos de observacin. Se determina el nmero medio por campo y, como se conoce la superficie del campo, se puede calcular las clulas en 1 cm2, que seran las existentes en el volumen extendido y por tanto lo podemos referir a 1 ml. El segundo mtodo consiste en mezclar una suspensin celular con bolitas de ltex calibradas. Estas bolitas se caracterizan porque tienen un volumen y peso constantes, por lo que se conoce el nmero de las mismas en un peso determinado. Por tanto, conocemos el nmero de ellas que hemos aadido a la suspensin celular. Si observamos una muestra de la mezcla al microscopio, podemos determinar el nmero medio de clulas y bolitas por campo, calculando la relacin de bolitas/clulas que tenemos podemos determinar el nmero de clulas en la suspensin. La utilizacin de sistemas electrnicos de medida se basan en dos principios distintos, segn la tcnica utilizada. Los contadores de partculas se basan en el establecimiento de un campo elctrico, que es alterado al ser atravesado por una partcula, lo que provoca una seal. Si hacemos pasar una suspensin de clulas, a travs de dicho campo, y medimos en nmero de veces que se emite la seal de cambio, podemos determinar el nmero de clulas en el volumen utilizado. Las clulas deben de pasar de una en una, para poder ser contadas. El citmetro de flujo tiene un fundamento similar, pero el sistema se basa en la utilizacin de tres sistemas lser, a distinta longitud de onda, que inciden sobre las clulas y, al utilizar distintos fluorocromos para teir las mismas, podemos detectar las seales que emiten al pasar por el camino del lser. Este sistema permite una deteccin de clulas vivas y muertas, segn los fluorocromos utilizados. Recuento de viables: Son los ms utilizados en control de calidad, ya que nos permiten contar las clulas capaces de multiplicarse, que son las que pueden incidir en la calidad del producto. Se basan en la deteccin del crecimiento de los microorganismos, utilizando tanto medios slidos como lquidos, a partir de muestras de cualquier tipo. Igualmente que con los recuentos de totales, existen diversos mtodos como: a) Nmero ms probable (NMP), b) nmero mnimo de dilucin y c) dilucin y siembra en placa. Los dos primeros mtodos utilizan
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medios lquidos por lo que slo pueden utilizarse para muestras no turbias, o que no produzcan turbidez. El ltimo, al utilizar medios slidos, sirve para cualquier tipo de muestra. NMP: La tcnica consiste en inocular varias series de tubos con distintos volmenes, o pesos, de muestra, observando en cuales aparece turbidez, despus de incubarlos a la temperatura adecuada. Con el nmero de estos tubos, para cada serie, se construye un nmero caracterstico que se compara con los valores de una tabla preestablecida, que nos indican cual es el NMP, as como los mrgenes de confianza para el 95 %. Nmero mnimo de dilucin: Consiste en realizar una dilucin sucesiva de la muestra, en un medio de cultivo, incubando a continuacin. La dilucin ms alta, que presenta crecimiento, nos indica el nmero mnimo de microorganismos que tenemos en la muestra. Dilucin y siembra en placa: Se realiza un banco de diluciones, con un diluyente que mantenga la viabilidad celular y no estimule el crecimiento, sembrando a continuacin, en placas con un medio de cultivo slido, un volumen determinado de cada dilucin. Se incuban las placas y se cuentan las colonias que aparecen en cada dilucin. El nmero de microorganismos ser el nmero de colonias que aparecen en una placa multiplicado por el inverso de la dilucin correspondiente. Para que el recuento sea fiable, slo se consideran las placas en las que aparecen entre 30 y 500 colonias. Mtodos indirectos Se basan en la cuantificacin de una caracterstica que est asociada con el crecimiento, por lo que un aumento de la misma nos indica un aumento de la poblacin y, por tanto, un aumento del nmero de clulas. Pueden agruparse en tres categoras: a) determinacin de la biomasa, b) determinacin de constituyentes celulares y c) determinacin de constituyentes de los medios. Determinacin de biomasa: Se basa en la evaluacin del peso seco de clulas en la suspensin celular; como es lgico pensar, este mtodo slo es vlido en muestras lquidas y nos proporciona una valoracin de totales. Determinacin de constituyentes celulares: Determinando un constituyente celular, ste aumentar al aumentar la poblacin. Los constituyentes elegidos deben de estar siempre presentes en las clulas y es preferible que no vare con el estado fisiolgico de las mismas. Uno de los constituyentes utilizado es el ATP y su valoracin se basa en una reaccin de bioluminiscencia, mediante el sistema luciferina/luciferasa de las lucirnagas.
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La luciferina es descarboxilada por la enzima luciferasa, siendo dependiente de O2 y de ATP. Una parte de la energa liberada por la hidrlisis de ATP se transforma en luz visible, de forma que si se mantiene constante las cantidades de luciferina y de luciferasa, as como un exceso de O2, la luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP. Esta tcnica nos proporciona la evaluacin de totales de la muestra. Determinacin de componentes del medio: Una de las tcnicas utilizadas consiste en medir el paso de corriente elctrica a travs del medio de cultivo, segn crecen los microorganismos, ya que al crecer los microorganismos se irn acumulando metabolitos en el medio y ms fcilmente pasar la electricidad. Para realizarlo, se introducen dos electrodos en el medio de cultivo. Los electrodos estn conectados a un sistema de medida. Despus de inocular el medio, se incuba la muestra y se va midiendo el paso de corriente, obtenindose una curva que permite detectar no slo el nmero de microorganismos, sino tambin su tasa de crecimiento y otros parmetros del mismo. Tema 7 IDENTIFICACIN IDENTIFICACIN IDENTIFICACIN
DE MICROORGANISMOS ESPECFICOS. DE ENTEROBACTERIAS. DE COCOS GRAMPOSITIVOS:

