Introduccin a las Enzimas

Las enzimas son catlisis biolgicas responsables de sostener casi todas las reacciones qumicas que mantienen la homeostasis animal. Por su funcin en el mantenimiento de procesos de la vida, los ensayos y la regulacin farmacolgica de las enzimas se han constituido en elementos claves para el diagnostico clnico y teraputico. Los compuestos macromoleculares de casi todas las enzimas estn hechos de protena, excepto por una clase de catlisis modificada de RNA conocidas con el nombre de ribozimas. Las ribozimas son molculas de acido ribonucleico que catalizan reacciones en el enlace fosfodiester de otros RNAs. Las enzimas se encuentran en todos los tejidos y fluidos del cuerpo. Las enzimas intracelulares catalizan las reacciones de las vas metablicas. Las enzimas en las membranas celulares regulan reacciones en las clulas como respuesta a seales extracelulares, y las enzimas de la circulacin son responsables de la regulacin de la coagulacin sangunea. Casi todos los procesos significativos en biolgica son dependientes de la actividad Enzimtica. Regreso al inicio

Clasificacin de las Enzimas

Tradicionalmente, a las enzimas simplemente se les asignaba nombres a cargo del investigador que las descubra. Cuando el conocimiento se expandi, el sistema de clasificacin de las enzimas se hizo complejo. Actualmente, a las enzimas se les agrupa en seis clases funcionales de acuerdo a la Unin Internacional de Bioqumicos (I.U.B). Numero Clasificacin 1 2 3 4 5 6 Propiedades Bioqumicas Actan sobre muchos grupos qumicos para aadir o retirar tomos de Oxidoreductasas hidrogeno Transfieren grupos funcionales entre molculas aceptoras y donadoras. Transferasas Las cinasas son transferasas especiales que regulan el metabolismo al transferir fosfatos desde el ATP a otras molculas Hidrolasas Aaden agua a travs de los enlaces, hidrolizndolos. Aaden agua, amoniaco o dixido de carbono a travs de enlaces Liasas dobles, o remueve estos elementos para producir enlaces dobles. Realizan muchas clases de isomerizaciones: isomerizaciones L a D, Isomerasas reacciones de mutacin (traslado de grupos qumicos) y otras. Catalizan reacciones en las que dos grupos qumicos se unen (o ligan) Ligasas con el uso de energa del ATP

Las reglas dan a cada enzima un nmero. El sistema IUB tambin especifica un nombre textual para cada enzima. El nombre de la enzima esta hecho de los nombres del sustrato(s), producto(s), y la clase funcional de la enzima. Debido a que muchas enzimas, como las alcohol

deshidrogenasas, son ampliamente conocidas en la comunidad cientfica por sus nombres comunes, el cambio a la nomenclatura aprobada por la IUB ha sido lento. En el uso del da a da, a la mayora de enzimas se les contina llamando por su nombre comn. A las enzimas tambin se les clasifica en base a su composicin. Las enzimas formadas completamente de protena se les conoce con el nombre simple de enzimas contrariamente a enzimas complejas, que estn hechas de protenas ms una molcula orgnica relativamente pequea. A las enzimas complejas tambin se les conoce con el nombre de holoenzimas. En esta terminologa el componente proteico se conoce con el nombre de apoenzima, mientras que el componente no proteico se conoce con el nombre de coenzima o grupo prosttico; en donde el grupo prosttico describe un complejo en el que la molcula orgnica pequea esta unida a la apoenzima por enlaces covalentes; cuando la unin entre la apoenzima y los componentes no proteicos no es covalente, la molcula orgnica pequea se conoce con el nombre de coenzima. Muchos grupos prostticos y coenzimas son derivados hidro-solubles de vitaminas. Debe indicarse que los sntomas clnicos ms importantes de la deficiencia de vitaminas en la dieta generalmente aparecen por el mal funcionamiento de las enzimas, que carecen de cofactores suficientes derivados de las vitaminas para mantener la homeostasis. El componente no proteico de una enzima puede ser tan simple como un ion metlico o tan complejo como una molcula orgnica pequea no proteica. Las enzimas que requieren de un metal en su composicin se conocen con el nombre de metaloenzimas si estas se unen y mantienen su tomo(s) de metal bajo todas las condiciones con una muy alta afinidad. Aquellas que tienen una afinidad mas baja para los iones metlicos, pero que aun requieren del metal para su actividad, se conocen con el nombre de enzimas activadas por metales. Regreso al inicio

Papel de las Coenzimas

El papel funcional de las coenzimas es actuar como transportadores de grupos qumicos desde un reactante a otro. Los grupos qumicos que se transportan puede ser tan simples como un ion hidrogeno (H+ + 2e) transportado por el NAD o una mol de hidrogeno transportado por el FAD; o pueden ser mas complejos que la amina (NH2) transportados por el fosfato de piridoxal. Debido a que las coenzimas son qumicamente cambiadas como consecuencia de la accin Enzimtica, frecuentemente es util considerar a las coenzimas como una clase especial de sustratos, o segundos sustratos, que son comunes a muchas y diferentes holoenzimas. En todos los casos, las coenzimas donan el grupo qumico que transportan a una molcula aceptora y as son regeneradas a su forma original. Esta regeneracin de la coenzima y holoenzima cumple con la definicin de una enzima como un catalizador qumico, debido a que (a diferencia de los sustratos usuales, que son usados durante el curso de una reaccin) las coenzimas generalmente se regeneran. Regreso al inicio

