A restriction map is a description of restriction endonuclease cleavage sites within a

piece of DNA.
Generating such a map is usually the first step in characterizing an unknown DNA, and a
prerequisite to manipulating it for other purposes.
Typically, restriction enzymes that cleave DNA infrequently (e.g. those with 6 bp
recognition sites) and are relatively inexpensive are used to produce at a map.
The DNA to be restriction mapped it usually contained within a well-characterized
plasmid or bacteriophage vector for which the sequence is known.
In fact, there are usually multiple known restriction sites immediately flanking the
uncharacterized DNA, which facilitates making the map.
In the following discussion, it is assumed that the unknown DNA has been inserted into a
plasmid vector, but the principles can readily be applied to other situations.

Creating a Map by Digesting DNA with Multiple Restriction Enzymes

The most straightforward method for restriction mapping is to digest samples of the
plasmid with a set of individual enzymes, and with pairs of those enzymes.
The digests are then "run out" on an agarose gel to determine sizes of the fragments
generated.
If you know the fragment sizes, it is usually a fairly easy task to deduce where each
enzyme cuts, which is what mapping is all about.
To illustrate these idea, consider a plasmid that contains a 3000 base pair (bp)
fragment of unknown DNA.
Within the vector, immediately flanking the unknown DNA are unique recognition sites
for the enzymes Kpn I and BamH I.
As illustrated in the figure below, consider first seperate digestions with Kpn I and
BamH I:
Digestion with Kpn I yields two fragments: 1000 bp and "big".
Since there is a single Kpn I site in the vector, the presence of a 1000 bp fragment tells
you that there is also a single Kpn I site in the unknown DNA and that it is 1000 bp from
the Kpn I in the vector.
The "big" fragment consist of the vector plus the remaining 2000 bp of the unknown.
Digestion with BamH I yields 3 fragments: 600, 2200 and "big". The "big" fragment is
again the vector plus a little bit (200 bp in this case) of unknown DNA. The presence of
600 and 2200 bp fragments indicate that there are two BamH I sites in the unknown.
You can deduce immediately that one BamH I site is 2800 bp (600 + 2200) from the
BamH I in the vector.
The second BamH I site can be in one of two positions: 600 or 2200 bp from the BamH I
site in the vector.