Staphylococcus. Streptococcus y Enterococcus. IDENTIFICACIN IDENTIFICACIN

DE BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES:

Pseudomonas.
DE HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS.

Los microorganismos que suelen considerarse como especficos son: 1. Enterobacterias, por haber estirpes patgenas y ser ndices de contaminacin fecal.
2. Cocos grampositivos, pues hay especies patgenas, as como

patgenas potenciales, y son ndices de contaminacin fecal (Streptococcus y Enterococcus) y de contaminacin por manipulacin (Staphylococcus).
3. Bacilos gramnegativos no fermentadores, en especial el gnero

Pseudomonas por su versatilidad metablica, que lo hace un potente agente biodeteriorador, y por presentar estirpes patgenas.
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4. Hongos unicelulares y filamentosos, ya que son agentes biodeteriorantes potentes, en condiciones que inhiben el crecimiento de bacterias, y existen cepas patgenas. Enterobacterias Son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con metabolismo oxidativo y fermentativo, que fermentan todos la glucosa y, algunos, la lactosa y son oxidasa y catalasa positivos. Su posible hbitat intestinal las hacen indicadoras de contaminacin fecal, existiendo algunas que son patgenas. La identificacin se realiza mediante las pruebas siguientes: 1. Utilizacin de azcares. 2. Movilidad. 3. Presencia de distintas enzimas (lisina, ornitina descarboxilasas, fenilalanina desaminasa y ureasa). 4. Produccin de H2S. 5. IMViC 6. Actividad ONPG. Sin embargo, slo se suelen utilizar, de forma rutinaria, la movilidad, la utilizacin de azcares (glucosa y lactosa), y el IMViC. Movilidad: La movilidad puede realizarse mediante observacin microscpica, o por utilizacin de medios semislidos para movilidad. Utilizacin de azcares: Las pruebas de fermentacin de azcares podemos realizarlas mediante la utilizacin de caldos glucosado o lactosado, medio de Kligler o TSI, o mediante discos con azcares en medio slido. IMViC: Las pruebas IMViC son cuatro pruebas diferenciales que nos indican: produccin de indol a partir de triptfano (I), tipo de fermentacin de la glucosa (M,V) y utilizacin de citrato como nica fuente de carbono (iC). Asimismo, se pueden utilizar galeras rpidas de identificacin (galeras API, Enterotube), que permiten la realizacin de mltiples pruebas diferenciales de gran potencia. Por otra parte, una identificacin orientativa de enterobacterias, o la ausencia de las mismas, puede realizarse mediante la utilizacin de medios selectivos, necesitndose una identificacin fina posterior. Cocos grampositivos Los cocos grampositivos se consideran microorganismos especficos porque entre ellos nos encontramos con formas patgenas u oportunistas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium,
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arginina

