DESINFESTAO E GERMINAO IN VITRO DE SEMENTES DE GRPIA1 LENCINA, Kelen H.2; HEBERLE, Michele3; KIELSE, Paula3; MAMBRIN, Ritieli B.

4; BISOGNIN, Dilson A.5; SAUSEN, Darlene4; RAUBER, Marcelo A.2; DOCKHORN, Pedro L. 4
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Trabalho de Pesquisa _UFSM/CAPES Curso de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil 3 Curso de Doutorado do Programa de Ps-Graduao em Engenharia Florestal da UFSM, Santa Maria, RS, Brasil 4 Curso de Agronomia da UFSM, Santa Maria, RS, Brasil 5 Professor do Departamento de Fitotecnia da UFSM, Santa Maria, RS, Brasil E-mail: khaygert@hotmail.com

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de desinfestao e germinao in vitro de sementes de grpia. As sementes foram pr-desinfestadas com etanol 70% por 30 seg., seguido dos tratamentos com imerso ou no em hipoclorito de Sdio (NaOCl) a 2,5 ou 5,0 %, por 5, 10 ou 15 min. Aos 30 dias foram avaliadas as percentagens de germinao e de desinfestao. Para o clculo do tempo mdio de germinao, em intervalos de trs dias foram contabilizadas as sementes germinadas. Para a porcentagem de germinao e desinfestao das sementes no houve interao entre os fatores doses de NaOCl e tempo de imerso, sendo observada uma taxa de germinao mdia de 87,66 %. A desinfestao por fungos e bactrias foi de 93 e 95% respectivamente. O TMG situou-se entre 5 e 7 dias. Foi possvel estabelecer plntulas asspticas de grpia in vitro. Palavras-chave: Apuleia leiocarpa (Vogel) Macbride; Cultura de tecidos; Hipoclorito de sdio; Espcie nativa.

1. INTRODUO Pertencente famlia Leguminosae, a grpia (Apuleia leiocarpa (Vogel) Macbride) uma rvore caduciflia de elevado porte, podendo atingir at 35 m de altura e 100 cm de dimetro altura do peito (DAP) na idade adulta (MATTOS e GUARANHA, 1983). Possui madeira densa e com boa durabilidade natural (CELULOSA ARGENTINA, 1975). indicada para a construo de estruturas externas, construo civil, marcenaria, peas de resistncia e vigas de ponte (PEREIRA e MAINIERI, 1957). Alm disso, a madeira apresenta alto teor de lignina, sendo recomendada para produo de lcool, coque e carvo. A casca chega a

ter 24% de tanino (MATOS e GUARANHA, 1983), e tambm apresenta propriedades medicinais (CORREA, 1952). A espcie se distribui do Nordeste brasileiro at o Rio Grande do Sul, estendendo-se ao leste do Paraguai e Provncia de Missiones na Argentina. No Rio Grande do Sul, a grpia uma espcie prioritria nas aes relativas conservao in situ e in vitro, em funo da relevante importncia ecolgica e econmica, e da sua escassez em todo o estado. Para suprir essa demanda por mudas em um mercado competitivo, no basta produzir mudas, mas sim mudas de elevada qualidade, incluindo caractersticas genticas e fitossanitrias. Assim, o desenvolvimento de tcnicas eficientes de produo de mudas florestais nativas de alta qualidade importante no s para a recuperao de reas degradadas e para reposio florestal, mas tambm para suprir a demanda dos futuros plantios comerciais. Os frutos da grpia amadurecem de novembro a abril no Rio Grande do Sul e suas sementes so dispersadas pelo vento (CARVALHO, 2003). A espcie apresenta irregularidade de produo de sementes, as quais apresentam dormncia tegumentar, sendo recomendados tratamentos para quebra da dormncia, que podem elevar o poder germinativo de 20 para 90% (MATTOS e GUARANHA, 1983). As limitaes na regenerao de grpia por propagao sexuada, torna a propagao vegetativa, a exemplo da estaquia e da micropropagao, uma tcnica alternativa para a produo de mudas dessa espcie. Porm, a tcnica de estaquia em espcies arbreas adultas dificultada pela sua maturidade, uma vez que a formao de razes adventcias diminui medida que avana a idade da planta matriz fornecedora dos propgulos (HARTMANN et al., 2002). Assim, durante os ltimos anos houve um expressivo aumento no uso da micropropagao, pois explantes provenientes de plntulas estabelecidas in vitro so excelentes propgulos para o desenvolvimento dessa tcnica, especialmente por apresentarem tecidos juvenis com pronta capacidade de crescimento e resposta morfognica aplicao de fitorreguladores (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Contudo, a obteno de plntulas asspticas pela desinfestao de sementes uma etapa problemtica, pois o agente desinfestante utilizado na assepsia do material vegetal deve eliminar os microorganismos de superfcie, sem, contudo, danificar os tecidos (BONGA e DURZAN, 1985). Diversas substncias com ao germicida so utilizadas para a assepsia de explantes, sendo o etanol e o hipoclorito de sdio ou de clcio os produtos mais eficazes (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi estabelecer um protocolo de desinfestao e germinao in vitro de sementes de grpia, verificando a eficcia do etanol a 70% e do hipoclorito de sdio, em diferentes tempos de