At this point, there is no way to know which of these alternative positions is correct.
The trick to determining where the second BamH I site is located is to digest the plasmid
with Kpn I and BamH I together (click the diagram below with your mouse to see this
effect).
This so-called double digest yields fragments of 600, 1000 and 1200 bp (plus the "big"
fragment).
The 600 bp fragment is the same as obtained by digestion with BamH I alone.
The 1000 and 1200 bp fragments tell you that Kpn I cut within the 2200 bp BamH I
fragment observed when the plasmid was cut with BamH I alone.
You already know where Kpn I cuts in the unknown DNA, and you therefore now know
the location of the second BamH I site!
0100090000032410010000007783000000001610000026060f002220574d464301000000000001
0060e000000000090000000020000064f7000064170100010000006c0000000000000000000000
2f020000ef00000000000000000000005b4400004b1d000020454d4600000100641701000c0000
0001000000000000000000000000000000000400000003000040010000f0000000000000000000
00000000000000e2040080a90300460000002c00000020000000454d462b014001001c0000001
00000000210c0db01000000600000006000000046000000dc0e0000d00e0000454d462b224004
000c000000000000001e4009000c00000000000000244001000c00000000000000304002001000
0000040000000000803f214007000c0000000000000008400005280e00001c0e00000210c0db01
000000000000000000000000000000000000000100000089504e470d0a1a0a0000000d4948445
200000230000000f00403000000eca843c100000030504c5445f8fcf80000f8f80000008000000000
808080f8fc00800000f800f8c0c0c0000000000000000000000000000000000000eb6f4820000000
01624b47440088051d480000000c636d50504a436d7030373132000000074f6db7a500000d6649
44415478daed9d4d92b338128685cb0e6f4d446fd83988394045f802f404336b2fa66e30d16b761c
6166392c7ddb91520224d0bf25012ebd5fb78d1006e7e3ccd40f502094959595959595959595959
59595959595959595959595959595959595959595b523956579d395cd3ad5f51dd5f80da13b2da
bb755569dee51ac2bb03951766ca53b3ae17f840a58773f49b64074e549b393c34ae94b8408fec5
319f93c2c4cf06a3b3e98e993030a7fa74bfd71060d8774e18d99d04570dafa713893a741aab6a54
c31abc626b2b82aaae497e0130e84e22ea0e9c6a523a119be91bf518f0294a70aa22ae7682ad3f0
bcc7d7c65606a0a06a3216693ffea1ade2630d8676ab63df6a03b59206beefb0ba5b75a251e0ccd3
214cc89261da0b502031fa13ec5c0509831f44eab5418ca366058abc483b9cfd62fc1cc55732845f3
989bf727adc1487c09aca1fd983bc4464de289bcd7e40d27576c377923f916fa37354dbe50554392
a6c9b7d6747ef60e46527357efd6ca07eeba063c8c6e9a3a6dda70c83107040339c6bd33ef7a149
9612a9d2c6283f66fa27ee71422e01759fef84669542cfcac706eae772dffe6fa6628eb74dfda6ca35
c3a1f0bdd0c65ee20f2e67ad7d283d146c73265ab53f87afd3da64d5f8fc7b4fcc0fa7a7c7b8021a1a
4b4ffa6fbe8cd7ae3c460d0e36b22f1f58d971f1efb28b426050203be94b055d281c11ec42af58ea40
753860b253166e383797c93285a83f9fa9e4a5a4782508addc14b0ee641e9e0ffbe88830860663ff
18930a642d796db7b0ca9291287d283815979cc8380fb5ef292985e6aecbfe9b2cced76d396758a
0e06a8a8c0d04a0398a2d0d81f080c4dbe7ced9660be0380d10e2f6fc54d5b1691154296890a06fa
312c9456fd1842c40a0c2ad5f6dfde99aed90e8c9edaf7e84ee6e4abb4bfd0758c8bc528ab508fba8
82f89c3ebedc01007c22e44d868fb31d06028edd7a5d35b21e25c964515289ac7d876d9667d9937
2b883d6afb7523297b30e04b621e0b09c6b6cb36eb61de8e8251d91f686a139015c24182825177d
9be9d7624804931b5497d4938445830ca2e9b3f98248a3cb5a9e9b245037376a9d46ebc5058305
c97ed4b60a30463938ccea8393818a1cbf695c1cc60f82e9b15988745bb9406ccf22021c1885d362
59807682c58ecf7f06088b8293b15187ef9f7809943c30e8c8d3e02ccaca060da80da3518a7132bf
83bffbd0ea6bfd9818927bdc7b89c58490526be5b8606d3b621c134dbd1b704a33ab1b2508b2d09f
99dcfd29f733760342756165cc84bd8ef2c2393c42d6d3d46314dbef825814ed8f05f7fed346e6907
4679fe40e0a241efafd55e13b965403051b8acba7a89dcd2028cf6c44a723089dcd2068c9f0101d5
280be1a4f8f2194c4c3091beb2f8a5d3d09f94c11c1e4c9283cc0a0ae627a03e0acc935b77e13770