La Enzima en Relacin al Tipo de Sustrato

Aunque las enzimas son altamente especficas para el tipo de reaccin que catalizan, lo mismo no es siempre la verdad sobre los sustratos que estas atacan. Por ejemplo, mientras la succinado deshidrogenasa (SDH) siempre cataliza reacciones de oxido-reduccin y su sustrato es invariablemente el acido succnico, la alcohol deshidrogenasa (ADH) siempre cataliza reacciones de oxido-reduccin pero ataca a varios diferentes alcoholes, que van desde el metanol al butanol. Generalmente, las enzimas que tienen una especificidad amplia de sustrato son mas activas con un sustrato en particular. En el caso de la ADH, el etanol es el sustrato preferido. Las enzimas son tambin especificas para una configuracin estrica particular (ismero ptico) de un sustrato. Las enzimas que atacan a un azcar D no atacaran a su ismero L correspondiente. Las enzimas que actan sobre un aminocido L no utilizaran el ismero D correspondiente como un sustrato. Las enzimas conocidas con el nombre de racemasas proveen una excepcin importante a estas generalizaciones; de hecho, el papel de las racemasas es convertir a los ismeros D a ismeros L y viceversa. As, las racemasas atacan a las formas D y L de sus sustratos. Como las enzimas tienen ms o menos un amplio rango de especificidad de sustrato, entonces un sustrato determinado puede ser utilizado por un nmero diferente de enzimas, cada una de las cuales utiliza el mismo sustrato(s) y produce el mismo producto(s). Los miembros individuales de un grupo de enzimas que comparten tales caractersticas se conocen con el nombre de isozimas. Estas son productos de genes que varan muy poco; frecuentemente, varias isozimas de un grupo se expresan en diferentes tejidos del cuerpo. El grupo de isozimas mejor estudiado es el sistema de la lactato deshidrogenasa (LDH). La LDH es una enzima tetramrica compuesta de todos los arreglos posibles de dos subunidades proteicas diferentes. Las subunidades se conocen con el nombre de H (por corazn en ingles) y M (por msculo). Estas subunidades se combinan en varias maneras produciendo 5 isozimas distintas. La isozima hecha con solamente con subunidades H es caracterstica del corazn, y la isozima M se encuentra en el msculo y en el hgado. Todas estas isozimas catalizan la misma reaccin qumica, pero exhiben diferentes grados de eficiencia. La deteccin de isozimas de LDH especificas en la sangre es altamente diagnostica de dao tisular como ocurre en el infarto del corazn (ver mas abajo). Regreso al inicio

Interacciones Enzima-Sustrato
El modelo mas favorecido de la interaccin enzima sustrato se conoce como el modelo de ajuste inducido. Este modelo propone que la interaccin inicial entre la enzima y el sustrato es relativamente dbil, pero que estas interacciones dbiles rpidamente inducen cambios conformacionales en la enzima que fortalecen la unin y atraen los sitios catalticos en proximidad a los enlaces del sustrato que deben alterar. Despus de que la unin se ha hecho, uno o ms mecanismos de catlisis generan complejos de estado-de transicin y productos de la reaccin. Los posibles mecanismos de catlisis son cuatro:

1. Catlisis por tensin de enlace: en esta forma de catlisis, los rearreglos estructurales inducidos que se hacen con la unin del sustrato y enzima finalmente producen uniones de sustrato tensionadas, que mas fcilmente logran es estado de transicin. La nueva conformacin frecuentemente forza a los tomos del sustrato y a grupos catalticos, como el glutamato y el aspartato, a conformaciones que tensan enlaces de sustrato existentes. 2. Catlisis por proximidad y orientacin: las interacciones enzima-sustrato orientan los grupos reactantes y los juntan uno con otro. Adems de inducir tensin, grupos como el aspartato son frecuentemente qumicamente reactivos tambin, y su orientacin y proximidad al sustrato favorecen su participacin en la catlisis. 3. Catlisis que involucran donadores (cidos) y aceptores (bases) de protones: otros mecanismos tambin contribuyen significativamente para completar los eventos catalticos que se inician por mecanismos de tensin, por ejemplo, el uso de glutamato como un catalizado acido en general (donador de protones). 4. Catlisis covalente: en las catlisis que se realizan por mecanismos covalentes, el sustrato se orienta a los sitios activos de las enzimas de tal manera que se forma un intermediario covalente entre la enzima o la coenzima y el sustrato. Uno de los ejemplos mas conocidos de este mecanismo es el que involucra protelisis por las proteasas de serina, que incluye a enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina, y elastasa) y varias enzimas de la cascada de la coagulacin. Estas proteasas contienen en su sitio activo serina cuyo hidroxilo del grupo-R forma un enlace covalente con un carbono carbonilo de un enlace peptdico, por lo tanto causan hidrlisis del enlace peptdico. Regreso al inicio

Reacciones Qumicas y Velocidad (Proporciones) de Cambio

De acuerdo a las convenciones de la bioqumica, la proporcin de cambio de una reaccin qumica se describe por el numero de molculas de reactante(s) que es convertida a producto(s) en un periodo de tiempo especifico. La proporcin de cambio de la reaccin siempre depende de la concentracin de los qumicos involucrados en el proceso y de las constantes que son caractersticas de la reaccin. Por ejemplo, la reaccin en la que A se convierte en B se escribe como sigue:

A > B
La proporcin de cambio de esta reaccin se expresa algebraicamente como una disminucin en la concentracin del reactante A:

[A] = k[B]