imerso, na desinfestao e germinao in vitro, para o estabelecimento de plntulas asspticas da espcie. 2. METODOLOGIA Os experimentos foram conduzidos no Ncleo de Melhoramento e Propagao Vegetativa de Plantas (MPVP), pertencente ao Departamento de Fitotecnia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS. Foram utilizadas sementes de grpia adquiridas em um viveiro comercial, em Iju, RS. Para a quebra de dormncia tegumentar, as sementes foram imersas em cido sulfrico (N2SO4) concentrado, por 20 min., e posteriormente lavadas em gua corrente, durante 5 min., conforme protocolo estabelecido para a espcie (NICOLOSO et al., 1997). Aps a quebra de dormncia, as sementes foram inicialmente pr-desinfestadas em soluo de etanol na concentrao de 70%, por 30seg., em cmara de fluxo laminar. Procederam-se ento aos tratamentos de desinfestao, que consistiram na imerso das sementes em hipoclorito de sdio nas concentraes de 2,5 ou 5%, por 5, 10 ou 15 min., mais o tratamento controle, que consistiu apenas da pr-assepsia das sementes. Entre cada procedimento, as sementes foram lavadas trs vezes em gua destilada e autoclavada. As inoculaes foram realizadas em frascos de 10 mL contendo 5 mL de meio de cultura simples, composto de gua destilada, 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de agar. Os frascos foram fechados com filme de Poli Cloreto de Vinila (PVC) e mantidos por 30 dias em sala de cultivo com temperatura de 25 2 C e fotoperodo de 16 h, sob intensidade luminosa de 14,3 E m-2 S-1 fornecida por lmpadas fluorescentes. Nos primeiros sete dias as culturas permaneceram em fotoperodo negativo. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em um fatorial 2 x 4 (doses de NaOCl x tempo de imerso), com cinco repeties de seis sementes cada uma. Aos 30 dias foram avaliadas as porcentagens de desinfestao e de contaminao por fungos e/ou bactrias. As taxas de germinao foram obtidas em intervalos de trs dias, at 30 dias aps a inoculao, possibilitando o clculo do tempo mdio de germinao, expresso pela equao TMG = (N1T1 + N2T2 + ... + NnTn) / (N1 + N2 + ... + Nn), sendo N o nmero de sementes germinadas e T o tempo em dias (HARRINGTON, 1972). O critrio considerado para contabilizar a germinao foi a protuso da radcula das sementes. Os dados foram submetidos anlise de varincia e as mdias comparadas pelo teste de Tukey, em nvel de 5% de probabilidade de erro. As anlises foram realizadas com o auxlio do programa ESTAT (Unesp-Jaboticabal), e os dados de porcentagem, transformados para arcoseno

x / 100 .

3. RESULTADOS E DISCUSSES Aos 30 dias de avaliao no houve interao entre as doses de hipoclorito de sdio e o tempo de imerso para a porcentagem de sementes germinadas de grpia, indicando que esses fatores so independentes, conforme apresentado na tabela 1. Foi verificada uma elevada taxa de germinao mdia (87,66%), indicando que as doses de NaOCl e os tempos de imerso no afetaram negativamente a germinao das sementes de grpia. Em sementes de louro-pardo (Cordia trichotoma Vell.) foi verificado 60% de germinao no tratamento com 5% de NaOCl por 5 min., e a reduo da porcentagem de germinao medida que aumentou o tempo de exposio das sementes ao agente desinfestante (HEBERLE, 2010). Em estudo de germinao in vitro de mogno (Swietenia macrophylla King), obteve-se o ndice mximo de 48% (COUTO et al., 2004) e para aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All), essa percentagem chegou a 57,5% (ANDRADE et al., 2000). A ocorrncia de dificuldades de germinao bastante comum entre as espcies arbreas, manifestando-se em dois teros delas em grau variado, sendo que para leguminosas a causa mais comum de dormncia a impermeabilidade do tegumento entrada de gua (RAMOS e ZANON, 1984). No caso da grpia, a eficincia da aplicao de H2SO4 na superao da dormncia tegumentar de sementes de grpia (NICOLOSO et al. 1997), contribuiu para as satisfatrias respostas de germinao in vitro das sementes. No presente estudo, a alta taxa de germinao no tratamento controle, onde as sementes apenas foram imersas em etanol a 70% (tabela 1), evidencia a facilidade de obteno de grande quantidade de explantes de grpia a partir de sementes, o que permitir o desenvolvimento de protocolos de micropropagao para a espcie, hoje inexistentes.
Tabela 1: Percentagem de germinao de sementes de grpia (Apuleia leiocarpa), desinfestadas ou no com hipoclorito de sdio (NaOCl) a 2,5 ou 5%, por 5, 10 ou 15 min., aos 30 dias em sala de cultivo. Santa Maria, RS, 2010.