afb828c144a57f6430510fa2900b0c131841ee15fb02e3abcdc0043f482430c1b50598b3e538cbc6
e8a460a21e241298a7acf2822e4ff4435e16fa31577c0898b589d4cce7e5829ecfcb623dac335458
875228fa71c03c65df999828b51fa9c0202d98b8f4e38051fd980afb9515b395123071e9ef02ccd36
c8c432885a10f60fe31778dffd572fd64b1221a185c0e9963c2d04f0b469efe2e3f4faf56292a7df47e
28f147b281e7a5b75b2557fa21c070874a0a26ea414280f9c96014609e198c1cccec32bf1a8c64fee
b99c164301a308bdde550528279aa761d4e8d6279df6094bbfee5609ef1bff4595908a9c5977f1b8c
66dfbf1a8cb8b32864167b8d720cc985e9ed3fff9af4ef37c1c4f9391b6df11860d4d7b2f96bb9cb445
7542d426986f49748cc120cb29ab871f9c26bd429dc323c18eba4e598db04f8e1b948f0874cbea99
4c02d8f0926855b1e13cc8ed86730194c06f3e160e467b133980c2683c9600e050677b7cff425831
1ec6fcfe7065e8e05e6da5f51cf56f41d5f4d4a575645de592d5eecb5bb5d85d2b93d22981ecd865e
0530509a98cdb50298ef0f067315515880e1d4ad77bbca2518cd11c174249a7acca7efaf1d844edf
d132361abf93d2b5232b586d4f82a9ef1edfb80a0a063024c51c100cb11f1b8a4dc78693170c602c
237855d5e2ff609d014c43260e8fd82a41329d4c67195701a6e7c080b3e085ce00e6a8fd980e3130
d44cb25eed31846307db7724e3905773281d144c3f82e9a8d1da509a6ac9b6d72b59d799c0f093e
14702d341aa259131a5d21eca240193240bd919bfa1fffe67aaed5952869a0f053389186b2b190f1
598374229ce893026cd1913114c87aec856d7450746380f1f30c74424a33b932482b96a9c60a585
77097b0a997ca391d19e610b3788e4aff539c2d50e86338f21c170bb0adb5c47216338231b120c7f
7958503032329e0fd59c3e663a537d09796bfa0c393098f28f3f6fa17e4064c5e52060824753842b1
b7488393b7430cee34ca74b072f2899945c1c92ef799ce974eaf9062493948b43737d6e7dc08423
e3cc850e96a19bd74ff3bcdd54db8b430636b69ac13cbdc0f07f52c4858c7fabe4ee2f184cc7e632a
79101d7bb8599cd79e6f3da8933bff6438233396be004863dac41f4999b0717e41b472398c97c7b3
0820c60cecb5032893d794320e307a675fb189dd28539076c797f25636732df0034d81203438bbd
3f980635d842b155b2042390f102d3ba7e8c4edeb2293a9885a1cbd31254002e56bcc2848c07185
93fc616cc4c66ce312ed9a6754e4d2218e20d131898bd64604828b1a2afc7482f6735887b2ec95b
6d93477eb942708c6050cf81b95e05306331251861d7fe647cf2ee02cc34c1bb08a56e3e89e29f7c
3d424946c6b9b96e7d3e06107a98d8eda01f0333bad051a153c11d4dc03d2b4e73c469c0080fe8a
5649c1ff54cb9bcf184682afbc9df14606ee2de1b0f0b591c6d0f861f2b8a30248348373040867b7e9
f4d748cf9a5f07fd83ac869f6570a861f2b8a920c224d5a3e721993997f7a1b27685d368ea8d0606e
4b93ce8d1398d665e3438341e73f2707324707d74ebf1b4a3b03b37ee4b24b7f26edfc4b5230121
57ffc3961bbd973d9de631aa46a95907babb47ee4322a8ad1670a7de210fda52836cd32c1fb31ab2
70b130b19193d98451c6d0e467917add75849060695631f5837625ee6177842f40781593d72991
da7593d7258cf656b850e25b4b69fcd76b6da47c7afb9447ea26d623092472ed3271a83edeaacb1
e6327dec33c0481eb93c5ba89ead94c4d1278211ede7a6365b45ee95e517cfb32e7b052379e4b2
89c0fef26e0c3026b596ebb6570a300db7b4a6d09a3ff619609ad55febe0c1ac38a8fde597815990d
0c4d16f0323b0d0e5975f0786a3a1cdbbbf0fccc443df1e490ff98aabff6d0b861131b4d37b06d38c1
73b3881b185edf3836c0886bfc1ed3c5e37e406c6e2699e2dfe67a3fd8069daf99648dc1f8b05c692
cb8ec020ee265a6e92dc1e0cde38a0c7b4bb01c3dfa8ef0186cc4759784c6beb33cde2c84705037
3bb6630ad7534358bd352326b867218aa012f945030193fd037e9769660b8d32a96601ae93edf6b
95ce26301536b29a4caea418947cacc1c8ff18882518bb1904cb9eaf742bb985430230ea5fce2290
9cedb423c31d5c656155beca0a47145e1a2a1c5778a92c4911af254183dfaa175dc0aba152164c4
a30c6bfb5f93e18ebd1b51b986180ff21b0b0e550ae9833552f280c740113611b57a9c0d86c643f1f
2305ae0343dc8480a988d9d823aab29cc0808f94b0308c144b0730ef8592c5460e33780e6098b73
08fa9a8b3d08c4cc1bc48f800c1a1a24e43374e03c622923ce77ce7a3cb32660530c0de6a063310
379287d2483195c798c1f89e25d083c1d975284b48bf6409ffab48d840be251e52d24d20f9e28592
646552ed927ce382691dd75b82916b50b7d4eaca6dc0b41e351f0546715f6babb97b5559f7f406f3
92343ac6cac860f8954fce2b344f59e60ef05c6fe505c6471b806991160c3756fc2560382ed28ae91
3f28b3b3f1d4cab24365748c9e8c19492aec86bec02b351126c376d467abee5d44e0fd0c457a9c0a
8b8183faf3c880a0cd7b4f0842ad6e71de4db55f3c6d5a27d4a0cc6f67a0625194f30d5cec02c2386
72798e4ff15ce8c2550864b80a051898b91bbbbb2f1822e21259c623a3171d56e2f5d476ba503130
50aa128359d8cef2cb737ceeebe253ec59b0b48227c355c8c1c038719c5f600325b6504e8986cdcf
c02089cc46e09578f80025322583f34d323017d163581c3d5560100f4620630643c78630eaa9e89
cc330d061a338d61e682e268e54d1f82947849b85d2945f9460c48a990ce7631a30e334384cb5bc
aa9203338fb599c7cc6086d7d660e6bcab027341620547c6ca635e7c28b199058662a0a1b44730
5c7ba4cc310b301319638e211902b22ec9bb25745a20bf5430f340fb317432a284cc0215748a622
ea9fa3121b506c3b7d3aa56e9e76759c1c8985ba5b969564a5bb9565c30522e4e3b6a162b3e0c8
cff75aa4b321a30fa338fe6f3921b8079e7fa5de52310ddec74560a30ef5dd72c92f92430ef5eef2d90

