MICOBIOTA ALTERNATE EN

MILANESAS DE SOJA Y
VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Universidad Nacional de Mar del Plata

Facultad de Ciencias Agrarias

Agosto de 2005
 MICOBIOTA ALTERANTE EN
MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Monografía presentada como requisito parcial para

optar al grado de Licenciado en Ciencia y Tecnología
de los Alimentos.

Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Mar del Plata.

Agosto de 2005
 MICOBIOTA ALTERANTE EN
MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Director: Dr. Federico Laich ................................

Asesor: Ing. Agr. Yolanda Andreoli ................................

Asesor: Lic. Osvaldo Cuello ...............................

Delegado del Decano: ...............................

 AGRADECIMIENTOS

• Al dueño de la empresa donde realice este proyecto. Sin

su permiso no hubiera sido posible mi trabajo.
• A Federico Laich, Yolanda Andreoli y Osvaldo Cuello,
quienes me guiaron en mi trabajo.
• A Yoli y Elsa del Laboratorio de Microbiología de Suelos
de I.N.T. A. Balcarce, quienes me a yudaron cuando el trabajo
me desbordaba.
• A la profesora Graciela Vacarezza de la Facultad de
Ciencias Veterinarias, UNICEN, Tandil, quien me permitió
utilizar el servidor de la Facultad y acceder a valiosísima
información.
 ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN. ................................................................. 1

1.1. Los hongos como contaminantes y degrad adores de los

alimentos. ........................................................................... 1
1.1.1. Principales es pecies cont aminantes. ........................... 3
1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la
mic obiota. ......................................................................... 5
1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con
hongos. ............................................................................... 7
1.2.1. Principales mic otoxinas y su efecto en el humano. ....... 8
1.3. M étodos de control del crecimiento de contaminantes. . 12
1.4. Objetivos. .................................................................... 14
2. MATERI ALES Y MÉTODOS. ................................................ 16

2.1. Proceso de elaboración. ............................................... 16

2.2. Identificación de la micobiota contaminante. ................ 18
2.2.1. Muestreo. ................................................................ 18
2.2.2. Aislamiento y purific ación. ........................................ 19
2.2.3. Identificación primaria. ............................................. 20
2.3. Origen de los contaminantes identificados en las
milanesas. .......................................................................... 20
2.4. Tratamiento térmico. .................................................... 21
2.5. Efecto del pan rallado como contaminante. .................. 23
2.6. Contaminación cruzada. ............................................... 24
2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. ... 26
3. RESULT ADOS. ................................................................... 27

3.1. Identificación de la micobiota contaminante. ................ 27

3.1.1. Materias primas. ...................................................... 27
3.1.2. Milanesas. ............................................................... 27
3.1.3. Ambiente. ................................................................ 30
3.2. Origen de los contaminantes identificados en las
milanesas. .......................................................................... 30
3.3. Tratamiento térmico. .................................................... 35
3.4. Efecto del pan rallado como contaminante. .................. 37
3.5.Contaminación cruzada. ................................................ 38
3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. ... 40

4. DISCUSIÓN FIN AL. ............................................................ 42

5. BIBLIOGRAFÍ A. ................................................................. 46
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación

de las milanesas de zapallo y cebolla. ................................. 36
Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de
cebolla y zapallo. La escala utilizada para cuantificar el grado
de contaminación se detalla en el apartado 2.6. ................... 50

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja. ........ 28

Figura 2: Esquem a del ensayo aplicando un shock térmico a las
milanesas una vez escaldadas. ........................................... 33
Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de
almacenamiento, después de la incubación a 25º C en cámara
húmeda durante 7 días. ...................................................... 41
Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado
recolectadas en diferentes tiempos del proceso de elaboración.
........................................................................................ 45
Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri
con el medio de cultivo APA 5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y
pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado
sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado
de las bandejas (derecha). Todas las placas corresponden a la
misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas. ... 46
Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock
(derecha). ......................................................................... 47
Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock
(derecha). ......................................................................... 48
Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda
durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se
presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la
izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación
cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación
cruzada). ........................................................................... 51
Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda
durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se
presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la
izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación
cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación
cruzada). ........................................................................... 52
Figura 12: Crecim iento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato
de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril
evitando la contaminación cruzada. ..................................... 53
 RESUMEN

Los hongos filamentosos tienen la capacidad de desarrollarse

sobre la superficie de muchos alimentos con un típico aspecto
aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado.

Si bien es cierto que ciertas especies son útiles en la

elaboración de ciertos productos alimenticios o de
componentes de los mismos, muchas especies fúngicas
intervienen en la formación de micotoxinas y en la alteración
de diferentes tipos de alimentos. En estos casos se considera
que el producto no es apto para el consumo.

El objetivo del presente trabajo fue determinar el origen de la

contaminación fúngica e identificar las especies existentes en
la elaboración de milanesas de soja y verdura en una fábrica
ubicada en el SE bonaerense. Para ello, se realizó un estudio
cuantitativo y cualitativo de diferentes especies que se
desarrollaban a través del proceso de elaboración y
almacenamiento de las milanesas. En este análisis se
determinó la micobiota existente a partir de los productos
utilizados como materia prima (harinas, pan rallado, etc.), y
sobre el producto elaborado y almacenado. Las principales
especies aisladas fueron identificadas como Penicillium spp.,
Aspergillus spp., Rhizopus spp. Alternaria sp. y Cladosporium
spp. La presencia de hongos filamentosos en el alimento se
debió principalmente a la contaminación ambiental y al pan
rallado utilizado en el rebozado final del producto. La
aplicación de un tratamiento térmico previo al rebozado
disminu yó significativamente la concentración de levaduras en
unidades formadoras de colonia por gramo (ufc), mientras que
el recuento de ufc de hongos filamentosos se incrementó luego
del rebozado y a través del periodo de almacenamiento. Por
último, la utilización de sorbato de potasio y la conservación
de las milanesas a bajas temperaturas, incrementó
significativamente la vida útil del producto.
ABSTRACT

Moulds have the aptitude to develop on surfaces of man y

food w ith their typical velvet or cotton y aspect, sometimes
pigmented.

Though it is true that certain species are useful in the

production of food products or their components, many fungi
species intervene in the formation of m ycotoxins and in the
alteration of different types of food. In these cases it is
considered that the product is not suitable for the
consumption.

The aim of the present w ork was to determine the origin of

the fungi spoilage and to identify the species in the production
of soybean and vegetable escalopes in a factory located in the
SE of Province of Buenos Aires. There, a quantitative and
qualitative stud y of different species developing during the
process of production and storage of the product w as realized.
In this anal ysis the existing m ycobiota w as determined from
the products used as raw material (flours, breadcrumbs, etc.),
and from the elaborated and stored product. The principal
isolated species w ere identified as Penicillium spp.,
Aspergillus spp., Rhizopus spp. Alternaria sp. and
Cladosporium spp. The presence of spoilage moulds in the
food w as related principall y to the environmental contaminants
and to the breadcrumbs used. The application of a thermal
shock before the final rolled in breadcrumbs, decrease
significantl y the yeast colon y forming units per gram (cfu),
w hereas moulds cfu increased after the treatment and during
storage. Finall y, the application of potassium sorbate and
conservation at low temperature, increase the shelf-life of the
product.
 1. INTRODUCCIÓN.

En los últimos años la dieta de los argentinos se ha visto

orientada hacia alimentos más saludables y de menor costo y
la soja ha desempeñado un papel mu y importante como
reemplazante de las proteínas de origen animal, ya sea bajo la
forma de leche, milanesas o hamburguesas de soja. Si bien las
cantidades de soja que se pierden por contaminaciones
microbiológicas durante la elaboración de los alimentos son
importantes, no existen publicaciones que citen el problema y
menos aún, que traten de enumerar o explicar cuáles son los
microorganismos implicados, ni como evitar la alteración de
este tipo de alimentos.

El presente trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar

de milanesas de soja ubicada en la ciudad de Tandil. Si bien la
producción de la fábrica es pequeña y la ma yoría de la
mercadería se vende en comercios de la ciudad, la intención
del propietario fue aumentar su producción y el área de venta
hacia otras ciudades. En estas circunstancias el tiempo que
transcurre entre elaboración y consumo es ma yor y por lo
tanto se detectaron problemas de contaminación y desarrollo
de microorganismos. Ante esta situación la finalidad del
presente trabajo fue identificar los principales
microorganismos contaminantes, detectar su fuente de inóculo
y proponer modificaciones durante la elaboración para evitar la
aparición y desarrollo de microorganismos.

1.1. Los hongos como contaminantes y degradadores

de los alimentos.

Los consumidores de los países desarrollados tienen una

actitud más crítica a la hora de elegir que comer y que beber
como consecuencia de la vida moderna. Por ende los
microbiólogos en alimentos tienen cara a cara el enorme
desafío de garantizar la frescura de los alimentos que está
implícita en la demanda de los consumidores. Los alimentos
con procesos menos severos, libres de aditivos, más seguros y
fáciles de preparar son buscados debido a la alta
concientización del consumidor en lo que respecta a nutrición
y salud (Loureiro y Querol, 1999).