O como un incremento en la concentracin del producto B:

[B] = k[A]
En la segunda ecuacin (de las 3 anteriores) el signo negativo significa una disminucin en la concentracin de A mientras la reaccin procede, los corchetes definen la concentracin en molaridad y la k se conoce como la constante de la proporcin de cambio. Las constantes de la proporcin de cambio son simplemente constantes de proporcionalidad que dan una conexin cuantitativa entre las concentraciones qumicas y las proporciones de reaccin. Cada reaccin qumica tiene valores caractersticos para sus proporciones de cambio constantes; estas a su vez se relacionan directamente con la constante de equilibrio para esa reaccin. As, la reaccin puede reescribirse como una expresin de equilibrio para demostrar la relacin entre la proporcin de la reaccin, y las constantes de equilibrio y de proporcin de cambio para este caso simple. La constante de cambio para la reaccin hacia delante se define como K+1 y la reversa como k-1. En equilibrio la proporcin de cambio (v) de la reaccin hacia delante (A > B) es, por definicin, igual a la proporcin de la reaccin reversa o de regreso (B > A), una relacin que algebraicamente se representa como:

Vadelante = vatras
En donde, para la reaccin hacia adelante:

vadelante = k+1[A]
y para la reaccin hacia atrs:

vatras = k1[B]
En las ecuaciones anteriores, k+1 y k1 representan constantes de cambio para la reacciones hacia delante y hacia atrs, respectivamente. El signo negativo se refiere a una reaccin reversa, no a un valor negativo para la constante. Para poner las relaciones de las dos ecuaciones en palabras, establecemos que la proporcin de cambio de la reaccin hacia delante [Vadelante] es igual al producto de la constante de cambio hacia delante k+1 y la concentracin molar de A. La proporcin de la reaccin reversa es igual al producto de la constante de cambio hacia atrs k1 y la concentracin molar de B. En equilibrio, la proporcin de cambio de la reaccin hacia delante es igual a la proporcin de la reaccin reversa llevando a la constante de equilibrio de la reaccin y se expresa:

Esta ecuacin demuestra que la constante de equilibrio para una reaccin qumica no solamente es igual al radio de equilibrio de las concentraciones del producto y del reactante, sino que tambin es igual al radio a las constantes caractersticas de la reaccin. Regreso al inicio

Orden de las Reacciones Qumicas

El orden de la reaccin se refiere al nmero de molculas involucradas en la formacin de un complejo de reaccin que es competente para producir un producto(s). Empricamente, el orden se determina fcilmente sumando los exponentes de la concentracin de cada trmino en la ecuacin de la proporcin de cambio para una reaccin. Una reaccin caracterizada por la conversin de una molcula de A a una molcula de B sin la influencia de ningn otro reactante o solvente es una reaccin de primer orden. El exponente en la concentracin del sustrato en la proporcin de la ecuacin para este tipo de reaccin es 1. Una reaccin con dos sustratos que forma dos productos es una reaccin de segundo orden. Sin embargo, los reactantes en reacciones de segundo o de un orden ms alto no tienen que ser de especies qumicas diferentes. Un ejemplo de una reaccin de segundo orden es la formacin de ATP por la condensacin de ADP con ortofosfato:

ADP + H2PO4 <> ATP + H2O

Para esta reaccin la proporcin de cambio hacia delante seria escrita como:

vforward = k1 [ADP][H2PO4]
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Las Enzimas Como Catalizadores Biolgicos

En las clulas y en los organismos la mayora de reacciones son catalizadas por enzimas, que se regeneran en el curso de una reaccin. Estos catalizadores biolgicos son fisiolgicamente importantes porque aceleran la proporcin de las reacciones que de otra forma seria demasiado lenta para mantener la vida. Las enzimas incrementan las proporciones de cambio de las reacciones, algunas veces hasta un milln de veces, pero mas tpicamente aproximadamente mil veces. Los catalizadores aceleran las reacciones en direccin hacia delante y su reverso en forma proporcional de tal forma que, aunque la magnitud de la constante de las reacciones hacia delante y su reverso se incrementa, el radio de las constantes de proporcin de cambio permanece igual en presencia o ausencia de la enzima. Debido a que la constante de equilibrio es igual al radio de las constantes de proporcin de cambio, es aparente que las enzimas y otros catalizadores no tienen efecto en la constante de equilibrio de las reacciones que estos catalizan. Las enzimas incrementan la proporcin de la reaccin al disminuir la cantidad de energa que se requiere para formar un complejo de reactantes que es competente para producir productos en la

reaccin. Este complejo se conoce con el nombre de estado activado o estado de transicin para la reaccin. Las enzimas y otros catalizadores aceleran las reacciones al disminuir la energa del estado de transicin. La energa libre que se requiere para formar un complejo activado es mucho mas baja en la reaccin que es catalizada. La cantidad de energa que se requiere para lograr el estado de transicin es mas bajo; consecuentemente, en cualquier momento una proporcin ms grande de molculas en la poblacin puede lograr el estado de transicin. El resultado es que la proporcin de cambio de la reaccin se incrementa. Regreso al inicio

