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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO-BIOLOGICAS


INGENIERA BIOQUMICA

REPORTE DE PRCTICA Elisa para antgeno de Dengue NS1

ALUMNO: Ramrez Carrasco Jess Humberto

MAESTRA: MC. Janette Chvez Ontiveros

MICROBIOLOGA Cuarto grado

CULIACN SINALOA 7 DE DICIEMBRE DEL 2011

ELISA PARA ANTGENO DE DENGUE NS1 Objetivos: 1.- El alumno ser capaz de realizar la tcnica de ELISA. 2.- El alumno aprender a validar los resultados obtenidos.

Introduccin Existen dos importantes variaciones en relacin con ELISA. En primer lugar, que los anticuerpos o antgenos soluble se pueden hacer insolubles por adsorcin a una fase slida, como pueden ser las placas de microtitulacin o los tubos de poliestireno. La adsorcin depende tambin dl tiempo, temperatura y pH. Algunos mtodos precisan que las placas se mantengan durante toda la noche a 4 C, en un tampn de pH elevado. En segundo lugar, los antgenos o anticuerpos se pueden conjugar al enzima sin prdida de actividad. Se han utilizado toda una variedad de enzimas, entre los que citaremos la fosfatasa alcalina, la peroxidasa dl rbano picante y la glucosa-oxidasa. El 4nitrofenil fosfato o sustrato usado para la fosfatasa alcalina no es peligroso, a diferencia del cido 5-aminosaliclico o sustrato de la peroxidasa del rbano, que se considera carcinognico. La hidrlisis de stos sustratos da, respectivamente, un color amarillo ( : 405nm) y oscuro ( : 450nm). La preparacin de conjugados se consigue, en el caso de la fosfatasa alcalina, mediante la unin covalente con glutaraldehido. La fraccin inmunogloblinica de la globulina antiespecie se asla por precipitacin salina. sta se combina con el enzima en la proporcin 3:1. La mezcla se incuba con glutaraldehdo al 0.2% durante 2-4 horas a temperatura ambiente. El glutaraldehdo libre se elimina por dilisis. Se debe aadir un estabilizante enzimtico antes de proceder a su conservacin a 4C, que puede prolongarse hasta 12 meses. Las tcnicas ELISA tienen numerosas aplicaciones en bacteriologa, parasitologa y virologa. Principio La prueba Platelia TM para dengue NS1 Ag, es un mtodo inmunoenzimtico en una etapa de tipo sndwich, en microplaca para la deteccin cualitativa o semicuantitativa del antgeno NS1 del virus de dengue en el suero o en el plasma humano. La prueba utiliza anticuerpos monoclonales de ratn (AcM) para su captura y revelacin. Las muestras de pacientes y los patrones son incubados directa y simultneamente con el conjugado durante 90 minutos a 37C en las cpulas (pocillos) de la microplaca sensibilizada por los AcM. En presencia de antgeno NS1 en la muestra, se forma un complejo inmune AcM-NS1AcM/peroxidasa. Tras los lavados practicados al final de la incubacin, la presencia del complejo inmune es revelada mediante el aadido de una solucin de revelacin enzimtica que induce el desarrollo de una reaccin coloreada, a los 30 min de incubacin a temperatura ambiente, la reaccin enzimtica es interrumpida mediante la adicin de una solucin cida. La densidad ptica obtenida a 450/620 nm es proporcional a la cantidad de antgeno NS1 presente en la muestra. Control de calidad Para validar la manipulacin, debern de cumplirse los siguientes criterios: Valor de densidad ptica de CO debe ser mayor a 0.200 CO > .400 Relaciones: Relacin R3 < 0.400 (Relacin R3 = DO R3 /CO)Control negativo Relacin R5 > 1.50 (Relacin R5 = DO R5 / CO)Control positivo

Interpretacin de resultados

Relacin Relacin < 0.50 Relacin 0.50 y < 1.0 Relacin 1.0

Resultado Negativo

Equvoco

Positivo

Interpretacin La muestra es considerada no reactiva para el antgeno NS1 Del virus del dengue La muestra es considerada dudosa para el antgeno NS1 del virus del dengue La muestra es considerada reactiva para el antgeno NS1 del virus del dengue.

Resultado obtenidos Pocillo A (-) B (CO) C (CO) D (+) E ( Mtra. 1) F ( Mtra. 2) G (Mtra. 3) H (Mtra. 1) Densidad Optica 0.112 0.205 0.155 0.405 0.067 0.099 0.074 0.081

Promedio CO = (.205+.155)/2 = 0.18 Relacin R3 (-) = .112/0.18 = 0.622 Relacin R5 (+) = .405/0.18 = 2.25 Mtra. 1 = .067/0.18 = 0.37222 Mtra. 2 = .099/0.18 = 0.55 Mtra. 3 = 0.074/0.18 = 0.4111 Mtra. 4 = 0.081/0.18 = 0.45 Posibles Causas de error Lavado insuficiente de las microplacas. Error en el pipeteo. Contaminacin de las muestras negativas por un suero o plasma muy concentrado. Contaminacin puntual de la solucin de revelacin por agentes qumicos oxidantes (lejas, iones metlicos). Contaminacin puntual de la solucin parada. Conclusiones y Comentarios Debido a que la prueba fue hecha por varias manos los resultados nos salieron fuera de los rangos esperados pero aprendimos lo que es el principio que era el principal objetivo de la prctica.

Micro-9 1. Mencione las diferencias entre la morfologa colonial bacteriana y la morfologa colonial de hongos. En la morfologa de bacterias podemos encontrar algunas formas puntiformes, algunas son lisas, otras como una especie de moco y en el caso de los hongos El cuerpo de casi todos los hongos es un micelio, que es una masa entretejida de filamentos de una clula de espesor, parecidos a hilos, llamados hifas. Las hifas, dependiendo de la especie que se trate, consisten en clulas individuales alargadas con numerosos ncleos o subdivididas por tabiques llamados septos en muchas clulas, c/u con una o varios ncleos.

2. Qu diferencias existen entre la morfologa microscpica de los hongos filamentosos (mohos) y las levaduras? Los mohos filamentosos poseen un micelio vegetativo "areo" y otro "profundo". (Son los hongos que aparecen comnmente en los alimentos, sobre todo limones o naranjas). El micelio posee estructuras llamadas "hifas" las cuales pueden o no ser septadas (divididas). Ejemplos de hongos filamentosos: Penicillium sp., Aspergillus flavus, etc. Las levaduras son menos complejas y no poseen micelios, sus colonias tpicas son como las de las bacterias y se usan mucho en la fermentacin de bebidas alcohlicas, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

3. En qu ambientes se encuentran este tipo de microorganismos? Ambos crecen en ambientes cidos y son organismos psicrtrofos, es decir, crecen a temperaturas bajas (-5 a 5 C), aun cuando su temperatura ptima de crecimiento sea alrededor de los 18 C.

4. Cules son las condiciones ptimas para el crecimiento de hongos y levaduras? Los hongos y las levaduras pueden crecer en un sustrato o medio de concentraciones de azucares que inhiben a la mayora de las bacterias esto por ejemplo el PDA.