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DETERMINAO DE CAFENA EM MEDICAMENTO, BEBIDAS E FLUIDO BIOLGICO ATRAVS DE CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFCINCIA (CLAE).

PAIXO, Juliana Azevedo da1; SANTOS, Nathlia Ribeiro dos1; CARVALHO, Priscila Caldeira1; CONCEIO, Rodrigo Souza1; RIBEIRO, Jaff 2.
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Docente da Faculdade de Farmcia, Universidade Federal da Bahia - Rua Baro de Jeremoabo, s/n, Ondina, CEP:40170-115, Salvador /BA. 1 Graduandos do Curso de Farmcia da Universidade Federal da Bahia - Rua Baro de Jeremoabo, s/n, Ondina, CEP:40170-115, Salvador /BA.

RESUMO
A cafena um alcalide encontrado em uma grande variedade de

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Palavras-chave: ________________________________ Cafena Refrigerante Energtico Neosaldina Urina Determinao CLAE

__________________________________________________________________________________ 1. INTRODUO
A cafena (1,3,7-trimetilxantina) um alcalide farmacologicamente ativo pertencente ao grupo das metilxantinas que atua como estimulante do sistema nervoso central e est presente em uma grande quantidade de alimentos (cerca de 60 espcies de plantas no mundo) a exemplo do caf, cacau, chs e tambm nos medicamentos do tipo analgsicos, medicamentos contra gripe e inibidores de apetite (PACHECO,2007), cuja estrutura contm um

Figura 1: Estrutura qumica da cafena

A absoro da cafena no organismo muito rpida, assim como a sua distribuio, passando rapidamente para o sistema nervoso central. Existe a chamada sensibilidade cafena, a qual se refere quantidade necessria dessa substncia para produzir os efeitos secundrios negativos, tais como perda de sono e aumento da freqncia cardaca. A cafena acumula-se no plasma numa concentrao de cerca de 25% (BORTOLINI, 2010). O Conselho da Associao Mdica dos EUA em Assuntos Cientficos (American Medical Association on Scientific Affairs) recomenda consumo moderado de cafena (at 250 mg de cafena ao dia). So vrios os efeitos fisiolgicos da cafena os quais incluem estimulao do sistema nervoso central, dos msculos cardacos, do sistema respiratrio e da

esqueleto de purina (Fig. 1). Embora uma parcela pequena da populao consuma cafena na forma de frmacos, grande parte deste alcalide ingerida na forma de bebidas (MARIA; MOREIRA, 2007)1. Da, a diversidade de fontes que possibilitam a ingesto de cafena e seus conseqentes efeitos no organismo. secreo de cido gstrico. Tambm considerada como um diurtico fraco e relaxante muscular. Devido Sua atuao no sistema nervoso central principalmente como estimulante a cafena bastante utilizada como doping por atletas que buscam um maior nvel de vigor e alerta deve ser observada em competies esportivas oficiais e, portanto, necessita ser monitorada continuamente durante as competies. Em face do seu largo espectro de ao fisiolgica, existe um grande interesse da comunidade cientfica no estabelecimento de nveis seguros de ingesto de cafena para diversos subgrupos populacionais humanos, pois os limites de tolerncia variam por indivduo. Alm disso, a cafena uma droga estimulante que pode ser usada indevidamente em atividades esportivas oficiais e, portanto, necessita ser monitorada continuamente durante as competies1. Evidentemente o conhecimento das tcnicas para anlise de cafena em matrizes alimentcias e fluidos biolgicos, bem como suas vantagens e limitaes, um fator primordial para monitorar os nveis de cafena no organismo.

