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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMTICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA LABORATRIO DE ELETROFORESE CAPILAR CURSO DE GRADUAO

EM BACHARELADO EM QUMICA

OTIMIZAO DA SEPARAO ELETROFORTICA DE FLAVONIDES EM EXTRATOS VEGETAIS E COSMTICOS

Michelle Barcellos

Orientador: Prof. Gustavo Amadeu Micke

Florianpolis Novembro, 2008

MICHELLE BARCELLOS

OTIMIZAO DA SEPARAO ELETROFORTICA DE FLAVONIDES EM EXTRATOS VEGETAIS E COSMTICOS

Trabalho de Concluso de Curso apresentado ao Curso de Graduao em Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial obteno do ttulo de Bacharel em Qumica.

Florianpolis 2008

AGRADECIMENTOS

Universidade Federal de Santa Catarina; Ao meu orientador, Prof. Dr. Gustavo Amadeu Micke, pela oportunidade oferecida e por todo incentivo e confiana no presente trabalho; Aos professores da banca examinadora; Aos professores e demais funcionrios do Departamento de Qumica da UFSC, pela convivncia estabelecida nestes anos; empresa Farmaservice Bioextract Ltda., pelo acompanhamento nas pesquisas e fornecimento de amostras; Ao Professor Doutor Moacir Geraldo Pizzolatti pelo fornecimento dos padres; Ana Carolina pelo convvio e pelas melhorias propostas ao trabalho; Aos amigos do laboratrio, Mel, Marcel e Kaline, por toda ajuda prestada e por tornarem esta experincia muito mais interessante; Aos meus pais, Nando e R, que foram o alicerce para a construo dos meus sonhos, sempre com muito amor, fora e carter. Amo vocs!; Ao meu irmo Gui, pela amizade, alegria e amor que nos une; Ao meu namorado Marcio, por todo apoio, amor e carinho durante esta etapa da minha vida, e por me ensinar a ter segurana, confiana e perseverana; s minhas avs, Kathy e Marlene, por fazer de meus sonhos, os seus sonhos; s minhas madrinhas, Irene e Dia, que me apoiaram e me encheram de boas energias para prosseguir com beleza esta caminhada; toda minha famlia que sempre unida me ensinou muito sobre convivncia, responsabilidade, harmonia e muita felicidade. Que venham as comemoraes! Marcia que cuidou da minha espiritualidade e de meus medos, e ao Jorge que sempre me estampou uma boa risada; Aos meus amigos inicos, Clari, Patty e Tuim, por toda afinidade, pelas alegrias vividas, ajudas trocadas e torcidas; Aos meus amigos da vida, F, Como, Marcelo, Ogo, Bruna, Dyeson, L, Fran, Danielsio, ...que compartilharam esses anos de estudos e expectativas e tornaram esta caminhada muito mais agradvel; Que fique registrado meu mais profundo agradecimento!

"No podemos fazer muito sobre a extenso de nossas vidas, mas podemos fazer muito sobre a largura e a profundidade delas."
Evan Esar

RESUMO

O presente estudo consiste na elaborao de uma metodologia analtica utilizando eletroforese capilar para determinao de flavonides em extratos de origem vegetal e produtos cosmticos. Estes biocompostos so metablitos

secundrios, ou seja, so compostos utilizados nas funes vitais dos organismos vegetais, estando presentes, de forma combinada, em espcies do reino vegetal com o intuito de proteger o organismo das intempries e da ao degradativa de outros seres vivos. Dentro do corpo humano os flavonides atuam em uma srie de processos biolgicos ligados produo de radicais livres, isto porque sua estrutura possibilita diminuir a formao destes radicais, o que lhe confere uma ao antioxidante. Para otimizao do mtodo de separao e identificao destes compostos, foram promovidos diversos testes para a escolha da composio do eletrlito de corrida. Aps os testes preliminares, foram estabelecidas as

faixas de Tetraborato de Sdio (TBS) e metanol para a composio do eletrlito, seguido de um planejamento sistemtico e tratamentos matemticos, que nos apresentaram a condio tima de 25 mmolL-1 de TBS e 14% de metanol para a separao dos flavonides. O mtodo foi ento aplicado a extratos vegetais de origem comercial de camomila (Matricaria chamomilla), hiprico (Hypericum perforatum) e passiflora (Passiflora incarnata); extratos vegetais de Tmitu-pinheirinho (P. Sabulosa), extratos de folhas e flores de maracuj amarelo (Passiflora edulis) e maracuj doce (Passiflora alata) e de dois cremes de uso contnuo, contendo extrato de Passiflora Alata.

Palavras chaves: flavonides, tetraborato de sdio, eletroforese capilar, extratos vegetais, cosmticos.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Estrutura bsica dos flavonides___________________________ 14 FIGURA 2: Estrutura da miricetina____________________________________15 FIGURA 3: Estrutura da quercetina___________________________________15 FIGURA 4: Representao esquemtica de um equipamento de eletroforese capilar__________________________________________________18 FIGURA 5: Representao esquemtica do fluxo eletroosmtico normal_______19 FIGURA 6: Representao do fluxo eletroosmtico em funo do pH_________20 FIGURA 7: Representao das condies de anlise para nions____________20 FIGURA 8: Estrutura do kaempferol___________________________________24 FIGURA 9: Eletroferogramas de diferentes concentraes de TBS. Condies experimentais: eletrlito constitudo de 5, 10, 20, 30 e 40 mmolL-1 de TBS; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm________________24 FIGURA 10: Eletroferogramas dos diferentes teores de metanol e acetonitrila. Condies experimentais: eletrlito constitudo de 30 mmolL-1 de TBS e teores de 0 a 40% de metanol e 0 a 40% de acetonitrila; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm__________________________25 FIGURA 11: Eletroferogramas comparativo entre 20% de metanol e 20% de acetonitrila. Condies experimentais: eletrlito constitudo de 30 mmolL1