Actualmente existe un amplio conocimiento y comprensión

de los hongos en la contaminación alimenticia. En los últimos
5-10 años se lograron los mayores progresos que han
contribuido a prevenir la contaminación causada por hongos,
remarcándose su importancia en la contaminación alimenticia
tras el descubrimiento de las micotoxinas (Filtenborg et al.,
1996).

A pesar de las innovaciones científicas aplicadas a la

identificación de microorganismos, la mayoría de los métodos
de análisis estándar, así como otros métodos utilizados en la
industria de alimentos, siguen utilizando los pasos clásicos
establecidos hace ya algunas décadas:

1) mezcla/homogeinización de la muestra; 2) dilución

decimal del homogeneizado; 3) siembra de las diluciones en el
medio apropiado 4) aislamiento, purificación e identificación
de los microorganismos. En algunos casos se necesita aplicar
técnicas de preenriquecimiento o de selección previo a la
siembra. (Loureiro y Querol, 1999).

Generalmente los alimentos no son tratados como un

ecosistema, tal vez porque no sean considerados sistemas
“naturales”. Sin embargo, si lo son, ya que los almacenes de
alimentos son vastos. Los alimentos como hábitat de
microorganismos son mu y ricos en contraste del suelo, agua y
vegetales. Dadas las condiciones fisicoquímicas correctas, una
población de microorganismos será capaz de crecer y
desarrollarse en ese alimento. En los alimentos “vivientes”
como las frutas y vegetales frescos, un gran número de
mecanismos de defensa son aplicados en contra de la invasión
de microorganismos. Pero en los alimentos que se encuentran
en un estado de latencia o no vivos los factores a tener en
cuenta son actividad de agua, concentración de iones
hidrógeno, temperatura (de procesado y almacenamiento),
tensión de gases (especialmente oxígeno y dióxido de
carbono), consistencia, composición nutricional, efectos
específicos de solutos y la presencia de conservantes (Pitt y
Hocking, 1997).

1.1.1. Principales especies contaminantes.

Los mohos son capaces de crecer en todo tipo de

alimentos: cereales, carne, lácteos, frutas, vegetales, frutos
secos y productos de éstos. El crecimiento fúngico resulta en
diversos tipos de alteraciones alimenticias: flavores
desagradables, toxinas, decoloración, pudrición y formación
de propágulos patógenos o alérgenos (Chelkowski,1991;
Bigelis, 1992; Tipples, 1995). El deterioro de las propiedades
sensoriales es a menudo causada por la producción de
exoenzimas: lipasas, proteasas y carbohidratasas (Bigelis,
1992). Una vez que éstas enzimas se encuentran dentro del
alimento continúan su actividad independientemente de la
destrucción o la remoción del micelio (Tindale et al ., 1989;
Whitfield et al ., 1991; Lily y Viani,1995).

Con respecto a las levaduras, los reportes publicados hace

unos 30-40 años atrás, afirmaban que el riesgo que provocaban
las levaduras en la salud humana no era significante. Sin
embargo, a partir de la década de los 80 existen trabajos de
investigación que refieren por primera vez la necesidad de
reevaluar el impacto en la salud pública causada por las
levaduras en alimentos (Loureiro y Querol, 1999). La
contaminación producida por levaduras consiste en una
alteración de las propiedades físicas o sensoriales del
alimento como resultado de su actividad. En las bebidas
ácidas con o sin azúcar ocurren las alteraciones más
conocidas, estando caracterizadas por una abundante
producción de gas que puede llegar a deformar envases,
formar sedimentos, aromas y gustos alterados. En otro tipo de
alimentos las principales alteraciones que las levaduras
pueden provocar son el crecimiento superficial, la
decoloración, la producción de gas, la formación de biofilms,
flavores desagradables y cambios de textura (Loureiro y
Querol, 1999).

La micobiota xerofílica está caracterizada por ser la de

mayor capacidad para crecer bajo condiciones de actividades
de agua (a w ) de 0,85 y es asociada mu y comúnmente a
alimentos de humedad intermedia, inclu yendo cereales,
nueces, especias y un amplio espectro de alimentos secos
(Hocking y Pitt, 1988). Según un estudio realizado en harinas
Australianas (Berghofer, 2003) los microorganismos más
frecuentemente detectados en las harinas fueron Bacillus spp.,
coliformes y mohos. Se aislaron 102 Unidades Formadoras de
Colonia por gramo (U.F.C./g) de levaduras y 103 U.F.C./g de
mohos, siendo los mohos más comúnmente aislados
Aspergillus, Penicillium Penicillium, Cladosporium y Eurotium
spp.

Los causantes más frecuentes de la contaminación de

panificados son los hongos y levaduras. Los géneros de
hongos más importantes aislados a partir de los panificados
españoles son Eurotium , Cladosporium y las especies mas
xerotolerantes de Penicillium Penicillium y Aspergillus
(Abellana et al . 1997b). Según Ramos (2002) a causa de la a w
de los productos panificados (0,75–0,90), los hongos alterantes
son comúnmente xerófilos, encontrándose especies de
Eurotium y Aspergillus . Estos mohos son destruidos durante el
horneado, por lo tanto la contaminación proviene de las
esporas ambientales o de las superficies que se encuentra en
contacto con el producto durante el enfriado (Seiler, 1988;
Fustier et al. 1998 ). El crecimiento fúngico en panificados
durante el almacenamiento es un problema serio que ocasiona
importantes pérdidas económicas. A causa de la baja a w de
estos productos (0,75-0,90), la contaminación fúngica es
comúnmente producida por las especies más xerofílicas del
género Aspergillus. Las especies de Eurotium , formalmente
conocidas como las del grupo de Aspergillus glaucus tienen u n
crecimiento óptimo a 0,70-0,80 a w en sustratos que contienen
altas concentraciones de sal o azúcar (I.C.M.S.F., 1980).

En porotos de soja se ha encontrado que los mohos son

importantes contaminantes. Los géneros aislados más
frecuentemente son Penicillium , Aspergillus , Scopulariopsis ,
Mucor , Rhizopus y Cladosporium . Las especies de Aspergillus
encontradas y aisladas fueron A. candidus, A. flavus, A.
fumigatus, A. niger, A. ochraceus, A. sydowii y y A. versicolor.
(Kacàniovà, 2003) .

Rabie (1997) encontró que la micobiota de los granos de

cebada sometidos a malteado también variaba según su etapa
de proceso: los granos sin remojar dieron conteos más altos
de Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Epicoccum nigrum y
Mucor spp, sin embargo, en los granos preremojados se
obtuvieron conteos más altos de Penicillium spp.

1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la

micobiota.

Anderson y Smith (1971) y Deans et al . (1980), demostraro n

que la formación y germinación de conidios y esporas depende
principalmente de las condiciones de crecimiento (sustrato, a w
y temperatura), lo que revela las limitaciones de los métodos
microbiológicos basados en la enumeración de esporas
formadas para evaluar el crecimiento fúngico.

El concepto de a w introducido por Scott (1957) es la forma

más útil para expresar la disponibilidad de agua existente para
el crecimiento de microorganismos (Lace y y Magan, 1991) y su
actividad enzimática (Acker, 1963). La a w no es el único factor
ambiental que influencia el crecimiento fúngico. Su
crecimiento y sobrevivencia estarán influenciados por la
temperatura, pH, concentración de oxígeno y dióxido de
carbono, y la presencia de conservantes. Cuando uno de estos
factores es subóptimo, el efecto inhibitorio de la a w reducida
tiende a incrementarse.

Los niveles de a w correspondientes al rango de contenidos

de humedad pueden ser trazados para proveer una isoterma de
sorción de agua. Esta isoterma es mu y útil, pues no sólo nos
muestra a que contenidos de humedad son conseguidos
niveles de a w deseables o indeseables, sino que también nos
indican que significativos serán pequeños cambios del
contenido de humedad en términos de a w . Por ende, es una
guía útil para determinar la longitud del periodo de
almacenamiento de alimentos conservados a temperaturas
moderadas y preservados solo por su aw reducida. El
crecimiento fúngico en alimentos inadecuadamente
almacenados puede provocar la inducción de producción de
micotoxinas (Jimenez et al ., 1991; Scudamore y Hetmanski,
1995). Las isotermas de sorción de agua de cereales y de otros
productos han sido estudiadas y publicadas por diferentes
autores: en arroz por Rahgaswami (1973), Hunt y Pixton (1974)
y Gough y King (1980); en harina de trigo por Bushuk y Winkler
(1957), Pratap et al . (1982) y Leiras e Iglesias (1991); y en
harina de arroz, harina de arroz aglutinada y arroz aglutinad o
Abdullah et al. (2000).
1.2. Problemas del consumo de alimentos
contaminados con hongos.

