EFEITO DO CURTO PERODO DE ESTOCAGEM DOS OVCITOS E TEMPO DE ENXAGUE DA GUA DE ATIVAO DOS GAMETAS NA REPRODUO DE DOURADO Salminus

brasiliensis Marcos Weingartner* e Evoy Zaniboni Filho

*Laboratrio de Biologia e Cultivo de Peixes de gua Doce (LAPAD/CCA/UFSC), Rodovia SC 406, n 3532, Armao, 88066-000 Florianpolis, SC. E-mail:marcos@lapad.ufsc.br

Resumo Vrios fatores tm afetado a qualidade dos gametas de peixes aps a extruso. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de um curto tempo de estocagem entre a extruso dos ovcitos e a fertilizao, bem como o tempo de enxge da gua de ativao dos gametas sobre a taxa de fertilizao de ovos de dourado Salminus brasiliensis. Para isso, ovcitos obtidos atravs de reproduo induzida foram fertilizados com diferentes tempos aps a extruso, sendo: 10, 25, 35 e 55 minutos (T1, T2, T3 e T4, respectivamente). Para avaliar o efeito do tempo de enxge, a gua de ativao dos gametas foi mantida por 1, 2 e 3 minutos at o enxge e posterior acondicionamento dos ovos nas incubadoras. Todos os tratamentos foram realizados em triplicata e a taxa de fertilizao foi medida sete horas aps a fertilizao, quando foi observado o fechamento do blastporo a uma temperatura de 25,3 C. As taxas de fertilizao revelaram uma relao inversa entre o aumento do tempo de estocagem e a taxa fertilizao, com valores de 82,902,87%; 79,675,59%; 61,403,16% e 44,813,13% para T1, T2, T3 e T4, respectivamente. Contudo, a anlise de varincia seguida de teste Tukey mostrou no haver diferena significativa (P>0,05) nas taxas de fertilizao entre T1 e T2. Houve uma diminuio na taxa de fertilizao com o aumento do tempo para o enxge, com valores de 18,205,94%; 12,038,54% e 7,846,03% para 1, 2 e 3 minutos, respectivamente. Desta forma, dentro das condies do atual trabalho, recomendada a estocagem dos ovcitos por um tempo mximo de 25 minutos aps a extruso, bem como, realizar o enxge da gua utilizada para a ativao do smen depois de 1 minuto, a partir do qual so observados prejuzos na taxa de fertilizao de ovos de dourado. Introduo Conhecer os processos que envolvem a ativao e fertilizao dos gametas das espcies de peixes utilizados na piscicultura extremamente importante para o sucesso reprodutivo destes peixes. O tempo envolvido entre a extruso e a ativao dos gametas pode determinar o sucesso na fertilizao, durante o processo de reproduo induzida (Yang & Chen, 2006), bem como, as condies em que ocorre a fertilizao determinante para a produo final e qualidade das larvas (Sawada et al., 2006). Para muitas das espcies amplamente cultivadas no mundo muito se conhece das exigncias dos gametas ps-ovulao para obteno de razoveis taxas de fertilizao (Rottmann; Shireman & Chapman, 1991). No entanto, para as espcies nativas brasileiras, faltam conhecimentos essenciais para o sucesso da reproduo em cativeiro destes peixes. Segundo Zaniboni-Filho (2000), um dos motivos que levaram a esta falta de conhecimento se deve ao fato de que o desenvolvimento da piscicultura brasileira ocorreu por meio do cultivo de espcies exticas, sendo que, por muito tempo, as espcies nativas no foram consideradas para a piscicultura.