de TBS e teores de 20% de metanol e 20% de acetonitrila; injeo

hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_________________________26 FIGURA 12: Resultados do planejamento sistemtico para o grupo A de flavonides. Condies experimentais: eletrlito constitudo conforme descrito nas figuras; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_____________27 FIGURA 13: Resultados do planejamento sistemtico para o grupo B de flavonides. Condies experimentais: eletrlito constitudo conforme descrito nas figuras; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_____________28

FIGURA 14: Janela de resoluo da macro e resultado numrico do planejamento fatorial_________________________________________________29 FIGURA 15: Resultado grfico do planejamento fatorial____________________29 FIGURA 16: Eletroferograma da mistura de padres dos flavonides no mtodo otimizado. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL1

de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s;

tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm____________________________________________________30 FIGURA 17: Grfico de correlao entre as mobilidades dos flavonides previsto pela Equao 2 e obtido experimentalmente____________________30 FIGURA 18: Figura comparativa da separao de flavonides antes e depois do processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_______________________________________________31 FIGURA 19: Separao de flavonides antes e depois do processo de hidrlise para as flores da espcie P. Sabulosa. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm________________________32 FIGURA 20: Separao de flavonides das folhas da espcie P. Sabulosa, antes e depois do processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm__________________________33 FIGURA 21: Separao de flavonides antes e depois do processo de hidrlise para os galhos da espcie P. Sabulosa. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm__________________________33 FIGURA 22: Comparao dos eletroferogramas para o extrato de camomila antes e aps o processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo

hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm__________________________34 FIGURA 23: Eletroferogramas comparativos para a anlise do extrato de hiprico antes e aps o processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_________________________35 FIGURA 24: Comparao dos eletroferogramas antes e aps a hidrlise extrato de passiflora. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL1

de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s;

tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm___________________________________________________35 FIGURA 25: Anlise eletrofortica das folhas da P. Edulis. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_________________________36 FIGURA 26: Separao dos flavonides das flores da espcie P. Edulis. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_____________36 FIGURA 27: Anlise comparativa da folhas jovens e velhas da espcie P. Alata. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm________37 FIGURA 28: Separao dos compostos presentes nas flores da espcie P. Alata. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm________38 FIGURA 29: Anlise comparativa das flores da espcie P. Alata. Flores abertas (A), flores fechadas (B), brotos grandes (C) e brotos pequenos (D). Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm________38

FIGURA 30:

Anlise comparativa dos cremes de uso contnuo, adicionados de

estrato de P. Alata. Creme dia (A) e creme noite (B). Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL-1de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm_____________39

LISTA DE EQUAES

EQUAO 1: Mobilidade efetiva experimental_____________________________28 EQUAO 2: Mobilidade efetiva _______________________________________29

LISTA DE TABELAS

TABELA 1:Correlao dos sinais atribudos s concentraes das espcies_____26 TABELA 2: Descrio dos experimentos planejados________________________26 TABELA 3: Diviso dos grupos para os experimentos do planejamento fatorial___27

SIGLAS E ABREVIATURAS

TBS Tetraborato de sdio UV/VIS Ultravioleta/visvel ABIHPEC Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos ERMO - Espcies reativas do metabolismo do oxignio CLAE - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia CG - Cromatografia Gasosa EC - Eletroforese Capilar CCD - Cromatografia em Camada Delgada CFS - Cromatografia de Fluido Supercrtico CCCAE - Cromatografia em Contra Corrente de Alta Eficincia ECZ - Eletroforese Capilar de Zona FEO Fluxo eletrosmtico ECSL Eletroforese Capilar em Soluo Livre DMSO - Dimetilsulfxido ef Mobilidade efetiva Ldet - Comprimento do capilar at o detector LTot - Comprimento total do capilar V - Potencial estabelecido durante a anlise tm - Tempo de migrao do analito t0 - Tempo de migrao do FEO

SUMRIO

1. INTRODUO 1.1. FLAVONIDES 1.2. ELETROFORESE CAPILAR 1.2.1. Instrumentao 1.2.2. Fluxo eletrosmtico 1.2.3. Eletroforese capilar de zona 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL 2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1. PREPARO DE PADRES 3.2. PREPARO DE AMOSTRAS 3.3. EQUIPAMENTOS 4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1. DESENVOLVIMENTO DO MTODO 4.2. APLICAO EM EXTRATOS E PRODUTOS COSMTICOS 4.2.1. Espcie polygala sabulosa 4.2.2. Extratos vegetais comerciais 4.2.3. Espcie passiflora edulis 4.2.4. Espcie passiflora alata 4.2.5. Extratos de cremes de uso contnuo 5. CONCLUSO REFERNCIAS