La consecuencia más grave de la presencia de mohos en los

alimentos es que éstos pueden llegar a ser capaces de
producir toxinas si las condiciones son favorables. Estas
toxinas se denominan micotoxinas y son metabolitos tóxicos
que ingeridos en cantidad suficiente, provocan intoxicación en
el hombre y animales. Una micotoxicosis es un problema
alimentario, que no es infeccioso ni contagioso (Bourgois,
1994).

Como para todas las sustancias tóxicas ha y que distinguir

entre las intoxicaciones agudas que se producen por la
ingestión de una sola vez o varias veces seguidas de una dosis
relativamente elevada de toxinas, y las intoxicaciones crónicas
que se manifiestan después de la ingestión de pequeñas dosis
repetidas durante largos periodos. Estas últimas son las que
afectan en ma yor grado al ser humano ya que al demostrarse
que la Aflatoxina B1 es cancerígena, las concentraciones
necesarias para producir una intoxicación son mínimas (Moss,
2002). Estas intoxicaciones provo can problemas pasajeros o
crónicos, que afectan a varias funciones del organismo:
alteraciones hepáticas, renales, de los centros nerviosos,
circulatorias, del tracto digestivo, etc.

Las micotoxinas son producto del metabolismo secundario

de los mohos y no todos las elaboran. Además el tipo de
sustrato y las condiciones ambientales juegan un papel
importante en el nivel de su producción. Es por esta razón por
la que no es suficiente detectar en un alimento una especie de
moho tóxico para considerar a un alimento peligroso.
 Las micotoxinas más importantes son las: Aflatoxinas,
producidas por A. flavus y A. parasiticus ; la Zearalenona
producida por especies del género Fusarium ; la Ocratoxina que
es producida por A. ochraceus y P. viridicatum ; los
Tricotecenos que son producidos sobre todo por especies del
género Fusarium y también por otras especies de mohos como
Stachybotris , Trichotecium , Myrothecium , Dendrodochium , etc;
la Patulina que es producida por numerosos mohos pero
principalmente por P. expansum y la Fumonicina producida
principalmente por F. moniliforme.

En la alimentación humana la diversificación de la dieta

impide la absorción regular de cantidades suficientes de
toxinas para llegar a ser peligrosas a excepción de países
castigados por el hambre. Actualmente, el consumidor tiene la
tendencia a creer que todo lo natural es bueno, pues
precisamente las micotoxinas son un ejemplo de moléculas
naturales elaboradas espontáneamente por mohos en nuestro
ambiente y que pueden ser el origen de graves intoxicaciones.
Son típicos contaminantes biológicos y por lo tanto se debe
prestar especial atención en el control de su desarrollo.

Una de las principales fuentes de contaminación de mohos

micotoxigénicos, es el aire (Cvetni et. al, 1997). En Croacia se
expusieron al aire 350 cajas de Petri durante 10 minutos y se
identificaron 3.400 colonias de 22 géneros distintos, siendo los
géneros mas frecuentes Cladosporium (44.7%), Penicillium
(34.4%), Alternaria (26.3%), Aspergillus (21.6%) y Absidia
(12.2%). Encontrándose que el 16,9 % de los aislados de los
géneros Aspergillus , Fusarium y Trichoderma eran
potencialmente productores de micotoxinas.

1.2.1. Principales micotoxinas y su efecto en el humano.

 Las aflatoxinas son compuestos con efectos tóxicos
inmediatos, además de inmunosupresores, mutagénicos,
teratogénicos y carcinogénicos. El principal órgano afectado
por la carcinogénesis de las aflatoxinas es el hígado. La
evaluación de los resultados epidemiológicos y de laboratorio
llevada a cabo en 1987 por el Centro Internacional de
Investigaciones sobre el Cáncer (CIIC) determinó que existen
suficientes datos demostrativos del efecto carcinogénico de
mezclas naturales de aflatoxinas en el ser humano, las cuales
se clasifican por ello como carcinógeno del Grupo 1, salvo en
el caso de la aflatoxina M1, que se considera posiblemente
carcinogénica para el hombre (Grupo 2B) (I ARC, 1987)

Se han registrado varios brotes de aflatoxicosis en países

tropicales, la ma yoría entre adultos de las poblaciones rurales
con una nutrición deficiente y cuyo alimento básico era el
maíz. El cuadro clínico llevaba a sospechar una intoxicación
hepática aguda, que se confirmó por las alteraciones
morfológicas observadas en las muestras de necropsia
hepática, indicativas de hepatitis tóxica. (Tandon et. al. 1977)
Las tasas de mortalidad en la fase aguda eran del 10%-60%.
Transcurrido un año, los supervivientes no presentaban
ictericia y la mayoría se habían recuperado clínicamente. (Bha t
and Krishnarnachari, 1977).

También se han señalado a las aflatoxinas como posibles

factores etiológicos de un cuadro de encefalopatía y
degeneración grasa similar al síndrome de Re ye, frecuente en
países de clima cálido y húmedo. Con degeneración grasa,
palidez y aumento de tamaño del hígado y los riñones, unidos
a edema cerebral grave.

El ácido 3-nitropropiónico (3-NPA) es un metabolito

secundario de Artbrinium sp., género de hongos considerados
causantes de una forma de intoxicación alimentaria aguda
denominada “intoxicación por la caña de azúcar mohosa” (Liu,
1988). Durante el periodo 1972-1988, resultaron afectadas 884
personas y se produjeron 88 (10%) defunciones. (Liu et al .,
1992). El principal dato epidemiológico es el reducido número
de personas en cada brote (entre una y cinco), siendo las
víctimas en su mayoría niños y jóvenes. El periodo de
incubación suele ser de entre 2 y 3 horas a partir de la
ingestión de la caña de azúcar mohosa, y se desarrolla
principalmente con vómitos, distonía, desviación unilateral de
la mirada, convulsiones, espasmo cardopedal y coma. Entre el
10% y el 50% de los pacientes se ven afectados por un cuadro
de distonía tardía, consecuencia de la necrosis simétrica y
bilateral de los núcleos basales. En el adulto, el 3-NP A causa
síntomas gastrointestinales; no son frecuentes los signos de
encefalopatía grave. (Ludolph et al. , 1991)

Las ocratoxinas son metabolitos secundarios de cepas de

Aspergillus y Penicillium presentes en los cereales, el café y el
pan, así como en todo tipo de productos alimenticios de origen
animal en muchos países. (Speijers y Van Egmond, 1993) La
más frecuente es la ocratoxina A, que también es la más
tóxica. Se ha comprobado que tiene efectos nefrotóxicos,
inmunosupresores, carcinogénicos y teratogénicos en todos
los animales de experimentación estudiados hasta el momento
(Criterios de Salud Ambiental).

Se registró en Italia un caso de insuficiencia renal aguda

debido posiblemente a la inhalación de ocratoxina A en un
granero que había permanecido cerrado por 2 años (Di Paolo e t
al., 1994). Los síntomas aparecieron al cabo de 24 horas,
durante las cuales el paciente presentó tensión epigástrica
transitoria, dificultad respiratoria y pirosis retroesternal. La
biopsia mostró una necrosis tubular aguda, pero no se
investigó la presencia de ocratoxina A en sangre. La
cromatografía de capa fina demostró cualitativamente la
presencia de la micotoxina en el trigo del granero. No existe
fase aguda; los primeros signos y síntomas son inespecíficos,
consisten en cansancio, cefaleas, pérdida de peso y palidez. A
lo largo de varios años va instaurándose una proteinuria leve
de proteínas de bajo peso molecular, sin hipertensión, pero
con anemia aplásica o normocrómica. La nefropatía endémica
se caracteriza por lesiones bilaterales y fundamentalmente
crónicas de la corteza renal (degeneración tubular, fibrosis
intersticial e hialinización glomerular). En fases avanzadas de
la enfermedad disminu ye mucho el peso y el tamaño de los
riñones, que muestran una fibrosis cortical difusa, por lo
general sin signos de inflamación (Radoni ć et al ., 1966; Vukeli ć
et al ., 1992).

El CIIC clasificó la ocratoxina A como un compuesto

posiblemente carcinogénico para el ser humano (Grupo 2B)
(I ARC, 1987).

Los tricotecenos son micotoxinas producidas sobre todo

por miembros del género Fusarium , aunque también las
sintetizan hongos de otros géneros (como Trichoderma,
Trichothecium, Myrothecium y Stachybotrys) . Hasta la fecha se
han aislado 148 tricotecenas pero sólo unas pocas se han
detectado como contaminantes de los alimentos. De ellas las
más importantes son el desoxinivalenol (DON), conocido
también como vomitoxina, el nivalenol (NIV) y el
diacetoxicirpenol (D AS), mientras que la toxina T-2 es menos
común. (Criterios de Salud Ambiental , 1990).

Las manifestaciones habituales de la intoxicación po r

tricotecenos consisten en inmunodepresión y náuseas,
acompañadas de vómitos. La primera micotoxicosis por
tricotecenos que se identificó fue la aleucía tóxica alimentaria,
en la URSS en el año 1932, con una tasa de mortalidad del 60%.
(Gajdušec, 1953).
 En varios casos, la micotoxicosis por tricotecenas se debió
a una única ingestión de pan elaborado con harina tóxica
(Bhat et al. , 1989) o de arroz (Ueno, 1971), (Wang et al., 1993).