Neste experimento utilizaremos a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) para determinar o teor de cafena em um medicamento analgsico (neosaldina). Alguns mtodos tais como espectrofotometria, titulometria e cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) so usados para a determinao de cafena, a vantagem da CLAE na anlise destes compostos inclu eficincia, sensibilidade, especificidade e rapidez. O objetivo desse trabalho determinar cafena pelo mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), em coluna de fase reversa, em amostras de refrigerante, energtico, medicamento e urina. 2. MATERIAIS E MTODOS 2.1. Amostragem Foi investigada a dosagem de cafena em medicamento (Neosaldina), refrigerante (CocaCola), energtico (Red Bull diet) e fluido biolgico (urina), sendo este ltimo obtido no Laboratrio de Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal da Bahia e os demais adquiridos em comrcio local. 2.2 Tratamento das amostras 2.2.1 Medicamento O preparo da primeira amostra foi com a Neosaldina, medicamento investigado. Soluo Oral em gotas contendo 15 ml, valido at janeiro de 2012, do laboratrio Nycomed Pharma LTDA. Na composio contm dipirona sdica 300 mg, cloridrato de isometepteno 50 mg e cafena 30 mg. Para obteno da amostra foram diludos 10 mL do medicamento em 19,90 mL de gua destilada com o objetivo de obter uma concentrao de 150 mg/L (1 : 200). Em seguida, a amostra foi filtrada em membrana de celulose regenerada com poros de 0,2 m. 2.2.2 Refrigerante e energtico O refrigerante, Coca-Cola, foi diludo com gua destilada nas propores 1:1. A bebida foi previamente desgaseificada por agitao manual,

a fim de retirar o gs e torn-las passveis de anlise. 5 mL da bebida desgaseificada foi diludo em gua tipo 1 para 10 mL de soluo. Logo depois foi filtrada em membrana de celulose regenerada com poros de 0,2 m. O energtico foi diludo com gua destilada nas propores de 1:5, A bebida foi previamente desgaseificada por agitao manual, a fim de retirar o gs e torn-las passveis de anlise. 1 mL da bebida desgaseificada foi diludo em gua tipo 1 para 5 mL de soluo e depois foi filtrada em membrana de celulose regenerada com poros de 0,2 m. O processo de desgaseificao prvio foi realizado a fim de retirar o gs e torn-las passveis de anlise. 2.2.3 Fluido biolgico Foi analisada a urina de um paciente do Laboratrio de Anlises Clinicas da Faculdade de Farmcia (UFBA) com o objetivo de avaliar o teor de cafena nela contida. A amostra foi filtrada em membrana de celulose regenerada com poros de 0,2 m e no sofreu diluio. A urina foi centrifugada a 4400 rpm / 15C por 5 min. Foi fortificada com padro de cafena obtendo uma concentrao final de 24,0 mg/L, sendo pesada 1,2mg de cafena (mesma especificao do padro) e dissolvidos em 50mL do sobrenadante da urina previamente centrifugada. 2.3 Padres e solventes Os solventes utilizados (metanol e gua milli-Q na proporo de 40: 60) foram de grau CLAE e filtrados por um sistema de filtrao a vcuo de membrana de celulose regenerada com poros de 0,45m. O padro cromatogrfico investigado cafena anidra (Vetec) foi de alta pureza. O preparo do padro foi feito a partir da pesagem de cafena para obteno do padro de 100 mg/L. Foi pesado 11,7 mg da cafena e dissolvida em 100 mL de gua pura tipo I. A partir desta soluo de padro de cafena de 100 mg/L, foram feitas sucessivas diluies em gua pura tipo I at atingir as concentraes de 50 e 25 mg/L, sendo todas essas concentraes utilizadas na construo da curva de calibrao. Todas as solues dos padres foram analisadas pelo