Cintica de Michaelis-Menten
En reacciones tpicas catalizadas por enzimas, las concentraciones de reactantes y productos son cientos o miles de veces mas grandes que la concentracin de la enzima. Consecuentemente, cada molcula de la enzima cataliza la conversin a producto de muchas molculas reactantes. En reacciones bioqumicas, a los reactantes se le conoce comnmente con el nombre de sustratos. El evento analtico que convierte un sustrato a producto involucra la formacin de un estado de transicin, y este ocurre mas fcilmente en un sitio de unin especifico en la enzima. Este sitio, el sitio cataltico de la enzima, ha sido formado evolutivamente para proveer una unin especfica de alta afinidad del sustrato(s) y para dar un medioambiente que favorece los eventos catalticos. El complejo que se forma, cuando el sustrato(s) y la enzima se combinan, se llama el complejo enzima sustrato (ES). Los productos de la reaccin aparecen cuando el complejo ES se rompe liberando a la enzima. Entre la unin del sustrato a la enzima, y la aparicin de la enzima libre y el producto, una serie de eventos complejos deben sucederse. Por lo menos se debe formar un complejo ES; este complejo debe pasar al estado de transicin (ES*); y el estado de transicin debe avanzar a un complejo enzima producto (EP). Este ltimo es finalmente competente para disociarse en producto y enzima libre. La serie de eventos puede indicarse as:

E + S <> ES <> ES* <> EP <> E + P

La cintica de reacciones simples como la anterior fue caracterizada por primera vez por los bioqumicos Michaelis y Menten. Los conceptos que respaldan su anlisis sobre la cintica Enzimtica continan aportando con la base para entender el metabolismo ahora, y para el desarrollo y uso clnico de frmacos dirigidos para selectivamente alterar constantes de proporciones de cambio e interferir con el progreso de los procesos de enfermedad. La ecuacin de Michaelis-Melten es una descripcin cuantitativa de la relacin entre la proporcin de una reaccin catalizada por una enzima [V1], la concentracin del sustrato [S] y dos constantes, Vmax y Km (que se establecen por la ecuacin propia). Los smbolos utilizados en la ecuacin de Michaelis-Melten se refieren a la velocidad de la reaccin [V1], velocidad mxima de la reaccin (Vmax), concentracin del sustrato [S] y la constante de Michaelis-Melten (Km).

La ecuacin de Michaelis-Melten puede utilizarse para demostrar que a la concentracin del sustrato que produce exactamente la mitad de la velocidad mxima de la reaccin, i.e. Vmax , la concentracin del sustrato es numricamente igual a la Km. Este hecho provee una herramienta bioanaltica simple pero util que se ha utilizado para caracterizar enzimas normales y alteradas, como las que producen sntomas de enfermedades genticas. Reordenando la ecuacin de Michaelis-Melten:

De esta ecuacin debe ser aparente que cuando la concentracin del sustrato es la mitad de la que se requiere para alcanzar la velocidad mxima de la reaccin, la velocidad observada, V1, ser igual a Vmax dividida para 2; en otras palabras, V1=[Vmax/2]. A esta concentracin del sustrato la Vmax/ V1 ser exactamente igual a 2, con el resultado que.

[S](1) = Km
El ltimo es una afirmacin algebraica del hecho de que, para enzimas del tipo de MichaelisMelten, cuando la velocidad observada de la reaccin es la mitad de la mxima velocidad posible, la concentracin del sustrato es numricamente igual a la constante de MichaelisMelten. En esta derivacin, las unidades de Km son aquellas que se utilizan para especificar las concentraciones de S, usualmente molaridad. La ecuacin de Michaelis-Melten tiene la misma forma que la ecuacin para una hiprbole; el anlisis grafico de la proporcin de la reaccin (V) versus la concentracin del sustrato [S] produce un grafico de proporcin hiperblico.

Concentracin del sustrato versus la velocidad de la reaccin

Las caractersticas claves del cuadro estn marcadas por los puntos A, B, y C. A altas concentraciones de sustrato la velocidad representada por el punto C es casi igual a la Vmax, y la diferencia en la velocidad de la reaccin a concentraciones cercanas del sustrato es casi inexistente. Si la curva de Michaelis-Melten se extrapola a concentraciones de sustrato infinitamente altas, la proporcin extrapolada es igual a Vmax. Cuando la velocidad de la reaccin se hace independiente (o casi) de la concentracin de sustrato, se dice que la velocidad es de orden cero. Ntese que la reaccin es de orden cero solamente con respecto a este sustrato. Si la reaccin tiene dos sustratos, puede o no puede ser de orden cero en relacin al segundo sustrato. Las diferencias muy pequeas en la velocidad de la reaccin a concentraciones de sustrato cercanas al punto C (cerca de Vmax) reflejan el hecho de que a estas concentraciones casi todas las molculas de la enzima estn unidas al sustrato y la velocidad de cambio es virtualmente independiente del sustrato, por tanto de orden cero. A concentraciones mas bajas, tales como en los puntos A y B, las velocidades mas bajas de la reaccin indican que en cualquier momento solamente una porcin de las molculas de la enzima estn unidas al sustrato. De hecho, a la concentracin del sustrato indicada por el punto B, exactamente la mitad de las molculas estn en un complejo ES y la velocidad de cambio es exactamente la mitad de la Vmax. A concentraciones de sustrato cercanas al punto A la velocidad de cambio parece ser directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y la proporcin de la reaccin se dice ser de primer orden. Regreso al inicio

Inhibicin de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Para evitar el tratamiento de grficos curvilneos de las reacciones catalizadas por enzimas, los bioqumicos Lineweaver y Burk introdujeron un anlisis de la cintica Enzimtica basndose en el siguiente rearreglo de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Los grficos de 1/V versus 1/[S] producen lneas rectas que tienen una inclinacin de Km/Vmax y una intercepcin en la ordenada a 1/Vmax

