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i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS


INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
LAQQA LABORATRIO DE QUIMIOMETRIA EM QUMICA ANALTICA









Utilizao do sinal analtico lquido para validao de modelos de
calibrao multivariada atravs do clculo de figuras de mrito e de
cartas de controle




DISSERTAO DE MESTRADO


AUTOR: WRICKSON FORTUNATO DE CARVALHO ROCHA
ORIENTADOR: Prof. Dr. RONEI JESUS POPPI


CAMPINAS SP, JULHO DE 2007

ii
FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO
INSTITUTO DE QUMICA DA UNICAMP


Rocha, Wrickson Fortunato de Carvalho.
R582u Utilizao do sinal analtico lquido para
validao de modelos de calibrao multivariada
atravs do clculo de figuras de mrito e de cartas
de controle / Wrickson Fortunato de Carvalho
Rocha. -- Campinas, SP: [s.n], 2007.

Orientador: Ronei Jesus Poppi.

Dissertao - Universidade Estadual de
Campinas,
Instituto de Qumica.

1. NAS. 2. Nimesulida. 3. Figuras de mrito.
4. Carta de controle multivariada. I. Poppi, Ronei
Jesus. II. Universidade Estadual de
Campinas. Instituto de Qumica. III. Ttulo.



Ttulo em ingls: Utilization of net analyte signal for validation of models of
multivariate calibration by using figure of merit and chart control

Palavras-chaves em ingls: NAS (Net Analyte Signal), Nimesulide, Figure of
merit, Statistical quality control multivariate

rea de concentrao: Qumica Analtica

Titulao: Mestre em Qumica na rea de Qumica Analtica

Banca examinadora: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi (orientador), Prof. Dr. Marco
Flres Ferro (UNISC-DQF) e Jarbas Jos Rodrigues Rohwedder (UNICAMP-IQ)

Data de defesa: 18/07/2007



iv
Dedico este trabalho aos meus queridos
pais, Adonias Maciel Rocha
e Snia Maria de Carvalho Rocha.
Obrigado pelo amor, pelo
apoio e pela torcida em toda minha trajetria.


















v
Se quisermos progredir, no devemos repetir a histria, mas fazer uma histria
nova.
(Hannibal)
Ou encontramos uma forma, ou a inventamos.
(Hannibal)
Quando a gente pensa que sabe todas as respostas, vem a vida e muda todas as
perguntas.

(Emily Paul)

"No fiz o melhor, mas fiz tudo para que o melhor fosse feito. No sou o que
deveria ser, mas no sou o que era antes."
(Martin Luther King)

claro que meus filhos tero computadores, mas antes tero livros."

(Bill Gates)

"Este livro apenas uma pequena parte; tenho material para pelo menos mais dez
livros. Depende de voc para que os outros dez sejam publicados - uma
responsabilidade que lhe passo. Durma bem."

(Leon Eliachar)














vi

AGRADECIMENTOS

Ao professor Dr. Ronei Jesus Poppi pela oportunidade de realizao desse
trabalho, pela orientao, confiana, pacincia, convivncia e amizade,
principalmente nas horas ruins que no foram poucas.
Aos colegas do grupo LAQQA, IQ-Unicamp e da Moradia Estudantil da Unicamp:
Bruno Bernado Galindo Lopes, Jeferson Gomes Cassemiro, Andr Luis Camilo,
Jos Cicero Calheiros, Aldo Gomes Pereira, Andr Luis Rosa, Andr Murari,
Deleon, Renato Andrade, Erick (Pricles), Heloisa Biscolla, Joclia, Joo, Clebr
Maia, Ebnezer, Marcelo Cordeiro, Diorginis, Kssio Lima, Marcello Garcia
Trevisan, Paulo Henrique Maro, Uanderso Resende, Julio, Mored, Fabiano,
Ferro, Paulo da Costa Filho (Pinto), Renato, Marcelo(P-2), Maurcio(Professor de
ingls), Marco Franco, Danilo, Alexandre Kisner e dentre outros nos quais seria
impossvel descrever aqui.
Ao IIPF-Instituto Internacional de Pesquisas farmacuticas por ter concedido a
matria-prima necessria na realizao de todo o trabalho, por ter fornecido as
informaes e mtodos de anlise utilizado pela indstria e pelo apoio.
Ao Dr. Jos Antnio Martins pela ajuda atravs do fornecimento da mteria-
prima utilizada para a realizao desse trabalho.
minha famlia, meus pais Adonias Maciel Rocha e Snia Maria de Carvalho
Rocha, meu irmo Adson Batista de carvalho Rocha.
minha tia Vanda que pagou a inscrio do meu vestibular da Unicamp em
2001.
minha madrinha, Madalena, e ao meu padrinho, Silvrio, pelo apoio quando
precisei.
minha tia Lindalva e ao seu marido Humberto pelas conversas pelo telefone na
qual eu ligava cobrar.
minha av, Dalva Maciel, a qual eu amo muito.
vii
Ao meu tio, Rondon Maciel Rocha, pelos R$ 550,00 emprestados em 2001 para
eu vir para Campinas o qual eu ainda no paguei.

famlia da minha namorada, Michele de Souza e Silva, pela amizade e
companheirismo durante esses 2 anos de mestrado que tornaram os meus fins de
semanas mais alegres.
minha namorada, Michele de Souza e Silva, pela amizade, carinho, incentivo e
puxes de orelha nos momentos certos, principalmente, quando eu no fazia as
tarefas de ingls.
vizinha da minha namorada Carina e seu marido, Alexandre, pela amizade.
CAPES pelo financiamento desse projeto.
Unicamp e ao Estado de So Paulo por fornecer toda estrutura fsica,
tecnolgica, e humana para realizao deste trabalho.
Aos funcionrios, colegas, familiares e amigos do Instituto de Qumica da
Unicamp aos quais me esqueci e a todas as pessoas que, de uma forma ou outra
contriburam para a realizao deste trabalho e para esta nova etapa de minha
vida concluda, os meus sinceros agradecimentos.




















viii
Currculo
1. Dados pessoais

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha
Naturalidade: Pompu-MG
2. Formao Acadmica (Graduao e Ps-Graduao)

Curso Superior em Qumica (UNICAMP)
Mestrado em Qumica Analtica sub-rea: Quimiometria (UNICAMP)
3. Produo cientfica
3.1. Iniciao cientfica
Orientador: Dr. Ronei Jesus Poppi
Instituio: Unicamp
Nome do projeto:
Parmetros de Qualidade de Lubrificantes e leo de Oliva atravs de
Espectroscopia Vibracional, Calibrao Multivariada e Seleo de Variveis
3.2. Resumo do trabalho cientfico apresentado em
congresso
Modelos de regresso empregando iPLS e DRIFTS para determinao de
Carbamazepina em medicamento.
ROCHA, Wrickson Fortunato de Carvalho; POPPI, Ronei Jesus;
FERRO, Marco Flres.
29 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, guas de Lindia,
2006.
Publicado no livro de resumos v.29, p.QA-031.

Figuras de mrito em calibrao multivariada na determinao de
carbamazepina.
ROCHA, Wrickson Fortunato de Carvalho; Ferro,Marco ; Franco, Marco
Fernando ; Poppi, Ronei Jesus
3 Seminrio Internacional Cincia e Tecnologia na Amrica Latina - A
Universidade como Promotora do Desenvolvimento Sustentvel.
Evento ocorrido na cidade de Campinas na Universidade Estadual de
Campinas entre os dias 14 e 15 de Setembro de 2006.

Determination of Nimesulide Tablets employing IPLS and DRIFTS
ROCHA, Wrickson Fortunato de Carvalho; Rosa, Andr Luis; Martins,
Jos Antnio; Poppi, Ronei Jesus
10th International Conference on Chemometrics in Analytical Chemistry.

ix
Livros didticos A matria: Estados Fsicos, Estrutura e Comportamento
R. JUNIOR, L.; SANTOS, M. M. ; ROCHA, Wrickson Fortunato de
Carvalho
V Encontro de Estudantes de Graduao dos Cursos de Formao de
Professores da Unicamp. 2004
4 de Dezembro de 2004.Evento ocorrido na Faculdade de Educao da
Unicamp.

Validao de modelos de calibrao multivariada atravs do sinal analtico
lquido e do clculo de ANOVA
30 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Agus de Lindia,
2007.
ROCHA, Wrickson Fortunato de Carvalho ; Franco,Marcos Fernando ;
Poppi,Ronei Jesus

Modelos de regresso empregando Bi-PLS e espectroscopia no
infravermelho para determinao de Nimesulida em medicamento
30 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Agus de Lindia,
2007.
ROCHA, Werickson Fortunato de Carvalho ; Franco,Marcos Fernando ;
Poppi,Ronei Jesus

Validao de modelo de calibrao multivariada atravs do clculo de
figuras de mrito e de espectroscopia no infravermelho prximo.
ROCHA, Werickson Fortunato de Carvalho; Rosa, Andr Luis; Martins,
Jos Antnio; Poppi, Ronei Jesus
30 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, guas de Lindia,
2007.

Monitoramento no controle de qualidade de frmacos atravs de cartas
de controle multivariada.
ROCHA, Werickson Fortunato de Carvalho; Rosa,Andr Luis ; Martins,Jos
Antnio ; Poppi,Ronei Jesus
30 Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, guas de Lindia,
2007.

Validation of models of multivariate calibration: an application in the
determination of nimesulide in tablets by near infrared spectroscopy
ROCHA, Werickson Fortunato de Carvalho; Rosa, Andr Luis; Martins,Jos
Antnio; Poppi, Ronei Jesus
The 13th International Conference on Near Infrared Spectroscopy (13th
ICNIRS) In Ume-Vasa, Sweden & Finland 15-21 June 2007

Monitoramento de frmacos atravs de espectroscopia no infravermelho
prximo e de cartas de controle multivariadas
ROCHA, Werickson Fortunato de Carvalho; Poppi,Ronei Jesus
Escola Latino-americana sobre Matria condensada.Corrientes, Argentina.
x
3.3. Publicao
Ttulo: Modelos de regresso empregando iPLS e DRIFTS para
determinao de Carbamazepina em medicamento.
Autores: W. F.C. Rocha, M. F. Ferro e R.J. Poppi
Palavras-chave: iPLS, Carbamazepina, DRIFTS, Quimiometria
Revista: TECNOLLOGICA vol. 10-n. 1-Jan./jun. 2006 ISSN. 1415-6229
UNISC- Universidade de Santa Cruz do Sul

4. Outros
4.4 . Monitoria
Monitor de Qumica e Fsica do colgio Anglo
Perodo: 1 Semestre de 2000
Monitor das disciplinas F-128 Fsica Geral 1\ F-129 Fsica
experimental(Unicamp)
Perodo: 1 e 2 semestre de 2002

4.5. Estgios

Estgio na rea de ensino de qumica CEES(Centro Estadual de
Educao Supletiva) Paula Decourt Unicamp
Perodo: 1 Semestre de 2004

Participao do programa PED(Programa de estgio docente) na
disciplina QA 313(Qumica para Engenharia) na Unicamp
Perodo: 1 Semestre de 2006

4.3 Cursos cientficos

Disciplina MEQVT(Metodologia do Ensino de Qumica via Telemtica)
oferecido pelo LAPEQ(Laboratrio de Pesquisa em Ensino de Qumica e
Telemtica Educacional)-USP
Carga horria: 60 horas
Responsvel: Prof. Dr. Marcelo Giordan
Perodo: 2 Semestre de 2005

Basic Chemometrics
Carga horria: 10 horas
Responsvel: Barry Wise (Eigenvector Research Inc. USA)
Perodo: 10/09/2006
Local: 10th International Conference on Chemometrics in Analytical
Chemistry.

xi
Uncertainty estimation in multivariate and multiway calibration
Carga horria: 10 horas
Responsvel: Klaas Faber (NL)
Perodo: 11/09/2006
Local: 10th International Conference on Chemometrics in Analytical
Chemistry.

QP-268 (Planejamento e Otimizao de Experimentos)
Carga horria: 60 horas
Responsvel: Prof.Dr. Roy Edwards Bruns
Perodo: 2 Semestre de 2006
Local:Universidade Estadual de Campinas

QP-434 (Tpicos Especiais em Fsico-Qumica II Controle Multivariado
de Processos Qumicos)
Carga horria: 60 horas
Responsvel: Prof(a)Dr(a). Mrcia Miguel Castro Ferreira
Perodo: 1 Semestre de 2007
Local:Universidade Estadual de Campinas

Curso de Nanotecnologia realizado pelos palestrantes: Prof. Dr.Fernando
Galembeck do Departamento de Fsico-Qumica, e Prof. Dr. Oswaldo Luiz
Alves, Laboratrio de Qumica do Estado Slido, Departamento de Qumica
Inorgnica (IQ-UNICAMP).

Curso de Qumica Computacional realizado pelos palestrante: Prof. Dr.
Rogrio Custodio, Prof. Dr. Nelson Henrique Morgon e Dr. Leandro
Martinez, Departamento de Fsico-Qumica (IQ UNICAMP)
Curso de Qumica Forense realizado pelo Palestrante: Prof. Dr. Valter
Stefani, Laboratrio de novos compostos orgnicos, Departamento de
Qumica Orgnica (IQ UFRGS).