f92030ef5f07cf93f91c3021ee0fe0c834de3bd987a6ef1fe6be89894cb407f3a6d26848a8fb4946328
707c30c08779f0d23d36c6dd8db76c06bc8fb8f2899666bc3de568b42df9745c8ecf34e2f3735c1ad
383787cf306046f85f37ea9ff54fa6363819723fc3d65605b002216439f3652bf4093e132b4b1e9d4c
bcd6e3d86462b6aa4726f311ad6a565656565656565656d6e6fa3fef75e3cee69ddab6000000004
9454e44ae4260820840010824000000180000000210c0db010000000300000000000000000000
00000000001b40000040000000340000000100000002000000000000bf000000bf00000c440000
704303000000000000b3000000b3ffff0b44000000b3000000b3ffff6f432100000008000000620000
000c00000001000000150000000c00000004000000150000000c00000004000000510000002407
010000000000000000002f020000ef0000000000000000000000000000000000000030020000f00
000005000000054000000a400000080060100000000002000cc0030020000f0000000280000003
0020000f000000001000400000000000000000000000000000000000b000000000000000000000
0ffffff00f8fcf800f80000000000f800008000008080800000fcf80000008000f800f800c0c0c0002222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222

22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222202222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22220022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222220022222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222

22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222221610000026060f002220574d4643010000
0000000100000000000000090000000020000064d700006417010022222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200222222000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000022222
22002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222200200022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222220002200222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222220002222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222202220022222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222002202222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222200
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
20022222002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222220222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222002222222220222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222220222222222222002222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222200222222222220222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222

22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222202222222222222220022222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222022
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222202222
22222222222220022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
0022222222222222220222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222202222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
2222222222222222222002222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222202222222222222222222222002222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222002222222222222222222220222222222222222
22aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222202222222222222222222
22222002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222200222222222222222222
22222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
20222222222222222222222222220022222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220
02222222222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aa333aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa333aaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaa2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222220222222222222222222222222222200222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222200222222222222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222220222222222222222222222222222222002
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222222022222222

