IDENTIFICACIN FUNCIONAL DE SUBTIPOS DE LINFOCITOS T A TRAVS DEL MARCAJE DE CITOQUINAS INTRACELULARES

Subtipos de linfocitos T Se han descrito varios subtipos de clulas T, cada uno de ellos con una funcin distintiva.

Linfocitos T citotxicos (CTL, por sus siglas en ingls) o linfocitos CD8: encargados de las funciones efectoras de la inmunidad celular, mediante la interaccin con un complejo "pptido-CMH-I"; los CTL reconocen las clulas infectadas por el patgeno para el que son especficos o clulas tumorales, y las destruyen segregando una serie de molculas (perforina, granzimas, FasL) que activan la apoptosis de la clula diana.

Linfocitos T cooperadores o linfocitos CD4+ o helper T cells: se encargan de iniciar la cascada de la respuesta inmune coordinada mediante la interaccin con un complejo "pptido-CMH-II". Cuando se activan, los linfocitos CD4+ se especializan, diferencindose a su vez en linfocitos efectores, que se distinguen por el tipo de citoquinas que producen:

Th1, que migran a los tejidos infectados y colaboran en la activacin de los macrfagos, ya que los Th1 segregan fundamentalmente interfern ; los Th1 son importantes en la defensa frente a los microbios intracelulares y la inflamacin; Th2, que permanecen sobre todo en los tejidos linfoides y colaboran en la activacin de los linfocitos B; segregan principalmente IL-4 (que estimula la secrecin de Ig-E, que a su vez activa los mastocitos) e IL-5 (que activa los eosinfilos); los Th2 son importantes en las reacciones alrgicas y en la defensa frente a parsitos; Th17, denominados as porque segregan IL-17, adems de IL-22; son los principales mediadores en algunas reacciones alrgicas, y parecen estar implicados en el desarrollo de enfermedades como la esclerosis mltiple, la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal.

La diferenciacin en Th1, Th2 o Th17 no es al azar, sino que depende de los estmulos que reciba el linfocito T4 virgen cuando contacte un antgeno extrao.

Linfocitos T de memoria: son clulas que se generan despus de la activacin de los linfocitos T, por exposicin a un antgeno extrao (un patgeno). Tienen vida larga, son funcionalmente inactivos, y pueden circular durante meses o aos, preparados para responder a nuevas exposiciones al mismo microbio. El objetivo de las vacunas es precisamente generar linfocitos de memoria (T y B) mediante la exposicin a un patgeno atenuado, de manera que el organismo responda de manera rpida y eficaz frente al patgeno activo. Linfocitos T reguladores (clulas Treg), anteriormente conocidos como clulas T supresoras. Su funcin principal es eliminar la inmunidad mediada por clulas al final de la reaccin inmune y eliminar clulas T auto-reactivas que escaparon al proceso de seleccin negativa en el timo.

Clulas T natural killers (NK). Son un tipo especial de linfocitos, situados entre la respuesta inmune adaptativa (mediada por linfocitos), y la respuesta inmune innata (lainflamacin). Las clulas NK provienen del mismo precursor hematopoytico que el resto de los linfocitos T, pero no expresan el TCR. Sin embargo, estas clulas pueden recibir dos tipos de seales:

activadoras:

- las clulas NK expresan las molculas Fas-L o TRAIL, capaces de detectar la presencia de Fas o TRAIL-R en la clula diana, relacionadas con la apoptosis; - la ausencia de molculas CMH-I en la superficie de la clula diana, bien por infeccin viral o desarrollo tumoral (que ha bloqueado la produccin de molculas CMH-I), bien porque se trata de una clula exgena, en el caso de un transplante

inhibidoras: mediada por los receptores especficos para las molculas CMH-I, denominados KIR, por killer-cells immunoglobulin receptor. Estos receptores pertenecen a una familia de multigenes similares a las inmunoglobulinas, que han evolucionado recientemente; son los receptores principales tanto para molculas CMH-I clsicas (HLA-A, HLA-B, HLA-C) y para la molcula CMH-I no clsica HLA-G en primates. Algunos KIR son especficos para ciertos subtipos HLA.