etc.), as como por la posibilidad de utilizarlos como ndices del origen de la contaminacin, por el hbitat que presentan. En un primer paso, la diferenciacin puede realizarse mediante la prueba de la catalasa, ya que Staphylococcus y Micrococcus son catalasa positivos, mientras que Enterococcus y Streptococcus son catalasa negativos. Staphylococcus: Los catalasa (+) podemos diferenciarlos utilizando un medio selectivo y diferencial, como puede ser el agar manitol-NaCl, que permite determinar la presencia de S. aureus por su capacidad de fermentar el manitol y crecer en medios con contenido elevado de NaCl, o el agar de Baird-Parker, entre otros. Algunas cepas de S. aureus son patgenas, lo que se determina mediante la prueba de la coagulasa libre, enzima que slo producen las cepas patgenas y provoca la coagulacin del plasma citratado. Enterococcus y Streptococcus: Su identificacin se realiza mediante pruebas de hemolisis, resistencia a distintos inhibidores (optoquina, bacitracina, sulfamidas) y distintas pruebas bioqumicas (hidrlisis del hipurato, de la esculina, etc.). Bacilos gramnegativos no fermentadores Se caracterizan, inicialmente, por no producir cido en agar de Kligler, no crecer en medio de MacConkey y ser oxidasa positivos. Frente a un aislamiento con estas caractersticas, podemos sospechar que se trata de uno de estos microorganismos. Para su identificacin definitiva, debemos realizar una serie de pruebas secundarias, tales como: utilizacin de azcares, produccin de indol, produccin de pigmentos difusibles y no difusibles, sensibilidad a la penicilina, etc., que permiten establecer una serie de grupos fisiolgicos. Una caracterstica de estos grupos fisiolgicos es que en todos ellos nos encontramos con miembros de un gnero, Pseudomonas, que presenta una gran versatilidad nutricional. Debido a su gran versatilidad, el gnero Pseudomonas es un agente biodeteriorador muy importante. Asimismo, algunas especies de este gnero pueden actuar como patgenos, p.e. P. aeruginosa. La identificacin fina de Pseudomonas se realiza mediante una gran variedad de pruebas bioqumicas, pero se puede realizar una identificacin presuntiva mediante la utilizacin de medios que promueven la produccin de pigmentos difusibles caractersticos, la piocianina y la pioverdina, o fluorescena, que presentan color azul y verde amarillento, respectivamente. Asimismo, la fluorescena produce fluorescencia bajo luz ultravioleta.
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Los medios utilizados son los medios A y B de King (o medios P y F), que estimulan la produccin de piocianina y fluorescena, respectivamente. Hongos unicelulares La identificacin se realiza mediante su capacidad de utilizar azcares, fundamentalmente, por lo que se realizan pruebas de fermentacin de azcares, as como pruebas de su utilizacin como nica fuentes de carbono. Asimismo, se deben de realizar otras pruebas adicionales, como la produccin de tubo germinal. Tema8 RECUPERACIN RECUPERACIN
DE PRODUCTOS CONTAMINADOS. MEDIANTE TEMPERATURAS ELEVADAS:

PASTEURIZACIN. APPERTIZACIN. ESTERILIZACIN. TERMALIZACIN.

RECUPERACIN RECUPERACIN

POR RADIACIONES IONIZANTES. POR FILTRACIN.