4.3. Experincia profissional na rea

Professor de Qumica Cursinho do Sindicato dos Trabalhadores de
Campinas
Perodo: 1 Semestre de 2003- 2 Semestre de 2004

Professor de Qumica/Fsica do pr-vestibular da Moradia Estudantil da
UNICAMP
Perodo: 1 Semestre de 2002- 1 Semestre de 2005


xii
Professor de Fsica e Qumica ERAB (Escolas Reunidas Armas
Brasileiras)
Perodo: 1 Semestre de 2005
Autor da apostila de Qumica do Cursinho da Moradia Estudantil da
Unicamp.




























xiii
Resumo

Autor: Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha
Orientador: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi

Este trabalho teve como objetivo realizar a validao de modelos de
calibrao multivariada atravs do clculo de figuras de mrito e de cartas de
controle multivariadas do medicamento Nimesulida por meio do infravermelho
prximo.
Foram preparadas 69 amostras sintticas contendo o princpio ativo
(Nimesulida) na faixa 10,38-39,47% (m/m) em excipiente (lactose, povidona-KV29-
32, celulose 200, lauril sulfato de sdio, croscarmelose sdica e estereato de
magnsio). Destas, 49 amostras foram utilizadas para a calibrao e 20 para a
validao as quais foram separadas atravs do algoritmo de Kennard-Stone.O
tratamento utilizado nos espectros foi a correo do espalhamento multiplicativo.
Na sequncia, foram obtidos os seguintes valores para as figuras de mrito: limite
de deteco (0,61), limite de quantificao (2,03), exatido (RMESC 0,66 %(m/m),
RMESCV 0,92 %(m/m), RMESP 1,05 %(m/m) de Nimesulida), seletividade mdia
(0,0056), sensibilidade (0,0036), inverso da sensibilidade analtica (0,20 %(m/m)
-1

de Nimesulida) e razo sinal rudo (181,11).
Na segunda parte do trabalho foram utilizadas 113 amostras sintticas para
construo das cartas de controle multivariadas. Foram desenvolvidas trs cartas
de controle e calculado os limites de controle para cada carta. Os valores
encontrados foram: - carta NAS (Superior = 6,54x10
-4
; Inferior = 5,25x10
-4
), carta
interferente (7,45) e carta resduo (2,38x10
-6
). Atravs dessas cartas de controle
multivariadas foi possvel identificar as amostras que estavam dentro e fora de
controle. Obteve-se 64 amostras fora de controle e 20 amostras dentro de controle
de acordo com o planejamento experimental realizado. Sendo assim, foi possvel
identificar, de forma qualitativa, as amostras de Nimesulida que estavam dentro e
fora de controle.
xiv
Portanto, a dissertao desenvolvida sugere um novo mtodo analtico que
pode ser usado para controle de qualidade em frmacos e para validao de
modelos de calibrao multivariada, pois os resultados obtidos, indicam que o
modelo desenvolvido pode ser utilizado na indstria farmacutica como uma
alternativa ao mtodo-padro.
































xv
Abstract
Author: Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha
Adviser: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi

This study was mainly intended to elaborate the validation of multivariate
calibration models based on the determination of figures of merit and multivariate
control charts constructed with data from Nimesulide tablets upon near-infrared
spectroscopy use.
A total of 69 synthetic samples were prepared containing the active principle
(Nimesulide) in the range of 10,38-39, 47% (m/m) in excipients (Cellulose,Sodium
Lauryl Sulphate, Magnesium Stearate, Carmellose Sodium,Povidone and Lactose).
It was used 49 samples for the calibration and 20 for the validation that were
separated by the Kennard-Stone algorithm. It was used the multiplicative scatter
correction on the spectra set. Then, the following values for figures of merit were
calculated: limit of detection (0,61) , limit quantification (2,03) , accuracy (RMESC
0,66 %(m/m), RMESCV 0,92%(m/m), RMESP 1,05%(m/m) of Nimesulide), mean
selectivity (0,0056), sensitivity (0,0036), inverse analytical sensitivity (0,20 %(m/m)
-
1
of the Nimesulide) and signal-to-noise ration (181, 11).
In the second application, 113 synthetic samples were used for the
construction of multivariate control charts. Three control charts were designed and
the control limits for each chart were calculated. The values found were: - chart
NAS (upper = 6,54x10
-4
; below = 5,25x10
-4
), chart interferent (7,45) and chart
residual (2,38x10
-6
). From these charts it was possible to identify the samples that
were in and out of control. It was obtained 64 samples out of control and 20
samples in control, according to the experimental design.
Therefore, it was possible to identify, in a qualitative way, the Nimisulide
samples that were in control and the ones that were out of control.
Hence it follows that, this research project suggests a new analytical method
that can be used for quality control in drugs and also for the validation of
multivariate calibration models. Thus, the results obtained indicate that this model
can be used in pharmaceutical industries as an alternative to the standard
procedure.
xvi
NDICE
ndice de figuras...........................................................................................XXV

ndice de tabelas......................................................................................... XXIX

Captulo 1- Introduo....................................................................................1

1.1 Princpios da Espectroscopia no Infravermelho..................................................3
1.2 Espectroscopia no Infravermelho por Reflectncia Difusa..................................7
1.3 Objetivos..............................................................................................................8

Captulo 2- Mtodos Quimiomtricos.........................................................9

2.1 Organizao dos Dados...................................................................................11
2.2 Tratamento........................................................................................................12
2.2.1 Primeira Derivada..........................................................................................12
2.2.2 Correo do Espalhamento Multiplicativo......................................................13
2.3 Anlise de Componentes Principais PCA......................................................15
2.4 Regresso por Mnimos Quadrados Parciais...................................................17
2.5 Validao Cruzada............................................................................................19
2.6 Deteco de Amostras Anmalas em Calibrao Multivariada........................20
2.7 Previso............................................................................................................22
2.8 Sinal Analtico Lquido......................................................................................23

Captulo 3- Validao de Modelos de Calibrao Multivariada
Atravs do Clculo de Figuras de Mrito ...............................................25

3. Validao e Figuras de Mrito............................................................................27
3.1 Validao..........................................................................................................27
3.2 Figuras de Mrito..............................................................................................28
3.2.1 Exatido.........................................................................................................28
3.2 .2Ajuste do Modelo...........................................................................................29
xvii
3.2.3 Linearidade....................................................................................................29
3.2.4 Sensibilidade..................................................................................................30
3.2.5 Sensibilidade Analtica...................................................................................30
3.2.6 Seletividade...................................................................................................31
3.2.7 Razo Sinal/Rudo.........................................................................................31
3.2.8 Testes para erros Sistemticos (bias).........................................................31
3.2.9 Limite de Deteco e Quantificao..............................................................32

Captulo 4-Cartas de Controle Multivariadas.........................................33

4.1 Cartas de Controle Multivariadas......................................................................35
4.2 Carta de Controle Multivariada Baseado na Diviso do Espectro em NAS,
Interferente e Resduos..........................................................................................35
4.3 Construo de Cartas de Controle Baseada no Sinal Analtico Lquido...........36
4.4 Clculo dos Limites Esttisticos para as cartas NAS, Interferente e
Resduos.................................................................................................................39
4.5 Carta de Controle NAS.....................................................................................39
4.6 Carta de Controle Interferente..........................................................................40
4.7 Carta de Controle dos Resduos.......................................................................42
4.8 Validao das Cartas de Controle ...................................................................44
4.8.1 Carta de Controle NAS Para Novas Amostras..............................................44
4.8.2 Carta de controle Interferentes Para Novas Amostras..................................44
4.8.3 Carta de Controle Resduos Para Novas Amostras......................................45








xviii
Captulo 5- Determinao de Nimesulida em Medicamentos
Atravs do Clculo de Figuras de Mrito e de Espectroscopia no
Infravermelho Prximo..................................................................................47

5-Parte Experimental..............................................................................................49
5-1 Espectroscopia no Infravermelho Prximo.......................................................51
5-2 Modelos de Regresso PLS.............................................................................51

Captulo 6-Controle de Qualidade da Nimesulida Atravs de
Cartas de Controle Multivariada e de Espectroscopia no
Infravermelho Prximo..................................................................................61

6- Parte Experimental.............................................................................................63
6-1 Espectros no Infravermelho Prximo................................................................65
6-2 Construo das Cartas de Controle Multivariadas...........................................66
6-3 Validao das Cartas de Controle Multivariadadas..........................................70

Captulo 7.Concluses....................................................................................77

Captulo 8.Referncias Bibliogrficas......................................................81








xix
ndice de Figuras

Figura 1. Diferentes modos vibracionais de uma molcula de gua.
Figura 2. Frmula estrutural da Nimesulida.
Figura 3. Diagrama esquemtico da configurao do acessrio de reflectncia
difusa equipado com esfera de integrao.
Figura 4. Organizao dos dados em uma matriz X a partir dos espectros no
infravermelho para construo de um modelo de calibrao multivariada.
Figura 5. A) Espectros no infravermelho sem nenhum pr-processamento;
B) Espectros corrigidos com a 1 derivada.
Figura 6. A) Espectros no infravermelho sem nenhum pr-processamento;
B) Espectros corrigidos com o MSC.
Figura 7. Decomposio da matriz X nas matriz de escores (T), pesos (P) e
resduos (E).
Figura 8. Representao de duas componentes principais.
Figura 9. Representao geomtrica do PLS com uma varivel latente modelando
os dados de X (variveis independentes) e Y (variveis independentes). Os dados
X formados por trs variveis e dados de Y por duas variveis.
Figura 10. Grfico do RMSECV em funo da dimensionalidade do modelo de
regresso.
Figura 11. Representao geomtrica da decomposio do sinal analtico.
Figura 12. Representao da diviso do espectro ( r ) em quatro diferentes
contribuies: NAS (
rk

), interferente (
rINT
) , resduos (
rRES
) e r

(NAS +
resduos).
Figura 13. Representao da Carta de Controle NAS.
Figura 14. Representao da Carta de Controle Interferente.
Figura 15. Representao da Carta de Controle Resduo.
Figura 16. Representao da Carta de Controle NAS para novas amostras.
Figura 17. Representao da Carta de Controle Interferente para novas amostras.
Figura 18. Representao da Carta de Controle resduo para novas amostras.
Figura 19. Diagrama ternrio para a mistura fsica do medicamento Nimesulida.
xx
Figura 20. Metodologia utilizada para construo e validao do modelo para a
mistura sinttica do medicamento Nimesulida.
Figura 21. A) Espectros NIR do medicamento Nimesulida sem tratamento;
B) Espectros NIR do medicamento Nimesulida com MSC.
Figura 22. Grfico dos resultados obtidos pelo mtodo de validao cruzada
utilizado para a escolha do melhor nmero de variveis latentes.
Figura 23. Grfico dos valores de referncia contra os valores previsto em (%)
m/m estimado pelo o modelo PLS. () Calibrao, () Validao e () Reta
ajustada
Figura 24. Representao do modelo na sua forma pseudo-univariada.
(*) Calibrao, () Validao e () Reta ajustada.
Figura 25. Resduos entre os valores reais e previstos pelo modelo PLS.
() Calibrao e () Validao.
Figura 26. Resduos entre os valores reais e os previstos pelo modelo
pseudo-univariado. A) (X) Calibrao e B) (*)Validao.
Figura 27. Escore da 1 varivel latente contra as concentraes da calibrao.
Figura 28. Grfico de resduos contra as concentraes de referncia.
Figura 29. Diagrama ternrio para a escolha das amostras de calibrao e
validao.
Figura 30. Espectros da mistura (-) e dos constituintes puros (-) sem tratamento e
com a primeira derivada: a) Celulose, b) Estereato de Magnsio, c) Povidona e d)
Nimesulida.
Figura 31. Espectros da mistura (-) e dos constituintes puros (-) sem tratamento e
com a primeira derivada: a) Lactose, b) Amido e c) NaHCO
3
.
Figura 32. A) Espectros NIR do medicamento Nimesulida sem tratamento;
B) Espectros NIR do medicamento Nimesulida com 1 derivada.
Figura 33. Diviso espectral em NAS, Interferente e Resduos.
Figura 34. Valor do NAS vs Nimesulida (% (m/m)) para as amostras da figura 19.
Figura 35. Cartas de controle a) NAS; b) Interferentes e c) Resduos.
Figura 36. Cartas de controle com novas amostras a) NAS; b) Interferentes e c)
Resduos.
xxi
Figura 37. Vetores interferentes para as amostras sob controle (-) e para amostras
1, 11, 21, 22, 29, 36 e 42 que esto fora de controle(-).
Figura 38. Vetores resduos para as amostras de calibrao (-) e das novas
amostras 1, 4, 7, 19, 21, 29, 32, 36, 40, 44 e 50 (-).
Figura 39. Vetores resduos para regio 4250-4650(cm
-1
) da figura 38.
Figura 40. Cartas de controle: amostras sob controle () e amostras fora de
controle (*). a) NAS; b) Interferentes e c) Resduos.
Figura 41. Vetores interferentes.
Figura 42. Vetores interferentes para regio 4000-6000 (cm
-1
) da figura 41.
Figura 43. Vetores resduos.





















xxii
ndice de Tabelas

Tabela 1. Resultados dos parmetros de figuras de mrito para o modelo PLS.
Tabela 2. Descrio de todas amostras usadas para construo e validao das
cartas de controle.



Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
1





CAPTULO 1




INTRODUO














Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
2
1.1 Princpios da espectroscopia no infravermelho

Determinaes espectroscpicas so rpidas e no-destrutivas, tm
ganho cada vez mais popularidade como mtodo analtico em indstrias
farmacuticas, com destaque para o uso da espectroscopia no infravermelho
prximo (NIR) para anlise em matrias-primas
1,2
, produtos intermedirios
3,4,5
e
finais
6,7
.O NIR corresponde a regio do espectro eletromagntico que vai de
12800 a 4000 cm.
-1
Durante o desenvolvimento do NIR, as medidas
inicialmente eram realizadas com fotmetros e espectrofotmetros dispersivos,
baseados em arranjos pticos com filtros e redes de difrao, respectivamente,
com configuraes semelhantes as utilizadas em espectrofotmetros que
trabalham na regio do ultravioleta e visvel(UV-VIS), ou mesmo em
equipamentos que possuam fonte e detectores que se estendiam at essa
regio.Atualmente, devido ao reconhecimento do potencial da aplicao do
NIR, principalmente para anlises quantitativas, equipamentos modernos, em
sua maioria interfermetros com transformada de Fourier, vm sendo
desenvolvidos especificamente para anlises nesta regio e j se encontram
disponveis com acessrios para anlise de amostras slidas, lquidas e
gasosas, assim como os que possibilitam o desenvolvimento de aplicaes em
reas especficas, como por exemplo, nas reas farmacutica e clnica
8
.
Diferentes ligaes moleculares absorvem em nmero de onda
especfico na regio do infravermelho, que possui uma faixa espectral
conhecida como regio de impresso digital. Os tomos em uma molcula
nunca esto imveis. Se, em um sistema, h N tomos livres para se
movimentarem nas trs dimenses, o sistema ter 3N graus de liberdade. Se,
no entanto, esses tomos estiverem ligados entre si, formando uma molcula,
continuaro ainda existindo 3N graus de liberdade, sendo trs graus para a
translao do centro de massa da molcula e, para uma molcula no linear,
trs graus para a rotao da mesma em torno dos trs eixos, restando, assim,
3N-6 graus de liberdade para as vibraes. Para molculas lineares, como no
h rotao em torno do eixo internuclear, restam 3N-5 graus de liberdade para
as vibraes. Esses graus de liberdade correspondem aos diferentes modos
normais de vibrao de uma molcula. Um modo normal de vibrao aquele
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3
em que cada ncleo realiza uma oscilao harmnica simples em torno de sua
posio de equilbrio, todos os ncleos se movem com a mesma freqncia e
em fase e o centro de gravidade da molcula permanece inalterado
9
.
Na prtica, nem sempre o nmero de modos normais de vibrao
corresponde ao nmero de bandas observadas no espectro. Isso ocorre devido
existncia de vibraes de mesma energia, apresentando a mesma
freqncia e, conseqentemente, a mesma posio no espectro. Alm das
freqncias associadas s vibraes normais, freqncias adicionais podem
aparecer no espectro, resultantes dos seguintes fatores:
Sobretons - bandas com valores de freqncia correspondentes a
mltiplos inteiros daqueles das vibraes normais. Por exemplo, seja o valor
da freqncia de um dado modo normal de vibrao, os sobretons vo
aparecer com valores aproximados de 2, 3, etc.
Bandas de combinao so combinaes lineares das freqncias
normais ou mltiplos inteiros destas. Por exemplo, sejam
a
e
b
valores de
freqncia de modos normais de vibrao, podem ocorrer as bandas de
combinao (
a
+
b
), (
a
-
b
), (
a
+ 2
b
), etc.
As atividades dos sobretons e das bandas de combinao podem ser
deduzidas pela teoria de grupos. Em todos os casos, as intensidades dessas
bandas sero menores quando comparadas com as dos modos normais. As
vibraes moleculares podem ser classificadas em deformao axial (ou
estiramento) e deformao angular e podem ser simtricas ou assimtricas. As
vibraes angulares podem ainda ser classificadas como no plano ou fora do
plano. Os diferentes tipos de vibrao para uma molcula de gua so
mostrados na figura 1.