Durante su desarrollo, es necesario que la clula NK reconozca con sus receptores inhibidores el CMH-I para convertirse en clula asesina. La expresin de los receptores inhibidores es al azar, de manera que se expresan en ausencia de ligando. Adems, las clulas NK son "anrgicas": no son funcionales, en ausencia de activacin. Una vez activadas, estas clulas pueden realizar funciones relacionadas tanto con los linfocitos T4 (cooperadores) como con los T8 (citotxicos): produccin de citoquinas y liberacin de molculas citolticas, capaces de destruir la clula objetivo. Las clulas NK, por tanto, van a destruir todas aquellas clulas que carezcan de molculas CMH-I, ya que stas son clulas que se identifican como potencialmente dainas: infectadas o tumorales. En el caso de las clulas transplantadas (exgenas), es una situacin no fisiolgica, y la activacin de las clulas NK constituye una de las principales barreras al transplante. En general, la tolerancia de las clulas NK hacia las clulas propias est asegurada porque un nico receptor CMH-I activado es suficiente para asegurar la inhibicin, ya que la sealizacin inhibidora es dominante frente a la activadora.

Clulas T gamma/delta. Son un pequeo grupo de clulas T que poseen un TCR especfico en su superficie. La mayor parte de los linfocitos tienen un TCR compuesto por dos cadenas glucoproteicas denominadas y . Sin embargo, en las clulas , el TCR est formado por una cadena y una cadena . Este grupo de linfocitos es muy poco frecuente (5% del total), pero son abundantes en la mucosa del intestino, formando parte de una poblacin de linfocitos denominada linfocitos intraepiteliales. Los antgenos que activan estos linfocitos eran desconocidos, se ha descubierto una presentacin de glucoproteinas como antigenos, en vez de pptidos. Sin embargo, los linfocitos no presentan restriccin CMH, y parece que reconocen protenas completas en lugar de pptidos, aunque algunos reconocen molculas CMH-IB.

FUNDAMENTO La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser focalizado. El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas seales en

seales electrnicas que posteriormente sern digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios parmetros en una misma clula. Estos parmetros son: - Parmetros relacionados con caractersticas intrnsecas de la clula, como su tamao y la complejidad de su ncleo y citoplasma. - Parmetros relacionados con caractersticas antignicas de cada clula (inmunofenotipo). Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una clula por medio de sus caractersticas antignicas y/o por sus caractersticas morfolgicas de tamao y complejidad.

LECTURA Las seales producidas por la interaccin de las clulas con el haz de luz son de dos tipos:

- Seales de dispersin. - Seales de fluorescencia. a) Seales de dispersin: La dispersin resulta de la interaccin de la luz con una partcula que produce un cambio de direccin (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las caractersticas morfolgicas que determinan la dispersin de la luz son fundamental-mente el tamao celular, la membrana, el ncleo y el material granular del interior de la clula, llamado com-plejidad. En los Citmetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersin: -La luz dispersada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la direccin de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaoo de la partcula que produce la dispersin. -La luz dispersada en ngulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partcula. (www.citometriadeflujo.com)

b) Seales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molcula qumica que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energa) y emite a una longitud superior (menor energa). El espectro de absorcin o excitacin es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisin es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitacin procedente del lser emite energa radiante. Debido a que parte de la energa se utiliza para la absorcin, la luz emitida es de menor energa que la luz de excitacin, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorcin y emisin se denomina Stokes shiff. Los citmetros de flujo permiten detectar seales de fluorescencia procedentes de complejos Antige-no/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una clula, siendo la cantidad de seal de fluorescencia emitida igual a la proporcin de la cantidad de componentes fluorescentes de la partcula. CARACTERISTICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO La CMF es una tcnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clnicos y de investigacin, capaz de proporcionar resultados de forma rpida que pueden ser aplicables al diagnostico. Gracias a su gran especificidad es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una poblacin celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la principal caracterstica de la CMF es que puede ofrecer informacin simultnea de varios parmetros de cada una de las clulas analizadas y la relacin entre los parmetros de una clula y los de otra clula tambin analizada. Permite el anlisis de dos parmetros de dispersin, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo lser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos lseres. (www.citometriadeflujo.com)