13 14 16 17 19 20 21 21 21 22 22 22 23 24 24 31 32 34 36 37 39 40 41

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1. INTRODUO

Os processos de oxidao do corpo humano ocorrem naturalmente durante a respirao. Essas oxidaes, no entanto, so multiplicadas pelos poluentes do ar, tabaco, radiao ultravioleta-visvel (UV/VIS) e alimentao rica em cidos graxos poliinsaturados, gerando assim uma srie de problemas pele e ao organismo1. Com o aumento da expectativa de vida do homem, veio tambm a preocupao em manter uma aparncia jovem por mais tempo e com uma menor agresso ao corpo2. Isto motivou a indstria de higiene pessoal, perfumaria e cosmticos a incentivar pesquisas na busca de compostos naturais com bioativos3. Esta mudana serviu no s como atrativo comercial, mas tambm como contribuio s polticas de no agresso natureza e s redes sociais envolvidas na fabricao. As vantagens apresentadas por esta mentalidade agradaram

tanto indstria quanto os consumidores. Isto porque os ingredientes naturais so biocompatveis, agindo sinergicamente sob vrios mecanismos, apresentando assim, maior atividade no organismo humano como um todo. Alm disso, estes compostos so menos agressivos ao corpo, diminuindo assim as chances de problemas causados por componentes de produtos cosmticos3, 4. Todas estas vantagens foram revertidas em lucros para o setor. Segundo o levantamento da Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos (ABIHPEC), este setor apresentou um crescimento mdio deflacionado de 10,9% nos ltimos 12 anos, superando o crescimento tanto do Produto Interno Bruto quanto das demais indstrias2. Este crescimento foi o responsvel pela terceira posio do Brasil no ranking Top Ten da Euromonitor, com um faturamento lquido de US$ 18,2 bilhes em 2006, e um crescimento mundial de 26,2%, o maior apresentado pelo setor. Hoje o Brasil conta com mais de 1590 empresas, sendo 15 delas de grande porte, com faturamento lquido acima dos R$ 100 milhes2. Este panorama possibilita um maior investimento em pesquisas e

desenvolvimento cientfico no ramo de fitocosmticos, que utilizam os efeitos sinrgicos de vrios compostos presentes em espcies vegetais na promoo de aes benficas sade e beleza humana. Dentre os compostos ativos estudados para a incorporao em produtos cosmticos cabe destacar os flavonides.

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1.1. FLAVONIDES

O grupo dos flavonides formado por mais de 4000 compostos naturalmente metabolizados pelo reino vegetal, como resultado da adaptao aos sistemas bitico e abitico sendo nomeados metablitos secundrios por no serem utilizados nas funes vitais das plantas5-6. So compostos de baixo peso molecular e composio polifenlica de estrutura bsica C6-C3-C6, formada por dois anis fenil (A e B) ligados entre si por um anel pirano (C), (Figura 1)1.

Figura 1: Estrutura bsica dos flavonides

Por ser uma classe de compostos ampla, seus integrantes so divididos em seis principais subclasses: antocianidinas, favanis, flavanonas, flavonis, flavonas e isoflavonas7, 11. Eles so ainda divididos quanto existncia ou no de aucares em suas estruturas, sendo chamados de agliconas quando no possuem ligao com molculas de acar e de flavonides glicosilados ou conjugados quando esto associadas a uma ou mais molculas de acar. Esta ligao pode ocorrer tanto no oxignio como no carbono. O que ocorre mais comumente a ligao com o oxignio nos grupos hidroxila dos carbonos 3 e 7, onde o flavonide chamado Oglicosdeo. J para as associaes com o carbono, o flavonide identificado como um C-glicosdeo com a ligao nos carbonos 6 e 86. Os flavonides foram descobertos em 1930, pelo prmio Nobel Szent-Gyrgy, com a extrao da citrina da casca do limo. Por apresentar propriedades semelhantes vitamina C, esta classe foi inicialmente chamada de vitamina C2, o que mudou em 1950 pela no caracterizao como vitamina1. Algumas destas propriedades farmacolgicas e bioqumicas no corpo humano so: atividades antiinflamatrias, protetoras cardacas, analgsicas, antialrgicas, anticancergenas, antidiabticas e antiviral. Em geral estas atividades esto diretamente ligadas ao poder antioxidante e estrutura dos flavonides5-7.

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Durante a produo de energia, nosso organismo reage com oxignio molecular que forma espcies reativas do metabolismo do oxignio (ERMO) atravs de reaes catalticas, como a reao de Fenton que a mais difundida por ser catalisada pelo ferro, metal mais abundante no organismo humano1, 9. Dentre as espcies formadas, o radical hidroxila, OH, o mais efetivo na formao de leses nas molculas celulares, como as paredes lipdicas e as estruturas do DNA10. Diante disto, ao longo da evoluo, as clulas vegetais desenvolveram mecanismos de defesa antioxidantes, como os exercidos pelos flavonides. Dentre os mecanismos podemos destacar a quelao do metal de transio, catalisador das reaes de formao das ERMO10 e a interceptao e neutralizao das cargas pela doao de H ionizveis. Alm disso, a presena de uma dupla ligao com oxignio em C4 e de grupos hidroxila no anel B e nas posies C3 e C5 aumentam a delocalizao eletrnica por toda molcula1. Com base nos mecanismos de defesa que estes compostos apresentam, podemos dizer que eles so considerados antioxidantes mais efetivos que as vitaminas C e E1,
8-9

, sendo a miricetina (Figura 2) e a quercetina (Figura 3) suas

duas molculas mais bioativas1.