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4


Figura 1: Diferentes modos vibracionais de uma molcula de gua.

Considerando a energia da radiao eletromagntica na faixa do NIR,
essa possui energia suficiente para excitar sobretons e combinaes de
vibraes moleculares a altos nveis de energia. Logo usada na medida
quantitativa de grupos funcionais orgnicos, especialmente O-H, N-H, e C=O.
Porm, uma desvantagem da tcnica, provavelmente, a baixa sensibilidade a
constituintes menores em uma determinada amostra
9
.
Uma importante aplicao do infravermelho a anlise quantitativa de
misturas de compostos. Como o valor de absorbncia de uma banda de
absoro proporcional a concentrao do componente, a quantidade de um
composto presente em uma amostra pode ser determinada atravs de uma
curva de calibrao (absorbncia versus concentrao) construda a partir de
amostras com concentraes conhecidas do composto em questo. No
entanto, quanto mais complexa a amostra, ou seja, quanto maior o nmero
de espcies presentes na matriz, mais difcil se torna a construo de uma
calibrao univariada confivel, sendo necessrio lanar mo de clculos
estatsticos mais complexos, que permitam a utilizao de vrios comprimentos
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
5
de onda para determinao de uma nica propriedade, obtendo-se, assim, uma
calibrao multivariada.
A anlise do princpio ativo, contido em tabletes individuais de
medicamentos, pode ser realizada pelo NIR no modo reflectncia ou
transmitncia
10
. Para quantificar uma determinada quantidade de princpio
ativo, modelos quantitativos de calibrao construdos atravs do NIR devem
ser desenvolvidos, a priori, para quantificar amostras futuras. Em muitos casos,
um modelo quantitativo desenvolvido com vrios nveis da concentrao do
princpio ativo em um determinado medicamento, produzindo vrias amostras.
Essas so dividas em amostras de calibrao e de validao com o intuito de
construir o modelo e valid-lo, respectivamente.
Em anlises de frmacos, o princpio ativo usualmente a propriedade
de interesse mais importante. Entretanto, j que amostras inteiras so medidas
instantaneamente no NIR, o espectro tambm contm informao de outros
compostos denominados excipientes, bem como propriedades fsicas do
medicamento. Dessa forma, a homogeneidade dos excipientes, assim como a
gua contida pode ser identificada. Especialmente, quando o princpio ativo a
menor parte do produto, isto , medicamentos que contm pequena quantia de
princpio ativo, os excipientes podem estar controlando importantes
propriedades na qualidade como dissoluo e dureza
11
.
Nimesulida, cuja frmula estrutural est apresentada na figura 2, um
agente antiinflamatrio no-esteroidal, com atividade analgsica e antipirtica
cuja frmula molecular C
13
H
12
N
2
O
5
S.
12,13
.Sendo assim, usada no
tratamento de rinite alrgica e artrite.


Figura 2: Frmula estrutural da Nimesulida.
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6
1.2 Espectroscopia no infravermelho por Reflectncia Difusa

Na espectroscopia de reflectncia no infravermelho prximo, a amostra
slida finamente moda irradiada com uma ou mais bandas estreitas de
radiao com comprimento de onda na faixa do NIR (12800 4000 cm
-1
).
Ocorre reflectncia difusa, na qual a radiao penetra na camada superficial
das partculas, excita modos vibracionais da molcula do analito e , ento,
espalhada em todas as direes. Um espectro de reflectncia que depende da
composio da amostra , assim, produzido. Instrumentos para medidas de
reflectncia difusa esto disponveis, podendo ser desde fotmetros de filtro at
equipamentos baseados na transformada de fourier. Normalmente, as medidas
de reflectncia difusa so feitas em dois ou mais comprimentos de onda para
cada espcie de analito que est sendo determinada
14
. A figura 3 mostra um
esquema de uma medida por reflactncia difusa utilizando esfera de
integrao.

Figura 3: Diagrama esquemtico da configurao do acessrio de reflectncia difusa equipado
com esfera de integrao.

As paredes internas da esfera de integrao da figura 3, que circunda a
amostra, so recobertas com um material que reflete a radiao difusamente
de modo quase perfeito, como sulfato de brio. A radiao refletida pela
amostra chega aos detectores aps mltiplas reflexes nas paredes da esfera.
Isto faz com que a esfera seja iluminada uniformemente, de modo que a
posio do detector no seja crtica, contudo, uma vez que a radiao difusa se
espalha por toda a esfera, a intensidade do sinal registrado pelo detector
menor que os obtidos por outros acessrios em que a radiao chega
diretamente no detector.
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7
1.3 Objetivos

O objetivo deste trabalho consiste em construir e validar, utilizando
espectroscopia no infravermelho prximo com medidas feitas por reflectncia
difusa:
- modelos de calibrao multivariada, atravs do clculo de figuras de mrito,
para quantificao de Nimesulida em amostras de medicamentos genricos,
similares e de referncia;
- cartas de controle multivariadas baseadas na diviso do espectro de
infravermelho prximo em analito, resduo e interferente para o frmaco
Nimesulida.






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9








CAPTULO 2









MTODOS QUIMIOMTRICOS













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10
Captulo 2- Mtodos Quimiomtricos

O objetivo principal da qumica analtica quantitativa estimar a
concentrao de uma ou mais espcies a partir dos valores de determinadas
propriedades fsico-qumicas do sistema de interesse. Para isto, necessrio
construir um modelo de calibrao, ou seja, determinar a relao entre
propriedades medidas e concentraes. A calibrao multivariada uma das mais
bem sucedidas combinaes de mtodos estatsticos com dados qumicos, tanto
na qumica analtica, quanto na qumica terica.
As notaes de lgebra linear tambm se aplicam a quimiometria. Um vetor
uma matriz que tem somente uma linha ou uma coluna sendo chamado de vetor
linha ou coluna respectivamente. Os vetores so designados por letras minsculas
em negrito (y). As matrizes so designadas por letras maisculas em negrito (X).
Os elementos das matrizes, dos vetores, ou ainda constantes como coeficientes
de regresso so representados por letras sem negrito (x)
1
.

2.1 Organizao dos dados

Os dados em calibrao multivariada podem ser dispostos em forma de
matriz conforme a figura 4 no qual as linhas da matriz referem-se as amostras
obtidas e as colunas referem-se s variveis (absorbncia de um composto em
diferentes nmero de onda)
2,3
.









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11


Figura 4: Organizao dos dados em uma matriz X a partir dos espectros no infravermelho para
construo de um modelo de calibrao multivariada.

2.2 Tratamento
2.2.1- 1 Derivada

Variaes na linha de base de um espectro produzem variaes
indesejveis nas medidas de absorbncia. Estes problemas de linha de base
podem ser corrigidos tomando-se as derivadas do espectro.O mtodo utilizado
para essa tarefa foi a primeira derivada atravs do algoritmo Savistky-Golay
4
. A
figura 5 abaixo demonstra espectros no infravermelho sem nenhum tratamento e
com 1derivada.


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12



Figura 5: A) Espectros no infravermelho sem nenhum tratamento
B) Espectros corrigidos com a 1 derivada.

2.2.2 Correo do Espalhamento Multiplicativo

Uma outra alternativa para a correo da linha da base dos espectros, a
correo do espalhamento multiplicativo do ingls Multiplicative scattter
correction, MSC
5
. Esta correo faz uma regresso de um espectro medido
contra um espectro de referncia (geralmente o espectro mdio) e corrige o
espectro medido usando uma inclinao. Para cada espectro individual x
i
, os
parmetros a
i
e b
i
so estimados por regresso em x (espectro de
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13
referncia/mdio). Os parmetros estimados a
i
e b
i
so utilizados para realizar a
correo do espectro da seguinte maneira:

i i i
b x a x + = (Equao 1)
( )
i
i i
corrigido i
b
a x
x

=
,
(Equao 2)
A figura 6 mostra o efeito da correo com o MSC sobre espectros de
infravermelho com diferentes linha-base.

Figura 6: A) Espectros no infravermelho sem nenhum tratamento
B) Espectros corrigidos com o MSC.


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14
2.3 Anlise de Componentes Principais - PCA

Mtodos baseados em fatores tm por objetivo a projeo dos dados
originais de grande dimenso especial para dimenses menores. Esta projeo
pode ser realizada principalmente pela Anlise de Componentes Principais (PCA),
Anlises de Fatores (FA) e Decomposio de valor singular (SVD).
A Anlise de Componentes Principais (PCA) foi introduzido na qumica por
Malinnowski no final dos anos 60, com o nome de Anlise de fatores, e a partir da
dcada seguinte um grande nmero de aplicaes foram desenvolvidas, o que a
tornou muito conhecida e explorada.
O objetivo da PCA transformar dados complexos para que as informaes
mais importantes e relevantes se tornem mais fceis de visualizar
6,7,8
. Para isso, a
matriz original X, que uma tabela onde os dados qumicos multivariados so
reconstruda para 2 matrizes menores denominadas matrizes de escores (T) e de
pesos (P) e mais uma matriz de resduos que indica a parte no modelada como
mostrado na figura 7.


= + +



Figura 7: Decomposio da matriz X nas matriz de escores (T), pesos (P) e resduos (E).

Neste caso, X a matriz original constituda de m linhas (objetos-
amostras) e n colunas (variveis); T a matriz de escores com mlinhas e d
colunas (nmero de componentes principais); P a matriz de pesos com
dimenses d e n em que d o nmero de linhas e n o de colunas e E a matriz
de resduos com mlinhas e n colunas.
As componentes principais so determinadas baseadas no critrio de
varincia mxima. Cada componente principal subseqente descreve um mximo
X T P
T
E
m
n
m
d
d
n
m
n
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15
de varincia contido nos dados, sendo que a primeira componente principal
determina a maior varincia dos dados. No segundo componente principal, h
menos informao do que no primeiro e, assim, sucessivamente.
A figura 8 representa graficamente duas componentes principais no caso de
2 variveis (x
1
e

x
2
).










Figura 8: Representao de duas componentes principais.

Note pela figura 8 que a maior varincia dos dados est sendo explicada
pela primeira componente principal (PC1)- esferas azuis.
As novas coordenadas-PC1 e PC2 (que podem ser denominadas de
Fatores ou Componentes Principais) so combinaes lineares das variveis
originais. Por exemplo, os escores do primeiro componente principal so definidos
como:

1 21 2 11 1 1
1 2 21 22 11 21 21
1 1 21 12 11 11 11
....
....
....
n mn m m m
n n
n n
p x p x p x t
p x p x p x t
p x p x p x t
+ + + =
+ + + =
+ + + =

(Equao 3)


Por causa da grande frao de varincia usualmente descrita pelo primeiro,
segundo e terceiro componentes, os dados podem ser visualizados atravs dos
escores de um componente contra outro. O mtodo mais simples usado para o
clculo dos escores e pesos em qumica analtica o algoritmo NIPALS
8
(mnimo
X
2
X
1
PC
1
PC
2
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16
quadrados parciais no linear iterativo). A anlise de componentes principais
(PCA) muito aplicada para obter informaes espectrais utilizadas no controle de
qualidade de matrias-primas, produtos acabados bem como no monitoramento
do produto durante a produo. Engenheiros de controle de processos industriais
tm aplicado PCA, por exemplo, na deteco de falhas durante a operao de
processos industriais
9
.

2.4 Regresso por Mnimos Quadrados Parciais

O mtodo de regresso por mnimos quadrados parciais (PLS, do ingls,
Partial Least Squares) pode ser considerado como o mtodo mais utilizado para a
construo de modelos de calibrao multivariada. Esse mtodo realiza uma
anlise de fatores em que a matriz de espectros decomposta em matrizes de
variaes do espectro (pesos) onde os escores representam a contribuio de
cada amostra
10
.
No PLS, tanto a matriz das variveis independentes X, como a das
variveis dependentes Y so decompostas pela Anlise de Componentes
Principais:
F UQ Y
E TP X
T
T
+ =
+ =

Uma relao entre os dois blocos pode ser realizada correlacionando-se os
escores para cada componente de cada vez, utilizando-se um modelo linear:
h h
t u
h
b = == = (Equao 6)
Onde :
h
T
h
T
h h
t t
t u
= == =
h
b
(Equao 7)
Para cada h=1,2.....A componentes principais
Esse modelo, entretanto, no o melhor possvel. Isto porque a Anlise de
Componentes Principais realizada em cada matriz separadamente, podendo
resultar numa relao no muito satisfatria (no linear) entre os escores dos dois
(Equao 4)
(Equao 5)
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17
blocos. Deve-se buscar um modelo onde as matrizes de resduos E e F sejam as
menores possveis e, ao mesmo tempo, conseguir uma relao linear entre t e u.
No PLS isto realizado por uma leve mudana nos valores dos escores, de
forma a produzir a melhor relao possvel, ou seja, h uma leve rotao no eixo
das componentes principais para obteno de uma maior correlao com o vetor
de dados y. Ento, essas novas componentes principais passam a se chamar
variveis latentes
11
. Como pode ser notado, h um compromisso entre a
habilidade dos componentes principais em descrever as amostras nos espaos
individuais (modelagem dos blocos X e Y), e o aumento na correlao entre u e t.
A figura 9 mostra uma representao geomtrica do PLS com uma varivel latente
modelando os dados do bloco de variveis independentes (x) e o das variveis
dependentes (y).

Figura 9: Representao geomtrica do PLS com uma varivel latente modelando os dados de X
(variveis independentes) e Y (variveis independentes). Os dados X formados por trs variveis e
dados de Y por duas variveis.



Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
18
2.5 Validao Cruzada

Para a determinao do nmero correto de PC o mtodo mais utilizado
consiste no mtodo de Validao Cruzada (CV do ingls, Cross Validation), o
qual se baseia na habilidade de previso de um modelo construdo por parte de
um conjunto de dados seguido pela previso do restante do conjunto de dados,
que realizada pelo modelo construdo. A validao cruzada pode ser realizada
em blocos, ou seja, um nmero determinado de amostras deixado de fora no
processo de construo do modelo e a seguir essas amostras so previstas pelo
modelo construdo, ou ainda por um caso conhecido como leave one out (deixe
um fora), onde uma amostra deixada de fora no processo de construo do
modelo e a seguir essa amostra prevista pelo modelo construdo. Em ambos os
casos, o processo repetido at que todas as amostras tenham sido previstas e a
raiz quadrada da soma do quadrado dos erros da validao cruzada (RMSECV
do ingls, Root Mean Square Error of Cross validation) calculado
12

( )
n
RMSECV
n
i
i i
y y

=
1
1
2

(Equao 8)
Onde
y
i

e
y
i
so, respectivamente, os valores previstos e de referncia para a
propriedade de interesse.
O clculo feito para o nmero de componentes principais de 1 at A, e os
resultados de RMSECV so mostrados em um grfico de RMSECV contra o
nmero de variveis latentes. Escolhe-se ento o valor mnimo ou quando se tem
variao significativa desse valor.