En los animales de experimentación los tricotecenos son 40

veces más tóxicos por inhalación que por vía oral (98).

La zearalenona es producida principalmente por Fusarium

graminearum y especies afines, sobre todo en el trigo y el
maíz, pero también en el sorgo, la cebada y los piensos
compuestos. La zearalenona y sus derivados tienen efectos
estrogénicos en varias especies animales (infertilidad, edema
vulvar, prolapso vaginal e hipertrofia mamaria en hembras, y
feminización de los machos, con atrofia testicular y aumento
de tamaño de las mamas) (Peraica et al. , 2000).

Las fumonicinas son micotoxinas producidas en todo el

mundo por Fusarium moniliforme y especies afines cuando
crecen en maíz. Tienen importancia toxicológica las
fumonicinas B1 y B2; las demás aparecen en concentraciones
mu y bajas y son menos tóxicas. En la India se informó de un
brote único de intoxicación aguda transmitida por los
alimentos y causada posiblemente por la fumonisina B1. (Bath
et al., 1987). La enfermedad se caracterizaba por dolores
abdominales, borborigmos y diarrea transitorios, que
comenzaban entre media hora y una hora después de consumir
pan ácimo preparado con sorgo o maíz mohos. Los pacientes
se recuperaron por completo al suprimir la exposición a la
toxina y no se produjeron defunciones.

Las toxinas de F. moniliforme han sido clasificadas por un

grupo de trabajo del CIIC como posiblemente carcinogénica
para el ser humano (Grupo 2B) (I AR C, 1987).
1.3. Métodos de control del crecimiento de
contaminantes.

Un método para prevenir la contaminación fúngica en

alimentos a medio procesar puede ser la aplicación del
"concepto barrera" o el método de conservación combinada.
Este método utiliza varias “barreras”, que separadamente no
otorgan la conservación adecuada, pero combinadas brindan la
conservación conveniente. Estas barreras pueden ser cambios
en la temperatura, a w , pH, calentamiento mínimo o la adición
de conservantes. Para que éste concepto sea utilizado en
forma exitosa, la influencia de varios factores intrínsecos y
extrínsecos sobre el crecimiento fúngico necesitarán ser
cuantificados. El factor más importante dentro de los factores
ambientales que afectan la germinación, crecimiento y
establecimiento fúngico sobre sustratos ricos en nutrientes
probablemente sea la disponibilidad de agua (Magan, 1988;
Cooke y W hipps, 1993). El rango de valores de a w que permiten
la germinación de esporas es ma yo r a la temperatura óptima, y
generalmente es requerida una ma yor a w para la formación de
la espora que para la germinación. Es por ello que el nivel de
a w es de importancia práctica para controlar la aparición y
severidad de la alteración producida por mohos. Comúnmente
se observa que los alimentos más fácilmente degradables por
la actividad de microorganismos y cambios químicos, son
usualmente los que poseen una a w mayor (Abdullah, et al .,
2000).

La mayoría de los agentes conservantes clásicos son

ácidos débiles orgánicos. Estas moléculas inhiben el
crecimiento de células bacterianas y fúngicas. El ácido sórbico
también inhibe la germinación de esporas bacterianas (Sofos y
Busta, 1981; Blocher y Busta, 1985). Según Eklund (1983, 1985)
y Peth ybridge et al ., (1983). La actividad antimicrobiana de
todos estos ácidos débiles depende principalmente de la
molécula sin disociar. Los conservantes ácido débil existen en
solución en un equilibrio dependiente del pH entre el estado
disociado y no disociado. La actividad inhibitoria es óptima a
bajo pH debido a que favorece al estado no disociado y no
cargado de la molécula. De esta forma, la molécula es
permeable a través de la membrana y por ello capaz de
ingresar a la célula. Sin embargo, la acción inhibitoria se debe
a los compuestos que atraviesan la membrana plasmática en el
estado disociado. Subsecuentemente, al encontrarse con un
pH ma yor dentro de la célula, la molécula se disocia resultando
que el escape de los aniones y protones hacia el exterior de la
membrana no sea posible. Una reducción del pH desde 6,0 a
5,0-5,2 resulta en un gran incremento relativo en la proporción
de la forma no disociada (Chirife y Favetto, 1992). En
conclusión, las moléculas de conservantes difunden al interior
de la célula hasta que el equilibrio es alcanzado y provoca la
acumulación de aniones y protones dentro de la célula (Booth
y Kroll,1989). Por otro lado, se ha propuesto que la inhibición
del crecimiento por los conservantes ácido débil se debe a un
gran número de acciones, incluyendo la disrupción de la
membrana (Freese et al ., 1973; Stratford y Anslow , 1998;
Brace y et al ., 1998), inhibición de las reacciones metabólicas
esenciales, estrés en la homeostasis del pH intracelular
(Salmond et al ., 1984; Cole y Keenan, 1987; Brace y et al ., 1998)
y acumulación de aniones tóxicos (Eklund, 1985). En las
levaduras, también se ha propuesto que la acción inhibitoria
de los conservantes ácido débil es debida a la inducción de
una respuesta a un stress enérgico que atenta a restaurar la
homeostasis y resulta en la reducción de los pooles de energía
disponible para el crecimiento y otras funciones metabólicas
esenciales. Stratford y Anslow (1998) propusieron que el ácido
sórbico actúa como una sustancia activa a las membranas de
los microorganismos y no como un conservante ácido-débil.

1.4. Objetivos.
 La soja es uno de los cultivos más importantes de la
Argentina tanto en superficie sembrada como en niveles de
producción. Tanto los aceites como las harinas de soja son
ampliamente consumidos en el país ya sea por sus
propiedades nutritivas como por sus bajos precios.

De las comidas con soja, la milanesa de soja es la más

conocida y aceptada en nuestro medio. Ha y innumerables
variantes para este preparado. Estas recetas se publican mu y
usualmente en revistas, libros e internet y van desde triturar
los porotos y formar una masa con condimentos, hasta mezclar
distintas harinas, entre ellas la harina de soja con huevo y
especias. A medida que se extendió su consumo apareció en el
mercado la venta minorista de harinas de soja en comercios
naturistas y fraccionadores. En la medida que la soja
reemplazó a otros alimentos en la dieta de los argentinos,
fueron apareciendo pequeñas empresas dedicadas a la
elaboración de milanesas de soja. Actualmente existen
innumerables pequeñas y medianas empresas (P yMES)
dedicadas exclusivamente a la elaboración de éste producto.
Además, la popularidad de éste producto es tal que figura en
las cartas de numerosos restaurantes de Argentina.

En lo que respecta a alimentos a base de soja no existen

antecedentes que describan su micobiota. Tampoco éste
producto se encuentra bajo una legislación y no es nombrado
en el Código Alimentario Argentino (C. A. A.). Sólo, existen
trabajos que enumeran los contaminantes encontrados en
productos cárnicos con agregados de proteínas o aislados de
soja.

Como se expreso anteriormente, el desarrollo del presente

trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar de milanesas de
soja ubicada en la ciudad de Tandil.
Los objetivos fueron:

1. Identificar la micobiota contaminante durante la

elaboración del producto.
2. Detectar las principales fuentes de contaminación y
los puntos críticos durante su manufactura.
3. Realizar modificaciones durante la elaboración que
permitan disminuir el desarrollo de microorganismos a
través de cambios en el proceso y mediante la adición
de conservantes.
 2. MATERIALES Y MÉTODOS.

2.1. Proceso de elaboración.

En la fábrica se elaboran principalmente dos tipos de

milanesas: milanesas de soja y de verdura. Las milanesas de
soja son producidas con una mezcla de harina común, harina
aglutinada y harina de soja. En el caso de las milanesas de
verdura, la harina de soja es reemplazada por verdura fresca
hervida y triturada o por verdura deshidratada que se
reconstitu ye antes de formar la masa. Estos ingredientes son
inicialmente mezclados e hidratados en una amasadora de
panadería, hasta formar una masa con la consistencia deseada.
Posteriormente, la masa se estira por medio de una sobadora
eléctrica hasta obtener una lámina de medio centímetro de
espesor. Estas láminas son cortadas manualmente con un
molde que posee la forma definitiva de la milanesa. Para el
armado final se ubica una porción de queso cremoso en el
centro de dos láminas de masa y se cierra presionando sobre
los bordes. Una vez armadas las milanesas, se someten a un
proceso de escaldado en agua hirviendo. Para ello se
sumergen en el agua hasta que las mismas emergen a la
superficie. Por último, las milanesas se escurren y se rebozan
con pan rallado y una mu y pequeña cantidad de orégano y
perejil deshidratado. El proceso implica gran cantidad de mano
de obra y se detalla en la figura 1.
 Mezcla AMASA Agu

Ma

ESTIRA

Lámi

CORTAD
Tapa

Tap
a
COLOCA COLOC Ques
CIÓN ACIÓN
PEGA milan ALMAC ESCAL
DO DE ENADO DADO

ENVASA ALMAC REBO

ENADO ZADO
Per
REFRIG Pan
Rall
Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja.
2.2. Identificación de la micobiota contaminante.