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Debido a la necesidad de utilizar una suspensin de partculas (clulas, ncleos, cromosomas, etc), para ser ledos de una en una hace que se pierda informacin sobre la arquitectura de los tejidos que componen las clulas o de las propias clulas, as como la ineraccin entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta mltiples ventajas frente al microscopio de fluorescencia y las tcnicas citoqumicas, como: - Posibilidad de empleo de mltiples marcajes frente a un solo marcaje de la citoqumica y la microscopia de fluorescencia. - Posibilidad de analizar un elevado nmero de partculas en un corto periodo de tiempo (5000 partculas/segundo). - Posibilidad de cuantificar la intensidad antignica por medio de los canales medios de fluorescencia. - Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mnima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basfilos. - Posibilidad de analizar poblaciones celulares y eptopos celulares. - Permite almacenar informticamente la informacin del anlisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar anlisis hechos con anterioridad. - Posibilidad de cuantificar las molculas antignicas presentes en un grupo celular. SELECCION DE LINFOCITOS Citomtricamente la poblacin linfoide puede ser seleccionada por sus caractersticas fsicas y antignicas. El patrn de dispersin (FSC/SSC) de la poblacin linfoide normal, corresponde al de clulas pequeas poco complejas. Antignicamente los linfocitos presentan la expresin del Ag CD45 (Ag leucocitario comn) ms intensa de la hematopoyesis. La seleccin de linfocitos procedentes de una muestra de sangre perifrica puede realizarse por sus caractersticas fsicas aunque la forma ms correcta es realizarlo mediante la combinacin SSC/CD45. Esto es de gran utilidad en el anlisis de muestras procedentes de pacientes con Talasemia, en los que puede haber circulando un elevado nmero de clulas rojas nucleadas. En las muestras procedentes de mdula sea existe una poblacin que corresponde a la serie roja normal inmadura nucleada no lisada y que por su morfologa (clula pequea nucleada) presenta caractersticas de dispersin similares a los linfocitos, por lo que la seleccin de estos en este tipo de muestras debe realizarse por medio de la expresin de CD45, que ser muy intensa para los linfocitos y negativa para la serie roja. Al realizar la seleccin en muestras procedentes de mdula sea, debemos tener en cuenta que existe una poblacin normal de linfocitos B inmaduros que expresan CD19 con menor intensidad para CD45 que los linfocitos maduros y que representa la poblacin de los progenitores linfoides B.

Otra causa de error en la seleccin de linfocitos se puede presentar al realizarla segn el patrn de dispersin en muestras de pacientes con intensa basoflia. Normalmente los basfilos se presentan en un nmero tan bajo que no afectan el contaje de linfocitos. Cuando existe basoflia, debido al comportamiento de los bas-filos en cuanto a sus patrones de dispersin, los hace comportarse de igual forma que los linfocitos en un citograma SSC/FSC. Para evitarlo en estos pacientes la seleccin de linfocitos se realizar por medio de la intensidad de expresin del CD45 sabiendo que ser menor en los basfilos. En algunos SLPC-B CD5+ (LLC-B, LNH-B ZM) parte de los linfocitos pueden aparecer pegados como dobletes representando una poblacin celular con patrones de dispersin mayores que los linfocitos normales. Esto es debido a que el CD5 es el receptor del CD72, por lo que los verdaderos dobletes coexpresan CD5 y CD19. Tambin podemos encontrarnos una poblacin con caractersticas de dispersin similares al anterior caso pero que no coexpresan Ag de clula B y CD5 al mismo tiempo, considerndose a esta poblacin como linfocitos de mayor tamao y complejidad (como por ejemplo los tricoleucocitos).