Figura 2: Estrutura da miricetina

Figura 3: Estrutura da quercetina

Tais propriedades atribudas aos flavonides e sua aplicabilidade em indstrias farmacuticas e cosmticas mostram a necessidade de identificao, caracterizao e quantificao dos constituintes presentes nas misturas complexas existentes em matrizes vegetais. A confirmao dada pela literatura, que mostra mais de 300 artigos escritos entre os anos de 2000 e 2005 para fins medicinais ou de classificao cientfica6. A anlise destes compostos pode ser feita para as agliconas e para os flavonides glicosilados, porm na falta de padres que identifiquem estes ltimos, podemos comparar as anlises antes e depois do

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processo de hidrlise, onde todos os conjugados so convertidos agliconas, e a quantificao de ambos os tipos de flavonides torna-se possvel6. Como descrito nos artigos de reviso de Rijke e Molnr-Perl, os flavonides podem ser separados por diferentes tcnicas analticas, tais como: a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)12-19,29, a cromatografia gasosa (CG)16,20-22, a eletroforese capilar (EC)23-30, a cromatografia em camada delgada (CCD)6, alm de outras menos usuais como a cromatografia de fluido supercrtico (CFS) e a cromatografia em contra corrente de alta eficincia (CCCAE)31, associados a um ou mais mtodos de deteco acoplados aos equipamentos para identificao apropriada das molculas analisadas, sendo assim possvel a anlise de plantas, alimentos e fludos biolgicos6,11. Levando em considerao alguns aspectos da eletroforese capilar para anlises de diferentes matrizes, tais como a alta eficincia e resoluo, esta tcnica apresenta-se como uma ferramenta atrativa para o desenvolvimento de mtodos de anlise de flavonides em matrizes complexas30.

1.2. ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese uma tcnica de separao e identificao relativamente nova, fundamentada na migrao diferenciada de espcies neutras, inicas ou ionizveis, em uma soluo tampo, quando h aplicao de um campo eltrico32. Desenvolvida por Arne Tiselius na dcada de 30, em um estudo indito sobre separao das protenas do soro sanguneo, a nova tcnica rendeu ao qumico sueco o Prmio Nobel no ano de 1948, alm de incentivar a criao de diferentes mtodos de separao para nions, ctions, aminocidos, drogas, vitaminas, carboidratos, protenas, peptdeos, entre outros. A criao da tcnica gerou interesse para a indstria de biotecnologia em um projeto de larga escala que utilizou a eletroforese como ferramenta no sequenciamento do DNA no Projeto Genoma Humano32. A eletroforese no formato capilar realizada em tubos com dimenses capilares, foi uma soluo hbil para conter o efeito Joule, pois devido a fatores geomtricos (rea superficial interna grande comparada com o volume total do capilar), ocorre uma dissipao de calor bastante eficiente, favorecendo a aplicao de campos

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eltricos elevados (100 500 V/cm), que resultam em separaes de alta eficincia (da ordem de 105 pratos tericos)33,34. O primeiro a adotar a idia foi Hjrten em 1967 com o emprego de um tubo de quartzo de 300 m de dimetro e aplicao de 75 V/cm33,34. Mais tarde Jorgenson e colaboradores investigaram a viabilidade da EC ser utilizada como uma tcnica analtica instrumental ganhando, aps sua completa automatizao, o status de tcnica analtica de rotina33. A apresentao de boas resolues nas anlises e a grande versatilidade da tcnica (separao de molculas orgnicas, inorgnicas, macromolculas, etc.), foram os principais fatores de credibilidade durante sua criao. Alm disso, a tcnica se destaca pelo baixo consumo de amostras, reagentes e solventes (da ordem de nanolitros), a completa automao da anlise, alm da compatibilidade com sistemas de deteco utilizados para a cromatografia, que proporcionam um aumento da sensibilidade e reprodutibilidade da tcnica 32-35. No que diz respeito anlise de fitoqumicos, o modo de separao eletrofortico mais utilizado a eletroforese capilar de zona (ECZ)4, 37, que apresenta tempos de anlise reduzidos, de grande importncia para anlises rotineiras em indstrias de produtos cosmticos e fitomedicamentos4, 34-37.

1.2.1. Instrumentao

Uma das caractersticas favorveis da eletroforese capilar a sua simplicidade instrumental (Figura 4). Um equipamento de eletroforese capilar composto basicamente de uma fonte de alta tenso, dois eletrodos, um capilar e um detector. Alm destes, existem ainda o cartucho que comporta o capilar, os recipientes de soluo e seu compartimento para armazenamento, e os sistemas de controle de injeo e temperatura.

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Figura 4: Representao esquemtica de um equipamento de eletroforese capilar.