2.2.1. Muestreo.

En todos los casos, las muestras se tomaron asépticamente

y se conservaron en placas de Petri o en tubos de ensayo
estériles para su posterior traslado al laboratorio. En el caso
de las materias primas (harinas y especias deshidratadas) se
extrajeron las muestras a partir de los recipientes que habían
recibido menor manipulación en la empresa, para determinar la
calidad microbiológica al momento de llegada a la fábrica.

Las muestras de milanesas fueron extraídas durante las

diferentes etapas del proceso de elaboración (figura 1). Se
analizaron milanesas de soja y de verdura, obteniéndose en
ambos casos las siguientes muestras:

• masa sin estirar.

• masa estirada (en el caso de la masa de soja, se obtuvo
además una muestra a las 24 h posteriores a su elaboración
y conservada en frío).
• milanesa sin cocinar.
• milanesa cocida y sin rebozar.
• milanesa cocida y rebozada.

Paralelamente, se realizó un muestreo ambiental con la

finalidad de identificar la micobiota presente en la fábrica.
Para ello se realizaron dos tipos de muestreos. En uno de ellos
se analizó la contaminación existente en el aire y en el otro la
contaminación de las superficies de trabajo. Para el primer
caso, se destaparon en diferentes lugares de la fábrica placas
de Petri conteniendo el medio de cultivo AP A (papa 200 g
sometida a una decocción de 1 hora; azúcar 20 g; agar 15 g;
agua destilada 1.000 ml; pH 6,0; autoclavado a 121º C durante
20 min.) durante 5 minutos (método gravimétrico).
Posteriormente, las placas fueron incubadas en el laboratorio a
25º C durante 5 días. En el segundo caso, se realizaron
hisopados de la superficie de las mesas de trabajo y de las
bandejas donde se colocaban las milanesas a enfriar. Para
ello, se utilizaron hisopos comerciales estériles que fueron
introducidos en un tubo de ensayo con solución fisiológica
estéril (cloruro de sodio 0,85%) y posteriormente se frotaron
en un área de 10 cm 2 por distintas partes de la mesa de
trabajo. Una vez recolectada la muestra, los hisopos se
conservaron dentro de la solución. A partir de ésta, se
realizaron diluciones seriadas de 1/10 y las mismas fueron
sembradas en superficie en placas de Petri con AP A e
incubadas a 25º C durante 5 días.

2.2.2. Aislamiento y purificación.

Las muestras de masas y milanesas fueron incubadas en

cámaras húmedas a 25º C durante 7 días. Para ello se
utilizaron bandejas con tapa que fueron desinfectadas con
alcohol etílico comercial y ubicadas bajo luz UV en la cámara
de flujo laminar durante 10 minutos. Luego se colocaron en su
interior tres papeles de diario estériles por cámara y se
hidrataron con agua estéril.

También se dejaron en cámara húmeda 3 milanesas de soja,

con más de una semana de elaboración, que presentaban
signos de alteración fúngica con distinta micobiota
predominante.

Transcurridos los 7 días, se repicaron las colonias de

mohos y levaduras con diferencias morfológicas entre sí, en
placas de Petri con medio AP A. Este procedimiento se repitió
tantas veces como fue necesario hasta obtener un cultivo
puro.
 Los conidios de los diferentes aislamientos de hongos
filamentosos y las células de levaduras fueron conservados en
glicerol al 20 % a –20º C para su posterior análisis.

2.2.3. Identificación primaria.

Se realizó la identificación primaria de los aislamientos

obtenidos utilizando la clave taxonómica de Pitt y Hocking
(1997).

2.3. Origen de los contaminantes identificados en las

milanesas.

Debido a la diversidad de hongos filamentosos obtenidos a

partir de las muestras de milanesas, se realizó un nuevo
muestreo con la finalidad de determinar el origen de las
contaminaciones. Para ello, se obtuvieron muestras a partir de:

• Perejil deshidratado.
• Acelga deshidratada.
• Harina de soja.
• Harina común.
• Pan rallado.
• Harina aglutinada.
• Milanesa de espinaca con queso sin cocinar.
• Milanesa de espinaca con queso cocida sin rebozar.
• Milanesa de espinaca con queso cocida y rebozada.
• Milanesa de soja sin queso sin cocinar.
• Milanesa de soja sin queso cocida sin rebozar.
• Milanesa de soja sin queso cocida y rebozada.
• Milanesa de soja con queso sin cocinar.

Cada una de las muestras fueron procesadas de la siguiente

manera: se colocaron 10 g de muestra en 90 ml de solución
fisiológica estéril dentro de recipientes cerrados
herméticamente y fueron agitados vigorosamente durante 15
min. En el caso de las muestras con mu y baja densidad, como
el perejil y la acelga deshidratada, se colocó 1 g de muestra en
99 ml de solución fisiológica. A partir de las diluciones
obtenidas y después de ser agitadas se realizaron diluciones
seriadas de 1/10 en solución fisiológica estéril hasta 10 - 8 .
Estas diluciones fueron sembradas por duplicado en placas de
Petri con el medio de cultivo AP A e incubadas a 25º C durante
5 días, para luego realizar los recuentos de mohos y levaduras.
A partir de éstas placas se aislaron los microorganismos
predominantes de cada muestra para su posterior
identificación.

En el caso de los aislamientos que presentaron dificultades

durante la purificación como consecuencia de una
contaminación masiva con hongos Mucorales, se realizó la
siembra en el medio AP A con el agregado de ácido láctico
hasta llegar a pH 5,6 y con un 5% de rosa de bengala para
inhibir el crecimiento de Rhizopus spp. y Mucor spp.

2.4. Tratamiento térmico.

Con la finalidad de disminuir el tiempo de enfriado de las

milanesas en la fábrica luego del escaldado, se realizó un
shock térmico con agua fría después de realizar el tratamiento
térmico. El tiempo de exposición de las milanesas durante el
enfriado es importante ya que en su interior se encuentran una
porción de queso que mantiene mucho el calor. Debido a ello
las milanesas se exponen durante un tiempo largo a la
contaminación ambiental ya que se enfrían a temperatura
ambiente. Con el shock térmico mediante enfriado además de
tener un efecto negativo para el desarrollo de los
microorganismos se pretendía que las milanesas estuvieran
expuestas a la micobiota ambiental el menor tiempo posible.
 Para este experimento se usaron 16 muestras al azar de
milanesas de soja a medida que se desarrollaba el proceso
productivo. La mitad de estas muestras fueron expuestas a un
shock térmico llevado a cabo por inmersión en una batea de
agua fría. Cuatro milanesas con shock térmico fueron
rebozadas y cuatro se dejaron sin rebozar. Idéntico tratamiento
se realizó con las milanesas sin shock térmico. Las muestras
para el análisis de los microorganismos se extrajeron en dos
momentos: 0 h y 12 h, según se representa en la figura 2.

tiem Milanesa

Milanesa sin

Rebozar

tiem
po

Sin Con
Shoc Shoc

Figura 2: Esquema del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas.

Una vez realizado el ensayo, a cada una de las milanesas se

le realizaron cortes longitudinales separados entre sí por 1 cm
de longitud. Tres fragmentos al azar por milanesa fueron
incubados a 25º C en una placa de Petri ubicada dentro de una
bandeja con papel estéril embebido en agua estéril para crear
una cámara húmeda. Cada placa de Petri con sus tres cortes de
milanesa fue designado como una muestra.

Los restos de muestra que no fueron introducidos en

cámaras húmedas se conservaron a temperatura de
refrigeración para su posterior observación.

Luego de 7 días de incubación a 25º C se sacaron las placas

de Petri para su observación y se le tomaron fotografías con
una cámara digital.

2.5. Efecto del pan rallado como contaminante.

A partir de los ensayos anteriores se observó que las

milanesas al ser rebozadas incrementaban los recuentos de
UFC de mohos. Es por eso que se decidió analizar el estado
del pan rallado que llegaba a la fábrica y como progresaba su
estado al continuar el proceso de elaboración. Para realizar
este análisis se tomaron muestras al azar del pan rallado antes
de ser sacado de las bolsas en las cuáles llegan a la fábrica
(P AN SIN US AR), del pan rallado que va quedando en las
asaderas donde se rebozan las milanesas (P AN USADO), del
pan rallado que se encontraba en las bandejas donde se
almacenan las milanesas (P AN B ANDEJ A), y del pan que se
encontró en la mesa de trabajo (P AN MES A). Paralelamente, se
tomó una muestra de la harina común, la harina aglutinada y la
harina de soja.