Desta forma, muitas das tcnicas reprodutivas para os diversos peixes nativos ainda esto sendo descobertas, sendo que os principais pacotes tecnolgicos voltados reproduo dos peixes so os mesmos utilizados para espcies exticas (Andrade & Yasui, 2003). Entre os peixes nativos que tem despertado interesse entre os piscicultores e centros de pesquisa, destaca-se o dourado, S. brasiliensis. O dourado um caracdeo encontrado na bacia dos rios Paran, Paraguai, Uruguai, So Francisco, alm daquelas ligadas ao sistema lagunar da Lagoa dos Patos (Morais Filho & Schubart, 1955; Froese & Pauly, 2003). a espcie que atinge o maior tamanho entre os representantes do gnero Salminus, podendo passar de um metro de comprimento (Morais Filho & Schubart, 1955). Segundo Vazzoler (1996), uma espcie migradora de desova total anual, possui ovos semidensos e no apresenta cuidado parental. Por ser uma espcie de piracema, no reproduz naturalmente em cativeiro, necessitando de induo hormonal para a maturao final, ovulao e desova. De acordo com Weingartner & Zaniboni-Filho (2005), historicamente o dourado tem apresentado baixas taxas de fertilizao durante o processo de reproduo induzida em diferentes laboratrios brasileiros. Estes autores acreditam que esta baixa taxa de fertilizao deve estar associada ao uso de procedimentos inadequados, devido utilizao de tcnicas desenvolvidas para as espcies exticas. Desta forma, este trabalho tem como objetivo estudar alguns procedimentos relacionados fertilizao dos ovcitos de dourado, avaliando a viabilidade dos ovcitos estocados por curto perodo em condio ambiente e o efeito do tempo de manuteno da gua de ativao dos gametas at o enxge. Material e Mtodos Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Biologia e Cultivo de Peixes de gua Doce (LAPAD/UFSC), durante o perodo reprodutivo 2004/2005 e 2006/2007. Foram utilizados reprodutores de dourado do plantel mantido pelo LAPAD composto por exemplares selvagens capturados no alto rio Uruguai, bem como descendentes diretos (F1 - produto do cruzamento dos indivduos selvagens). Para obter a maturao final e desova em laboratrio foi seguido o protocolo de induo hormonal recomendado por Zaniboni-Filho & Barbosa (1996), sendo aplicadas trs doses do hormnio de extrato de pituitria de carpa, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 5,0 mg/kg, com intervalos de 24 horas entre a primeira e segunda aplicao e 12 horas entre a segunda e terceira. A desova ocorreu 5 horas aps a ltima aplicao a uma temperatura de 25C, totalizando 125 horas-grau. Foram utilizados ovcitos provenientes de uma nica fmea para a realizao de cada experimento. O trabalho consistiu na realizao de dois experimentos, um avaliando a qualidade dos ovcitos submetidos a perodo varivel de estocagem entre a extruso e a fertilizao; e o segundo buscou avaliar o efeito do tempo de manuteno da gua de ativao dos gametas, antes do enxge. A gua de ativao aquela adicionada aos gametas ainda secos para desencadear o processo de hidratao dos ovcitos e motilidade do smen, tcnica conhecida como fertilizao a seco (Zaniboni-Filho e Weingartner, 2007). O enxge realizado para retirada

do smen imediatamente aps a fertilizao, do contrrio, pode haver o comprometimento da qualidade da gua durante a incubao dos ovos. No primeiro experimento, os ovcitos foram estocados em temperatura ambiente por tempos de: 10, 25, 35 e 55 minutos entre a extruso e a fertilizao. Foi utilizado um tempo de enxge de 3 minutos aps a adio da gua. Para o segundo experimento os vulos foram fertilizados 10 minutos aps a extruso com tempos de enxge variando de 1, 2 e 3 minutos aps a adio da gua, sendo posteriormente liberados nas incubadoras. Para ambos os experimentos, cada tratamento foi feito em triplicata. A fertilizao foi feita em recipientes de 500 ml contendo 10 gramas de ovcitos cada. Foi utilizada uma relao de 4 ml smen por quilo de ovcito. O smen foi previamente misturado aos ovcitos antes da distribuio nos recipientes de 500 ml. Para ativao dos gametas foi utilizado um volume de 100 ml de gua no experimento de estocagem e de 40 ml para o experimento de tempo para o enxge da gua de ativao. Estas diferenas no volume de gua de fertilizao foram utilizadas para exacerbar o efeito dos tratamentos nos diferentes experimentos. Segundo Weingartner & Zaniboni-Filho (2006), os volumes utilizados em ambos os experimentos adequado para proporcionar boa taxa de fertilizao para o dourado, no entanto, 40 ml de gua para 10 gramas de ovcitos o limite mnimo recomendado. Para a incubao dos ovos, foram utilizadas incubadoras cilndro-cnicas de 56 litros com fluxo contnuo de gua no primeiro experimento, enquanto no segundo experimento foram utilizadas incubadoras cilndro-cnicas com 18 litros de volume til, sem renovao de gua e com aerao constante para garantir a movimentao dos ovos. Durante os trabalhos de fertilizao e incubao a gua apresentou temperatura de 25,3 C e 6,70 mg de oxignio dissolvido. Foi utilizada a taxa de fertilizao para avaliar o efeito dos tratamentos sobre a qualidade dos ovos. A taxa de fertilizao apresenta alta correlao com a qualidade dos ovcitos obtidos por reproduo induzida, e dessa forma, recomendada para avaliar o efeito de experimentos como estes (Rizz et al., 2003; Formacion et al., 1993). A taxa de fertilizao foi quantificada sete horas aps a fertilizao, quando era observada a fase de fechamento do blastporo, atravs da amostragem de 260 ovos de cada incubadora, conforme Zaniboni-Filho (1992). Em ambos os experimentos, os dados foram submetidos anlise de regresso linear para avaliar o efeito dos tempos de estocagem e do enxge sobre as taxas de fertilizao. Foi utilizado ANOVA para verificar a existncia de diferena estatstica significativa entre os tempos de cada experimento e o Teste-Tukey para separao de mdias. Resultados e Discusso Em ambos os experimentos houve alterao nas taxas de fertilizao em funo dos tratamentos utilizados. A taxa de fertilizao foi inversamente proporcional ao tempo de estocagem dos ovcitos (Figura 1). No entanto, no houve diferena na taxa de fertilizao para os tempos de estocagem de 10 ou 25 minutos (P>0,05) com valores de 82,912,87% e 79,675,59, respectivamente. Entre 35 e 55 minutos de estocagem houve um decrscimo significativo (P<0,01), com valores de fertilizao de 61,393,16% e 44,823,13%, respectivamente.