A fonte de alta tenso pode funcionar em voltagem e/ou corrente constante, gerando potenciais de at 30 kV e correntes de at 100 A. Ligados fonte esto os dois eletrodos, em geral de platina, que criam a diferena de potencial para o estabelecimento da eletromigrao33, 38. O capilar onde ocorrer a separao dos analitos pode ser feito de vidro, teflon ou slica, sendo protegido por um cartucho plstico, com as extremidades prximas aos eletrodos. Seu dimetro interno varia entre 10 e 300 m, com comprimentos entre 32 a 100 cm que se estendem at os recipientes que contm o eletrlito de corrida ou da amostra. Os capilares de slica fundida com revestimento externo de poliimida possuem boa resistncia mecnica, alm de possibilitarem a retirada do revestimento externo prximo a uma das extremidades do capilar, formando assim uma janela transparente que permite ao detector a visualizao da passagem dos analitos32-33,38-39. Ao se iniciar uma corrida eletrofortica, preciso primeiramente condicionar o capilar. Aps isto, o eletrlito de corrida introduzido no capilar por presso, preenchendo toda sua extenso. Na seqncia a amostra introduzida pelo mesmo sistema, porm com uma presso menor e com um volume dependente do tempo de injeo, da presso aplicada, das dimenses do capilar e da viscosidade da soluo. Suas extremidades so ento introduzidas nos recipientes do eletrlito, onde aplicada uma diferena de potencial que faz com que as molculas migrem em direo janela de deteco32-33. Dentre os modos de deteco mais empregados em EC, destaca-se o espectrofotomtrico no UV/VIS por englobar uma srie de substncias e por

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possibilitar o acoplamento de um multiplicador de sinais do tipo arranjo de diodos, que gera um espectro para cada substncia detectada39.

1.2.2. Fluxo eletrosmtico

Capilares de slica fundida so extensivamente utilizados em eletroforese capilar por apresentarem boa condutividade trmica e transparncia no UV. Um fenmeno muito importante que ocorre durante a execuo da tcnica o fluxo eletroosmtico (FEO). Ele ocorre devido a presena de grupos silanis na parede interna do capilar (Figura 5) que apresentam um carter cido, e se ionizam quando em contato com solues com pH superior a 3. Com isto, a parede interna do capilar torna-se carregada negativamente, gerando o potencial zeta32-33,38-39. Os ons H+ provenientes da parede do capilar so solvatados por molculas de gua e migram para o seio da soluo. A partir de uma determinada distncia da parede, chamada de plano de cisalhamento, essas molculas de gua no sofrem mais atrao pela parede do capilar, e migram, em direo ao eletrodo de carga oposta, quando submetidas um campo eltrico, gerando assim, um fluxo com um perfil plano por toda soluo, denominado fluxo eletroosmtico. Por conveno, o fluxo que migra do nodo para o ctodo chamado de fluxo eletrosmtico normal3233,38-39

Figura 5: Representao esquemtica do fluxo eletroosmtico normal.

Este fluxo responsvel pelo transporte diferenciado de todas as espcies presentes na amostra at o detector. No entanto como depende do grau de ionizao da parede do capilar, o eletrlito utilizado deve ser tamponado para que no haja variaes da velocidade dos analitos estabelecida durante uma anlise. Uma soluo tampo de baixo pH gera um FEO bastante lento (Figura 6), pois os grupos silanis ainda esto protonados, j em pH alto, o grau de ionizao maior, e, portanto o fluxo mais rpido32-33,39.

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Figura 6: Representao da variao do fluxo eletroosmtico em funo do pH.

1.2.3. Eletroforese Capilar de Zona

A eletroforese capilar possui vrios modos de anlise que envolve separaes com aplicao de campo eltrico em um capilar preenchido de soluo tampo, sendo o modo mais comumente usado a eletroforese capilar de zona ou eletroforese capilar em soluo livre (ECSL) como tambm conhecida39. Este modo eletrofortico se baseia nas diferenas de velocidade de migrao que os analitos apresentam frente soluo tampo, ou seja, nas diferentes mobilidades eletroforticas, definidas pela razo volume/carga em um determinado pH. Alm disso, o eletrlito utilizado na separao pode estar acrescido de aditivos, alterando as mobilidades eletroforticas dos analitos, modificando o fluxo eletrosmtico, solubilizando compostos presentes na amostra ou ainda reduzindo a interao de algumas espcies com a parede do capilar, e melhorando assim a separao dos analitos38-39. Para a anlise de nions grandes e lentos, a separao pode ser efetuada sob aplicao de voltagem positiva e fluxo eletrosmtico normal, alto o suficiente para arrastar os analitos em direo a janela de deteco (Figura 7)34.

Figura 7: Representao das condies de anlise para nions.

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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Desenvolvimento de uma metodologia analtica para a separao e identificao de flavonides e aplicao em extratos vegetais e produtos cosmticos.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS Otimizao da composio do eletrlito de corrida atravs da utilizao de mtodos numricos; Utilizao de softwares de simulao de eletroforese capilar para a otimizao da separao; Aplicao do mtodo otimizado em extratos vegetais e produtos cosmticos.

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3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Todas as solues foram preparadas com gua desionizada (desionizador Mili-Q, Milipore, Bedford, Ma, E.U.A.).

3.1. PREPARO DOS PADRES

Os padres dos flavonides apigenina, miricetina, quercetina e rutina, das cumarinas escopoletina e umberliferona e do resveratrol foram adquiridos da empresa Sigma Aldrich (So Paulo, SP, Brasil). Os padres de flavonides apiina, aromadendrin, eriodectiol, fustin, galangina, hispidulina, isoquercetrina, kaempferol, luteolina-7-oglu, naringerina, naringina, taxifolina, taxifolina-3-ac. e vitexina foram isolados pelo grupo de trabalho do Professor Doutor Moacir Geraldo Pizzolatti atravs de cromatografia lquida, utilizando coluna de slica, com caracterizao via RMN de hidrognio e carbono. Todos os padres de flavonides foram preparados com metanol:gua (90:10, v/v) (Cintica) em solues padres de 1000 mg L-1. Foi feita ento, a mistura de padres com concentrao de 30 mg L-1 por flavonide. Para a hidrlise foram adicionados 20 L de HCl 6 mol L-1 100 L da mistura dos padres. A mistura foi aquecida a 95 por uma hora, secas com nitrognio e C, ressuspensas em 200 L de etanol:gua (75:25, v/v) (Nuclear, So Paulo).

