T.P.

N 4 Actividad enzimtica de la -amilasa Grupo 2

Integrantes. Legal, Esteban. Leiva, Jsica. Introduccin. La -amilasa es una enzima que degrada almidn para formar azcares simples. El almidn, reserva alimenticia predominante en las plantas, es un polisacrido constituido por dos tipos de molculas, las cuales tienen como monmero a la glucosa: -la amilasa, una cadena lineal y arrollada en forma helicoidal en la cual el C1 de una glucosa est unido al C4 de la siguiente; -la amilopectina, una cadena que, a diferencia de la amilasa, tiene ramificaciones (uniones C1 con C6). La -amilasa es una hidrolasa que acta rompiendo la unin entre los carbonos 1 y 4 de dos glucosas, con la obtencin de dextrinas (oligosacridos compuestos por glucosa) como producto de la reaccin. Para determinar la actividad enzimtica de la -amilasa (velocidad de la reaccin catalizada, factores que la afectan y mecanismos por los cuales ocurre) puede medirse: Cantidad de sustrato que desaparece en un tiempo determinado; Cantidad de producto que aparece en un tiempo determinado. Objetivos. Estudiar y caracterizar la actividad enzimtica de la -amilasa. Materiales y mtodos. Se estudi la actividad enzimtica observando la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo. Deteccin de la desaparicin del sustrato utilizando un test colorimtrico: Se utiliz una solucin de Lugol (1% de iodo diatmico en equilibrio con ioduro de potasio 2% en agua destilada), en la cual se aumenta la solubilidad del iodo, un elemento que interacta con las molculas de amilasa del almidn, con lo cual este presenta una coloracin azulada. As, mientras la -amilasa degrada el almidn, provocndole la prdida de la propiedad de interactuar con iodo, este comienza a perder la coloracin azulada. Obtencin de la dilucin ptima de la -amilasa salival y de los tiempos de referencia:

Se tom como tiempo de referencia para que la enzima degrade completamente al almidn (efecto acromtico) entre 1 y 8 minutos, tiempo que se utilizar para evaluar el efecto de distintos tratamientos sobre la actividad enzimtica. La dilucin ptima es aquella en la cual, precisamente, el efecto acromtico ocurre en este intervalo de tiempo. Soluciones utilizadas: -solucin neutra de almidn 1%, 10ml -solucin de iodo (100ml de agua corriente+1ml de I2/IK) 0.01M, 5ml por tubo. 1) Se recolect una muestra de saliva de 2 ml en un vaso de precipitado. 2) Se realiz una dilucin de 1/5 de la saliva en un tubo de ensayo, se tap el tubo con tapn de goma y se mezcl por inversin suavemente varias veces. 3) Se coloc un tubo de ensayo con 10 ml de solucin neutra de almidn 1% en un bao trmico, a 37 C, durante al menos 2 minutos. 4) Se agreg al tubo con almidn (mantenindolo en el bao trmico) 1ml de saliva diluida, se tap con tapn de goma y se mezcl por inversin. Se estableci este momento como t=0 (tiempo de comienzo de la reaccin), por lo que se comenz a cronometrar. 5) Se retir del tubo en el que estaba ocurriendo la reaccin, a t=0 y cada 30 segundos, 200l y se agreg a sucesivamente a cada uno de los 10 tubos con la solucin de iodo. Se mezcl por inversin. 6) Se determin el tiempo en el cual ya no ocurra efecto acromtico: 1 30 (en el caso de no estar este tiempo en el rango del tiempo de referencia prefijado, se deben hacer las diluciones necesarias hasta alcanzar la dilucin ptima). ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA EN DISTINTAS CONDICIONES DE ENSAYO: PH cido y alcalino: Se realizaron nuevamente los pasos seguidos en la obtencin de la dilucin ptima, pero utilizando: a) solucin de almidn 1% pH 2; b) solucin de almidn 1% pH 12. Se determin en cada caso el tiempo necesario para que ocurra el efecto acromtico. 0C y 70C: Se llev a cabo el mismo procedimiento que en la obtencin de la dilucin ptima, pero incubando en bao trmico a: a) 0C; b) 70C. Se determin en cada caso el tiempo necesario para que ocurra el efecto acromtico. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA CON PRE-TRATAMIENTOS: Pre-tratamiento de la enzima con Proteinasa-K: 1) Se mezcl 1 ml de saliva a dilucin ptima con 0.1 ml de proteinasa K (10 mg/ml) y se incub a 37 C por 1 hora. 2