mtodo CLAE UV-VIS nas mesmas condies cromatogrficas. Estas diluies fizeram parte da curva de calibrao, descrita mais adiante neste relatrio. A gua usada foi obtida pelo sistema Milli-Q, que faz a purificao da gua destilada em gua ultra-pura. 2.4 Instrumentao Para a anlise em CLAE da cafena, utilizou-se um cromatgrafo lquido de alta eficincia com um detector espectrofotomtrico UV-VIS ( Perkin Elmer) srie 200; acoplado a um computador com software Totalchrom Workstation verso 6.3.1.; bomba binria, sistema de bombeamento isocrtico; com degasser. A fase mvel empregada consistiu de gua: metanol (60:40). A coluna utilizada foi C-18, 22cm x 4,6mm, tamanho da partcula de 5m. Com Prcoluna C18 15mm x 3,2mm x 5 m.A injeo da amostra (10L) foi automtica (autosampler);.Aps eluio os componentes da amostra passam a um detector, que neste trabalho consiste num espectrofotmetro de UV/Vis com uma clula de fluxo especialmente desenhada para permitir a medida da absorvncia da soluo que nela passa, sem que se d alargamento significativo da zona de lquido onde est cada um dos solutos (SKOOG, 2002), tendo ento, a deteco ocorrido a 254nm. A separao cromatogrfica foi realizada a um fluxo constante de 0,8 mL/min, sendo o tempo de corrida 20 minutos, a temperatura da coluna 25C. A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente automticos. um tipo de cromatografa lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluida a altas preses, (COLLINS, 1997) . O sistema de deteco UV-VIS tem seu funcionamento baseado na absorbncia de luz por parte da amostra ao passar atravs dela qualquer radiao eletromagntica; normalmente isto ocorre no ultravioleta at o infravermelho, em um dado comprimento de onda (COLLINS, 1997). O comprimento de onda selecionado foi o de 254

nm, pois corresponde ao mximo da cafena (SCHUBERT,2006). 3. RESULTADOS E DISCUSSO Nas condies cromatogrficas obteve-se uma boa separao da cafena dos demais componentes das amostras. O cromatograma do padro de cafena (Figura 1) apresentou tempo de reteno para as diferentes concentraes 25, 50 e 100 mg/L de 5,60`;5,52`; 5,36`, respectivamente (Tabela 1).
Tabela 1. Dados sobre concentrao, tempo de reteno e rea das amostras do padro. Dados dos padres Concentrao (mg/L) Tempo de reteno (Tr) (min) rea

A partir da rea obtida para as concentraes de 25, 50 e 100 mg/ L do padro (Tabela 1) foi construda a curva de calibrao (Figura 2) que apresentou a seguinte equao Y=14777x - 27833 ( r =1) , onde Y a rea, X a concentrao (mg/L) e r o coeficiente de correlao linear. A curva analtica possibilitou a determinao das concentraes de cafena nas amostras estudadas.
1,80 Milhes 1,70 1,60 1,40 1,20 1,00 rea do Pico (maU) 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Concentrao de Cafena (mg/ L) 0,41 y = 14777x - 27833 R =1
2

0,83

Sri e1 Linear (Sri e1)

Figura 2. Curva de calibrao do padro de cafena nas concentraes de 25mg/L, 50mg/L e 100mg/L.

A anlise qualitativa dos cromatogramas obtidos para o padro e para as amostras (Figuras

3 e 4) possibilitou a comprovao que a Neosaldina, Coca-Cola, Red Bull Diet e a urina realmente possuam esse alcalide em sua composio, j que os mesmos apresentaram picos com valores de reteno muito prximos do padro, mais especificamente a coca-cola com pico em tempo de reteno de 5,23`, o Red Bull Diet com pico em tempo de reteno de 5,66`, a Neosaldina com pico em tempo de reteno 5,56` e a urina com pico em tempo de reteno de 5,47` (Tabela 2).
Tabela 2. Dados sobre diluio, tempo de reteno e rea das amostras de neosaldina, coca-cola, red Bull diet, guaran e urina.

50 mg/L

100 mg/L mu

Dados das Amostras Amostra Neosaldina Coca-Cola Red Bull Urina Diluio 1: 200 1: 1 1: 5 N/A Tr (min) rea

em Fig 4. Cromatrogramas CLAE UV-VIS das amostras de Neosaldina, Coca-cola, Red Bull e Urina.