Los productos contaminados pueden ser recuperados, teniendo en cuenta su valor, la necesidad de los mismo, o ambas cosas. Para conseguir esta recuperacin, pueden seguirse varias tcnicas que persiguen la muerte de los microorganismos, o su eliminacin fsica. Sin embargo, debemos considerar la composicin del producto, as como el microorganismo contaminante, para aplicar una tcnica u otra, ya que podemos alterar el producto u obtener un producto no utilizable. Las tcnicas a utilizar se agrupan en tres categoras: a) recuperacin mediante temperaturas elevadas, b) recuperacin mediante radiaciones y c) recuperacin mediante filtracin. Utilizacin de temperaturas elevadas Estas tcnicas producen la muerte de los microorganismos mediante dos mecanismos, bien por alcanzarse rangos de temperatura disgensicos, por encima de 56 C, con lo que los sistemas enzimticos celulares se inactivan, bien porque la actividad de los conservantes, que lleva el producto, son ms efectivos cuando se alcanzan temperaturas, no disgensicas, del orden de 40-45 C. Asimismo, las diversas tcnicas utilizables pueden provocar la eliminacin total de la viabilidad celular, o slo destruir algunos tipos determinados de microorganismos, segn la temperatura alcanzada y el tiempo de actuacin de la misma.
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Los procesos podemos agruparlos en dos categoras: a) procesos que utilizan temperaturas inferiores a la de ebullicin del agua y b) procesos con temperaturas superiores a la de ebullicin del agua. En ambos casos, el tiempo de actuacin puede ser ms o menos largo, dependiendo de lo que queramos conseguir. Pasteurizacin: Esta tcnica utiliza temperaturas por debajo de la ebullicin del agua (70-100 C), durante tiempos cortos. El calentamiento se realiza rpidamente y, a continuacin, se baja la temperatura, tambin de forma rpida. La alternancia brusca de temperatura es lo que provoca la muerte de los microorganismos. Conseguimos la eliminacin total de los microorganismos patgenos y una disminucin considerable de la poblacin saprfita; por tanto, se consigue asegurar la calidad higinica, por la muerte de patgenos, y la calidad mercado, al reducirse las poblaciones biodeteriorantes. Appertizacin: Emplea temperaturas superiores a la de ebullicin (121-150 C), durante tiempos cortos. Tambin se conoce como pasteurizacin a temperaturas elevadas durante tiempos cortos. Provoca la reduccin de las poblaciones microbianas hasta unos valores tan pequeos que no son significativos y no pueden ponerse de manifiesto por los mtodos convencionales de deteccin, pero no conduce a la desaparicin total de microorganismos; es decir, se consigue lo que se llama una esterilidad comercial, no una esterilidad biolgica, ya que sta implica una destruccin total de la viabilidad celular. Esterilizacin: Utiliza, como la anterior, temperaturas superiores a los 100 C, pero el tiempo de actuacin es elevado. Es la nica tcnica que asegura la esterilidad biolgica. Termalizacin: Consiste en someter al producto a temperaturas de 4045 C, durante tiempos largos, con la finalidad de aumentar la actuacin de los conservantes. La destruccin de los microorganismos no es una consecuencia directa de la temperatura, sino a una activacin del conservante. Radiaciones ionizantes Se basa en la formacin de radicales libres de las molculas biolgicas, que permiten el establecimiento de enlaces anormales, lo que conduce a la inactivacin de las mismas. La formacin de radicales libres es proporcional a la intensidad de la radiacin y al tiempo de actuacin de la misma. Por tanto, tenemos tres posibilidades de proceso: a) con energa elevada, b) con energa media y c) con energa baja. Cada uno de estos procesos varan en el tamao de la destruccin de los microorganismos y en el tipo eliminado. Cuanto mayor sea la
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energa utilizada, mayor ser la destruccin y se eliminarn ms tipos de microorganismos, por lo que podremos conseguir una esterilidad industrial o un alargamiento de la vida media del producto. Filtracin Permite la recuperacin de productos fluidos, mediante la eliminacin fsica de los microorganismos. Se pueden seguir dos tcnicas distintas, que dependen del mecanismo de eliminacin de los microorganismos. Las tcnicas son: a) filtracin pantalla, en la que el mecanismo de eliminacin es por cribado y b) filtracin en profundidad, cuyo mecanismo es el establecimiento de enlaces inicos, por puentes de hidrgeno y de Van der Walls; es decir, por adsorcin al material filtrante. Tema 9 CONTROL
DE AGUAS DE CONSUMO Y ENVASADA.