Representacin Lineweaver-Burk
Una transformacin linear alternativa de la ecuacin de Michaelis-Melten es la de Eadie-Hofstee:

Cuando V/[S] se representa en el eje de las Y versus V en el eje de las X, el resultado es un cuadro lineal con una inclinacin de 1/Km y el valor Vmax/Km es el intercepto en el eje de las Y y Vmax es el intercepto en el eje de las X. Las transformaciones de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee de la ecuacin de Michaelis-Menten son tiles para el anlisis de la inhibicin Enzimtica. Debido a que la mayora de la terapia

farmacolgica clnica se basa en la inhibicin de la actividad Enzimtica, el anlisis de las reacciones enzimticas utilizando las herramientas descritas anteriormente ha sido fundamental para el diseo moderno de frmacos. Ejemplos bien conocidos de tales terapias incluyen el uso de metotrexate en la quimioterapia del cncer para inhibir semi-selectivamente la sntesis de DNA de las clulas malignas, el uso de la aspirina para inhibir la sntesis de prostaglandinas que son al menos parcialmente responsables de los dolores de la artritis, y el uso de sulfas para inhibir la sntesis del acido flico que es esencial para el metabolismo y crecimiento de bacterias patgenas. Adems, muchos venenos, como el cianuro, el monxido de carbono y lo bifenoles policlorinados (PCB) causan sus efectos letales por la inhibicin de enzimas. Los inhibidores enzimticos se clasifican en dos clases amplias: aquellos que causan inactivacin irreversible de las enzimas y los que sus efectos inhibitorios pueden revertirse. Los inhibidores de la primera clase usualmente causan una modificacin covalente inhibitoria de la estructura enzimtica. El cianuro es un ejemplo clsico de inhibidor irreversible de enzima: al unirse en forma covalente a la citocromo oxidasa mitocondrial, el cianuro inhibe todas las reacciones asociadas con el transporte de electrones. El efecto cintico de los inhibidores irreversibles es disminuir la concentracin de enzima activa, disminuyendo as las concentraciones mximas posibles del complejo ES. Debido a que la velocidad de actividad enzimtica limitante es frecuentemente K2[ES], es claro que bajo estas circunstancias la disminucin en la concentracin de la enzima llevara a una disminucin en la velocidad de la reaccin. Ntese que cuando las enzimas estn solamente parcialmente inhibidas por inhibidores irreversibles, las enzimas restantes que no estn modificadas no se pueden distinguir de aquellas mismas enzimas en clulas no tratadas con el inhibidor; particularmente, estas enzimas tienen el mismo volumen (cantidad) y el mismo Km. La cantidad de enzima, en relacin a la Vmax se define como el nmero mximo de moles de sustrato que pueden convertirse en producto por mol de sitio cataltico por segundo. Usualmente se considera que los inhibidores irreversibles son txicos y en general no son tiles para propsitos teraputicos. Los inhibidores reversibles se pueden dividir en dos categoras principales; inhibidores competitivos e inhibidores no competitivos, y una tercera categora que rara vez se encuentra los inhibidores que no compiten. Tipo de Inhibidor Inhibidor competitivo Sitio de unin en la Enzima Efecto cintico Vmax no cambia; el Km esta incrementado, definido por la [S] que se requiere para llegar a la de la actividad mxima de a reaccin La Km no esta alterada. la Vmax disminuye proporcionalmente a la concentracin del inhibidor Aparentemente la Vmax esta disminuida; la Km esta disminuida,

Especficamente al sitio activo, en donde compite con el sustrato en un proceso dinmico de equilibrio. La inhibicin es reversible por el sustrato Se une a la E o al complejo ES en un sitio diferente al sitio activo. La unin al sustrato Inhibidor no no se altera, pero el complejo ESI no puede competitivo producir producto. La inhibicin no puede revertirse por el sustrato Inhibidor que Se une solamente al complejo ES en sitios no compite distintos al cataltico. La unin del sustrato

modifica la estructura de la enzima, definida por la [S] que se requiere para haciendo posible la unin del inhibidor. La llegar a la de la actividad mxima inhibicin no puede revertirse por el de a reaccin sustrato. La caracterstica de los inhibidores reversibles es que cuando las concentraciones del inhibidor caen, la actividad de la enzima se regenera. Usualmente estos inhibidores se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes y el inhibidor mantiene un equilibrio reversible con la enzima. La constante de equilibrio para la disociacin del complejo enzima-inhibidor se conoce como Ki:

La importancia de la constante Ki es que en todas las reacciones enzimticas en donde interactan sustrato, inhibidor y la enzima, el Km y o la Vmax normales para la interaccin sustrato-enzima parecen estar alterados. Estos cambios son una consecuencia de la influencia de Ki sobre la ecuacin de la reaccin. Los efectos de Ki se observan mejor en los cuadros de Lineweaver-Burk. Probablemente los mejores inhibidores reversibles conocidos son los inhibidores competitivos, que siempre se unen al sitio cataltico o sitio activo de la enzima. La mayora de frmacos que alteran la actividad Enzimtica son de este tipo. Los inhibidores competitivos son especialmente tiles como moduladores clnicos de actividad Enzimtica porque ofrecen dos rutas para la desinhibicin de la actividad Enzimtica afectada, mientras otros inhibidores reversibles solamente ofrecen una. Primero, como casi con la mayora de inhibidores reversibles, una disminucin en la concentracin del inhibidor reversa el equilibrio regenerando enzima libre activa. Segundo, debido a que el sustrato y el inhibidor competitivo se unen al mismo sitio activo estos compiten uno con otro para unirse a este sitio especfico de la enzima. El incremento de la concentracin de sustrato (S), manteniendo la concentracin del inhibidor sin cambiarla, da la segunda va de revertir la inhibicin competitiva. Mientras ms alta la proporcin del sustrato, mas alta es la proporcin de la enzima presente en complejos competentes ES. Como se indico anteriormente, concentraciones altas del sustrato pueden desplazar virtualmente a todo el inhibidor competitivo unido al sitio activo. As, es aparente entonces que la Vmax no se cambia por accin de los inhibidores competitivos. Esta caracterstica de los inhibidores competitivos se refleja en los interceptos idnticos del eje vertical de los grficos LineweaverBurk, con y sin inhibidor.