3.2. PREPARO DE AMOSTRAS

As amostras de extratos vegetais hidroalcolicos de camomila, hiprico e passiflora foram cedidas pela empresa Farmaservice Bioextract Ltda (So Paulo, SP, Brasil), e diludas na proporo 1:3 (v/v) com gua desionizada. As amostras dos extratos das flores, folhas e galho da Polygala Sabulosa foram cedidas pelo grupo de trabalho do Professor Doutor Moacir Geraldo Pizzolatti, e foram diludas na proporo 1:3 (v/v) com gua desionizada. A hidrlise dos extratos vegetais de camomila, hiprico, passiflora e Polygala Sabulosa foi realizada com a adio de 20 L de HCl 6 mol L-1 100 L do extrato das plantas. A mistura foi aquecida a 95 por uma hora, secas com nitrognio e C, ressuspensas em 200 L de etanol:gua (75:25, v/v) (Nuclear, So Paulo).

23
15

As amostras de folhas e flores de Passiflora Alata e Passiflora Edulis foram adquiridas em diferentes localidades da ilha de Florianpolis/SC. As folhas das espcies foram secas em estufa eltrica (DeLeo) a 70 maceradas, extradas C, durante 1 hora em soluo contendo etanol hidratado:gua (90:10, m/m), submetidas a agitao, centrifugadas a 4000 rpm (centrfuga CentriBio) e o sobrenadante foi diludo na proporo 1:1 (v/v) com soluo de etanol hidratado:gua (50:50, v/v). As flores foram trituradas com soluo de etanol hidratado:gua (80:20, m/m), extradas durante 1 hora sob agitao, centrifugadas a 4000 rpm (centrfuga CentriBio) e o sobrenadante foi diludo na proporo 1:1 (v/v) com soluo de etanol hidratado:gua (50:50, v/v). As amostras de cremes de uso dirio foram adquiridas em comrcio local. Seu preparo consistiu em uma diluio na proporo 1:3 (m/m) em soluo de etanol:gua (75:25, v/v) (Nuclear, So Paulo), agitado em vrtex (QL-901) e centrifugado por 20 minutos (centrfuga MiniStar). O sobrenadante foi ento diludo em gua desionizada 1:1 (v/v) e analisado.

3.3. EQUIPAMENTOS

O equipamento de EC utilizado para as anlises foi da marca Agilent Technologies modelo HPCE3D (Palo Alto, CA, E.U.A.), equipado com detector de arranjo de diodos. As medidas foram efetuadas a uma temperatura de 25 C em capilar de slica fundida com revestimento externo de poliimida (45 cm x 50 m D.I. x 375 m D.E.) procedente da empresa Polymicro Technologies (Phenix, E.U.A.). O primeiro condicionamento do capilar foi realizado a 25 C da seguinte forma: 30 minutos com uma soluo de NaOH 1 mol L-1, 30 minutos com gua desionizada e 20 minutos com o eletrlito de corrida a ser utilizado na anlise. O condicionamento entre as corridas foi de 1 minuto com o eletrlito de corrida. Aps o auto zero, as solues padres e as amostras so introduzidas pelo inlet (extremidade do capilar mais distante do detector) sob injeo hidrodinmica, com uma presso positiva de 50 mbar por 3 s. A separao dos analitos foi efetuada sob aplicao uma tenso de 30 kV com polaridade positiva e deteco UV/VIS e monitoramento em 200 nm de comprimento de onda, com a constituio do eletrlito otimizada por planilhas eletrnicas e mtodos numricos utilizando o software Microsoft Excel XP.

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4. RESULTADOS E DISCUSSES

4.1. DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAO DO MTODO

Segundo caractersticas dos flavonides, como demonstrado pela estrutura do kaempferol na Figura 8, estes absorvem luz na regio do UV/VIS e possuem pKa superior a 7.
OH

HO

OH OH O

Figua 8: Estrutura do Kaempferol

Assim sendo, o TBS apresenta-se como uma boa escolha para compor o eletrlito de corrida, uma vez que em meio aquoso o sal forma um tampo de pH 9,36, gerando um fluxo eletrosmtico com alta mobilidade, responsvel por conduzir os analitos aninicos em direo ao detector. Alm disso, o TBS no absorve na regio do UV, possibilitando uma anlise com deteco direta. Foram testadas as concentraes de 5 a 40 mmol L-1 de TBS para a separao da mistura de padres de 21 compostos (Figura 9).

5 mmol/L

10 mmol/L

20 mmol/L

30 mmol/L

40 mmol/L

Figura 9: Eletroferogramas de diferentes concentraes de TBS. Condies experimentais: eletrlito -1 constitudo de 5, 10, 20, 30 e 40 mmolL de TBS; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3 s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

25
15

possvel observar que na concentrao de 5 mmol L-1 a velocidade de migrao dos analitos alta, gerando uma baixa resoluo. Com 40 mmol L-1 de TBS, ocorre uma reduo significativa da velocidade de anlise, o que aumenta significativamente o tempo de anlise e gera deformao das bandas dos analitos. Sendo assim, a faixa de concentraes de TBS de 10 a 30 mmolL-1 apresentou melhores resolues. Um parmetro vlido para modificao da mobilidade do fluxo eletrosmtico, e por conseqncia, da mobilidade dos analitos, a utilizao de modificadores orgnicos. Dentre as possibilidades, o metanol e a acetonitrila foram testados devido sua solubilidade em gua. Foram avaliadas porcentagens de 0 a 40% de metanol e acetonitrila (separadamente) para a separao da mistura de padres de 18 flavonides, duas cumarinas e um estilbeno, com eletrlito fixado em 30 mmolL-1 de TBS (Figura 10).