222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220222222222222
22222222222222222222002222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222222222222
222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa33333333a333aa33aa333
aaa33a333aaaaaaa3aa3aaa333a33a333a33aaa333aa333aa3a33aa333a33333aaaaa3333333a
33a33333aaa333333aaa3333333a33a33333aa333a333aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222022222222222222262222222222222222220022222222222222222222226222662226
62226622222222222222222222222222222222666622662226622266222222222222222222200
222222222222662226622266222662222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3
aaa3aa3a3aaaa3aa3a3aa3aa3aa3aa3aaaaaa3aa3aaaa3aa3aaa3aa3aaaaa3aaa3aaaa33aa3aa
3aa3aa3aaaaa3aa3aa3aa3a3aaa3aaaaa3aaaa3a3aa3aa3aa3aa3aa3aaaa3aaa3aaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000002222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222022222222222222262222222222222222222200222222222
22222222222622622626226262262222222222222222222222222222222622226226262262622
622222222222222220022222222222226226262262622626226222022222222222222222aaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aa3aa33aa3aaaaaa33aa3aaaa33aaaaa3a33a3aaa3aa3aaa3aa3
aaaaa3aa3aaaaa3aaa3aa3aa3aa3aaaaa3aa3aa3aa3a3aaa3aaaaa3aaaa3a3aa3aa3aa3aa3aa3
aaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000002222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222022222222222222262222222222
22222222222200222222222222222222622622626226262262222222222222222222222222222
22226222622626226262262222222222222200222222222222222222626226262262622622202
2222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aa3a3aa3a3333a33aaaa3aa33aaaaaa
a3aa3a3aaa3aa3aaa3aa3aaaaa3a3aaaaaa3aaa3aa3aa3aa3aaaaaa333aa3aa3a3aaa3aaaaa3a
aaa3aa333aa3aa3aa3aa3aaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000002
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222022222
22222222226222222222222222222222222002222222222222222622622626226262262222222
22222222222222222222222222622622626226262262222222222220022222222222222222266
2262262622626226222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aa33aa3a3aa3a3
aa3a3aa3aa3aa3aa3aaaaa3aa3aa3aa3aa3aaa33a3aaaaa33aaaaaaa33aa3aa33a3aa3aaaaa3a
a3aa33a3a3aa33aaaaa33333aa3aa3aa33a33a3aa333333aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222
22222222222222222000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222202222222222222626222222222222222222222222220022222222222262622
62262622626226222222222222222222222222222222222262622626226262262222222222002
2222222222222222222226262262622626226222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaa33a3a33aa3333a33aaa333a333aa333aaaa33a333a3333a333aa3a3aaaaaa3a3aaaaa3
3a33aa33a3aaa3aaaaaa33aa33a3aaa33a3aaaaa3aaa3aaa33aa33a3aa3aaa3aaaa3aaa3aaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222222000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222202222222222222266222222222222222222222222
22220022222222222662262262622626226222222222222222222222222222222262262622626
22626226222222220022222222222222222222262262622626226262262220222222222222222
22aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3
aaa3aaaaaaaa3aa3aaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaa3aaa3aaaaaaaaaaa
aaaaaa3aaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222222000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222202222222222222226222

22222222222222222222222222200222222222262226622266222662222222222222222222222
22222222222662226622266222662222222002222222222222222222222226622266222662226
62222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaaaaaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3
aaaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222
22200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
20222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222200222222222222222222222
22222222222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa33aa3
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaa33aaaaaaa333aa333aaaaaaaaaaaaaa33
3aaaaaaaaaaaaaaaaaa33aaaa33333aaaaaaaaaaaaaaaaa333aa333a333aaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaa2222222222222222222200000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000022222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222220222222222222222222222222222222222222222222222222220022
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022
22222222222222222222222222222222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222200000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000022222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222220222222222222222622222222222222222
22222222222222222220022222222222622222222222222222222222222222222222222222222
22222622222222200222222222222222222222222222222222222222622222222222022222222
222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222200000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000022222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220222222222222
22262222222222222222222222222222222222222200222222222622222222222222222222222
22222222222222222222222222622222220022222222222222222222222222222222222222222
622222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222
22222222220000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222022222222222222262222222222222222222222226222222222222222002222222622
22222222222222222222226222222222222222222222222622222002222222222222222262222
222222222222222222222622222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa333aaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa333aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000002222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222022222222222222262222222222222222222222226222222
22222222222002222262222222222222222222222226222222222222222222222222622000222
222222222222222262222222222222222222222222622222222222022222222222222222aaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000002222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222221610000026060f002220574d46430100000000000
100000000000000090000000020000064b7000064170100222222222222202222222222222226
66666666666666666666666666666666666666666666006666666666666666666666666666666
66666666666666666666666006666666666666666666666666666666666666666666666666222
22222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

aaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222
22222200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22220222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222222
22222222222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaa333aaa333333a33aa333a33aaa333a333a33a33a3333a333aa33aaaaaa33aa333a
aaaa333aaa33aaa33aaaaa333aa333333a33a333a333a33aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaa2222222222222222222200000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000022222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222220222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222220022222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222022222222222222222aaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaa3aaa3aa3a3aa3aa3aa3aaaaa3aaa3aa3aa3a3aa3a3
aaaa3aa3aaaaa3aa3aaa3aaaa3aa3a3aa3a3aa3aaaa3aa3aa3aa3aa3a3aaaaa3a3aa3aaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222200000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000022222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222220222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222
22200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222022222
222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaa3aa3aa3a3aaaaa3a3aaa
aaa3aaa3aa3aa3a3aa3aa33aa3aaaaaaaa3aa3aaa3aaaaaa33a3aaaa3aaaaaaaaa33aa3aa3aa3
aa33aaa3a3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222200000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000022222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222222222
22222222222222222222220022222222222222222222222222222222222222222222222222222
222222222222222022222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaa
aaaa3aa3a3aaaaa33aaaaaaa3aaa3aa3aa3aa333a3aa3a3333aaaaa3aa3aaa3aaaa33aaa3333a
3333aaaa33aaaa3aa3aa3a3aa3aa3a3333aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222
22222222222220000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222202222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222002222222222222222222222222222222222002222222222222222222222222222222222
222222222222222222222222222222222220222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaa3aa3a3aa3aa3a3aaaaaa3aaa33a33a3a3aa3a3aa3a3aa3aaaaa3
aa3aaa3aaaa3aa3a3aa3a3aa3aaaa3aa3aa3aa33a3a3aa3aa3a3aa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000000000077777777777777
77777777000777777777777777777777700002222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222202222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222220022222222222222222222222222222200222222222222222
222222222222222222222222222222222222222222222222222222220222222222222222222aa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaa3a33aa333aa3a33aaaaa3aa33a3aa3a
aa33aaa3333a33aaaaa333aa333aaaaaa333aa33aaa33aaaaaa333a33a33a3aaa3333a3aa33aa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000
00000007777777777777777777777000777777777777777777777700002222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222220222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222
22002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220
2222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaa3aa3aaaaaaaaa
a3aaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222002
22222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222

2222222222222222222202222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaa3aaa33aa3aaaaaaaaaa3aaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
22222222222222222222000000000000000000000000000000000022000220002200000000000
00000000000000000000000222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222002222222222222222220022222222222222222222222222222222222
2222222222222222222222222222222222222220022222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa333a3a33aa3aaaaaa33aaaaaaa333aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3aaaaaaaaaaaa33aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222222000000000000000000000000000000000200
20200202002000000000000220002200022000000000222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222022222222220000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000222222022222222222222222
22222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222222222000000000000000
00000000000000000020020200202002000000000002002020020200200000000222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200222222220
44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444400444444444
40044444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444440222
20022222222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa22222222222222
22222200000000000000000000000000000000020020200202002000000000002002020020200
20000000022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222200022222044444444444444444444444444444444444444444444444444444444
44444444444400444444004444444444444444444444444444444444444444444444444444444
44444444444444444020002222222222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaa2222222222222222222200000000000000000000000000000000022200200202002000
00000000200202002020020000000022222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222200000044444444444444444444444444444444444
44444444444444444444444444444444444004400444444444444444444444444444444444444
44444444444444444444444444444444444444002222222222222222222222222222aaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222200000000000000000000000000000
00000200020020200200000000000222002002020020000000022222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222202202044444444444444
44444444444444444444444444444444444444444444444444444444440044444444444444444
44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444022222222222222222
222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222222222222222200000000
00000000000000000000000000022002200022000000000000020002002020020000000022222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
20220204444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444
00440044444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444
444022222222222222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2222222
22222222222220000000000000000000000000000000000000000000000000000000000002200
22000220000000002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222

22222222222222222222220220200000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
000000000000000000000000022222222222222222222222222222aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaa222222222222222222220000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000002222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222220220222222222222222222222222222222
22022222222222222222220222222222222222002222222222002222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222022222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222220000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000002222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220220222222222
22222222222222222222222022222222222222222220222222222222200222222222222220022
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222022222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222022022222222222222222222222222222222022222222222222222220222222222220
02222222222222222220022222222222222222222222222222222222222222222222222222222
02222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222022022222222222222222222222222222222022222222222
22222222022222222200222222222222222222222200222222222222222222222222222222222
22222222222222222222202222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222022022222222222222222222222
22222222202222222222222222222022222220022222222222222222222222222002222222222
22222222222222222222222222222222222222222202222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222022022
22222222222222222222222222222202222222222222222222022222002222222222222222222
22222222222002222222222222222222222222222222222222222222222222202222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222202222222222222222222022200
22222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222222222222222222
22222220222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222