Diagramas de inhibicin enzimticas de Lineweaver-Burk

Debido a que para lograr la Vmax se requiere concentraciones de sustrato apreciablemente ms altas en presencia de un inhibidor competitivo, El Km (la concentracin del sustrato a la mitad de la velocidad mxima) tambin es ms alto, como se demuestra por el intercepto diferente negativo en el eje horizontal del panel B. Igualmente, el panel C ilustra que los inhibidores no competitivos no parecen tener efecto en el intercepto en el eje de las X implicando que los inhibidores no competitivos no tienen efecto sobre el Km de las enzimas que inhiben. Debido a que los inhibidores no competitivos no interfieren en el equilibrio de una enzima, sustrato y complejo ES, las Kms de las enzimas tipo Michaelis-Menten no se afectan por los inhibidores no competitivos, como se demuestra por los interceptos en el eje de las X en el panel C. Sin embargo, debido a que los complejos que contienen inhibidores (ESI) son incapaces de progresar la reaccin para producir productos, el efecto del inhibidor no competitivo es reducir la concentracin de complejos ES que pudieran avanzar a producto. Debido a que Vmax = K2 [Etotal], y la concentracin de Etotal competente esta

disminuida por la cantidad de ESI que se ha formado, los inhibidores no competitivos se espera que disminuyan la Vmax, como se ilustra en el intercepto del eje de las Y en el panel C. Un anlisis similar de los inhibidores que no compiten llevan a pensar que estos inhibidores deben cambiar los valores aparentes de Km as como de Vmax. El cambio de estas dos constantes lleva a grficos recprocos dobles, en los que los interceptos en los ejes de las X y de las Y cambian proporcionalmente; esto lleva a la produccin de lneas paralelas en reacciones inhibidas y no inhibidas, panel D. Regreso al inicio

Regulacin de la actividad Enzimtica

As como esta claro que las enzimas son responsables de las catlisis de casi todas las reacciones bioqumicas, es importante tambin reconocer que rara vez, (si alguna pasa) las reacciones enzimticas suceden en forma aislada. El escenario ms comn es que las enzimas catalizan pasos individuales en vas metablicas que tienen mltiples pasos, como es el caso de la gliclisis, gluconeognesis o la sntesis de cidos grasos. Como consecuencia de esta secuencia de reacciones, cualquier enzima depende de la actividad de reacciones precedentes para su sustrato. En los humanos, la concentracin del sustrato depende en la fuente de comida y usualmente no es un mecanismo fisiolgico importante para la regulacin de rutina de la actividad Enzimtica. Por otro lado, la concentracin de la enzima es modulada continuamente en respuesta a las necesidades fisiolgicas. Se conocen tres mecanismos principales para regular la concentracin de enzimas activas en los tejidos: 1. La regulacin de la expresin de genes controla la cantidad y proporcin de la sntesis Enzimtica. 2. La actividad proteolca determina la proporcin de degradacin Enzimtica. 3. Modificaciones covalentes de pro enzimas inactivas pre-existentes producen enzimas activas. La sntesis y degradacin de las enzimas son mecanismos relativamente lentos para regular la concentracin de las enzimas, con respuesta de horas, das o aun semanas. La activacin de pro enzimas es un mtodo ms rpido para incrementar la actividad Enzimtica pero, como mecanismo regulador, tiene la desventaja de no ser un proceso reversible. Generalmente las pro enzimas se sintetizan en abundancia, se almacenan en grnulos secretorios y se activan covalentemente luego de que han sido liberadas de su sitio de almacenamiento. Algunos ejemplos de pro enzimas importantes son el pepsingeno, tripsingeno, y quimiotripsingeno, que dan origen a enzimas proteolticas digestivas. De manera similar, muchas de las protenas involucradas en la cascada de la coagulacin se sintetizan como pro enzimas. Otras protenas importantes, como las hormonas peptdicas y el colgeno, tambin se derivan por modificaciones covalentes de sus precursores.