Para o tempo de enxge, foi observada uma queda nos valores da taxa de fertilizao com o aumento de tempo de manuteno da gua de ativao. Os valores caram de 18,205,94% com enxge aps 1 minuto da adio da gua, para 12,038,54% e 7,846,03% de fertilizao quando o tempo foi de 2 e 3 minutos, respectivamente (Figura 2). No presente trabalho foi observada uma reduo na taxa de fertilizao dos ovcitos estocados por curto perodo, com efeito significativo aps 25 minutos da extruso. Rizzo et al. (2003) avaliaram a taxa de fertilizao e alteraes estruturais de ovcitos de curimba Prochilodus marggravii estocados em condies ambiente por at 120 minutos aps a extruso, em intervalos de 30 minutos. Estes autores tambm observaram queda significativa da fertilizao nos diferentes tempos e atriburam este fato a uma alterao no citoesqueleto dos ovcitos, sendo que a estrutura da micrpila no foi alterada, permanecendo aberta durante a estocagem, justificando a capacidade de fertilizao dos ovcitos.
90
85 a

Taxa de fertilizao (%)

y = -0,008x2 - 0,359x + 88,68 R = 0,946

80 75 70 65 60 55 50 45 40 c b

10

20

30

40

50

60

Tempo de estocagem (minutos)

Figura 1. Valores mdios (DP) da taxa de fertilizao de ovos de dourado (S. brasiliensis) submetidos a diferentes tempos de estocagem entre a extruso e a fertilizao.
30 25 y = -5,179x + 23,04 R = 0,988

Fertilizao (%)

20 15

10
5 0 0 1 2 Tempo para o enxge (min) 3 4

Figura 2. Valores mdios (DP) da taxa de fertilizao de ovos de dourado submetidos a diferentes tempos de manuteno da gua de ativao dos gametas at o enxge. No segundo experimento, a variao no tempo para a realizao do enxge dos gametas tambm afetou a taxa de fertilizao dos ovos de dourado. Uma das possveis causas

desta reduo pode esta associada a qualidade da gua durante a ativao dos gametas. Weingartner & Zaniboni-Filho (2006) observaram um aumento na taxa de fertilizao de ovcitos de dourado quando aumentaram o volume da gua utilizada para a ativao dos gametas. Estes autores concluram que este fato pode estar relacionado qualidade de gua durante a fertilizao, onde a utilizao de um pequeno volume de gua provoca uma rpida degradao da qualidade da gua, motivada pelo consumo do oxignio dos gametas e pela oxidao do smen, que possui um pequeno tempo de vida aps a ativao. O baixo tempo de vida do smen de peixes telesteos aps ativao tambm tem sido observado por vrios outros autores (Coward et al., 2002; Vladic & Jarvi, 1997). O efeito da qualidade da gua sobre a viabilidade de ovos foi observado por Sawada et al. (2006), que verificaram uma alta taxa de mortalidade dos ovos de Seriola dumerili submetidos na fase inicial de incubao a um curto perodo de hipxia. De acordo com os resultados observados neste trabalho, a baixa taxa de fertilizao observada nos ovos mantidos por tempo superior a 1 minuto antes do enxge pode estar relacionado no apenas ao tempo, mas a qualidade da gua durante o perodo de ativao dos gametas. Desta forma, o incremento no volume de gua de ativao dos gametas deve possibilitar a manuteno de boas taxas de fertilizao mesmo quando o enxge realizado em tempo superior a 1 minuto. Contudo, novos testes devem ser realizados para confirmar a relao entre tempo de enxge e volume de gua de ativao na taxa de fertilizao dos ovos de dourado. Concluses Os ovcitos de dourado podem ser mantidos por at 25 minutos de estocagem aps a extruso sem prejuzo da taxa de fertilizao. A gua utilizada para a ativao dos gametas de dourado deve ser mantida por 1 minuto, quando deve ser drenada e os ovcitos enxaguados para a obteno da mxima taxa de fertilizao. Agradecimentos A Barra Grande Energtica S.A, Tractebel Energia e CNPq pelo apoio financeiro. Referncias ANDRADE, D. R.; YASUI, G. S. O manejo da reproduo natural e artificial e sua importncia na produo de peixes no BrasiL. Rev. Bras. Reprod. Animal, Belo Horizonte, v.27, n.2, p.166-172, 2003. COWARD, K.; BROMAGE, N. R.; HIBBITT, O.; PARRINGTON, J. Gamete physiology, fertilization and egg activation in teleost fish . Reviews in Fish Biology and Fisheries, Dordrecht, 12: 3358, 2002. FORMACION, M. J.; HORI, R.; LAM, T.J. Overripening of ovulated eggs in goldfish. I. morphological changes. Aquaculture, Amsterdam, 68, 114:155, 1993. FROESE, R.; PAULY, D. (Eds.). FishBase. Disponvel em: <www.fishbase.org>. Acesso em: 10 de junho de 2003.

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