COLIMETRA. ESTREPTOMETRA. CLOSTRIDIOMETRA. MTODOS NORMAS AGUA

ALTERNATIVOS DE CONTROL. DE ACEPTACIN

AGUAS DE CONSUMO ENVASADA

El agua es uno de los medios de transmisin de microorganismos patgenos, por lo que es necesario realizar un control para asegurarnos que presenta calidad. En principio, el control del agua est encaminado a la deteccin de microorganismos patgenos; sin embargo, la deteccin de estos microorganismos es compleja y, adems, su permanencia en el agua es baja. Para solventar este problema, se buscan microorganismos que siempre acompaan a los patgenos, pues comparten el mismo hbitat, y adems sean fcilmente detectables y enumerables. Estos microorganismos se denominan "microorganismos ndice". Los microorganismos ndice utilizados son: a) coliformes, que pertenecen a las enterobacterias, b) estreptococos fecales, pertenecientes a los gneros Streptococcus y Staphylococcus y c) clostridios sulfitorreductores. Todos estos microorganismos presentan un hbitat intestinal. Los coliformes nos indican una contaminacin fecal reciente, puesto que son ms resistentes que los patgenos intestinales, aunque terminan por desaparecer. Los estreptococos fecales son ndice de contaminacin
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fecal a plazo medio, ya que son los ms resistentes de los no esporulados. Por ltimo, los clostridios sulfitorreductores muestran contaminaciones antiguas, ya que son esporulados. Asimismo, nos interesa conocer la carga total de microorganismos del agua pues, a mayor nmero de totales, mayor ser la probabilidad de que el agua est contaminada. El anlisis oficial de la aguas de consumo y de bebida est constituido por las siguientes pruebas: a) recuento de totales viables a 37 y 22 C, b) colimetra, que nos indica la presencia y recuento de coliformes, c) estreptometra, presencia y recuento de estreptococos fecales y d) clostridiometra, para valorar la presencia de clostridios sulfitorreductores. Colimetra Nos basamos en la caracterstica diferencia de los coliformes de fermentar la lactosa, con produccin de cido y gas; por tanto, realizaremos una siembra del agua en un medio lactosado que nos permita, despus de incubar a 37 C durante 48 horas, detectar la produccin de cido y de gas. Sin embargo, no todos los fermentadores de lactosa son coliformes, por lo que esta prueba es presuntiva, indicndonos slo de la posible presencia de coliformes. Una prueba presuntiva positiva obliga a confirmarla utilizando medios selectivos para coliformes. El mtodo oficial establece que el medio a utilizar es el medio de eosina-azul de metileno, segn Levine (EMB o EAM). Asimismo, debemos realizar un IMViC y la prueba de la oxidasa de las colonias caractersticas que aparezcan, despus de incubar a 37 C durante 48 horas. Adems de detectar la presencia de coliformes, debemos realizar un recuento de los coliformes totales (cido y gas positivos en lactosa), as como de los coliformes fecales, ya que estos son los que presentan un hbitat exclusivamente intestinal (Escherichia coli). Para realizar el recuento de coliformes totales y fecales, se utiliza la tcnica del NMP. Se siembran distintos volmenes del agua en medio lactosado. Los volmenes ms corrientes son: 1. 50 ml de agua en un matraz con 50 ml de medio lactosado a doble concentracin. 2. 50 ml de agua en cinco tubos, con 10 ml de medio a doble concentracin, a razn de 10 ml/tubo. 3. 5 ml de agua en cinco tubos, con 10 ml de medio concentracin normal, a razn de un ml/tubo. Despus de incubar a 37 C, durante 24-48 horas, los tubos positivos de cada serie se llevan a una tabla de NMP que nos indica el nmero de
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microorganismos en 100 ml de agua, as como los mrgenes superior e inferior de confianza, al 95 %. El recuento de coliformes fecales se realiza sembrando, a partir de los tubos positivos del recuento anterior, en medio EC. Se incuban a 44 C durante 24 horas. Los tubos positivos sern aquellos que presenten gas. Se realiza la incubacin a 44 C ya que E. coli es el nico que fermenta la lactosa con produccin de cido y de gas, a esta temperatura. El medio EC lleva sales biliares, como agente selectivo, para asegurarnos que la bacteria fermentadora es una enterobacteria. Estreptometra Esta tcnica nos permite detectar y enumerar los estreptococos fecales (Streptococcus bovis, S. equinus, Enterococcus faecalis, E. faecium y E. durans), que presentan la caracterstica de fermentar la glucosa, con produccin de cido, en 48 horas a 37 C. Como en el caso de la colimetra, la estreptometra presenta dos pruebas: a) presuntiva, en la que se siembran, en medio glucosa-azida, los mismos volmenes que para la colimetra, incubando durante 24-48 horas a 37 C, y b) confirmativa, que utiliza caldo glucosa-azida-violeta de etilo (caldo EVA), incubando a 34 C, 24-48 horas. La presencia de azida sdica, un veneno respiratorio, inhibe la presencia de los microorganismos, que no sean estreptococos fecales, en los medios utilizados. La positividad de la prueba presuntiva viene dada por la aparicin de turbidez, sedimento, o ambos. En el caso de la prueba confirmativa, los resultados positivos son semejantes a los de la presuntiva, pero el sedimento presenta una coloracin violeta. El recuento de estreptococos fecales se realiza de igual forma que en la colimetra. Clostridiometra La clostridiometra nos permite poner de manifiesto, as como realizar enumerar, los clostridios sulfitorreductores, que nos indican una contaminacin fecal antigua, ya que presentan esporas de resistencia pudiendo, por tanto, resistir grandes perodos de tiempo. El agua se calienta a 80 C, durante cinco minutos, para eliminar las formas vegetativas, sembrndose a continuacin 20 ml de agua en medio para sulfitorreductores. La incubacin se realiza a 37 C durante 48 horas. La presencia de colonias negras corresponden a los clostridios que han reducido el sulfito a sulfuro, el cual reacciona con una sal de hierro dando el color negro. Mtodos alternativos Los mtodos explicados hasta ahora son los mtodos oficiales dirimentes que se han establecido; sin embargo, en los trabajos de