2) Se agreg la saliva tratada a 10ml de almidn 1% previamente incubado a 37C por 2 minutos y se continu incubando. 3) Se repiti el procedimiento seguido en la obtencin de la dilucin ptima. Se determin el tiempo necesario para que ocurra el efecto acromtico. Pre-tratamiento de la enzima con calor (100C) 1) Se coloc en un tubo eppendorf 1ml de saliva a dilucin ptima y se incub 10 minutos en un bao de agua a 100C. 2) Se dej enfriar a temperatura ambiente. 3) Se midi la actividad enzimtica siguiendo el procedimiento utilizado en la obtencin de la dilucin ptima. Se determin el tiempo necesario para que ocurra el efecto acromtico. EFECTO DEL NaCl SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA: 1) Se realiz una dilucin 1/10 de la saliva (el doble de la ptima) utilizando una solucin de NaCl 0.1M. 2) Se prepar como control otro tubo con la dilucin 1/10 utilizando agua destilada. 3) Se midi la actividad enzimtica siguiendo el procedimiento utilizado en la obtencin de la dilucin ptima. Se determin el tiempo necesario para que ocurra el efecto acromtico. Resultados. Grupo 3 8 Dil. p. 1/5 1/20 PreTiempo tratamiento Referencia Proteinasa K 1 30 Calentamiento 3 de la enzima a 100 0C Tiempo Efecto Acromtico 1 30 Mayor a 6

Tabla que muestra la diferencia entre el tiempo de referencia y el tiempo observado en cada pre-tratamiento realizado.

Grupo 2 2 3 5 8 1

Dil. p. 1/5 1/5 1/5 1/20 1/20 1/10

Tratamiento pH 2 pH 12 Temperatura incub.:0 0C Temperatura incub.: ambiente Temperatura incub.:70 0C Temperatura incub.:70 0C 3

Tiempo Referencia 1 30 1 30 1 30 5 3 10

Tiempo Efecto Acromtico Mayor a 8 Mayor a 8 Mayor a 8 8 30 Mayor a 10 14

1/20

NaCl

1 30

Tabla que muestra la diferencia entre el tiempo de referencia y el tiempo observado en cada tratamiento realizado.

Discusin. Se toma una dilucin optima para que la accin enzimtica ocurra en un tiempo razonable, que no se prolongue demasiado el experimento, ese tiempo de referencia est sujeto a muchas variables (temperatura, pH, dilucin, etc. ), razn por la cual en cada caso se obtuvo un tiempo de referencia distinto. Pre-tratamientos . Luego de calentar la enzima hasta llegar a los 100 0C durante 10 minutos, se verifica que esta pierde su actividad enzimtica a 37 0C. Al elevarse la temperatura esta se desnaturaliza, de modo irreversible, lo cual da como resultado una estructura espacial diferente que no permite la actividad enzimtica. . Cuando se trata previamente a la enzima con proteinasa K se observa que el tiempo de accin enzimtica no vara. Esto nos hara suponer que la -amilasa no est constituida por protena (la proteinasa K degrada uniones peptidicas), pero como ya se sabe, las enzimas son protenas con actividad cataltica, lo cual nos hace concluir que la proteinasa K no tuvo efecto degradativo sobre la -amilasa, ya sea por error de experimentacin o ineficacia del tratamiento, por ser esta proteasa no especifica para esta enzima. Tratamientos . Al llevar el pH a los extremos (pH 2 y 12) se observa un aumento del tiempo de accin enzimtica, lo que demuestra que el pH influye en la actividad debido a la desnaturalizacin de la -amilasa provocado por el exceso de H+ y OH- en el medio. Tanto los protones H+ como los OH- , interaccionan con las cargas negativas y positivas de los restos de los aminocidos, por lo cual producen una desnaturalizacin en la estructura proteica rompiendo las uniones que la estabilizan. . Al cambiar las temperaturas de accin a 0 0C y a 70 0C se observa un aumento del tiempo de accin. Cuando se lleva a 0 0C las molculas tienen poca energa cintica disminuyendo la probabilidad de encuentro entre las molculas de enzima y sustrato. A los 70 0C la enzima sufre una desnaturalizacin, inhibiendo su actividad enzimtica. . Al agregar NaCl a la reaccin se ve una disminucin en el tiempo de accin. Como se sabe que el NaCl por s mismo no tiene actividad enzimtica, ya que es un compuesto inorgnico, inico, no proteico, concluimos que en este caso est actuando como un cofactor de la -amilasa, favoreciendo su actividad enzimtica, cuando el ion Cl- se acopla a la estructura proteica.