Con la finalidad de poder comparar los valores de UFC/g de

pan rallado entre las diferentes muestras, se determinó el
contenido de humedad en estufa hasta peso constante y se
consideró dicho valor en el cálculo de la población microbiana.
 Se tomaron muestras de 10 g que se colocaron en
recipientes estériles con 90 ml de agua destilada estéril y
fueron homogeneizadas durante 30 min con un agitador
automático. Las muestras de pan rallado se dilu yeron hasta 10 -
5
para luego ser sembradas por duplicado en placas de Petri
con medio AP A con el agregado de ácido láctico hasta pH 5,5,
5 % de rosa de bengala y un 2% de NaCl (para disminuir la a w
del medio de cultivo). Las muestras 10 - 2 , 10 - 3 y 10 - 4 se
sembraron por duplicado.

Por otra parte, se quiso determinar el efecto del pan rallado

en la contaminación de origen ambiental sobre las milanesas.
Para ello, se tomaron muestras de milanesas que fueron
expuestas toda la noche. Un grupo de milanesas se las dejó
sin rebozar, otro grupo fue rebozado con pan rallado
previamente esterilizado en autoclave y un último grupo fue
rebozado con el pan rallado que se usa habitualmente. A su
vez, la mitad de las muestras de cada grupo se tomaron
inmediatamente después de elaboradas y la otra mitad se las
tomó al día siguiente luego de que ha yan pasado la noche
expuestas al ambiente de la fábrica. Con este experimento se
intentó comprobar el nivel de la contaminación ambiental en el
que las milanesas pueden llegar a estar expuestas.

Las muestras una vez tomadas se llevaron refrigeradas al

laboratorio y allí fueron colocadas a 25º C durante 5 días. Se
realizó una evaluación cuali-cuantitativa visual del grado de
contaminación fúngica.

2.6. Contaminación cruzada.

A partir de los datos anteriores se observó que el escaldado

era un proceso muy eficaz a la hora de disminuir los recuentos
tanto de mohos como de levaduras. Sin embargo, después de
que las milanesas se rebocen los recuentos de levaduras se
incrementaban.

Como las bandejas utilizadas para almacenar las milanesas

una vez elaboradas, antes de escaldar y después de escaldar,
se compartían se sospechó de una contaminación cruzada.
Para ello se tomaron muestras de milanesas cocidas y
rebozadas. Se utilizaron 10 milanesas de cebolla y 10 de
zapallo. Una mitad de cada tipo de milanesa se las ubicó sobre
papel esterilizado y la otra mitad sobre las bandejas. Una vez
que el interior de las milanesas alcanzó la temperatura del
ambiente (aproximadamente 5 h), éstas fueron introducidas
dentro de placas de Petri estériles e incubadas a 10º C durante
10 días. De ésta forma se pretendió determinar el grado de
contaminación que aportaban las bandejas.

Para determinar el grado de contaminación se constru yó

previamente una escala visual que ponía en evidencia los
diferentes niveles de contaminación (Tabla 1).

Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación de las milanesas de zapallo

y cebolla.

Valor Descripción de la
numérico contaminación
Aparición de las primeras
1
levaduras
Levaduras numerosas o
2
aisladas
Aparición de los primeros
3
hongos filamentosos
 Los hongos blancos afectan
4
bordes de las milanesas
Las colonias blancas afectan
5
1/3 de la superficie
Las colonias fúngicas
6 blancas afectan ½ de la
superficie
Las colonias fúngicas
7 blancas afectan toda la
superficie
Las colonias fúngicas
blancas afectan toda la
8 superficie y las negras y
verdes ocupan por lo menos
1/5 de la superficie
Las colonias fúngicas
9 blancas “blanquean” 1/3 de
la superficie
Las colonias fúngicas
10 blancas “blanquean” la mitad
de la superficie
Las colonias fúngicas
11 blancas “blanquean” casi
toda la superficie
Las colonias fúngicas
12 blancas “blanquean” toda la
superficie
2.8. Control de la contaminación con Sorbato de
Potasio.

Con la finalidad de determinar el efecto del agregado de un

conservante sobre la inhibición del desarrollo de
contaminantes, se elaboró una experiencia en la cual se le
agregó a la masa un 0,66 % de Sorbato de Potasio para
asegurar un tiempo de vida útil del producto sin que éste sea
alterado por la actividad de los mohos y levaduras. Se realizó
un lote de milanesas de zapallo con un 0,66 % de sorbato de
potasio y otro sin el agregado del mismo. Las muestras una
vez enfriadas hasta temperatura ambiente se envasaron en una
bolsa de polipropileno y se colocaron en observación a 4º C y
20º C. El grupo de milanesas almacenadas a 20º C fueron
enfriadas sobre papel estéril y sobre las bandejas donde son
almacenadas habitualmente. Se tomaron 2 muestras para cada
tratamiento, lo que hace a un total de 12 milanesas de soja y
12 de zapallo. El día en que las muestras fueron envasadas se
consideró DI A 0 y a partir de allí se contaron los días hasta la
aparición de las primeras levaduras y de los primeros mohos.
Las evaluaciones se realizaron visualmente, considerando la
siguiente escala: las milanesas que presentaron desarrollo de
colonias de levaduras en su superficie fueron calificadas con
el valor 1, y las milanesas con desarrollo de colonias de mohos
se calificaron con el valor 3.
 3. RESULTADOS.
3.1. Identificación de la micobiota contaminante.

3.1.1. Materias primas.

En el caso de las especias deshidratadas el número de

colonias de levaduras fue superior al de los hongos. En
cambio en las harinas, los niveles de contaminación
detectados no fueron importantes, existiendo predominio de
hongos por sobre las levaduras. Los géneros de hongos
filamentosos encontrados mas comúnmente fueron Penicillium,
Aspergillus y Rhizopus .

Con respecto al queso el microorganismo encontrado más

comúnmente fue Geotrichum candidum .

En este ensa yo era de esperar que el pan rallado contuviera

altos niveles de contaminación fúngica, sin embargo, dichos
niveles no fueron lo suficientemente altos como para poder
justificar la contaminación de las milanesas. Dentro de los
mohos más comúnmente encontrados en esta materia prima se
destacan los géneros Aspergillus, Penicillium, Eurotium y
algunas levaduras filamentosas.

3.1.2. Milanesas.

Una vez realizados los aislamientos y la purificación de los

principales hongos filamentosos que se desarrollaban sobre la
superficie de las muestras de masa y milanesas (ver apartado
2.2.1.), se identificaron los mismos como:

Penicillium, Aspergillus, Geotrichum, Rhizopus, Mucor,

Cladosporium, Alternaria, Monascus y levaduras (
filamentosas y no filamentosas).
 Se encontró que a medida que el proceso de elaboración
avanzaba, el número de especies contaminantes y la cantidad
presente de cada una de ellas se incrementaba. En la masa de
acelga sólo se encontraron algunas colonias aisladas de
levaduras filamentosas, sin embargo, una vez estirada la masa
el número y la diversidad morfológica de las levaduras, se
incrementó. En todos los casos la masa de soja contenía una
mayor contaminación que la masa de acelga. Algo similar
ocurrió al comparar la masa antes y después de estirarla.
Previo a éste procedimiento se encontraron colonias de
levaduras color blanco y algunas colonias de mohos, mientras
que después del estirado el número y la variedad se
incrementaron.

Todas las muestras de milanesas que fueron tomadas antes

de que éstas fueran sometidas al escaldado presentaron una
contaminación inferior al observado luego de que éstas fueran
hervidas. En este caso el producto estaba totalmente invadido.
Es probable que el escaldado elimine la población de bacterias
y transformen a los nutrientes del alimento en formas que se
presenten más disponibles para ser utilizadas por los mohos y
levaduras.

Como se expresó anteriormente, en todos los casos se

encontró que las milanesas de acelga tenían menor
contaminación que las de soja. En ambos casos las muestras
sin escaldar poseían un bajo número de colonias en superficie
de levaduras, bacterias y mohos. En las muestras ya
escaldadas el número de colonias aumentó considerablemente.
En la ma yoría de los casos las muestras escaldadas estaban
prácticamente invadidas en toda la superficie por colonias de
Rhizopus spp. y por colonias de levadura blancas. Estas
últimas generalmente se desarrollaban sobre las muestras sin
escaldar en los lugares donde no se desarrollaban los mohos.
Las milanesas escaldadas y rebozadas se encontraban
invadidas por microorganismos en toda la superficie,
predominando Rhizopus spp. a excepción de algunos sectores
colonizados por levaduras blancas o de pigmentación rosada.

En el caso de las milanesas que se recolectaron en fábrica

después de transcurrida una semana de elaboración (Figura 3),
se identificaron mohos de los géneros Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium y Geotrichum , además de levaduras color blanco o
rosa.

Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de

la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días.
3.1.3. Ambiente.

A partir de las placas de Petri expuestas a la contaminación

ambiental (ver apartado 2.2.1.) se aislaron e identificaron
mohos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Cladosporium y
Geotrichum . En el caso de las placas de Petri ubicadas en las
bandejas, utilizadas para el enfriado de las milanesas, se
aislaron los géneros encontrados en las placas anteriores
además de algunas especies de los géneros Alternaria y
Monascus .