Figura 10: Eletroferogramas dos diferentes teores de metanol e acetonitrila. Condies -1 experimentais: eletrlito constitudo de 30 mmolL de TBS e teores de 0 a 40% de metanol e 0 a 40% de acetonitrila; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

O metanol apresentou-se como um modificador mais efetivo que a acetonitrila na separao dos compostos de interesse, como mostra a Figura comparativa 11, j que o mesmo reduz o fluxo eletrosmtico e melhora a separao dos analitos. A faixa de porcentagem de metanol satisfatria ficou entre 10 e 30%.

26
15

MeOH

ACN

Figura 11: Eletroferogramas comparativo entre 20% de metanol e 20% de acetonitrila. Condies -1 experimentais: eletrlito constitudo de 30 mmolL de TBS e teores de 20% de metanol e 20% de acetonitrila; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Depois de serem determinadas as variveis, a otimizao da composio do eletrlito foi realizada atravs de um planejamento fatorial, como mostrado nas Tabelas 1 e 2. O objetivo do planejamento fatorial foi estudar a concentrao de TBS e metanol favorvel separao dos analitos.
Tabela 1:Correlao dos sinais atribudos s concentraes das espcies. Tabela 2: Descrio dos experimentos planejados.

Para facilitar a identificao de cada analito em cada condio de anlises do planejamento, os 21 padres de flavonides, cumarinas e estilbeno foram divididos em dois grupos, como mostra a Tabela 3.

27

Tabela 3: Diviso dos grupos para os experimentos do planejamento fatorial.

Grupo A Apigenina Apiina Aromadendrin Eriodectiol Galangina Hispidulina Isoquercetrina Miricetina Resveratrol Taxifolina-3-ac Vitexina

Grupo B Escopoletina Fustin Kaempferol Luteolina-7-oglu Naringerina Naringina Quercetina Rutina Taxifolina Umberliferona

Em um primeiro momento, a resposta do planejamento foi dada em funo do numero de picos separados para a mistura dos padres de cada grupo, conforme as Figuras 12 e 13.

TBS 15mM / 10% MeOH

10 picos

TBS 15mM / 20% MeOH

11 picos

TBS 15mM / 30% MeOH

11 picos

TBS 20mM / 10% MeOH

9 picos

TBS 20mM / 20% MeOH

9 picos

40mA

TBS 20mM / 30% MeOH

10 picos

TBS 25mM / 10% MeOH

11 picos

TBS 25mM / 20% MeOH

10 picos

TBS 25mM / 30% MeOH

10 picos

Figura 12: Resultados do planejamento sistemtico para o grupo A de flavonides. Condies experimentais: eletrlito constitudo conforme descrito nas Tabelas 1 e 2; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

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15

Figura 13: Resultados do planejamento sistemtico para o grupo B de flavonides. Condies experimentais: eletrlito constitudo conforme descrito nas Tabelas 1 e 2; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Utilizando-se a Equao 1 foram calculadas as mobilidades efetivas (ef) experimentais de cada flavonide em cada uma das condies testadas, a partir dos tempos de migrao de cada flavonide e do fluxo eletrosmtico, marcado pelo solvente dimetilsulfxido (DMSO). (1) Sendo Ldet = Comprimento do capilar at o detector; LTot = Comprimento total do capilar; V = Potencial estabelecido durante a anlise; tm = Tempo de migrao do analito; t0 = Tempo de migrao do FEO. A fim de se calcular a mobilidade dos flavonides em funo de diferentes variveis, construiu-se a Equao 2, e atravs de mtodos numricos obtem-se os coeficientes desta equao para cada flavonide em cada condio experimental. Com isso foi possvel determinar a mobilidade efetiva terica de cada analito dentro dos limites de concentrao de TBS e metanol estudados.

29

(2)

A partir das mobilidades tericas e do mtodo de mnimos quadrados, os seis coeficientes da equao foram determinados. Atravs de uma macro criada no software Microsoft Excel XP (Figuras 15 e 16), foi possvel ento resolver o sistema matemtico e prever a melhor condio do eletrlito para efetuar a separao dos analitos.

Figura 14: Janela de resoluo da macro e resultado numrico do planejamento fatorial.

Figura 15: Resultado grfico do planejamento fatorial.

A Figura 15 mostra que, aps a otimizao, o eletrlito timo deve ser composto de 25 mmolL-1 de TBS e 14% de metanol. A separao obtida para os 21 padres apresentou tempo de anlise bastante satisfatrio, 6,135 minutos, com uma boa resoluo dos analitos, apresentando apenas uma pequena coeluio dos flavonides fustin e taxifolina, como demonstrada pela Figura16.