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19










Figura 10: Grfico do RMSECV em funo da dimensionalidade do modelo de regresso.

O comportamento tpico observado nesses grficos o aparecimento de
um mnimo ou de um patamar, que indica a melhor dimensionalidade do modelo
de regresso, ou seja, o menor nmero de variveis latentes ou componentes
principais que produziu o menor erro de previso. Nesse caso pode ser escolhido
5 variveis latentes.

2.6 Deteco de amostras anmalas em calibrao multivariada

Como j dito, na construo de um modelo de calibrao multivariada,
geralmente so utilizados dois conjuntos de amostras, um para a calibrao e
outro para a validao do modelo. Entre essas amostras, h possibilidade da
ocorrncia de amostras anmalas, isto , amostras que possuem comportamento
muito diferente, quando comparado com o restante do conjunto.
A ocorrncia desse tipo de amostras, entre as amostras de calibrao, pode
conduzir a modelos com uma baixa capacidade de previso, isto , que produzem
altos valores de erro
13
. Quando presentes entre as amostras de validao, podem
influenciar os resultados dos testes de validao, geralmente levando a resultados
que indicam que o modelo no adequado ou que a sua capacidade inferior
que ele pode apresentar na ausncia de tais amostras.

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
20
Hoje j existem diversas tcnicas para a identificao de amostras
anmalas
14,15,16,17
, sendo que esta rea constitui uma linha de pesquisa que ainda
de grande importncia, tendo em vista a variedade de tipos de equipamentos e
amostras que geram dados de diferentes magnitudes e complexidade.
No presente trabalho, como forma de deteco de amostras anmalas,
utilizou-se um dos mtodos recomendados pela norma E1655-00 da ASTM
(American Society for Testing and Materials)
14
, que se baseia na anlise da
influncia da amostra dentro do conjunto.
O peso relativo de uma amostra em relao s demais presentes em um
mesmo conjunto, pode ser calculado com base na distncia que uma amostra est
do centro dos dados. Essa caracterstica que descrita na literatura pelo termo
ingls leverage, determinada como:

=
=
A
a
a
T
a
a i
i
t t
t
h
1
2
,

(Equao 9)
Qualitativamente, tomando como por exemplo dados espectrais, o termo h
mede o quanto o espectro de uma amostra difere dos espectros das demais
amostras presentes nas amostras de calibrao, amostras com altos valores de h
so consideradas como amostras anmalas.
Para modelos de regresso linear, como por exemplo PLS, um valor mdio
de h para todos os espectros referentes s amostras de calibrao definido
como a razo : A/n
cal
, onde A o nmero de variveis do modelo, e n
cal
o
nmero de amostras utilizadas no conjunto de calibrao. Em mdia cada amostra
de calibrao contribui com A/n
cal
para a definio das variveis espectrais e dos
coeficientes de regresso. Segundo a norma E1655-00da ASTM
14
, amostras com
h maior que trs vezes esse valor devem ser retiradas do conjunto de amostras de
calibrao de um modelo.


As amostras anmalas identificadas segundo o procedimento descrito
acima correspondem a amostras que possuem os dados experimentais diferentes
do restante do conjunto.
Um outro tipo de amostra anmala so aquelas que possuem o valor da
propriedade de interesse (y) significativamente diferente do valor esperado ou
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
21
apresentado por um mtodo de referncia. Essa espcie de amostras pode ser
identificada por meio dos resduos estudentizados. O resduo estudentizado
(e
stud
) de uma amostra i, pode ser determinado como:

( (( ( ) )) )
( (( ( ) )) )
i
i i
stud
h RMSEC
y y
e


= == =
1

(Equao 10)
Onde o RMSEC a raiz quadrada do erro mdio quadrtico de calibrao (do
ingls, root mean square error of calibration), calculado como:
( (( ( ) )) )
GL
n
i
i i
n
y y
RMSEC


= == =

= == =
1
1
2

(Equao 11)
2.7 Previso

A parte fundamental da regresso a verificao de sua validade. Ou seja,
se o modelo desenvolvido capaz de prever corretamente ou com pequena
margem de erro os valores de novas amostras. Os espectros de infravermelho de
amostras desconhecidas so dispostos na forma de matriz (X
teste
). Aps isto, os
dados passam por pr-tratamentos matemticos assim como os dados de
calibrao
18
.
O passo seguinte consiste em se obter o vetor de escores (t
teste
) e os
resduos (e) pelo ajuste das matrizes dos novos espectros, X
teste
para p (pesos do
bloco X calculados na fase de treinamento):

=
+ =
A
1 a
teste
e X
T
a a
P T (Equao 12)

Para A variveis latentes na modelagem.

A partir dos coeficientes de regresso b calculados na fase de calibrao,
os escores T teste produzem uma estimativa do vetor de concentraes, j que
18
:

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22

=
=
A
1 a
T
a a a
q b t Y (Equao 13)
Para A variveis latentes.
Onde q
a
(os pesos do bloco Y) foi calculado na fase de treinamento.

2.8 Sinal Analtico Lquido

O sinal analtico lquido, do ingls, "Net analyte signal" foi definido por
Lorber
19
como sendo a parte do sinal analtico que ortogonal s contribuies de
outros possveis constituintes presentes na amostra como mostrado na figura 11.






Figura 11: Representao geomtrica da decomposio do sinal analtico.

Com o uso do NAS possvel calcular um valor escalar livre de
interferentes a partir do vetor sinal analtico, o que torna possvel a construo de
uma nova forma de calibrao, em que o modelo multivariado pode ser
representado em uma forma pseudo-univariada. Para o clculo do NAS usa-se a
matriz de dados reconstruda com A variveis latentes (
A
X

) atravs do algoritmo
SIMPLS
20,21
. Em seguida determinada a matriz que contm a informao de
todas as espcies presentes na amostra, exceto da espcie de interesse k,
como
22
:
[ ]
A K A, K A, K A,
X y y I X

= (Equao 14)
em que
K A
X
,

: matriz que contm a informao de todas as espcies, exceto da espcie de


interesse

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23
K A
y
,
: vetor de concentraes da espcie de interesse k estimado com A variveis
latentes e o ndice "+" sobrescrito indica a pseudo-inversa do vetor em questo.
I: matriz identidade
A
X

: matriz de dados reconstruda com A variveis latentes (


A
X

) atravs do
algoritmo SIMPLS
Isso faz com que a matriz (
K A
X
,

) fique livre de qualquer contribuio da


espcie k. Logo, o vetor NAS obtido conforme a equao 2.
( ) [ ]
A
T
K A,
T
K A,
nas
A,K
X X X I

+

= X (Equao 15)
em que:
A
X

: vetor de respostas instrumentais de uma amostra estimado com A variveis


latentes
nas
A,K
X

: vetor NAS
Uma vez que
nas
K A,
X

livre de interferentes, possvel substitu-lo por uma


representao escalar sem perda de informao. Assim temos:
nas
K A
s a n
,

X =
(Equao 16)
onde || || representa a norma Euclidiana do vetor
nas
K A
X
,

. Com a possibilidade de
calcular um valor escalar livre de interferentes, a partir de um vetor contendo
contribuies de constituintes desconhecidos, torna-se possvel a construo de
uma nova forma de calibrao multivariada, em que o modelo pode ser
representado em uma forma univariada. Primeiramente o clculo do NAS feito
para as i amostras de calibrao; em seguida o coeficiente de regresso
determinado por mnimos quadrados entre o vetor ns e o vetor de concentraes
y:
( (( ( ) )) ) y s a n s a n s a n

T
1
T

= == =
nas
b (Equao 17)
E o modelo de regresso pode, ento, ser representado por:
e s a n y + =

nas
b (Equao 18)
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25






CAPTULO 3





VALIDAO DE MODELOS DE CALIBRAO
MULTIVARIADA ATRAVS DO CLCULO DE FIGURAS
DE MRITO














Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
26
3.Validao e Figuras de Mrito

3.1 Validao

Quando um novo mtodo analtico desenvolvido existe a necessidade
das agncias reguladoras tais como INMETRO (Instituto Nacional de
Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial), ANVISA(Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria), Farmacopia Norte-Americana (USP), International
Conference on Harmonization (ICH) e American Society for Testing & Materials
(ASTM) para certificar se o mtodo apresenta uma perfomace adequada nas
condies em que ele ser aplicado. Esse processo de averiguao
denominado validao
1
. A validao se d atravs da determinao de
diversos parmetros conhecidos como figuras de mrito. As principais figuras
de mrito so
1,2,3
:

Exatido
Ajuste do modelo
Linearidade
Sensibilidade
Sensibilidade Analtica
Seletividade
Razo sinal/rudo
Teste para erro sistemtico ("bias")
Limite de deteco
Limite de quantificao
A maneira pela qual essas figuras de mrito devem ser determinadas
estabelecida pelos rgos de fiscalizao e encontra-se descrita em normas
especficas
4
, guias de validao
1,2,3,5,6
e trabalhos cientficos
7,8,9
.
Determinaes quantitativas utilizando espectroscopia no infravermelho
prximo tem crescido a cada ano, e estas determinaes fazem uso de
modelos de calibrao multivariada nas quais so utilizado o clculo de figuras
de mrito para validao. Exemplos, referem-se a determinao de parmetros
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
27
no controle de qualidade de indstrias alcooleiras
10
e determinaes de
propriedades de frmacos
11
.
A ausncia de validao desses modelos, devido carncia de normas
oficiais que descrevem como essa validao deve ser realizada tem restringido
sua implementao. Nos ltimos anos, uma considervel ateno vem sendo
direcionada para a elaborao de guias, normas e trabalhos cientficos que
enfocam a necessidade da validao de modelos de calibrao multivariada,
de modo que, atualmente, j se encontram disponveis trabalhos que
descrevem procedimentos e propostas de como essa validao deve ser
realizada. Alguns documentos apresentam carter geral, enquanto que outros,
como por exemplo a norma E1655-00 da ASTM
4
descrevem especificamente o
desenvolvimento e validao de modelos de calibrao multivariada a partir da
espectroscopia no infravermelho. Muitos trabalhos cientficos tratam de
problemas especficos, e portanto, abordam a determinao de apenas
algumas figuras de mrito especficas relacionadas ao trabalho realizado. So
exemplos destes trabalhos: a determinao de limite de deteco, estimativa
de intervalos de confiana, determinao de sensibilidade e sensibilidade
analtica
14
, determinao da seletividade, preciso no nvel de repetibilidade e
preciso intermediria
15
, sendo que, estes trabalhos mostram que figuras de
mrito, raramente abordadas durante a validao de modelos multivariados,
podem ser determinadas. So exemplos ainda, trabalhos que propem melhora
de definies e relaes entre diferentes definies para uma mesma figura de
mrito.

3.2 Figuras de Mrito

3.2.1 Exatido

Expressa o grau de concordncia entre o valor estimado ou medido e o
valor tido como verdadeiro ou de referncia
2
. Comumente em aplicaes com
calibrao multivariada, a exatido estimada atravs da raiz quadrada do erro
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
28
mdio quadrtico de previso (RMSEP "Root Mean Squares Error of
Prediction"):
( )
n

RMSEP
n
1 i
2

=
y y
i i
(Equao 19)
onde n o nmero de amostras de validao, y
i
o vetor referncia que
contm a concentrao do analito de interesse e
y
i
o vetor que contm os
valores previstos da concentrao dada pelo modelo. Segundo o protocolo
emitido pela ICH
2
, a exatido deve ser determinada usando um mnimo de
nove determinaes em no mnimo trs nveis de concentrao que cubram a
faixa de aplicabilidade do modelo. Nessa dissertao ela foi determinada com
base nas 20 amostras utilizadas no conjunto de validao.

3.2.2 Ajuste do modelo

O grau de ajuste do modelo pode ser estimado a partir da correlao
entre os valores de referncia e os valores estimados da propriedade de
interesse pelo modelo para as amostras de calibrao. Isso feito
determinando-se, por mnimos quadrados, a reta que melhor se ajusta aos
valores de referncia e os estimados pelo modelo
15, 16
. Uma vez que o escalar
"nas" determinado, o ajuste do modelo tambm pode ser determinado
atravs da melhor reta que se ajusta ao grfico do "nas" contra a concentrao,
para as amostras de calibrao.

3.2.3 Linearidade

Em modelos de calibrao multivariada uma medida quantitativa da
linearidade no corresponde a uma tarefa simples, ou mesmo possvel.
Qualitativamente, grficos de resduos e dos escores contra a concentrao, os
quais devem ter comportamento aleatrio e linear, respectivamente, podem
indicar se os dados seguem ou no o comportamento linear.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
31
00 da ASTM
4
sugere um teste-t para avaliar se o "bias" incluso no modelo
significante. O "bias" mdio pode ser calculado como:
( )
n

bias
n
1 i

=
y y
i i
(Equao 26)
Em seguida, o desvio-padro dos erros de validao (SDV, "standard
deviation of validation") estimado por:
( ) [ ]
1 n
bias -
SDV
2

=
y y
(Equao 27)
O valor de t ento obtido:
SDV
n
t
bias
= (Equao 28)
Caso o valor de t calculado seja menor que o seu valor crtico para n
graus de liberdade com 95% de confiana, o "bias" includo no modelo pode
ser considerado insignificante e desprezado.

3.2.9 Limite de Deteco e Quantificao

O limite de deteco (LD) e o limite de quantificao (LQ) de um
procedimento analtico, expressam as menores quantidades da espcie de
interesse que podem ser detectadas e determinadas quantitativamente,
respectivamente
3
. Para um conjunto de dados que apresenta comportamento
no qual a varincia constante ao longo da faixa de trabalho, erros com
previso no correlacionados e que seguem uma distribuio normal, os LD e
LQ na calibrao multivariada podem ser calculados por
15
:
N E S
x x LD

1
3 3 = =
k
b
(Equao 29)
N E S
x x LQ

1
10 10 = =
k
b
(Equao 30)
em que, x o desvio padro do sinal de referncia, b
k
o vetor dos
coeficientes de regresso do modelo PLS para a espcie k, N E S

corresponde
ao valor de sensibilidade obtido atravs das equaes 20 e 22.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
33




CAPTULO 4






CARTAS DE CONTROLE MULTIVARIADAS



















Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
34
4.1 Cartas de Controle Multivariadas

O controle de processo estatstico multivariado utilizado para checar o
desempenho de processos no controle de qualidade est se tornando cada vez
mais importante, diante do crescimento do nmero de variveis que podem ser
medidas
1,2,3,4
. Um dos exemplos da implementao de ferramentas estatsticas
multivariadas so as cartas de controle estatsticas baseadas no sinal analtico
lquido que levam em conta a diviso do espectro em quatro constituintes:
(NAS+resduos), NAS, resduos e interferentes. Essas cartas junto com as
cartas Hotteling
5,6,7,8,9
vm sendo usadas como uma ferramenta nova para
substituio das cartas de controle univariadas, tais como as cartas
Shewart
10,11,12,13,14
.