De los hisopados realizados en las mesas de trabajo,

mesadas y en las bandejas antes y después de ser utilizadas
se llegó a la conclusión de que las superficies de trabajo
podrían llegar a ser una fuente de contaminación importante de
levaduras. El análisis cuantitativo de dichas muestras fue
inconsistente, existiendo muestras con altísimos niveles y
otras con niveles casi nulos lo que podría estar generado en
una limpieza poco homogénea de las superficies.

3.2. Origen de los contaminantes identificados en las

milanesas.

A partir de las muestras de diferentes ingredientes y

milanesas recolectadas en la fábrica (ver apartado 2.3.) se
determinó que los recuentos en el pan rallado no justificaban
el incremento de la contaminación que se observaba al rebozar
las milanesas (Figura 4), a pesar de los comentarios del
fabricante. Debido a sus apreciaciones el pan rallado aparecía
como una posible fuente de contaminación importante, sin
embargo, esto no se demostró a través de los recuentos.

Otro ingrediente con altos niveles de contaminación fúngica

dentro de las materias primas utilizadas durante la
elaboración, fue el perejil deshidratado, que se utilizó junto
con el pan rallado para rebozar a las milanesas. Sin embargo,
la cantidad de perejil deshidratado utilizada como rebozador
fue ínfima, por lo que tampoco justificaría el incremento en la
contaminación de las milanesas rebozadas.

A partir del recuento de microorganismos realizado en las

harinas utilizadas en la fábrica, se observó que ninguna de las
muestras presentó concentraciones de mohos y levaduras
importantes, sin embargo, en algunas repeticiones las colonias
de bacterias impedían el desarrollo de los microorganismos
fúngicos. En la harina de soja las concentraciones de U.F.C. de
mohos duplicaron a las de las harinas comunes y las harinas
aglutinadas. Los recuentos de las U.F.C. de levaduras fueron
siempre nulos como se puede observar en la figura 4.

Si bien en el apartado 3.1.2. se expresó que los

microorganismos invadían con mayor facilidad las milanesas
ya escaldadas, en los recuentos en placa se encontró que el
número de éstos era mucho más bajo que en las milanesas sin
escaldar. Con respecto a las muestras de milanesas rebozadas
se observó una tendencia a aumentar el número de
contaminantes. Este efecto podría estar explicado por el ma yor
manipuleo que recibe el producto o por una ma yor exposición
a la contaminación ambiental (Figura 5).
 1.000.000

100.000

10.000
Log U.F.C. / g

1.000

100

10

1
o

ja

do
a
ad

ad

ad
So

la
at
at

tin

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dr

R
lu
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hi

Ag

n
a
es

es

in

Pa
ar

a
D

in
H
ga
jil

ar
re

H
el
Pe

Ac

Mohos Levaduras

Figura 4: Recuento de mohos y levaduras en diferentes materias primas.

100000000

10000000

1000000

100000
U.F.C. / g

10000

1000

100

10

1
M. espinaca s/ M. espinaca M. espinaca M. Soja s/ M. Soja M. Soja
cocinar cocinada rebozada cocinar cocinada Rebozada

mohos levaduras

Figura 5: Recuento de mohos y levaduras en milanesas de espinaca con queso y

milanesas de soja con queso durante el proceso.
 Al comparar las milanesas de espinaca y de soja antes de
ser cocinadas se puede observar que los recuentos de mohos
de las milanesas de espinaca son menores que los de soja. Es
mu y posible que la espinaca contenga naturalmente alguna
sustancia que inhiba el crecimiento fúngico. Una vez
escaldadas las milanesas, presentaron una fuerte disminución
de los recuentos de mohos y más aun de levaduras que
llegaron a ser casi nulos. Sin embargo, se pudo observar una
importante recontaminación después de rebozar con pan
rallado las milanesas, lo que indicaría que algunas de las
materias primas utilizadas en el rebozado, como el pan rallado
o el perejil deshidratado, están fuertemente contaminadas o
bien la fuente de esta contaminación podría ser atribuida al
medio ambiente en el cual se rebozan.

1.000.000

100.000

10.000
Log. U.F.C. / g

1.000
Se desarrollaron
100 bacterias que
inhibieron el
desarrollo
10
fúngico

1
Pan sin Usar Pan Usado Pan Bandeja Pan Enfriado Pan Enfriado Pan Mesa
Estado del Pan

Hongos totales Hongos xerofilos Aspergillus / Eurotium Levaduras totales Levaduras filamentosas

Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado recolectadas en diferentes

tiempos del proceso de elaboración.

En la figura 6 se puede observar los géneros que prevalecen

en la micobiota presente del pan rallado a medida que éste va
avanzando en las etapas del proceso de producción.
 Un dato que llama la atención es el nivel de U.F.C. de
levaduras del pan de las bandejas. Las bandejas son utilizadas
para almacenar las milanesas una vez terminadas y luego de
ser cocidas vuelven a ser depositadas sobre las mismas
bandejas, para su enfriado.

En el Pan Mesa los recuentos fueron nulos por estar los

medios de cultivo totalmente contaminados por bacterias que
podrían haber interferido en el crecimiento de posibles hongos
contaminantes.

En la Figura 7 se observan las diferencias en el tipo de

población contaminante que se desarrollan en las distintas
muestras de pan rallado. La fotografía de la izquierda
representa el pan rallado sin usar y en este caso se observan
50 colonias de mohos, de los cuales 40 pertenecen al género
Eurotium . La fotografía del centro representa al pan rallado
usado. En la misma se observan 25 colonias de mohos, donde
solamente 6 corresponden al género Eurotium . Finalmente la
fotografía de la derecha corresponde al pan de las bandejas, la
cual presenta muy pocos mohos y un gran predominio de las
levaduras.

Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cultivo APA
5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado
sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado de las bandejas (derecha). Todas
las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas.
3.3. Tratamiento térmico.

En este ensa yo se le aplicó un enfriado mediante inmersión

en agua fría a un lote de milanesas ( shock térmico). Luego se
tomaron muestras rebozadas y sin rebozar de milanesas con y
sin shock (ver apartado 2.4.) .

A partir de las muestras (cortes de milanesas) ubicadas en

cámara húmeda se observó que:
• No existió diferencias entre las muestras con y sin
shock .
• Cuando las milanesas fueron rebozadas no se observó
diferencias entre las muestras del tiempo 0 y 12 h.
• Cuando las milanesas no fueron rebozadas las muestras
recolectadas a las 12 h presentaron mayor contaminación
que las del tiempo 0.

En las figuras 8 y 9 se observa el desarrollo fúngico sobre

las milanesas incubadas a 25º C durante 7 días en cámara
húmeda.

0 12 0 12
Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock (derecha).
 0 12 0 12
Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

Al no existir diferencias entre las muestras con y sin shock

pero si entre las muestras rebozadas y sin rebozadas, sumado
a que los recuentos en pan rallado no son tan elevados como
eran de esperar, se consideró la posibilidad de que el pan
rallado podría ejercer un efecto adicional con respecto a la
captación de contaminantes.
3.4. Efecto del pan rallado como contaminante.

Para comprobar la existencia de algún fenómeno físico del

pan rallado que origine una ma yo r captación de esporas del
medio ambiente, se realizó la siguiente experiencia. Se
utilizaron milanesas sin rebozar, rebozadas con pan rallado
previamente esterilizado y rebozadas con pan rallado común.

De los resultados obtenidos se observó que:

• Las muestras rebozadas con pan estéril tenían una

contaminación similar a las milanesas sin rebozar.
• Las milanesas rebozadas con pan rallado común estaban
mucho más contaminadas y totalmente colonizadas.
• Las diferencias entre las muestras tomadas en el
momento y las tomadas 12 h después, no fueron
significativas.
• Los principales contaminantes identificados fueron
Penicillium spp. y Rhizopus spp.

De todos los resultados anteriores se conclu yó que ninguna

de las materias primas poseía niveles de contaminación de
levaduras importantes como así tampoco niveles de mohos
suficientes como para justificar los encontrados en las
milanesas una vez rebozadas. La materia prima con recuentos
más altos de levaduras que se pudo hallar fue el Pan Rallado
de las bandejas. Esto podría indicar una posible contaminación
cruzada en ese punto del proceso, lo que incrementaría
significativamente las U.F.C. de levaduras en la superficie de
las milanesas.
3.5.Contaminación cruzada.

Debido a que las bandejas donde se dejaban enfriar las

milanesas escaldadas eran las mismas donde se almacenaban
las milanesas antes de ser escaldadas, se decidió comprobar
si existía una posible contaminación cruzada. Para ello se
realizó un ensa yo que consistió en enfriar sobre papel estéril y
sobre las bandejas utilizadas habitualmente en fábrica,
milanesas de cebolla y de zapallo escaldadas y rebozadas (ver
apartado 2.6.). En la tabla 2 se representan los resultados.

Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala

utilizada para cuantificar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6.