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rutina, se pueden utilizar otros mtodos ms rpidos e igualmente fiables. Los mtodos alternativos se centran, fundamentalmente, en la deteccin y recuento de coliformes y estreptococos fecales, aunque tambin son posibles en el caso de sulfitorreductores. Los mtodos utilizados son: a) filtracin y siembra, para los tres tipos de microorganismos ndice, y b) utilizacin de sustrato definido, para coliformes y estreptococos fecales. La tcnica de filtracin y siembra consiste en realizar el filtrado, de un determinado volumen de agua, a travs de una membrana de 0.45 m. Colocando sta sobre el medio apropiado en una placa. Despus de incubacin a la temperatura adecuada, la presencia de colonias caractersticas nos indica la existencia de los microorganismos ndice. El recuento de las colonias presentes nos indica el nmero de los mismos en el volumen filtrado. La deteccin de coliformes se realiza utilizando el medio lactosa-azida-trifeniltetrazolio (medio de Chapman o agar TTC). Los fermentadores de lactosa aparecen como colonias amarillas, que pueden estar rodeadas de un halo amarillo. El TTC puede ser reducido a formazano, de color rojo ladrillo, de forma dbil por los coliformes, por lo que las colonias de los coliformes pueden aparecer ligeramente anaranjada, pero rodeadas del halo amarillo. La diferenciacin de coliformes totales y coliformes fecales se realiza mediante la incubacin a 37 C, para los totales, y a 44 C, para los fecales. La deteccin de estreptococos fecales se realiza mediante el medio de Slanetz-Bartley (medio glucosa-azida-TTC), que selecciona a los estreptococos fecales por la presencia de azida, que inhibe la microbiota acompaante, y la capacidad de reducir el TTC, que presentan; por tanto, las colonias de estos microorganismos ndice sern de color rojo ladrillo o violeta. Los clostridios sulfitorreductores se pueden detectar con el mismo medio que para la tcnica de tubos mltiples. La utilizacin de sustrato definido se basa en la capacidad de producir -galactosidasa, los coliformes, y de -glucuronidasa, Escherichia coli y los estreptococos fecales. Se realiza incubando una muestra de agua con los sustratos de la enzimas anteriores y a diferentes temperaturas, segn el microorganismo a detectar; es decir, o-nitrofenil--D-galactopiransido (ONPG), para la -galactosidasa, y 4-metil-umberiferil--D-glucurnido (MUG), para la -glucuronidasa.
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Incubando a 35 C, durante 24 horas, podemos detectar la presencia de coliformes por la aparicin de una coloracin amarilla en ONPG, debido a la produccin de o-nitrofenol. La presencia de E. coli la detectamos porque se produce una fluorescencia azul, al iluminar con luz UV, la muestra con MUG, despus de incubar a 35 C, 24 hora. Esto es debido a la liberacin de 4-metil-umbeliferona. Los estreptococos fecales se detectan en MUG, realizando la incubacin a 41 C, en lugar de a 35 C, que utilizbamos para E. coli. Normas de aceptacin Las normas de aceptacin de las aguas son diferentes segn se trate de aguas de consumo pblico o de aguas de bebida envasadas. Las aguas de consumo pblico son "aquellas utilizadas para este fin, cualquiera que sea su origen, bien en su estado natural o despus de un tratamiento adecuado, ya sean aguas destinadas directamente al consumo o aguas utilizadas en la industria alimentaria para fines de fabricacin, tratamiento, conservacin o comercializacin de productos o sustancias destinadas al consumo humano y que afecten a la salubridad del producto alimenticio final". Por otra parte, las aguas de bebida envasadas son "las distintas aguas reseadas a continuacin, que se comercializan envasadas y cumplen las especificaciones que para cada tipo de agua se establecen en esta Reglamentacin: a) aguas minerales naturales, b) aguas de manantial y c) aguas preparadas". Las normas para las aguas de consumo pblico establecen la ausencia de coliformes totales, coliformes fecales y estreptococos fecales en 100 ml de agua, cuando el mtodo utilizado sea el de filtracin. Si el mtodo es el del NMP, ste debe ser igual o inferior a uno en 100 ml de agua, para dichos microorganismos ndice, y en 20 ml, para clostridios sulfitorreductores. Los valores de coliformes totales puede ser rebasado en un 5 % de las muestras como mximo, pero siempre que el nmero sea menor de 10 y no se encuentren en dos muestras consecutivas. Adems, no deben contener patgenos (salmonelas, estafilococos patgenos, bacteriofagos fecales, enterovirus). Los recuentos de totales viables deben de presentar un nmero gua de 10 (37 C) y 100 (22 C). En las aguas de bebida envasadas, las normas establecen que deben cumplir lo establecido para las aguas minerales naturales, que son las siguientes: a) en los puntos de alumbramiento, el contenido de viables no debe superar las 20 colonias /ml (22 C) y 5 colonias/ml (37 C).
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b) despus de envasar, no pueden superar las 100 colonias/ml (22 C) y 20 colonias/ml (37 C), realizndose el recuento en las 12 horas del envasado y mantenida entre 1-4 C. c) en los puntos de alumbramiento, como durante su comercializacin, debe estar exenta de coliformes y estreptococos fecales, en 250 ml, clostridios sulfitorreductores, en 50 ml, y Pseudomonas aeruginosa, en 250 ml. Tema 10 CONTROL TEST MTODOS CONTROL
DE PRODUCTOS FARMACUTICOS. DE ESTERILIDAD. ALTERNATIVOS. DE PRODUCTOS COSMTICOS.