En sangre periferia. A.:Seleccin de linfocitos (en rojo) segn patrn de dispersin. B: Seleccin de linfocitos (en rojo) segn su intensidad de CD45. Debido a la seleccin en A, en B apreciamos una pequea poblacin de clulas no linfoides CD45- (debris)

En medula sea La Seleccin de CD45+++ (rojo) linfocitos, permite diferenciarlos de la serie rojo CD45(verde) con FSC/SSC similar (A). Sobre medula sea En verde precursores linfoides B con expresin de CD19 y CD45 de menor intensidad y menos complejidad que los linfocitos B maduros (en azul) con expresin de CD19 y CD45 de alta intensidad con mayor complejidad.

En sangre perifrica con basofilia. A: Seleccin de linfocitos (amarillo) y basfilos (negro) segn patrn de dispersin. B: Seleccin de linfocitos CD45+++ (amarillo) y basfilos CD45+ (negro). TINCION DE CITOQUINAS INTRACELULARES La tincin de citoquinas intracelulares y el anlisis de citometra de flujo fueron demostrados por primera vez por Andersson que demostr que la fijacin paraformaldehido, la permeabilizacin con saponina, y anticuerpos monoclonales especficos para citoquinas podra ser usada para detectar citoquinas dentro de varias clulas usando microscopia fluorescente y citometra de flujo. Estudios recientes han documentado la utilidad de este mtodo para la identificacin de citoquinas en pequeas subpoblaciones de clulas el anlisis cintico de la produccin de citoquinas, anlisis usando toda la sangre, y anlisis multiparamtrico para determinar la produccin de citoquinas en distintas subpoblaciones de linfocitos.

PROCESO DE TINCIN DE CITOQUINAS INTRACELULARES En primer lugar se debe de ajustar la concentracin de las clulas a 1x106cl/ml, las clulas pasan por un proceso de estimulacin con los respectivos antgenos o pptidos, esto es para mejorar la actividad co-estimuladora junto con la produccin de citoquinas). Seguido de esto se da un proceso de incubacin durante 6 horas a unos 37C junto con 5% de CO2, en caso se utilicen tubos halcn de 15ml, estos son aflojados para permitir la circulacin de CO2, durante las ltimas 4 horas se aade 10mg/ml deBrefeldina A(BFA), el BFA puede tambin ser aadido al inicio pero deber aumentarse el tiempo de incubacin y disminuir su concentracin. Pasadas las 6 horas de incubacin las muestras son puestas de 2 a 8C y con eso la reaccin se detendr, tambin se pueden aadir 200ml de 2% para-formaldehido y dejarlos en incubacin con una temperatura de 2-8C durante 20 minutos. En el caso de que se haya aadido el 2% para-formaldehido se lavan las clulas con 250ml de tampn durante 10 minutos, esto es para eliminar el fijador antes de la tincin. Antes de la permeabilizacin es importante tener en cuenta que debemos tener una suspensin celular fija, con el fin de mantener la integridad celular despus de la formacin de poros. Para garantizar la tincin de citoquinas intracelulares se debe de utilizar en el tampn de lavado el tampn de saponina fresco. Luego se procede a decantar el sobrenadante, se suspenden las clulas en 200ml del tampn y se deja a temperatura ambiente por unos 15 minutos. Se aaden los anticuerpos de citoquinas intracelulares en oscuridad y con agitacin (30 segundos), luego pasan por otro proceso de incubacin por 45 minutos 4C, pasados los 45 minutos se centrifuga con el tampn permeabilizado y se retira el sobrenadante, luego se aaden 300ml del 2% de para-formaldehido y mantenerlo de 2 a 8 C. ANEXOS http://www.citometriadeflujo.com/HTML/celulas_frame.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Linfocito_T http://www.info-farmacia.com/bioquimica/la-celula-t www.citometriadeflujo.com R.M.I.R.