Coca-Cola Fig 3. Cromatrograma CLAE UV-VIS da amostra padro de cafena nas concentraes de 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L respectivamente

Neosaldina

25 mg/L

Red Bull

Urina

A cafena, por apresentar propriedades estimulantes, pode ser adicionada em refrigerantes e bebidas energticas. Segundo o Ministrio da Agricultura e do Abastecimento, o teor mnimo de cafena permitido de 200mg/L (refrigerantes tipo cola), (BRASIL, 1998). Os resultados quantitativos obtidos no refrigerante Coca-Cola esto apresentados na tabela 2. O refrigerante tipo cola apresentou nvel de cafena de 87,78 mg/L, estando um pouco abaixo das normas (95,0 mg/L). Sendo assim, uma pessoa que ingere 250 mL de refrigerante tipo coca-cola (valor de uma lata) est consumindo 21,94 mg de cafena. Os dados obtidos para a Coca-Cola corroboram com os valores fornecidos pela companhia de refrigerantes (26 mg/ 350mL).
O O enrgtico Red Bull analisado apresentou concentrao de cafena de 242,83 mg/L, o valor obtido para uma lata dessa bebida foi de 60,71 mg/250ml. De acordo com a concentrao que

consta na embalagem da bebida, esta deveria conter 80mg de cafena, porm, os valores obtidos foram inferiores. Este fato pode estar associado data de validade da bebida que se encontrava ultrapassada, 38 dias (data de validade

08/08/2010). Estudos anteriores relatam sobre a melhora do estado de humor e do desempenho fsico aps a ingesto de RedBull (ALFORD , 2001; SEIDL, 2000). Nestes estudos, os autores atribuem os efeitos ingesto da cafena A cafena tambm pode ser encontrada na formulao de muitos medicamentos utilizados no tratamento da cefalia devido ao seu efeito de potencializao analgsica quando associada frmacos (AINES) alm de exercer leve ao estimulante sobre o sistema nervoso, aumentando assim, a capacidade de concentrao e raciocnio. Quando administrada isoladamente cafena no apresenta atividade analgsica significativa, o que no ocorre quando em associao, (MIGLIARDI, 1994). O consumo excessivo deste composto pode acarretar palpitaes, convulses, dores de cabea e estmago, insnia, perda de apetite, nusea, vmito, depresso, falta de potncia, entre outros problemas. Os efeitos adversos causados pelo excesso no consumo de cafena intensificam a importncia de se determinar o teor dessa substncia em medicamentos, sendo esta, tambm, uma forma de realizar o controle qualidade dos mesmos. O medicamento analisado (Neosaldina) um analgsico que contm a dipirona associada com o isometepteno e a cafena. A concentrao obtida foi de 18336,46 mg/L sendo que este valor foi inferior ao descrito pelo fabricante (30000 mg/L). O mtodo CLAE UV-VIS usado freqentemente para anlise de cafena e seus metablitos em fluidos biolgicos. A maior parte da metabolizao da cafena no organismo ocorre no fgado, iniciando pela remoo dos grupos metila 1 e 7, sendo essa reao catalizada pelo citocromo P450 1A2, o que possibilita a formao de trs grupos metilxantina que so a Teofilina (1,3 dimetilxantina), Teobromina (3,7 dimetilxantina ), e a Paraxantina (1,7 dimetilxantina). Alm do fgado, outros tecidos tambm so responsveis pela metabolizao da cafena, embora em menor grau, como os rins e crebro. Apesar de apenas uma pequena quantidade de cafena ser excretada (0,5 a 3%), sem alterao na sua constituio qumica, sua deteco na urina relativamente fcil. Nas condies cromatogrficas utilizadas, foi realizada a anlise da urina. O tempo de reteno da urina analisada foi de 5,47`, e sua