TEST "TODO

O NADA".

Los productos farmacuticos y cosmticos tienen, en la mayora de los casos, una composicin y caractersticas fsico-qumicas similares; la nica diferencia entre ellos es la presencia de un producto activo, en los primeros. Esta similitud es la causa de que las alteraciones producidas por microorganismos son compartidas por ambos tipos de productos. Productos farmacuticos Estos productos podemos dividirlos en dos categoras: a) productos con esterilidad biolgica y b) productos con esterilidad comercial. En los primeros es necesaria la ausencia de microorganismos viables, mientras que en los segundos pueden haber microorganismos, siempre que la poblacin sea pequea y no sean potencialmente patgenos. En el primer caso se realizan controles de esterilidad, mientras que en segundo se efectan controles "todo o nada", como en los productos cosmticos. Test de esterilidad Est encaminado a poner de manifiesto cualquier poblacin existente en el producto, por pequea que sea. Por esto puede considerarse como pruebas de enriquecimiento, utilizndose medios lquidos, que aseguran una disponibilidad amplia de nutrientes. Los tiempos de incubacin son muy amplios para poder detectar turbidez, a partir de poblaciones muy pequeas. Los medios utilizados deben de asegurar el crecimiento de la totalidad de microorganismos presentes, por lo cual se utilizan medios generales. Asimismo, tenemos que utilizar temperaturas de incubacin que permitan detectar el rango ms amplio de microorganismos.
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Los medios de cultivo utilizados son TSB, que se destina a la deteccin de aerobios exigentes, y el medio de tioglicolato, para facilitar la deteccin de microorganismos que requieren condiciones reductoras. El procedimiento consiste en sembrar 20 unidades, por separado, en ambos medios, incubando durante 14 das a 22 C (TSB) y 37 C (medio de tioglicolato). Mtodos alternativos En el caso de productos no miscibles, o insolubles, en agua, el mtodo anterior no es fiable. En estos casos se utilizan mtodos alternativos como puede ser disolverlos en disolventes orgnicos y realizar una filtracin, aadindose el filtro, entero o partido en dos, a los medios de cultivo. Productos cosmticos Los productos cosmticos, as como los farmacuticos que no requieren esterilidad biolgica, se controlan mediante el test de "todo o nada" (ver Tema 5). En el caso de obtenerse crecimiento, debe realizarse una identificacin de los microorganismos contaminantes, as como un recuento de los mismos.

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