Otro mecanismo para regular la actividad Enzimtica es secuestrar las enzimas en compartimientos en donde el acceso a sus sustratos es limitado. Por ejemplo, la protelisis de protenas celulares y de los glicolpidos por las enzimas responsables de su degradacin se controla secuestrando a estas enzimas dentro de los lisosomas. Al contrario de los mecanismos que alteran la concentracin de las enzimas, existe un grupo de mecanismos regulatorios que no afectan la concentracin de las enzimas, son reversibles y de accin rpida, y que son los que regulan fisiolgicamente a cada momento la actividad Enzimtica. Estos mecanismos incluyen la regulacin alostrica, regulacin por modificaciones covalentes reversibles y regulacin por protenas de control como la calmodulina. La modificacin covalente reversible es un mecanismo importante para la rpida y temporal regulacin de la actividad Enzimtica. Los mejores ejemplos, otra vez, vienen de estudios sobre la regulacin del metabolismo del glicgeno en donde la fosforilacin de la enzima glicgeno sintasa y de la cinasa de la glicgeno fosforilasa resulta en la estimulacin de la degradacin del glicgeno mientras que la sntesis del glicgeno es coordinadamente inhibida. Muchas otras enzimas del metabolismo intermedio se afectan por fosforilacin, tanto positiva como negativamente. Estas fosforilaciones covalentes pueden ser revertidas por un sub-grupo aparte de enzimas llamadas fosfatasas. Estudios recientes han demostrado que la fosforilacin aberrante de factores de crecimiento y de receptores hormonales, as como tambin de protenas que regulan la divisin celular, frecuentemente conducen a un crecimiento celular sin control o cncer. Los sitios usuales para aadir fosfatos a las protenas son los residuos hidroxilos de los grupos-R de la serina, treonina y tirosina. Regreso al inicio

Enzimas Alostricas
Adems de las enzimas simples que interactan con solamente sustratos e inhibidores, existe un grupo de enzimas que se unen a molculas fisiolgicamente importantes y que modulan su actividad de formas diferentes a las descritas arriba. A estas se les conoce con el nombre de enzimas alostricas; las molculas regulatorias a las que estas enzimas se unen se les conoce con el nombre de molculas efectoras. Los efectores alostricos producen modificaciones catalticas al unirse a las enzimas en distintos sitios alostricos, muy distintos del sitio activo de las enzimas, y causan cambios conformacionales que se transmiten a travs de toda la protena hasta el sitio(s) activo cataltico. La caracterstica ms importante de los efectores es que cuando estos se unen a las enzimas, estos alteran las propiedades catalticas del sitio activo de la enzima. Aquellos que incrementan la actividad cataltica se conocen con el nombre de efectores positivos. Los efectores que reducen o inhiben la actividad cataltica son efectores negativos. La mayora de enzimas alostricas son oligmeros (consisten en mltiples subunidades); generalmente se encuentran localizadas en o cerca de puntos de ramificacin en las vas metablicas, en donde influyen en la direccionalidad del sustrato en una u otra va metablicas disponible. Los efectores que modulan la actividad de estas enzimas alostricas son de dos tipos.

Los efectores activadores o inhibidores que se unen a los sitios alostricos se llaman efectores heterotrficos (as, existen efectores heterotrficos positivos y negativos). Estos efectores pueden tener una gran diversidad de formas qumicas, que van desde molculas inorgnicas simples a nucletidos complejos como el adenosina-monofosfato-cclico (cAMP). Su nica caracterstica que los define es que estos no son idnticos a los sustratos. En muchos casos el mismo sustrato induce efectos alostricos distantes cuando se une al sitio cataltico. Los sustratos que actan como efectores se llaman efectores homotrpicos. Cuando el sustrato es el efector, este puede actuar como tal, al unirse al sitio de unin del sustrato, o a un sitio efector allostrico. Cuando el sustrato se une al sitio cataltico transmite un efecto activadormodulatorio a otras subunidades de la molcula. Frecuentemente se utiliza como modelo homotrpico a la hemoglobina, aunque no es una enzima de ramificacin y por tanto no cumple con la definicin. Existen dos formas por las que la actividad Enzimtica puede alterarse por los efectores: la Vmax puede incrementarse o disminuirse, o el Km puede subirse o bajarse. Las enzimas cuyo Km se altera por los efectores se dice que son del tipo-K y los efectores, efectores tipo-K. Si la Vmax es alterada, la enzima y los efectores se dice que son del tipo-V. Muchas enzimas alostricas responden a varios efectores con comportamiento tipo-K y tipo-V. Aqu tambin la hemoglobina se utiliza como modelo para estudiar las interacciones alostricas, aunque estrictamente no es una enzima. En la discusin previa asumimos que los sitios catalticos y alostricos estaban homogneamente presentes en cada subunidad de una enzima alostricas. Aunque este es frecuentemente el caso, existe otra clase de enzimas alostricas que estn formadas de subunidades catalticas y regulatorias separadas. El arquetipo de esta clase de enzimas es la protena-cinasa dependiente de cAMP (cAMP), cuyo mecanismo de activacin se ilustra en la figura de abajo. La enzima es tetramrica, contiene dos subunidades catalticas y dos subunidades regulatorias y enzimaticamente activas. Cuando los niveles intracelulares de cAMP se incrementan, una molcula de cAMP se une a cada unidad regulatoria, haciendo que el tetrmero se disocie en un dmero regulatorio y dos monmeros catalticos. En la forma disociada, las subunidades catalticas son completamente activas; estas catalizan la fosforilacin de varias otras enzimas, como las involucradas en la regulacin del metabolismo del glicgeno. Las subunidades regulatorias no tienen actividad cataltica.