22222222222222222222222222200000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000022222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222002222222222222222222222222222222222222200222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222200000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000022222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222233333332233333332222222222
22222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222
22200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000022222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222232232
23222223222222222222222222222222223333333222222222222230033332222222222222222
22222222222222222222222222002222222222222222222222222222222222222223333333222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222220000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222223223223222232322222222222222222222222223223223222222222222002
23222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222
22222222222322322322222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222220000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000002222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222333332222322232222222222222222222222223
22322322222222220022232322222222222222222222222222222222222222222222222200222
22222222222222222222222222222222322322322222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222220000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000002222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222223222223222
22222222222222222222233333222222220002222322232222222222222222222222222222222
2222222222222222220022222222221610000026060f002220574d464301000000000001000000
00000000090000000020000064970000641701002222222222222222222222223333322222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222200007777777777777777777777000000000000000000000000000077777777777777
77777777000022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222322332222333333322222222222222222222222222222222200222222322222
32222222222222222222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222200007777777777777777777777000000000000000000000
00000007777777777777777777777000022222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222323232222322232222222222222222222222222322
33222002222222222333333322222222222222222222222222222222222222222222222222002

22222222222222222222222222222232233222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222200000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000022222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222323232222322232222222
22222222222222222232323200222222222222322232222222222222222222222222222222222
22222222222222222222002222222222222222222222222222232323222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200000
02220022000220002200000000000000000000000000000000022200220002200022000000022
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
33333222223332222222222222222222222222232320022222222222222322232222222222222
22222222222222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222232323
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222220000000200200202002020020000000000000000000000000000000002002
00202002020020000002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222233003222222222222
22223332222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200222222222
22222222222222223333322222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222220000000200200202002020020000000000000000
00000000000000000200200202002020020000002222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222233333222233333222222222222222222222
22220022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222220000000200200202002
02002000000000000000000000000000000000200200202002020020000002222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222232222222232222
22222222222222222222222003333322222222222222233333222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222002222222222222222222223333322222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22000000020020020200202002000000000000000000000000000000000200200202002020020
00000222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222223222222223222222222222222222222222200223222222222222222222232222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222222
22322222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222288882222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222000000020020020200202002000000000000000000000000000000
00020020020200202002000000222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222223333322222333322222222222222222220022223222222222
22222222223222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22220022222222222222222322222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222228822
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222000000220002200022000220000000000
00000000000000000000000220002200022000220000000222222222222222222222222222222

22222222222222222222222222222222222222222222222223222222222222222222222222222
22200222222333332222222222222222333322222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222200222222222222222333332222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222882222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222223222222
22222222222222222222220022222222322222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222222322222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222882882288882888888288822888828888888822888288888882222888888882888288888
22288888822288888888288288888882888888882222222222222222222222222222222222222
22222222200000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222233332222222222222222222222002222222222322222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022
22222222232222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222882882228822882288288222288222882882882288288228822
22882882288288288288222228822882882882288288288228822288228822222222222222222
22222222222222222222222222222200000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000022222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200222222222222233
33222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222220022222222223333222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222882882228822882288288222288228
82288288228828822882222282882288288288288222228822882282882288288288228822288
22882222222222222222222222222222222222222222222222200000000000000000000000000
00000000000000000000000000007777777777777777777777000022222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222228828828228
82288228828822228828822288288228828822882222228882288288288288222228822882228
88228828828822882228822882222222222222222222222222222222222222222222222200000
00000000000000000000000000000000000000000000000007777777777777777777777000022
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222233
33333223333333222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222882882822882288228828822228888222288288228828822882222882882288288
28828822222888882288288228828828822888888822882222222222222222222222222222222
22222222222222220000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000002222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222223222222222222222220022222222222222223333333222222222222
23333333222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222002333333322222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222228882882888882888828888222228828222888882288888
22288222228882288888222888822222882288228882288888288222882228822882222222222
22222222222222222222222222222222222220000000000000000000000000000000000000000
00000000000000002220222200220002200000002222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222223222222222222222002222222222222222
22222322222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222220022322222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222228228822222
22882282222222222222222288222222222222222222228822222882288222222222222222222

88222882288222222222222222222222222222222222222222222222220000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000200020202002020020000002222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222223222222222222
20022222222222222222222222322222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222200322222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222288222822882222222882228222222222222222288222222222222222222228822222882
28822222222222222222288222882288222222222222222222222622222222222222222222222
22000000000000000000000000000000000000000000000000000000000200002002002020020
00000222666666666666662222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222333333322222222002222222222222222222222222322222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222288222228882222228888288882222222222222888822222222
22222222228882222888888222222222222222222888828888888822222222222222222222662
22222222222222222222222000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00020000020200202002000000222666666666666662222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222200222222222222222222222222333333322222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222233333002222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222266622222222222222222222222000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000020000020200202002000000222222222222222662222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222266662222222222222222222222000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000020020020200202002000000222222222
22222266222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
00222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222200222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222266666222222222222
22222222200000000000000000000000000000000000000000000000000000000220002200022
00022000000022222222222222266222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222220022222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222226666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666
66666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666
66666666662222222222222222222200000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000022222222222222266222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222002222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222002222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222226666666666666666666666666666666666666666666666
66666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666
66666666666666666666666666666662222222222222222222200000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000022222222222222266222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222233300332222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220022222222222