4.2 Carta de Controle Multivariada baseado na diviso do
espectro em NAS, Interferente e Resduos

Na figura 12 o vetor r representa o vetor de dados, enquanto que, o
vetor r

representa o vetor resultante da decomposio do vetor r que
perpendicular ao vetor interferente r
int
.Realizando a decomposio do vetor
r

encontra-se como resultado o vetor NAS
rk

e o vetor resduos (r
res
). As
linhas pontilhadas em vermelho, na figura 12, representam a projeo do vetor
( r ) no espao dos interferentes e o vetor resduo (
rRES
). Enquanto que (b
k
)
representa a direo na qual foi projetado o vetor analito (
rk

).
A figura geomtrica que se aproxima de uma elipse mostrada no espao
dos interferentes da figura 12 indica o limite tolervel nesse espao para dizer
se determinada amostra est sob ou fora de controle, enquanto que, os eixos
representados dentro dessa figura representam as duas primeiras
componentes principais obtidas pelo PCA.




Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
35











Figura 12 : Representao da diviso do espectro ( r ) em quatro diferentes contribuies:
r

(NAS + resduos), NAS (
rk

), resduos (
rRES
) e interferente (
rINT
).

Aps essa diviso, so criadas trs cartas de controle (NAS,
interferentes e resduos) para cada parte da diviso espectral, com o intuito de
monitorar se as amostras esto dentro ou fora de controle. Para isso so
necessrias trs fases: construo do modelo, clculo dos limites estatsticos e
validao do modelo

4.3 Construo das Cartas de Controle Baseada no Sinal
Analtico Lquido

Para a construo das cartas de controle so necessrias duas partes. A
primeira refere-se criao do espao dos interferentes que descreve todas as
variaes dos constituintes da amostra, exceto do analito, enquanto a segunda
baseia-se no clculo do vetor de regresso NAS (b
k
)
7,15
. Para isso, dois grupos
de informao so necessrias: amostras que contm informao somente do
excipiente, denominada de placebo, e amostras que contm a informao do
medicamento. Para o clculo do espao dos interferentes utiliza-se a matriz
placebo (R
-k
). Para isso feito o PCA (Anlise de componentes principais)
16,17

da matriz placebo com A componentes principais conforme a equao 31.
r
bk
r
rres
PC 1
PC 2
Espao dos
interferentes
r k
*

rint
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36
E TP R
T
k
+ ++ +

= == = (Equao 31)
Em que:
R
-k
: matriz de dimenso (jxI
b
), onde j refere-se ao nmero de variveis e I
b
,
ao nmero de amostras do excipiente utilizadas para construir o espao dos
interferentes. O subscrito -k denota que a matriz no possui informao do
analito.
P: matriz loading de dimenso (jxA) onde j refere-se ao nmero de
variveis e A, ao nmero de componentes principais usado pelo PCA.
T: matriz score de dimenso (I
b
xA).
E: matriz resduos de dimenso (jxI
b
).
Aps essa fase, utiliza-se a matriz de loading para definir o espao dos
interferentes conforme a equao.
r PP r
int
+ ++ +
= == = (Equao 32)
Onde
r
int
: vetor interferente de dimenso (jx1), onde j refere-se ao nmero de
variveis.
r: vetor de dados que contm a informao do analito junto com a informao
do excipiente com dimenso (jx1).
P
+
: pseudo-inversa da matriz loading.
A segunda parte da construo do modelo leva em conta o clculo do
vetor de regresso NAS de acordo com as equaes 33 e 34.
mod
T
j
k
R PP I B | || |

| || |

\ \\ \
| || |
= == = (Equao 33)
Onde
B
k
: matriz que contm os vetores que so ortogonais ao espao dos
interferentes de dimenso (jxI
mod
) em que I
mod
o nmero de amostras dentro
de controle utilizadas para o clculo do vetor de regresso NAS, enquanto o
subscrito k refere-se matriz que contm a informao do analito de
interesse.
De acordo com Smilde e Skibsted
7
, recomendado usar cinco amostras
para o clculo da matriz B
k
, pois no h diferena se for usado um nmero
maior. Logo, o nmero de amostras (I
mod
) utilizadas nessa dissertao cinco.
I
J
: matriz identidade de dimenso (jxj)
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37
R
mod:
matriz de dados na qual existem somente amostras dentro de controle e
com dimenso (jxI
mod
).
Aps isso, calculado mdia dos vetores da matriz B
k
, com o intuito
de achar uma direo nica para os vetores ortogonais ao espao dos
interferentes. Esse novo vetor denominado vetor de regresso NAS e
calculado da seguinte forma:
I
od
i
k,i
k
mod
Im
B
b

= == =
= == =
1
(Equao 34)
b
k
: vetor de regresso NAS com dimenso (jx1).
Agora o vetor NAS (
rk

) pode ser computado pela projeo do espectro


na direo do vetor de regresso NAS, conforme mostrado na figura 12,
atravs da equao 35.
r b b b b r
T
k k
T
k k
*
k
1
| || |

| || |

\ \\ \
| || |
= == = (Equao 35)
importante notar, na figura 12, que existe uma pequena diferena
entre r

e
rk
*
que o vetor resduo. Ento, como:
res
*
k
r r r r
int
+ ++ + = == = + ++ + (Equao 36)
logo,
*
int
r r r
k res
r = == = (Equao 37)
onde:
:
rres
vetor resduo
*
r
k
: vetor NAS
int
r : vetor interferente
r : vetor de dados





Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
38
4.4 Clculo dos limites estatsticos para as cartas NAS,
Interferente e Resduos

Para o clculo dos limites estatsticos das trs cartas citadas acima
utiliza-se somente amostras que esto dentro de controle. Essas amostras so
organizadas em uma matriz denominada( R
noc
) e possuem dimenso (jxI
noc
)
em que I
noc


o nmero de amostras dentro de controle e j o nmero de
variveis espectrais. importante ressaltar que essas amostras no foram
usadas para construir o espao dos interferentes, nem para fazer o clculo do
vetor de regresso NAS. O subscrito noc (do ingls, normal operating
condition
17
) refere que essa matriz s possui amostras dentro de controle.
Nesta dissertao usou-se I
noc
igual a 19.

4.5 Carta de Controle NAS

A projeo do espectro da amostra no vetor de regresso NAS
proporcional concentrao do analito na amostra. Essa projeo
denominada NAS
18
.Os limites estatsticos da carta NAS para cada amostra
dentro de controle so calculados a seguir:

k
T
noc noc
b nas R = == = (Equao 38)
onde nas
noc
o vetor com os valores do NAS para cada amostra sob controle
da matriz R
noc
.
Calculando a mdia e o desvio-padro do vetor nas
noc
, pode-se
computar e graficar os limites estatsticos da carta NAS, como mostra a
equao 39.
Considerando o limite com 95% de confiana
19
, temos:
noc noc
s nas Limite 2
95
= == =
%
(Equao 39)
onde:
nas
noc
: mdia do vetor nas
noc
que possui dimenso (1x1)
s
noc
: desvio-padro do vetor nas
noc
que possui dimenso (1x1)



Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
39
Assume-se que os valores do NAS seguem uma distribuio normal, que
pode ser detectada por um teste de normalidade.A figura 13 abaixo representa
a carta NAS.








Figura 13 : Representao da Carta de Controle NAS

4.6 Carta de Controle Interferente

Todos os vetores que fazem parte da matriz R
noc
tm uma frao
projetada no espao dos interferentes, como mostrado na figura 12. Amostras
futuras tambm devem ser projetadas nesse espao. Dessa forma, amostras
projetadas dentro do limite representado pela figura geomtrica, que se
aproxima de uma elipse, que est graficada no espao dos interferentes
segundo a figura 12, so denominadas dentro de controle, enquanto as
amostras projetadas alm desses limites, so denominadas fora de controle.
Vale lembrar que o espao dos interferentes foi construdo atravs do modelo
PCA, no qual se usa a matriz de loadings, conforme mostrado na equao 32.
Novamente, na figura 12, temos que as duas retas que se encontram dentro do
limite referem-se s duas primeiras componentes principais do PCA. Sendo
assim, pode-se dizer que a carta interferente baseada na distncia da
projeo das amostras ao centro dos eixos formados pelas duas primeiras
componentes principais. Para construir a carta interferente, primeiramente,
deve-se projetar os vetores que so os espectros das amostras que esto
dentro de controle no espao dos interferentes, de acordo com a equao 40.
noc
R PP R
int
+ ++ +
= == = (Equao 40)
Onde:
NAS
Amostras
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40
R
int
: matriz interferente com dimenso (jx I
noc
)
Ento, necessrio calcular as novas coordenadas para esses interferentes
em um novo sistema de eixos (matriz score), da seguinte forma:
( (( ( ) )) )
1
= == = P P P R T
int
T T
noc
(Equao 41)
Agora, a distncia das amostras ao centro do eixo das duas
componentes principais calculada
( (( ( ) )) ) ( (( ( ) )) )
noc i noc
T
noc i noc i noc
t t S t t d
, , ,


= == =
1
(Equao 42)
onde
T
noc
: matriz score com dimenso (I
noc
x A), em que A o nmero de
componentes principais retidos no modelo PCA.
t
noc
: valor mdio para todos os vetores contidos na matriz T
noc
.
S: denota a matriz de covarincia centrada na mdia dos scores com
dimenso (AxA).
:
, t i noc
vetor score com dimenso (1xA)
:
, d i noc
distncia dos interferentes ao centro dos eixos formados pelas duas
primeiras componentes principais.
Dessa forma, o limite com 95% confiana para a carta interferente pode
ser calculado e graficado na figura 14 :
( (( ( ) )) )
( (( ( ) )) )
( (( ( ) )) )
( (( (
( (( (

( (( (







= == =
A I I
I I A
F D
noc noc
noc noc
A
noc
I A ite
2
95 0 95 , , % , lim
(Equao 43)
onde
F
0,.95
: valor da distribuio F com 95% de confiana em que o ndice (I
noc
-A)
refere-se ao nmero de graus de liberdade.






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41







Figura 14 : Representao da Carta de Controle Interferente

4.7 Carta de Controle do Resduo

A carta resduo baseia-se na parte do sinal que no modelada pelo
modelo e pelo limite estatstico-Q
20
.De acordo com a figura 12, temos que o
resduo provm da decomposio do vetor que ortogonal ao vetor interferente
(r
T
). Vale ressaltar que, a partir da decomposio desse vetor, temos como
resultado o vetor NAS e o vetor resduo.
Para o clculo do resduo necessrio o clculo da matriz NAS
(equao 44) e da matriz interferente (equao 40). Dessa forma, calcula-se a
matriz resduo segundo a equao 45.
( (( ( ) )) )
noc
T
k k
T
k k noc
R b b b b R
*
1
= == = (Equao 44)
Onde:
:
*
R
noc
matriz NAS que possui dimenso (jxI
noc
)

*
int
R R R R
noc noc res
= == = (Equao 45)
Ento, de acordo com Jackson e Mudholkar
26
, calculado o resduo Q
noc

da seguinte forma:
res
T
res noc
R R Q = == = (Equao 46)
onde:
Q
noc
: matriz com dimenso (I
noc
xI
noc
).
A diagonal da matriz Q
noc
contm os valores Q-estatstico que sero graficados
na carta resduo.
Amostras
Interferente
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42
O limite de confiana para carta Q
20
calculado e plotado na figura 15
conforme as equaes 47, 48 e 49.
( (( ( ) )) )
0
2
1
0 0 2
1
2
0 2
1
1
1
1
2
h
h h h c
Q
( (( (
( (( (
( (( (

( (( (





= == =

+ ++ + + ++ +

(Equao 47)

Onde
:
c
desvio-padro normal

+ ++ + = == =
= == =
n
k j
i
j i
1

i : 1, 2 e 3 (Equao 48)
k corresponde ao nmero de componentes principais retidos no modelo e
n ao nmero total de componentes principais (ou o nmero total de
amostras).

| || |
| || |

| || |


\ \\ \
| || |
= == =
2
2
3 1
0
3
2
1


h
(Equao 49)








Figura 15 : Representao da Carta de Controle Resduo







Resduos
Amostras
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43
4.8 Validao das Cartas de Controle (Modelo)

4.8.1 Carta de controle NAS para novas amostras

O valor NAS calculado de acordo com a equao 50 e graficado na
carta NAS de calibrao segundo a figura 16.
k
T
novo novo
b nas R = == = (Equao 50)







Figura 16 : Representao da Carta de Controle NAS.
Amostras de Calibrao; Amostras de Validao

4.8.2 Carta de controle do interferente para novas amostras

O valor dos interferentes para as novas amostras so calculados e
graficados na carta interferente de calibrao de acordo com a figura 17
atravs das equaes 51, 52 e 53.
novo novo
R PP R
int,
+ ++ +
= == = (Equao 51)
( (( ( ) )) )
1
= == = P P P R T
T T
novo novo
(Equao 52)
( (( ( ) )) ) ( (( ( ) )) )
novo i novo
T
novo i novo i novo
t t S t t d
, , ,


= == =
1
(Equao 53)





NAS
Amostras
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44









Figura 17 : Representao da Carta de Controle Interferente.
Amostras de Calibrao; Amostras de Validao

4.8.3 Carta de controle dos resduos para novas amostras

Tambm os resduos das novas amostras so calculados e graficados
na carta resduo de calibrao, como mostrado na figura 18 atravs das
equaes 54, 55 e 56 abaixo.

( (( ( ) )) )
novo
T
k k
T
k k k novo
R b b b b R
*
,
1
= == = (Equao 54)
*
, int, ,
R R R R
k novo novo novo novo res
= == = (Equao 55)
novo res
T
novo res novo , ,
R R Q = == = (Equao 56)











Figura 18 : Representao da Carta de Controle Resduos.
Amostras de Calibrao; Amostras de Validao
Amostras
Interferente
Resduos
Amostras
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47




CAPTULO 5


DETERMINAO DE NIMESULIDA EM
MEDICAMENTOS ATRAVS DO CLCULO DE
FIGURAS DE MRITO E DE ESPECTROSCOPIA NO
INFRAVERMELHO PRXIMO



















Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
48
Na primeira etapa desta dissertao aplicou-se espectroscopia no
infravermelho prximo e clculo de figuras de mrito, baseado no clculo do
sinal analtico lquido, para construir e validar um modelo de calibrao
multivariada linear por mnimos quadrados parcias (PLS).

5-Parte Experimental

Foram preparadas 69 amostras sintticas contendo o princpio ativo
(Nimesulida) na faixa 10,38-39,47% (m/m) em excipiente (lactose, povidona-
KV29-32, celulose 200, lauril sulfato de sdio, croscarmelose sdica e
estereato de magnsio), conforme mostrado na figura 19 abaixo.



Figura 19: Diagrama ternrio para a mistura fsica do medicamento Nimesulida.