Va que representa la activacin de la protena-cinasa dependiente de cAMP (PKA). En este ejemplo el glucagn se une a su receptor en la superficie de la clula, activando su receptor. La activacin del receptor esta acoplada a la activacin de una protena-G acoplada al receptor (protena que se une e hidroliza al GTP) compuesta de 3 subunidades. Luego de su activacin la subunidad- se disocia, se une y activa la adenilciclasa. La adenilciclasa entonces convierte el ATP a cAMP. El cAMP as producido entonces se une a las unidades regulatorias de la PKA llevando a su disociacin de las subunidades catalticas. Las subunidades catalticas son inactivas hasta que se disocian de las subunidades regulatorias. Una vez que se liberan las subunidades catalticas de la PKA fosforilan varios sustratos utilizando al ATP como donador de fosfatos. Regreso al inicio

Las Enzimas en el Diagnostico de Enfermedades

Se ha demostrado que la determinacin de los niveles sricos de varias enzimas es de importancia clnica. Esto es porque la presencia de estas enzimas en el suero indica que ha ocurrido dao tisular o celular, lo que resulta en la liberacin de los componentes intracelulares a la sangre. Por lo tanto, cuando un mdico indica que l va a medir las enzimas del hgado, el propsito es comprobar el potencial dao de las clulas del hgado. Las enzimas comnmente analizadas son las aminotransferasas: transaminasa de alanina, ALT (algunas veces llamada aun glutamato-piruvato aminotransaminas srica, sGPT), y la aspartato aminotransaminasa, AST (algunas veces llamada aun glutamato-oxaloacetato aminotransaminasa srica, sGOT); lactato deshidrogenasa, LDH; creatin cinasa, CK (tambin llamada creatin-fosfocinasa, CPK); gammaglutamil transpeptidasa, GGT. Otras enzimas se analizan en diferentes situaciones clnicas pero no sern tratadas aqu. Las enzimas hepticas tpicas que se determinan son la AST y la ALT. La ALT es diagnostica de dao heptico porque esta enzima se encuentra predominantemente en los hepatocitos. Cuando se miden ambas la AST y la ALT el radio de los niveles de estas enzimas tambin puede ser de diagnostico. Normalmente en el dao o la enfermedad hepticos que no es de origen viral el radio de ALT/AST es menor a 1. Sin embargo, con la hepatitis viral el radio ALT/AST ser mayor a 1. La medicin de la AST es util no solamente para detectar dao heptico sino tambin para detectar dao o enfermedad cardiaca. El incremento del nivel de AST en el suero es directamente proporcional al nmero de clulas involucradas as como tambin tiene relacin con el tiempo transcurrido luego del dao del tejido hasta la medicin de la enzima. Luego del dao, los niveles de AST se incrementan dentro de las primeras 8 horas y hacen un pico 24 a 36 horas mas tarde. Dentro de los 3 a 7 das los niveles de AST deben regresar a los niveles antes del dao, previendo que no este presente un dao continuo o que un nuevo insulto ocurra. Aunque la medicin de AST no es, en si misma, diagnostico para infarto del corazn, en conjunto con las mediciones de LDH y CK (ver abajo), el nivel de AST es util para determinar el tiempo del infarto. La medicin de la LDH es esencial para el diagnostico de infarto del miocardio porque esta enzima existe en 5 formas muy relacionadas pero poco diferentes (isozimas). Los 5 isotipos y su distribucin normal y sus niveles en ausencia de enfermedad o dao se indican abajo: LDH 1 se encuentra en el corazn y glbulos rojos y es 17% 27% del nivel srico total LDH 2 se encuentra en el corazn y glbulos rojos y es 27% 37% del nivel srico total LDH 3 se encuentra en una variedad de rganos y es 18% 27% del nivel srico total LDH 4 se encuentra en una variedad de rganos y es 3% 8% del nivel srico total

LDH 5 se encuentra en el hgado y en el msculo esqueltico y es 0% 5% del nivel srico total Luego de un infarto cardiaco los niveles sricos de LDH se incrementan dentro de las 2448 horas alcanzando un pico a los 23 das y regresan a valores normales a los 510 das. Especialmente diagnostico es una comparacin del radio LDH-1/LDH-2. Normalmente, este radio es menor a 1. Una reversin de este radio se llama "LDH al revs". Luego de un infarto agudo del miocardio el LDH al revs aparecer en 1224 horas y esta definitivamente presente a las 48 horas en ms del 80% de pacientes. Tambin es importante el hecho de que en personas que sufren de dolor precordial debido solamente a angina, estos no tendrn valores alterados de LDH. La CPK se encuentra primariamente en los msculos cardiaco y esqueltico as como tambin en el cerebro. Por tanto, las mediciones de los niveles de CPK en el suero es un buen diagnostico de dao de estos tejidos. Los niveles de CPK se incrementaran dentro de las 6 horas luego del dao y harn un pico alrededor de las 18 horas. Si el dao no es persistente el nivel de CK regresa a lo normal en 2 a 3 das. Como la LDH, existen isozimas tejido especficas de CPK y sus designaciones se indican abajo: CPK3 (CPK-MM) es la isozima predominante en el msculo y es 100% del nivel srico total. CPK2 (CPK-MB) corresponde al 35% de la actividad de la CPK en el msculo cardiaco, pero menos del 5% en el msculo esqueltico y es el 0% del nivel srico total. CPK1 (CPK-BB) es la isozima caracterstica del cerebro y esta en cantidades significativas en el msculo liso y es el 0% del nivel srico total. Debido a que la mayora de la CPK liberada en un infarto del corazn es la CPK-MB, un radio elevado de CPK-MB a CPK total puede ayudar en el diagnostico de un infarto agudo, pero un incremento de CPK solamente no. Los niveles de CPK-MB se incrementan 36 horas del infarto del miocardio y hacen un pico entre las 1224 horas mas tarde si no hay mas dao y regresan a valores normales a las 1248 horas luego del infarto. Regreso al inicio ltima modificacin: 31 de agosto de 2011