22222222222222222222222222222222222222222222222222226622222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222226666622222222222222222222200000
00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000022
22222222222226622222222222222222222222222222222222222222222222222222222222220
02222222222222222222222222222222222223333333222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222223333333
22222222220022222222222222222222222222222222222222222222222222222222222226622
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222226666222222
22222222222222220000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000002222222222222226622222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222200222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222200222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222662222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222666222222222222222222222220000000000000000000000000000000000000000
00000000000000000000000000000000000000002222222222222226622222222222222222222
22222222222222222222222222222222222220022222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222002222222222222222222
22222222222222222222222222222222222222662222222222222222222222222288882222222
22222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222
28888222222222222222222222222222662222222222222222222222220000000000000000000
0000000000000000000

If the process outlined above were conducted with a larger let of enzymes, a much more
complete map would result.
In essense, single digests are used to determine which fragments are in the unknown
DNA, and double digests to order and orient the fragments correctly.
Success in using this technique depends upon obtaining complete digestion of the
DNA with each of the enzymes used!
Partial digestion will yield fragments that are ultimately a great source of confusion.
One way to avoid this problem is to add up the estimated sizes of all the fragments in
each lane - if they don't sum to roughly that of the intact DNA, it is likely that digestion
was not complete.
One other thing to watch for is the presence of two fragments of roughly the same size,
that may appear to be one fragment on an agarose gel.
This situation is often suspected by observing an abnormally bright fragment on an
ethidium-stained gel, or by a fragment being broader than expected.

Creating a Map by Partial Digests of End-Labeled DNA

If a fragment of DNA is labeled with a radioisotope on only one end, it can be

partially digested with restriction enzymes to generate labeled fragments that
directly reveal where the cleavage sites are located.
Partial digestion, which is usually something to be avoided, is performed by using very
small amounts of enzyme or short periods of time.
As an example of how this procedure is applied, consider the diagram to the right.
The fragment of DNA to be mapped for Pst I sites is contained within a plasmid and
flanked by restriction recognition sites that are not present in the fragment itself - in this
case, Not I and EcoR I.
The steps that might be taken to map this fragment by partial digestion are:
1.
Digest the plasmid to completion with EcoR I, then label the ends of the
linearized plasmid with radioactive nucleotides.
2.
Digest the labeled DNA with Not I, run the digest on an agarose gel, and isolate
the fragment of interest, which now is labeled on only one end.
3.
This DNA is the substrate to be used for partial digestion.
4.
Perform a partial digest the end-labeled fragment with Pst I - in addition to the
full length fragment, this will generate 4 additional radiolabeled fragments.
5. Seperate the labeled partial digestion products on an agarose gel, and expose the
gel to Xray film (autoradiography) to visualize the sizes of the labeled fragments.

6. By incorporating labeled molecular weight markers (not shown in diagram), the

sizes of the partial digestion fragments can be deduced, and hence the positions
of all the Pst I recognition sites.
A single preparation of end-labeled DNA can be used for mapping recognition sites for
several different restriction enzymes, making this an efficient means of generating
comprehensive maps.
There are, however, at least two potential problems that can cause problems in
interpretation:

For a given enzyme, some recognition sites can be cleaved much less efficiently
than others.

The cause of this problem is usually not known, but it can lead one to miss
mapping of certain sites.

If is difficult to map sites near the ends of the fragment.

For this reason, it is often best to perform the procedure twice, with preparations
of fragment labeled at opposite ends (e.g. in the example, one preparation labeled
at the EcoR I end and one labeled at the Not I end).

Using a Computer to Generate Restriction Maps

All of the techniques described above for generating a restriction map assume that you
don't have the sequence of the DNA.
If the sequence is known, it is a simple matter to feed that sequence into any number
of computer programs, which will search the sequence for dozens of restriction
enzyme recognition sites and build a map for you.
One such program you can use is Mapper, available as part of the Molecular Toolkit.