concentrao de 32,43 mg/L, indicando a quantidade de cafena ingerida pelo indivduo que foi metabolizada e excretada no fluido biolgico. Esta abordagem importante para o estabelecimento de nveis seguros de ingesto da cafena, bem como para inibir seu uso indevido em modalidades esportivas. Falta falar que no deu certo! 4. CONCLUSO A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) com detector UV-VIS, revelou-se uma tcnica eficiente e conseguiu comprovar a existncia de cafena nas amostras de refrigerante, medicamento, energtico e fluido biolgico analisado em um curto perodo de tempo e em quantidades mnimas de amostra. A concentrao de cafena no refrigerante tipo cola de marca Coca-Cola foi condizente com o estipulado pela empresa de refrigerantes e pelos valores mnimos e mximos estabelecidos pelo Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. O energtico Red Bull Diet apresentou concentrao de cafena inferior ao estabelecido na embalagem do produto, fato esse que pode estar associado data de validade da bebida que se encontrava ultrapassada. A ingesto de bebidas energticas juntamente com a utilizao de bebidas alcolicas potencializa os efeitos tanto do lcool como de energtico, porm no se sabe ainda ao certo os motivos que levam essa otimizao. necessrio que seja feitos estudos que continuem comparando as diferentes taxas de cafenas em refrigerantes inclusive os que no so do tipo Coca-cola e outras bebidas que contenham cafena na sua composio como o caf. A anlise da concentrao de cafena em medicamentos uma ferramenta utilizada no controle de qualidade e seu estudo importante devido grande quantidade de efeitos adversos que podem ocorrer em resposta ao excesso do seu consumo. No medicamento Neosaldina, a concentrao de cafena foi inferior aos valores estabelecidos na embalagem.

Pode-se tambm determinar a concentrao de cafena na urina, sendo esta uma abordagem importante para o estabelecimento de nveis seguros de ingesto da cafena, bem como para inibir seu uso indevido em modalidades esportivas

5. REFERNCIAS
1

MARIA, C.A.B.; MOUREIRA, R.F.A. Cafena: reviso sobre mtodos de anlise. Qumica Nova, So Paulo, v. 30, n. 1, jan./fev. 2007.
3

BORTOLINI, K.; SICKA, P.; FOPPA, T. Determinao do teor de cafena em bebidas estimulantes. Revista Sade. v. 4, n. 2, 2010. .

SCHUBERT, A. et al. Variao annual de metilxantinas totais em amostras de Ilex paraguariensis A. St. Hil (erva-mate) em Iju e Santa Maria, Estado do Rio Grande do Sul. Qumica Nova, So Paulo, v.19, n. 6, nov./dez. 2006.
8

BRASIL, Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Portaria 544. Dirio oficial da unio, Brasilia, 16 de novembro de 1998. .
10

MIGLIARDI, J. R. et al. Caffeine as an adjuvant in tension headache. Clin Pharmacol Ther. v.56, p. 576-586, 1994
6

COLLINS, Carol; BRAGA, Gilberto; BONATO, Pierina (Coord). Introduo a Mtodos Cromatogrficos. 7. ed. So Paulo: UNICAMP, 1997.

8 Agora tem que colocar em ordem alfabtica e padronizado, falta ajeitar vrias coisas ainda.

SKOOG, K.A.; HOLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Cromatografia lquida de altaeficincia. In: Princpios de anlise instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman,2002, p. 642-677.23 PACHECO, A. H. R N; ARAUJO, D. M. R; LACERDA, E. M. A; KAC, G. Consumo de cafena entre gestantes e a prevalncia do baixo peso ao nascer e da prematuridade: uma reviso sistemtica. Cad. Sade Pblica, Rio de Janeiro, 23(12):2807-2819, Dez 2007. ALFORD C, COX H, Wescott R. The effects of redbull energy drink on human performance and mood. Amino Acids. 2001; 21(2):139-50. SEIDL R, PEYRL A, NICHAM R, HAUSER E. Taurine and caffeine-containing drink stimulates cognitive performance and wellbeing. Amino Acids 2000; 19(3-4):635-42.