Tempo de embebio (min.) 0 (controle) 5 10 15 NaOCl 2,5% 5% Mdia CV (%)

Germinao (%) 83,0 a* 94,9 a 86,4 a 86,4 a 85,5 a 89,8 a 87,66 19,31

*Valores seguidos de letra diferente diferem-se pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.

A tabela 2 apresenta os resultados obtidos para o tempo mdio de germinao (TMG), que por ter sido baixo em todos os tratamentos, expressa a rpida germinao das sementes. Lopes (2000) observou que as sementes de mogno tambm tm germinao rpida, levando um perodo de seis dias para germinar. Em estudo com aroeira, o incio da germinao se deu aos 2 dias aps a inoculao in vitro (ANDRADE et al., 2000). J para o louro-pardo, o TMG foi maior e situou-se entre 18 e 21 dias (HEBERLE, 2010). Esses resultados indicam que o TMG altamente varivel entre as espcies. Borghetti (2004) explica que o padro de germinao das sementes modulado no apenas em funo das condies ambientais vigentes, mas especialmente por caractersticas intrnsecas, espcieespecficas, e esse mecanismo de controle da germinao chamado de dormncia, a qual permite a germinao em momentos mais apropriados para o desenvolvimento do futuro indvduo.
Tabela 2: Tempo mdio de germinao (TMG) de sementes de grpia (Apuleia leiocarpa), desinfestadas ou no com hipoclorito de sdio (NaOCl) a 2,5 ou 5%, por 5, 10 ou 15 min., aos 30 dias em sala de cultivo. Santa Maria, RS, 2010.

TMG (dias) NaOCl (%) 2,5 5,0 Tempo (min) 0 (controle) 7 5 6 6 10 6 5 15 6 6

Considerando os resultados de contaminao por fungos ou bactrias, aos 30 dias de avaliao, no houve interao entre as doses de hipoclorito de sdio e o tempo de imerso para a porcentagem de sementes desinfestadas, indicando que esses fatores so independentes, conforme demonstrado na tabela 3. As altas taxas de desinfestao, que foram iguais ou superiores a 90%, incluindo o tratamento controle, sugerem que a utilizao de NaOCl desnecessria para a assepsia de sementes da espcie, e que a aplicao de cido sulfrico, alm de quebrar a dormncia, contribuiu para a desinfestao das sementes. Similarmente, a retirada do tegumento e a imerso das sementes de louro-pardo apenas em soluo de lcool etlico a 70% por 30 seg. promoveram uma efetiva desinfestao (FICK et al., 2007). J em sementes de cedro (Cedrela fissilis Vell.) foi necessria a aplicao de 2 % de hipoclorito de sdio por 75 min. para uma desinfestao eficaz (NUNES et al., 2002). Em sementes de mogno foi observado 89% de contaminao nos tratamentos sem substncias desinfestantes, mostrando a importncia desses agentes na assepsia de sementes (COUTO et al., 2004).

Tabela 3: Percentagem de sementes de grpia (Apuleia leiocarpa) sem infestao por fungos e/ou bactrias, tratadas ou no com hipoclorito de sdio (NaOCl) a 2,5 ou 5%, por 5, 10 ou 15 min., aos 30 dias em sala de cultivo. Santa Maria, RS, 2010.

Tempo de embebio (min.) 0 (controle) 5 10 15

Desifestao (%) Fungos 90,0 a* 96,8 a 96,8 a 88,4 a NaOCl Bactrias 90,0 a* 98,4 a 98,4 a 96,6 a

2,5% 5% Mdia CV (%)

probabilidade de erro.

90,9 a 95,1 a 93,0 16,72

94,2 a 97,5 a 95,85 13,20

*Valores seguidos de letra diferente diferem-se pelo teste de Tukey a 5% de

A exemplo dos resultados de germinao, as percentagens de desinfestao tambm se mostraram altas, determinando o sucesso do estabelecimento in vitro de plntulas asspticas de grpia, que, se mantidas em meio de crescimento, serviro como fonte de propgulos para a micropropagao dessa espcie. 4. CONCLUSO A quebra da dormncia tegumentar de sementes de grpia, com imerso das mesmas em cido sulfrico concentrado por 20 min., e subseqente lavagem em gua corrente por 5 min, mais a limpeza superficial com etanol a 70% por 30 s, sem a necessidade de aplicao de outras substncias comumente utilizadas em desinfestao de sementes florestais, permitem o estabelecimento de plntulas asspticas de grpia in vitro.
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