Nivel de contaminación de las milanesas

almacenadas a 10ºC
Día Día Día Día Día
Día 6 Día 7 D
1 2 3 4 5
Cebolla
en
0,00 0,00 0,00 0,60 3,00 5,80 7,00 9
papel
estéril
Cebolla
en 0,00 0,00 0,80 2,00 4,80 6,40 8,40 10
bandeja
Zapallo
en
0,00 0,00 0,00 0,40 5,00 6,40 7,20 11
papel
estéril
Zapallo 0,00 0,00 0,00 2,00 6,80 11,40 12,00 12
 en
bandeja
Se pudo observar que las milanesas de cebolla tuvieron una
tendencia a inhibir el crecimiento de los mohos ya que su
crecimiento se ve retardado con respecto a las milanesas de
zapallo. Este efecto inhibitorio de la cebolla sobre el
desarrollo de microorganismos fue reportado por Mei-chin y
Shih-ming (1999) y por Abdel-Hafez y El-Said (1997). Benkeblia
(2004) encontró que las cepas de Aspergillus niger, Penicillium
cyclopium fueron fuertemente inhibidas por bajas
concentraciones de aceites esenciales de cebolla y ajo.
Fusarium ox ysporum presentó una menor sensibilidad a los
extractos de estos aceites esenciales.

En la figura 10 y 11 se exponen fotografías que

corresponden a milanesas en el sexto día de incubación.

Repeti Repeti

Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones).
En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se
enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin
contaminación cruzada).
 Repeti Repeti

Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones).
En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se
enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin
contaminación cruzada).
3.6. Control de la contaminación con Sorbato de
Potasio.

Se elaboraron milanesas de zapallo con el sistema

habitualmente utilizado en fábrica y con el agregado de 0,66 %
de sorbato de potasio. Las milanesas fueron enfriadas sobre
las bandejas y sobre papel estéril, según se expresa en el
apartado 2.8.

Las muestras se incubaron a 4 y a 20º C y se registraron los

niveles de contaminación en la escala explicada en el apartado
2.8.

3,5

3
Nivel de Contaminación

2,5

1,5

0,5

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Días

Sin Sorbato Con Sorbato Con Sorbato Sobre Papel

Figura 12: Crecimiento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y
con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.
 3,5

3
Nivel de Contaminación

2,5

1,5

0,5

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Días

Sin Sorbato Con Sorbato Con Sorbato Sobre Papel

Figura 13: Crecimiento fúngico a 4º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con
sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

De los resultados obtenidos (Figuras 12 y 13) se observa

que:

1. Las milanesas tratadas con sorbatos (enfriadas en

bandejas o en papel estéril) e incubadas a 4º C,
permanecieron durante más tiempo sin la aparición de
mohos en superficie.
2. El enfriamiento de las milanesas (con sorbato e
incubadas a 4º C) sobre papel estéril retardó 3 días la
aparición de las levaduras.
3. La disminución de la temperatura de almacenamiento a
4º C provocó un retraso en la aparición de los
contaminantes mayor al observado por el agregado de
sorbato.
4. En todas las muestras excepto las que no estuvieron
en contacto con las bandejas, las levaduras se
desarrollaron antes que los mohos.
5. Al evitar la contaminación cruzada a 4º C, el desarrollo
de microorganismos se retarda 3 días.
 4. DISCUSIÓN FINAL.
Antes de dar comienzo a la pasantía se visitó la fábrica para
conocer la problemática y mediante una observación general
del proceso se sugirió al fabricante envasar las milanesas a
20º C y no a mayores temperaturas debido a que el vapor que
condensaba dentro del envase generaba humedad que podría
ser utilizada por los microorganismos. Además, se propuso
reemplazar el material de envase se polietileno por uno de
polipropileno.

Durante el desarrollo de la presente pasantía se llevaron a

cabo dos etapas de trabajo claramente diferenciadas. En la
primera, el objetivo principal fue detectar el origen de las
contaminaciones fúngicas a través del análisis de las materias
primas utilizadas durante la elaboración de las milanesas
(harinas, especias, pan rallado, etc) y el análisis de la
población ambiental. En una segunda etapa se detectaron los
puntos críticos de contaminación y se llevaron a cabo
modificaciones en el proceso productivo para mejorar la
calidad sanitaria y vida útil del producto final.

Durante el desarrollo de la primera etapa, se determinó que

muchos de los microorganismos presentes en las materias
primas también lo estaban en los productos intermedios. Sin
embargo, a medida que el proceso de elaboración avanzaba, se
incrementaba el número de especies y sus concentraciones. El
tratamiento térmico o escaldado a que son expuestas las
milanesas durante su elaboración, provocó una importante
disminución de la población de microorganismos. No obstante,
el producto final contenía un número de especies mucho ma yor
y concentraciones más altas de microorganismos que los
productos intermedios o las milanesas recién escaldadas. Este
hecho podía deberse principalmente a dos motivos:
contaminación de las materias primas utilizadas después del
escaldado o contaminación ambiental.

Por tal motivo se realizaron una serie de muestreos y

ensayos que permitieran determinar el origen concreto de los
microorganismos aislados. El pan rallado utilizado en el
rebozado, fue la materia prima más estudiada debido a que
parecía ser una posible fuente de contaminación. A través de
los análisis se determinó que el pan rallado contenía un
importante número de mohos, pero éstos no parecían ser
suficientes para causar la contaminación producida en las
milanesas rebozadas. Por otro lado, a partir de este
ingrediente no se aislaron levaduras y sin embargo, éstas eran
frecuentemente aisladas desde muestras de milanesas. Debido
a esto, se comenzaron los estudios de contaminación
ambiental. En este caso se encontró que en el aire y en las
bandejas de enfriamiento existían las mismas especies que
fueron encontradas en las milanesas. Además, a partir de
muestras recogidas en la superficie de las bandejas donde se
colocaban las milanesas sin escaldar y que más tarde se
colocaban las milanesas ya rebozadas, se aislaron las mismas
colonias de levaduras que se desarrollaban en las milanesas.
De esta forma se comprobó que la contaminación cruzada en
las bandejas donde se enfrían las milanesas y la exposición al
medio ambiente, eran los causales de la mayor parte de la
micobiota asociada o crítica.

Una vez detectado el origen de las contaminaciones se

inició con la segunda etapa del trabajo. En este caso se
realizaron una serie de experimentos que permitieron
confirmar y evitar la contaminación cruzada en las bandejas.
Por tal motivo, la sugerencia principal que se realizó al
fabricante fue la de mantener una estricta limpieza de las
bandejas y evitar compartir las mismas con milanesas
escaldadas y sin escaldar. A su vez, es importante mencionar
que en el caso de que se use el mismo carro para colocar
milanesas crudas y cocidas, las bandejas donde se colocan las
cocidas se deberán encontrar en la parte superior del carro ya
que de lo contrario las esporas fúngicas, restos de pan rallado
y otras materias contaminadas, podrían caer sobre las
milanesas ya escaldadas.

Para disminuir el nivel de contaminación ambiental, se

sugiere la colocación de un presurizador de aire. Este
artefacto tomará el aire del exterior, lo filtrará y lo enviará al
interior. De esta manera siempre que una puerta o ventana se
abra el aire saldrá y nunca podrá ingresar. La importancia de
que no entre aire sin filtrar radica en que de esta forma se
evita el ingreso de partículas de polvo con esporas fúngicas y
células de microorganismos adheridas a él. En caso de no ser
posible crear una presión positiva dentro de la fábrica se
deberán evitar las corrientes de aire dentro de la misma. De
esta forma se disminuirá la cantidad de partículas de polvo en
el aire que vehiculizan a los microorganismos presentes en el
aire.

Con el objetivo de aumentar la vida útil del producto, se

realizaron pruebas adicionando un conservante a la mezcla de
las milanesas. Para ello se utilizó un inhibidor del desarrollo
fúngico, como es el sorbato de potasio. De acuerdo a las
características del producto y al mercado al cual está
orientado, este conservante es el que mejor se adapta ya que a
bajas concentraciones su sabor es indetectable y es
considerado GR AS (Generalmente Reconocido Como Seguro)
por el Codex Alimentario. Sin embrago, se debe recalcar la
importancia de prevenir la contaminación antes de inhibirla
con conservantes ya que según Steels (2000) la concentración
inhibitoria mínima aumenta con el tamaño del inóculo. Altas
concentraciones de células requieren concentraciones de
conservantes considerablemente mayores para evitar el
crecimiento. Es por esto que la recomendación final que se
realizó al fabricante, fue aplicar una dosis de 0,10 a 0,66% de
sorbato, mantener la temperatura de las milanesas
almacenadas a 4º C y evitar la contaminación cruzada
producida por las bandejas de enfriamiento.
Otra alternativa a considerar es el agregado de una pequeña
cantidad de ácido cítrico para aumentar la eficiencia del
sorbato de potasio. Marin et al. (2002) encontró que en los
panificados españoles el sorbato de potasio actúa más
eficientemente a valores bajos de pH (Blocher and Busta,
1985) y de a w .

Es indispensable que el envasado del producto se realice a

una temperatura inferior a 20 ° C. De esta forma el agua de las
milanesas se terminará de evaporar y no se producirán
condensaciones dentro del envase que podrían llevar al
desarrollo de colonias de microorganismos.
 5. BIBLIOGRAFÍA.

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