Todas as amostras foram pesadas em uma balana analtica com
preciso de 0,00001g e misturadas atravs de vrtex e almofariz por cinco
minutos em recipientes de 5mL com a ajuda de trs esferas metlicas. Aps
isso, todas as amostras de Nimesulida foram colocadas em um moinho de
facas por um minuto. Depois as amostras foram recolocadas no vrtex por
mais um minuto.
*
Outros: povidona-KV29-32, celulose
200, lauril sulfato de sdio,
croscarmelose sdica e estereato de
magnsio.
Formulao
comercial
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
49




























Figura 20: Metodologia utilizada para construo e validao do modelo da mistura
fsica do medicamento Nimesulida.

Tambm foram utilizados, nas mesmas condies experimentais, trs
lotes de amostras comerciais do medicamento Nimesulida cuja concentrao
foi previamente determinada pelo mtodo padro que utiliza diluio seguida
de medida espectrofotomtrica na regio do UV.

69 amostras sintticas de Nimesulida

Princpio ativo na faixa 10,38-39,47% em
excipiente (Povidona-KV29-32, Celulose200,
Lauril Sulfato de Sdio, Croscarmelose
Sdica e Estereato de magnsio)

Pr-tratamento dos dados
MSC

t=5minutos t=1minuto
Validao
Algoritmo Kenstone

X
cal
(49x1557)
Y
cal
(49x10)
X
val
(20X1557)
y
val
(20x1)

Validao
Calibrao
Construo do modelo
Espectrmetro
Thermo Nicolet Antaris
TM 2 FT-NIR
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
50
5-1 Espectroscopia no infravermelho prximo

Os espectros de reflectncia foram obtidos num espectrmetro Thermo
Nicolet Antaris TM II FT-NIR com mdulo de esfera de integrao de ouro para
reflectncia difusa, fonte de tungstnio-halognio, 32 varreduras, resoluo de
8cm
-1
e detector de arseneto de glio.

5-2 Modelo de Regresso PLS

Na construo dos modelos foi utilizado o PLS-ToolBox 3.5
1
para
MATLAB 6.5 (MathWorks). O primeiro passo para a construo do modelo foi
realizar o pr-processamento dos dados, pois os espectros das amostras
apresentaram desvio da linha base. O pr-processamento utilizado para a
matriz X foi o MSC, do ingls multiplicative spectra correction enquanto para o
vetor y no foi realizado nenhum tratamento. Aps essa etapa, utilizou-se o
algoritmo de kennard-Stone
2
para separar as amostras de calibrao e
validao, ou seja, aps o tratamento de todas as amostras realizou-se a
separao das amostras em dois grupos: amostras de calibrao e validao.
A figura 21 mostra os espectros das amostras do medicamento Nimesulida
sem nenhum tratamento e com o tratamento MSC.











Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
51

Figura 21: A) Espectros NIR do medicamento Nimesulida sem tratamento;
B) Espectros NIR do medicamento Nimesulida com MSC.

Para o modelo construdo foram empregadas 6 variveis latentes. Isso
ocorre porque esse nmero apresenta o menor valor da raiz quadrada da soma
do quadrado dos resduos (RMSECV) que no leva a sobre-ajuste ("overfit") e
explica 100% da varincia de X e 99,93% de y. A figura 22 demonstra o grfico
dos valores de RMSECV versus o nmero de variveis latentes na qual foi
utilizado para a escolha do nmero de variveis latentes.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
52


Figura 22: Grfico dos resultados obtidos pelo mtodo de validao cruzada utilizado para a
escolha do melhor nmero de variveis latentes.

Assim, foi construdo um modelo de calibrao tanto na sua forma
pseudo-univariada utilizando o NAS como multivariada e validado atravs do
clculo de figuras de mrito. Nas figuras 23, 24, 25 e 26 a seguir esto
mostrados os valores de referncia contra os valores previstos pelos modelos
multivariado e pseudo-univariado e os seus respectivos erros.Tanto no modelo
multivariado como no pseudo-univariado. Nota-se uma boa concordncia entre
os valores de referncia e os valores previstos pelos modelos. Isso ocorre
porque nas figuras 23 e 24 os pontos graficados nessas figuras,
correspondentes a relao entre os valores obtidos pelo modelo e os valores
de referncia, esto bem sobrepostos nas retas ajustadas pelo mtodo dos
mnimos quadrados.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
53

Figura 23: Grfico dos valores de referncia contra os valores previstos do medicamento
Nimesulida em (%) m/m estimado pelo o modelo PLS.
() Calibrao, () Validao e () Reta ajustada.

Outra maneira de avaliar o ajuste do modelo atravs do grfico dos
valores escalares do sinal analtico lquido-NAS, determinados pela norma do
vetor de sinal analtico lquido em funo da concentrao da espcie de
interesse. Desta forma utilizou-se o modelo pseudo-univariado atravs da
equao 18 no qual encontrou-se a seguinte equao: 084 2 52 252 , ) , ( = == = nas y


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54

Figura 24: Representao do modelo na sua forma pseudo-univariada.
(*) Calibrao, () Validao e () Reta ajustada.

Os resduos referentes a esses ajustes, mostrados nas figuras 25 e 26,
so menores que 3% tanto para as amostras de calibrao quanto para
validao. O clculo dos resduos, mostrado nestas figuras, foi feito atravs da
equao 57 abaixo:
100











= == =
y
y y
R
ref
pred ref
resduos

Onde:
Rresduos
: Resduos
y
ref
: Vetor referncia que contm a concentrao do analito de interesse.
y
pred
: Vetor que contm os valores previstos da concentrao dada pelo
modelo.
Considerando a farmacopia USP
3
, pode-se considerar esse modelo
como aceitvel, pois a maioria das amostras de previso possuem erros
relativos menores que 5% e a farmacopia aceita at 10 (%) de diferena do
valor tabelado para a maioria dos medicamentos. No foi encontrado nessa
farmacopia o erro relativo tolervel para o medicamento Nimesulida. Sendo
assim, considerou o erro mximo aceitvel para a maioria dos medicamentos
que igual a 10 (%) do valor comercial.
(57)
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
55
Outro fato notrio que deve-se levar em conta que a indstria na qual
foi realizado o procedimento experimental considera o erro aceitvel para o
medicamento Nimesulida igual a 5%. J que as amostras apresentaram erros
inferiores 5% pode-se considerar o modelo como satisfatrio.

Figura 25: Resduos entre os valores reais e previstos pelo modelo PLS.
() Calibrao e () Validao.










Figura 26: Resduos entre os valores reais e os previstos pelo modelo
pseudo-univariado. A) (X) Calibrao e B) (*)Validao.

A tabela 1 apresenta os resultados para os parmetros de figuras de
mrito. Pode-se verificar que o uso do NAS para o clculo de algumas figuras
de mrito foi de essencial importncia para validao dos modelos
apresentados.

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
56
Tabela 1: Resultados dos parmetros de figuras de mrito para o modelo PLS.





































a
valores em % (m/m) de Nimesulida ,
b
valor em % (m/m)
-1
de Nimesulida e
c
valor mximo.
d
Raiz
quadrada do erro mdio quadrtico (RMSE) de validao cruzada (RMSECV), calibrao
(RMSEC), previso (RMSEP), respectivamente onde n o nmero de amostras, y
i
o vetor
referncia que contm a concentrao do analito de interesse e
y
i
o vetor que contm os
valores previstos da concentrao dada pelo modelo.






RMSECV
d
0,984
Exatido
a
RMSEC
d
0,653
RMSEP
d
1,122
R
2
calibrao
0,993

R
2
validao
0,988

Seletividade mdia 0,0056

Sensibilidade
b
0,0036

Sensibilidade analtica
a
4,9

Inverso da sensibilidade Analtica
b
0,2

Ajuste NAS Coeficiente angular 252,52 18,11
Coeficiente linear -2,08 0,02
Correlao 0,986

Ajuste PLS Coeficiente angular 0,99 0,01
Coeficiente linear 0,23 0,25
Correlao 0,996

Erro sistemtico Bias 0,03
de acordo com Desvio Padro 0,66
a ASTM Graus de liberdade 49
t
bias
0,31
t
crtico
2,10

Limite de quantificao
a
2,03

Limite de deteco
a
0,61

Razo sinal rudo
c
181,11
( (( ( ) )) )
n
RMSE
n
1 i
2

= == =

= == =
y y
i i

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
57
No que se refere exatido do modelo, essa figura de mrito
representada pelo coeficiente de correlao da calibrao (R
cal
), coeficiente de
correlao da validao (R
val
), raiz quadrada do erro quadrtico mdio da
calibrao (RMSEC) e da previso (RMSEP). Dessa forma, pode-se dizer que
o modelo pode ser considerado exato, pois possui valores de correlao tanto
na calibrao como na validao de 0,99. Alm disso, possui valores de
RMSEP e RMSEC, respectivamente 1,051 % e 0,655%. No que diz respeito
relao sinal/rudo, foi encontrado o valor de 181,11, o qual significa que o
escalar NAS est aproximadamente 181 vezes maior que o desvio-padro da
flutuao do sinal instrumental. Esse valor mostrou-se satisfatrio, porm,
quanto maior essa razo, melhor ser o valor do sinal obtido em relao ao
rudo.
Considerando os valores de limite de deteco e quantificao, pode-se
inferir que o modelo NIR construdo s pode detectar valores iguais ou
superiores a 0,61 % (m/m) de Nimesulida, enquanto para quantificao, o
modelo no consegue determinar valores menores que 2,03% (m/m) de
Nimesulida. Como a concentrao de Nimesulida varia de 10,38-39,47% (m/m),
pode-se considerar o modelo eficaz para detectar e quantificar esse princpio
ativo. Isso ocorre porque os limites, tanto de deteco como de quantificao
encontrado, possuem valores mdios menores do que as porcentagens de
Nimesulida presentes nas amostras.
O modelo apresentou um pequeno valor numrico de sensibilidade
(0,0036(m/m)
-1
), que em parte decorrncia do pr-processamento utilizado. O
valor para o inverso da sensibilidade analtica, apresentado na tabela 1, pode
ser interpretado de forma mais clara, por sua relao direta com a
concentrao. Segundo esse valor, o modelo capaz de distinguir entre
amostras com diferena de concentrao da ordem de 0,2% (m/m). J no que
se refere seletividade do modelo, o valor encontrado foi de 0,0056. Isso
significa que, em mdia, menos que 1% da informao do analito contido no
espectro da amostra no ortogonal aos interferentes. Deve-se ressaltar, que
esse valor de seletividade no se refere seletividade no seu significado fsico,
que em geral empregado em Qumica Analtica. Ele indica que cerca de 1 %
do sinal retirado na etapa de aniquilao de posto realizado durante o clculo
do NAS.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
58
O ajuste do modelo foi avaliado com base nas figuras 23 e 24.
Analisando a tabela 1, pode-se inferir que tanto o ajuste para o modelo PLS
quanto para o modelo pseudo-univariada possui uma grande correlao com
os dados de referncia, pois ambos possuem correlao aproximadamente
0,99 entre os dados de referncia e os dados calculados pelo modelo.
A medida quantitativa de linearidade em modelos de calibrao
multivariada no simples, ou mesmo possvel. Qualitativamente o grfico dos
resduos das amostras de calibrao e validao pode indicar se os dados
seguem ou no o comportamento linear
4
. A distribuio aleatria desses
resduos um indicativo de comportamento linear. Analisando as figuras 27 e
28, observa-se uma tendncia a um comportamento linear na figura 27 e erros
com comportamento aleatrio na figura 28 para as amostras de calibrao
como de previso. Logo, pode-se concluir que o modelo no possui falta de
linearidade.

Figura 27: Escore da 1 varivel latente contra as concentraes da calibrao.

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
59

Figura 28: Grfico de resduos contra as concentraes de referncia.

Em relao aos erros sistemticos, segundo as normas da American
Society for Testing and Materials (ASTM), h uma sugesto de realizao de
um teste-t para avaliar se o bias incluso no modelo significante. Como o
valor do t
bias calculado
(0,31) menor que o valor de t
crtico com n-1 graus de liberdade

(2,10) pode-se considerar que o bias includo no modelo insignificante.Logo,
o modelo no apresenta erros sistemticos, razo pela qual se pode dizer que
a construo do modelo apresentado, da fase experimental at o clculo das
figuras de mrito, foi realizada de forma adequada.
Ao que refere-se as amostras comerciais de trs lotes diferentes obteve-
se resduos (erros relativos) calculados atravs da equao 35 com valores
iguais 3 %, 5,5 % e 6,7 %.No foi realizado uma anlise de novos lotes ou
mesmo de mais amostras do mesmo lote porque a empresa na qual realizou-se
essas anlises estava mudando os locais de produo e de anlise do
medicamento Nimesulida. Esse fato impossibilitou a realizao de novas
anlises, porm os resultados obtidos podem ser considerados satisfatrios,
pois de acordo com USP
3
os erros encontrados foram menores que 10%.

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61


CAPTULO 6








CONTROLE DE QUALIDADE DO FRMACO
NIMESULIDA EM MEDICAMENTO ATRAVS DE
CARTAS DE CONTROLE MULTIVARIADA E DE
ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRXIMO











Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
62
A segunda parte desta dissertao refere-se ao controle de qualidade
em frmacos atravs da utilizao de cartas de controle multivariadas. A
vantagem do metdo fundamentada no monitoramento simultneo da diviso
espectral em analito (NAS), excipientes (interferentes) e resduos. Dessa
forma, temos dois casos: amostras que esto dentro ou fora de controle. As
amostras que possuem seus valores de NAS, interferente e resduos dentro
dos limites estabelecidos pelas amostras em controle so consideradas dentro
de controle. Ento, qualquer amostra que possuir pelo menos um valor fora do
limite de qualquer um dos trs parmetros (NAS, interferente e resduos) ser
denominada fora de controle
1
.

6-Parte Experimental

Na segunda etapa da dissertao foram utilizadas 113 amostras
sintticas, nas quais utilizou-se das mesmas 69 amostras mostradas da figura
19. Dessas 69 amostras (figura 29), 19 possuem concentrao dentro da faixa
de 22,33-27,29% (m/m) de Nimesulida e foram escolhidas para a calibrao,
enquanto que as restantes, ou seja, as outras 50 amostras foram escolhidas
para validao (figura 29). Deve-se ressaltar, que essas 50 amostras no
possuem concentrao do analito dentro da faixa de concentrao das
amostras de calibrao. Tambm foram preparadas mais 20 amostras (figura
29) para a validao contendo o princpio ativo (Nimesulida) dentro da faixa
22,33-27,29% (m/m) com o mesmo excipiente das amostras da figura 19,
totalizando desta maneira 89 amostras.

Figura 29: Diagrama ternrio para escolha das amostras de calibrao e validao

19 Amostras
para calibrao
20 Novas amostras para
validao
50 Amostras
para validao
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63
Foram tambm utilizadas 10 amostras para construo do espao dos
interferentes. Essas amostras foram feitas somente com os excipientes do
medicamento Nimesulida, ou seja, no foram acrescentadas o princpio ativo.
Essas amostras foram feitas dividindo os excipientes em trs partes.Uma
contendo lactose, outra contendo povidona e uma terceira parte denominada
outros no qual formado por celulose, lauril sulfato de sdio, croscarmelose
sdica e estereato de magnsio.
Dessa forma, misturou-se esses constituintes da mesma forma das
amostras anteriores variando a concentrao de lactose, excipiente que
contm a maior quantidade no medicamento comercial, entre 10-80% (m/m).
Essas amostras compem a matriz de dados denominada placebo.
As 14 amostras restantes que faltam para completar as 113 amostras
sintticas so amostras feitas para a validao das quais 9 foram adicionadas
NaHCO
3
e 5 amido, alm de todos excipientes que contm a formulao da
Nimesulida. Essas 14 amostras foram feitas ajustando a concentrao do
princpio ativo quando se acrescentava esses novos excipientes, ou seja,
calculava-se a nova concentrao de Nimesulida aps o acrscimo desses
novos excipientes.
A tabela 2 mostra um resumo de todas as amostras utilizadas nessa
segunda parte desta dissertao.

Tabela 2 Descrio de todas amostras usadas para construo e validao das cartas de
controle.











Descrio Usada para
- 10 amostras para o placebo - Construo do espao dos interferentes
(Amostras com todos os constituintes exceto o analito)
- 19 amostras sob controle - Construo dos limites para a carta NAS
- 70 amostras para validao
(50 amostras com concentraes fora e 20 com - Validao dos limites para a carta NAS
concentraes dentro do limite estipulado pela carta
NAS)

- 14 amostras fora de controle
( Amostras com presena de Amido
e Lactose.Constituintes ausentes nas - Validao dos limites para a carta
amostras sob controle) Interferente
- Total : 113 amostras
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64
6-1 Espectros no infravermelho prximo

Os espectros de todos os constituintes puros presentes no medicamento
Nimesulida junto com a mistura sinttica esto mostrados nas figuras 30 e 31.






Figura 30: Espectros da mistura (-) e dos constituintes puros (-) sem tratamento e com a
primeira derivada :a) Celulose, b) Estereato de Magnsio, c) Povidona e d) Nimesulida.

a)
b)
c)
d)
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65



Figura 31: Espectros da mistura (-) e dos constituintes puros(-) sem tratamento e com a
primeira derivada: a) Lactose, b) Amido e c) NaHCO
3
.

6-2 Construo das Cartas de Controle Multivariada

Para a construo das cartas de controle, primeiramente, realizou-se o
pr-processamento dos dados. Para os conjuntos de espectros de calibrao,
validao e placebo (povidona, croscarmelose sdica, lactose, estereato de
magnsio e lauril sulfato), utilizou-se a primeira derivada.
a)
b)
c)
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66

Figura 32: A) Espectros NIR do medicamento Nimesulida sem pr-processamento;
B) Espectros NIR do medicamento Nimesulida com 1 derivada.

Aps isso, realizou-se uma Anlise de Componentes Principais (PCA) da
matriz placebo para a construo do espao dos interferentes no qual foram
utilizadas duas componentes principais. Atravs do PCA consegue-se explicar
99,98% da varincia total dos dados. Construdo o espao dos interferentes,
dividiram-se os espectros dos dados em trs constituintes: NAS, interferente e
resduos, com o intuito de realizar a construo das cartas de controle. Para
isso, utilizou-se das equaes 40, 44 e 45. A figura 33 apresenta os sinais
referentes ao NAS, interferentes e resduos da amostra 15 .

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67

Figura 33: Diviso espectral em NAS, Interferente e Resduos.

Aps a etapa da diviso espectral de todas as amostras, foi necessrio
calcular os limites de confiana para cada carta. Para isso, utilizaram-se
somente as amostras sob controle -19 amostras escolhidas para a calibrao.
O limite de confiana para a carta resduo foi feito de acordo com a equao
47, obtendo-se o valor de 2,38x10
-6
, considerando 95% de confiana. Para a
carta interferente, o limite de confiana foi calculado conforme a equao 43,
obtendo-se o valor de 7,5.
Utilizando-se da carta NAS, foram determinados os limites de confiana
inferior e superior de concentrao de Nimesulida nas amostras, estipulados
em 22,35% (m/m) e 27,13% (m/m), respectivamente, levando-se em conta a
farmacopia USP
2
que considera a variao de 10% da concentrao do
princpio ativo no medicamento comercial , que de 24,83%(m/m). Amostras
que possuem concentrao entre esses limites esto dentro do controle em
relao a essa varivel. Pensando em um modelo pseudo-univariado, podem-
se entender esses limites como valores de NAS. Assim sendo, esses limites
so 5,26x10
-4
e 6,53x10
-4
. Entretanto, nesse caso, esses limites esto em
valores de NAS, e no mais de concentrao. A figura 34 mostra a relao
entre a concentrao de Nimesulida e o valor de NAS. As linhas horizontais e
verticais que passam pelos pontos dos grficos demarcam os limites superior e
inferior.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
68

Figura 34: Valor do NAS vs Nimesulida (% (m/m)) para as amostras da figura 19.


A figura 35 abaixo mostra as cartas de controle desenvolvidas. Como
todas as 19 amostras esto dentro de controle (amostras que foram escolhidas
para a calibrao), os valores de NAS, interferente e resduos desses
medicamentos esto dentro dos limites estabelecidos pelas trs cartas
representados pelas linhas vermelhas nas figuras 35, 36 e 40.




Figura 35: Cartas de controle a) NAS; b) Interferentes e c) Resduos.

(a)
(b)
(c)
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69
6-3 Validao das Cartas de Controle Multivariadada

Outra etapa do trabalho foi avaliar nessas cartas novas amostras que
estavam dentro e fora de controle. Na figura 36 utilizaram-se 70 amostras para
essa tarefa, das quais as 50 primeiras so as amostras de validao mostradas
na figura 29. Nota-se, pela figura 36, que todas essas amostras esto fora dos
limites da carta NAS, o que est de acordo com o esperado, pois essas
amostras foram preparadas em laboratrio com concentraes diferentes da
faixa de calibrao (22,35% a 27,13%). Dessa forma, verificou-se com essa
metodologia que 25 amostras esto fora do limite superior e 25, fora do limite
inferior, o que est de acordo com o planejamento realizado.
Considerando a carta interferente para essas amostras, pode-se inferir
que as amostras 1, 11, 21, 22, 29, 36 e 42 esto fora de controle, o que pode
ser explicado pelo fato de que as amostras 1, 11, 21, 22, 29 e 36 possurem
uma concentrao de lactose maior do que a faixa de concentrao de lactose
do modelo , enquanto a amostra 42 possui uma concentrao de lactose menor
do que a do modelo construdo.

Figura 36: Cartas de controle com novas amostras a) NAS; b) Interferentes e c) Resduos.
(a)
(b)
(c)
1
11 21 22 29 36
42
1 4
7
19 21
29
32
35
36
40
44
50
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70


Figura 37: Vetores interferentes para as amostras sob controle (-) e para amostras 1, 11, 21,
22, 29, 36 e 42 que esto fora de controle(-).

Na figura 37 mostrado os vetores relativos aos interferentes das
amostras sob controle e das amostras 1, 11, 21, 22, 29, 36 e 42 fora de
controle, assinaladas na parte b da figura 36. Nota-se nesse grfico que h
vrias regies espectrais com intensidades diferentes entre as amostras dentro
e fora de controle. No foi mostrado o espectro dos interferentes das novas
amostras que esto dentro de controle, pois dificultaria a visualizao do
espectro das amostras que esto fora de controle.
No que refere-se carta resduos, as amostras 1, 4, 7, 19, 21, 29, 32,
35, 36, 40, 44 e 50, assinaladas na parte c da figura 36 esto fora de controle.
Isso significa que essas amostras no foram modeladas adequadamente, pois
a diferena entre os valores previstos e os de referncia esto acima do
resduo padro estipulado no modelo. Investigando essas amostras, descobriu-
se que essas no foram submetidas ao moinho. Dessa forma, pode-se
considerar a hiptese de que essas amostras no so homogneas e que
possuem diferentes tamanhos de partculas entre os constituintes presentes.
Essa hiptese pode ser considerada uma vez que, antes de as amostras serem
submetidas ao NIR, os constituintes dos medicamentos tiveram de ser
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
71
homogeneizados por meio de vrtex, moinho e almofariz, pois os tamanhos
das partculas dessas diversas substncias so diferentes. O vrtex foi usado
com o objetivo de misturar as partculas dos diferentes constituintes, enquanto
o almofariz e o moinho foram utilizados com o intuito de triturar os slidos para
que essas partculas tenham aproximadamente a mesma granulometria. As
duas tarefas juntas tm como objetivo homogeneizar as misturas sintticas e,
conseqentemente, reduzir o espalhamento da luz no momento da aquisio
dos espectros. Logo, essas amostras podem no ter ficado homogneas, o que
explica os valores fora do limite na carta resduo. Isso pode ser visualizado nas
figuras 38 e 39 pela diferena espectral entre essas amostras e aquelas que
esto dentro de controle.


Figura 38: Vetores resduos para as amostras de calibrao (-) e das amostras 1, 4, 7, 19, 21,
29, 32, 36, 40, 44 e 50 (-).

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
72

Figura 39: Vetores resduos para regio 4250-4650(cm
-1
) da figura 38.

Outro fato notado que essas amostras foram feitas com massa total de
2g e em dias diferente daqueles das amostras de controle. Todas amostras em
controle foram pesadas com massa total 4g. Devido falta de reagentes foi
necessrio diminuir a massa total para 2g. Isso pode tambm ter influenciado
nos altos valores de Q obtidos. As amostras 51 a 70 so classificadas como
sob controle, pois, em todas as cartas, essas possuem valores dentro dos
limites estipulados. Isso est de acordo com o esperado, porque essas
amostras foram preparadas com os mesmos interferentes das amostras em
controle e com concentrao dentro da faixa de 10% do valor estipulado para
o medicamento comercial. Alm do mais, pode-se dizer que essas amostras
so homogneas, pois no esto fora de controle nas cartas interferente e
resduo. Alm disso, todas essas amostras foram preparadas da mesma forma
que as amostras de controle, ou seja, no mesmo dia, quantidade, tempo de
agitao e homogeneizao.
As ltimas amostras da figura 36-amostras 51 70 so as 20 amostras
que foram feitas dentro da faixa de concentrao do princpio ativo
(Nimesulida) estabelecido na calibrao e com o mesmo excipiente das
amostras da figura 19. Alm disso, da mesma forma e modo de preparo das
amostras de calibrao. Nota-se pela figura 36 que em todas as cartas essas
foram assinaladas dentro dos limites estabelecidos.Logo, pode-se concluir que
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
73
essas amostras esto dentro de controle o que tambm est de acordo com o
planejamento realizado mostrado na figura 29.
Em seguida, com o intuito de estudar o espao dos interferentes, foi feita
uma nova validao envolvendo mais 14 amostras de constituio idntica
citada acima, exceto pelo fato de que em quatro delas foi adicionado amido e
nas outras dez, NaHCO
3
, diferena essa que tem como objetivo confirmar que
o modelo, do ponto de vista do interferente, funciona adequadamente. Os
resultados obtidos esto mostrados na figura 40, a seguir.

Figura 40: Cartas de controle: amostras sob controle () e amostras de validao (*).
a) NAS; b) Interferentes e c) Resduos.

Pode-se notar pela figura 40 que todas as amostras de validao esto
fora do limite estipulado nas cartas interferentes e resduos, portanto esto fora
de controle, uma vez que essas tiveram acrscimo de amido e de NaHCO
3
, os
quais no esto presentes nas amostras de controle. As quatro primeiras
amostras tiveram acrscimo de amido. Nota-se pela carta NAS que essas
amostras esto dentro dos limites estabelecidos pela calibrao. Isso est de
acordo com o planejamento realizado, pois todas essas amostras foram feitas
com concentraes dentro da faixa de controle. Considerando ainda a carta
NAS, as prximas dez amostras tiveram acrscimo de NaHCO
3
. Pela anlise
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
74
de referncia, sete amostras foram feitas com concentrao fora dos limites
estipulados pela carta NAS e somente trs, dentro do limite estipulado pela
carta NAS. Isso tambm est de acordo com os resultados obtidos, o que
confirma mais uma vez a eficincia do modelo.
Analisando as figuras 41 e 42 abaixo, nota-se que os vetores
interferentes das amostras que possuem amido e NaHCO
3
so diferentes dos
vetores interferentes das amostras sob controle. Isso refere-se ao fato da
existncia de novas espcies (Amido e NaHCO
3
) nessas amostras o que
reflete na mudana dos espectros de infravermelho prximo para essas
amostras.Dessa forma, o modelo consegue identificar que essas amostras
possuem algum constituinte diferente nesse espao.

Figura 41: Vetores interferentes.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
75

Figura 42: Vetores interferentes para regio 4000-6000 (cm
-1
) da figura 41.

No que se refere aos resduos para essas novas amostras submetidas
ao modelo, nota-se pela figura 43, a presena de novos picos, principalmente,
na regio entre 5000-6000 (cm
-1
). Isso pode ser explicado por vrios fatores,
entre os quais esto as caractersticas de absoro de compostos no
modelados pelo espao dos interferentes, ou parte do vetor NAS, os quais
ocasionam, em muitos casos, mudanas de pico caractersticos na regio do
infravermelho
28
. A causa exata desses picos difcil de ser identificada, mas o
resultado obtido eficaz para diferenciar amostras que possuem constituintes e
modo de preparo diferentes daqueles do modelo construdo.













Figura 43: Vetores resduos.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
77






CAPTULO 7

CONCLUSES


















Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
78
A determinao de Nimesulida em medicamento genrico foi realizada
atravs de espectroscopia no infravermelho prximo, regresso por mnimos
quadrados parciais (PLS), juntamente com a determinao do NAS (Sinal
Analtico Lquido) para validar o modelo construdo atravs do clculo das
figuras de mrito e das cartas de controle multivariada. Em relao ao clculo
das figuras de mrito atravs do sinal analtico lquido, conseguiu-se obter,
para os valores de limites de deteco, como de quantificao, resultados
inferiores ao que se refere a concentrao de Nimesulida presente nos
medicamentos o que torna o modelo eficaz em relao a esse requisito.O
modelo pode tambm ser considerado exato e eficiente tanto para a calibrao
como para a previso, pois possuem valores de RMSEC, RMSECV, RMSEP,
R
validao
, R
calibrao
, ajuste(PLS e NAS) e erros segundo a ASTM aceitveis
para quantificao de Nimesulida, ou seja, alta correlao e baixos erros.O
modelo apresentou um alto valor da relao sinal/rudo o que torna o modelo
eficaz para discernir o que rudo e o que sinal das amostras do sinal
instrumental.Tambm o modelo consegue diferenciar valores muito baixos de
concentrao, entre os medicamentos, representado pelo seu reduzido valor do
inverso da sensibilidade analtica (0,2%).
Pode-se afirmar tambm que, com a utilizao do NAS, consegue-se
construir modelos de calibrao multivariada em uma forma pseudo-univariada,
conforme mostrado nas figuras 16 e 24, tornando os modelos de calibrao
multivariada mais prticos em termos de visualizao, pois se consegue
relacionar diretamente o valor da concentrao da Nimesulida com o sinal
instrumental, de forma semelhante ao que se realiza em modelos de calibrao
univariada.
A utilizao do NAS, no desenvolvimento desta dissertao, foi de
fundamental importncia para validao e caracterizao de modelos de
calibrao multivariada, conforme mostrado na tabela 1.Em relao aos
resduos para as amostras comerciais encontrou-se valores de 3 %, 5,5 % e
6,7 % que esto dentro dos valores aceitos pela farmacopia USP.Ento,
pode-se inferir que a metodologia descrita nessa dissertao vlida para
determinao de Nimesulida em formulaes farmacuticas.
No que se refere s cartas de controle de qualidade, foi possvel
demonstrar um novo mtodo multivariado para controle de qualidade na qual o
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
79
espectro do medicamento dividido em trs contribuies independentes: NAS
(analito), interferente e resduo. Ento foi desenvolvido trs cartas de controle
para cada contribuio e calculado os limites de controle para cada carta.
Atravs dessas cartas de controle multivariadas foi possvel identificar as
amostras que estavam dentro e fora de controle. Obteve-se 64 amostras fora
de controle e 20 amostras dentro de controle de acordo com o planejamento
experimental realizado.Sendo assim, foi possvel identificar, de forma
qualitativa, as amostras que estavam dentro e fora de controle.
Logo, a dissertao desenvolvida sugere um novo mtodo analtico que
pode ser usado para controle de qualidade em frmacos, principalmente, no
que se refere ao controle da homogeneidade dos constituintes.


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81





CAPTULO 8




REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS













Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
82
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Captulo 1- Introduo

1. PLUGGE, W.; VLIES, C. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis. 1996, 14, p. 891-898.
2. LANGKILDE, F. W; SVANTESSON, A. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. 1995, 13, p. 409-414.
3. HAN, S. M; FAULKNER, P. G. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. 1996, 14, p. 1681-1689.
4. FRAKE, P.; GREENHALGH, D.; GRIERSON, S. M.; HEMPENSTALL, J. M.;
RUDD, D. R. International Journal of Pharmaceutics. 1997, 151, p. 75-80.
5. DUONG, N.-H.; ARRATIA, P.; Muzzio, F. J.; LANGE, A.; TIMMERMANS, J.;
REYNOLDS,S. Drug Development and industrial Pharmacy. 2003, 29, p.
679-687.
6. GOTTFRIES, J.; DEPUI, H.; FRANSSON, M.; JONGENEELEN, M.;
JOSEFSON, M.; LANGKILDE, F. W.; WITTE, D. T. Journal of Pharmaceutical
and Medical Analysis. 1996, 14, p. 1495-1503.
7. PLUGGE, W.; VAN der Vlies, C. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. 1993, 11, p. 435-442.
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9. PASQUINI, C. Journal of the Brazilian Chemical Society. 2003, 14, p.
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10. DONOSO, M.; KILDSIG, D. O.; GHALY, E. S. Pharmaceutical
Development and Technology. 2003, 8, p. 357-366.
11. FVOTTE, G., Calas, J.; PUEL, F.; HOFF, C. International Journal of
Pharmaceutics. 2004, 273, p. 159-169.
12- http://www.rxlist.com/cgi/generic/cetiriz.htm, acessada em Agosto 2006.
13- http://www.gtamart.com/mart/products/chemical/mgi2.htm, acessada em
Abril 2007.
14- Berntsson, O. Characterization and Application of Near Infrared
Reflection Spectroscopy for Quantitative Process Analysis of Powder
Mixtures. Kungliga Tekniska Hgskolan (KTH), Stockholm, Sweden, 2001.
Tese (doutorado).

Captulo 2- Mtodos Quimiomtricos

1- KALIVAS,J.H. Analytical Letters. 2005, 38 , p. 2259-2279.
2- BRERETON, R. G.; Analyst. 2000, 125, p. 2125.
3- MILLER, J. N.; MILLER, J. C.; Statistics and Chemometrics for Analytical
Chemistry, 4 ed., Prentice Hall, United Kingdom, 2000.
4- SAVITSKY, A; GOLAY, M. J. E. Analytical Chemistry. 1964, 36, p. 1627-
1639
5- MALEKI, M. R.; MOUAZEN, A. M.; RAMON, H. Biosystems Engineering,
2007, 96, p. 427-433.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
83
6- RAWLINGS, O. J. Applied Regression Analysis-A Research Tool,
Wadsworth & Brooks/Cole Advanced Books & Software, Pacific Grove,
Califrnia, 1988.
7- MARTENS, H.; NAES, T. Multivariate Calibration. Wiley, New York, 1989.
8- GELADI, P.; KOWALSKI, B. Partial Least-Squares Regression: A Tutorial.
Analytical Chimica Acta. 1986, 185, p. 1.
9- ANDERSSON, M.; FOLESTAD, S.; GOTTFRIES, J., Johansson, M. O.;
JOSEFSON, M.; WAHLUND, K. G. Analytical Chemistry, 2000, 72, p. 2099-
2108.
10- ESCANDAR, G.M.; DAMIANI, P. C; GOICOECHEA, H. C. Microchemical
Jornal, 2006, 82, p. 29-42.
11- FOULK, S. American Laboratory, 2005, p. 37.
12- Otto, M. Chemometrics. Wiley, Weinheim, 1999.
13- VANDEGNISTE, B. G. M.; MASSART, D. L.; BUYDENS, L. M. C.; Jong, S.;
LEWI, P. J.; VERBEQUE, J.S. Handbook of Chemometrics and Qualimetrics
- Part B, Elsevier, Amsterdam, 1998.
14- Annual Book of ASTM Standards Predctices for Infrared, Multivariate,
Quantitative Analysis, ed. 1655, v. 03/06, ASTM International, West
Conshohocken, Pennsylvania, USA, 2000.
15- PIEMA, J. A. F., L; DASZYKOWSKI, M.; WAH, F., MASSART, D. L.
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2003, 68, p. 17.
16- PELL, R. J., Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2000,
52, p. 87.
17- WALCZAK, B.; MASSART, D. L. Chemometrics and Intelligent
Laboratory Systems. 1998, 41, p. 1.
18- BARTHUS, R.C. Aplicao de Mtodos Quimiomtricos para Anlises
de Controle de Qualidade de leos Vegetais Utilizando Espectroscopia no
Infravermelho e Raman. 1999. Tese (mestrado).
19- LORBER , A., Analytical Chemistry,1986, 58, p. 1167.
20- BRAGA, J. W. B.; POPPI, R. J.; Journal of Pharmaceutical Science.
2004, 93, p. 2124.
21- JONG, S. Simpls. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems.
1993, 18, p. 251-263.
22- BRAGA, J. W. B.; POPPI, R. J.; Qumica Nova. 2004, 27, p. 1004.

Captulo 3- Validao de Modelos de Calibrao Multivariada
atravs do Clculo de Figuras de Mrito

1- Eurachem/ Citac- Work Group. Guide of Quality in Analytical Chemistry
An Aid to Accreditation, 2002.
2- International Conference on Harmonization, ICH Harmonised Tripartite
Guideline Validation of Analytical Procedures: Metodology. 1997, 62, p.
27463.
3- International Conference on Harmonization, ICH Harmonised Tripartite
Guideline Text on Validation of Analytical Procedures.1995, 60, p. 11260.
4- Annual Book of ASTM Standards - Practices for Infrared Multivariate
Quantitative Analysis, vol. 03/06, 2000.
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
84
5- Pharmaceutical Analytical Sciences Grup (PASG). Guidelines for the
Development and Validation of Near Infrared (NIR) Spectroscopic
Methods. http://www.pasg.org.uk.
6- Eurachem/ Citac- Work Group. Quantiftying Uncertainty in Analytical
Measurement. 2 ed., 2000.
7- MIRMOHSENI, A.; ABDOLLAHI, H.; ROSTAMIZADEH, K. Analytica
Chimica Acta. 2007, 585, p. 179-184.
8- REN, M.; ARNOLD, M. A. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007,
387, p. 879-888.
9- BLANCO M; CASTILLO, M; PEINADO, A. Analytica Chimica Acta. 2007,
581, p. 318-323.
10- VALDERRAMA, P.; BRAGA, J. W. B.; POPPI, R. J. Journal of the
Brazilian Chemical Society. 2007, 18, p. 259-266.
11- KAUFFMAN, J. F.; DELLIBOVI, M.; CUNNINGHAM, C. R. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007, 43, p. 39-48.
12- Pure and Applied Chemistry. 2006, 78, p. 633661.
13- GABRIELSSON, J.; TRYGG, J. Critical Reviews in Analytical
Chemistry, 2006, 36, p. 243-255.
14- BURNS, D. A., CIURCZAK, E. W. Handbook of Near-Infrared Analysis,
Marcel Dekker, New York, 2001.
15- MOFFAT, A. C.; TRAFFORD, A. D.; JEE, R. D.; GRAHAM, P.; Analyst
2000, 125, p. 1341.
16- LAASONEN, M.; PULKKINEN, T. H.; SIMARD, C.; RASANEN, M.;
VUORELA, H.; Analytical Chemistry, 2003, 75, p. 754.
17- LORBER, A., Analytical Chemistry, 1986, 58, p. 1167-1172.
18- FERR, J.; BROWN, S. D.; RIUS, F. X.; Journal of Chemometrics. 2000,
15, p. 537.
19- RODRIGUEZ, L. C.; Campan, A. M. G.; Linares, C. J.; Ceba, M. R.
Analytical Letters, 1993, 26, p. 243.
20- PENA, A.M.; MANSILLA, A. E.; VALENZUELA, M. I. A; GOICOECHEA, H.
C., OLIVIERI, A. C., Analytica Chimica Acta, 2002, 463, p. 75.
21- VESSMAN, J.; STEFAN, R. I.; STADEN, J. F.,
DANZER, K.; LINDNER, W.; BUMS, D. T.; FAJGELJ, A.; MULLER, H. Pure
and Applied Chemistry, 2001, 73, p. 1381.

CAPTULO 4 - Cartas de Controle Multivariadas

1- NIJHUIS, A.; JONG, S.; VANDEGINSTE, B. G. M.;Chemometrics and
Intelligent Laboratory Systems, 1999, 47, p. 107-125.
2- . BARTHUS, R. C.; POPPI, R. J. Spectroscopy Letters, 2002, 35, p. 729-
739.
3- NIJHUIS, A.; JONG, S.; VANDEGINSTE, B. G. M. Chemometrics and
Intelligent Laboratory Systems, 1997, 38, p. 51-62.
4- SKIBSTED, E. T. S.; WESTERHUIS, J. A.; BOELENS, H. F.; SMILDE, A. K.;
WITTE, D. T. Applied Spectroscopy. 2004, 58, p. 264-271.
5- RAMAKER, H. J.; SPRANG, N. M. Statistical Batch Process Monitoring.
University of Amsterdam, Process Analysis & ChemometricsGroup, 2004. Tese
(doutorado)
Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
85
6- SEKULIC, S. S.; WARD, H. W.; BRANNEGAN, D. R.; STANLEY, E. D.;
EVANS, C. L.; SCIAVOLINO, S. T.; HAILEY, P. A.; ALDRIDGE, P. K.
Analytical Chemistry, 1996, 68, p. 509-513.
7- SKIBSTED, E. T. S.; BOELENS, H. F. M.; WESTERHUIS, J. A.; SMILDE A.
K.; BROAD, N. W.; REES, D. R., Witte; D. T. Analytical Chemistry. 2005, 77,
p. 7103 - 7114;
8- PLUGGE, W.; VLIES, C. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis. 1996, 14, p. 891-898.
9- Langkilde, F. W; Svantesson, A. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. 1995, 13, p. 409- 414.
10- HAN, S. M; FAULKNER, P. G. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. 1996, 14, p. 1681-1689.
11- FRAKE, P.; GREENHALGH, D.; GRIERSON, S. M.; HEMPENSTALL, J. M.;
RUDD, D. R. International Journal of Pharmaceutics. 1997, 151, p. 75-80.
12- DUONG, N. H.; ARRATIA, P.; MUZZIO, F. J.; LANGE, A.; TIMMERMANS,
J.; REYNOLDS, S. Drug Development and Industrial Pharmacy. 2003, 29, p.
679-687.
13- GOTTFRIES, J.; DEPUI, H.; FRANSSON, M.; JONGENEELEN, M.;
LANGKILDE, F. W.; WITTE, D. T. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis. 1996, 14, p. 1495-1503.
14- PLUGGE, W.; VLIES, C. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis. 1993, 11, p. 435-442.
15- LORBER, A. Analytical Chemistry. 1986, 58, p. 1167-72.
16- MARTENS, H.; NAES, T. Multivariate Calibration. John Wiley & Sons,
Chichester, 1989.
17- WOLD, S.; ESBENSEN, K. H.; GELADI, P. Chemometrics and Intelligent
Laboratory Systems. 1987, 2, p. 37-52.
18- LORBER, A.; FABER, N. M.; KOWALSKi, B. R. Analytical Chemistry.
1997, 69, p. 1620-1626.
19- MILLER, J. N.; MILLER, J. C. Statistics and Chemometrics for Analytical
Chemistry. Prentice Hall, New York, 2000.
20- JACKSON, J. E.; MUDHOLKAR, G. S. Technometrics. 1979, 21, p. 341-
49.

CAPTULO 5- DETERMINAO DE NIMESULIDA EM
MEDICAMENTOS ATRAVS DO CLCULO DE FIGURAS DE
MRITO E DE ESPECTROSCOPIA NO INFRAVEREMELHO
PRXIMO

1 WISE, B. M.; GALLAGHER, N. B.; BRO, R. SHAVER, J. M.; WINDIG, W.
PLS Toolbox 3.5 For Use With Matlab. Manson, WA, Eigenvector Research
Inc. 2005.
2- KENNARD, R.W.; Stone, L. A., Technometrics, 1969, 11, p. 137148.
3- The United States Pharmacopoeia. 25 ed. rev., U.S.P. Convention,
Rockville, 2002.
4- GOICOECHEA, H. C.; OLIVIER, A. C.; Chemometrics and Intelligent
Laboratory Systems. 2001, 56, p. 73.

Wrickson Fortunato de Carvalho Rocha Dissertao de Mestrado
86
CAPTULO 6- CONTROLE DE QUALIDADE DO FRMACO
NIMESULIDA EM MEDICAMENTO ATRAVS DE CARTAS DE
CONTROLE MULTIVARIADA E DE ESPECTROSCOPIA NO
INFRAVERMELHO PRXIMO

1- SKIBSTED, E. T. S., BOELENS, H. F. M.; WESTERHUIS, J. A., A. K.
SMILDE, N. W.; BROAD, D. R.; WITTE, D. T. Analytical Chemistry. 2005, 77,
p. 7103 - 7114;
2- The United States Pharmacopoeia. 25 ed. rev., U.S.P. Convention:
Rockville, 2002.

CAPTULO 7- CONCLUSES