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15

Figura 16: Eletroferograma da mistura de padres dos flavonides no mtodo otimizado. Condies -1 experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Relacionando as mobilidades dos flavonides na proporo 25 mmolL-1 de TBS e 14% de metanol, previstas pela Equao 2 e as obtidas experimentalmente pela Equao 1, obtemos uma boa correlao dos resultados( R2 = 0,9959), segundo a Figura 17, o que demonstra a validade do mtodo obtido.

Figura 17: Grfico de correlao entre as mobilidades dos flavonides previsto pela Equao 2 e obtido experimentalmente.

Um ensaio comparativo entre a separao dos padres dos flavonides antes e aps o processo de hidrlise ilustra que os compostos resveratrol, miricetina, taxifolina-3-ac e taxifolina foram decompostos durante a reao de hidrlise, talvez

31
15

pela temperatura elevada gerada pelo aquecedor. Os flavonides glicosilados naringina, luteolina-7-oglu, apiina, rutina, isoquercetrina e vitexina foram convertidos em suas respectivas agliconas.

Figura 18: Figura comparativa da separao de flavonides antes (A) e depois (B) do processo de -1 hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmol L de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Algumas

amostras

de

interesse

fitoterpico

cosmetolgico

foram

selecionadas ento e analisadas no referido mtodo.

4.2. APLICAO EM EXTRATOS E PRODUTOS COSMTICOS

Os analitos foram identificados pelo espectro UV/VIS e pelo tempo de migrao dos compostos.

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15

4.2.1. Espcie Polygala Sabulosa

Primeiramente foi analisada a amostra das flores, folhas e galhos de P. Sabulosa. As anlises das flores antes e depois do processo de hidrlise (Figura 19) mostraram a converso do flavonide glicosilado isoquercetrina sua respectiva aglicona, quercetina, a provvel degradao da vitexina, alm do aparecimento da escopoletina, proveniente da escopoletina prenilada que aparece junto do fluxo eletrosmtico antes da hidrlise.

Figura 19: Separao de flavonides antes (A) e depois (B) do processo de hidrlise para as flores -1 da espcie P. Sabulosa. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Para as folhas de P. Sabulosa as anlises antes e depois da hidrlise (Figura 20), mostraram o pico da aglicona galangina antes e aps a hidrlise e o aumento do pico da cumarina escopoletina que estava prenilada antes do processo. No foi possvel, porm, a visualizao o pico de aglicona da converso dos glicosdeos rutina, vitexina e isoquercetrina, que podem ter sofrido decomposio durante o processo de hidrlise.

33
15

Figura 20: Separao de flavonides das folhas da espcie P. Sabulosa, antes (A) e depois (B) do -1 processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Na anlise dos galhos de P. Sabulosa (Figura 21) observou-se o aparecimento do pico da escopoletina aps o processo de hidrlise. A converso da isoquercetrina e da vitexina em suas respectivas agliconas no foram observadas pela provvel decomposio das molculas. Alm disso, o pico da aglicona galangina manteve-se aps o processo de hidrlise.

Figura 21: Separao de flavonides antes (A) e depois (B) do processo de hidrlise para os galhos -1 da espcie P. Sabulosa. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

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4.2.2. Extratos vegetais comerciais

Foram feitas anlises de extratos vegetais hidroalcolicos de camomila, hiprico e passiflora, antes e depois do processo de hidrlise. Na anlise dos extratos de camomila (Figura 22) foi possvel observar o aumento do pico da apigenina devido converso da apiina, e a permanncia dos picos da umberliferona e da quercetina. Alm disso, nota-se que a luteolina-7-oglu provavelmente se converteu em composto no identificado ou degradou durante a hidrlise.

Figura 22: Comparao dos eletroferogramas para o extrato de camomila antes (A) e aps (B) o -1 processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Os eletroferogramas para a anlise de hiprico (Figura 23) mostraram a converso completa das quercetinas glicosiladas 1, 2, 3, 4 e 5 aglicona quercetina.

35

Figura 23: Eletroferogramas comparativos para a anlise do extrato de hiprico antes (A) e aps (B) -1 o processo de hidrlise. Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

As bandas das agliconas hispidulina e quercetina para o extrato de passiflora mantiveram-se no mesmo tempo de migrao aps a hidrlise. A vitexina possivelmente foi degradada durante a hidrlise, como mostra a Figura 24.

Figura 24: Comparao dos eletroferogramas antes (A) e aps (B) a hidrlise extrato de passiflora. -1 Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

36
15

4.2.3. Espcie Passiflora Edulis

A anlise das folhas do maracuj amarelo (P. Edulis), segundo a Figura 25, mostra a presena de dois flavonides glicosilados, rutina e vitexina, e duas agliconas, hispidulina e quercetina.

Figura 25: Anlise eletrofortica das folhas da P. Edulis. Condies experimentais: eletrlito -1 constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Para as flores da espcie (Figura 26), foram encontrados os mesmos flavonides das folhas, rutina, vitexina, hispidulina e quercetina. Porm ao se

comparar seus eletroferogramas possvel perceber que nas flores os compostos esto em menor concentrao do que nas folhas.

Figura 26: Separao dos flavonides das flores da espcie P. Edulis. Condies experimentais: -1 eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

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4.2.4. Espcie Passiflora Alata

Segundo FREITAS a Passiflora Alata extensivamente estudada como fitoterpico por ser rica em flavonides, sendo o principal a vitexina40. A anlise comparativa de folhas jovens e velhas do maracujazeiro doce (Figura 27) mostra que a composio das folhas praticamente no se modifica, mas a concentrao diminui em folhas mais antigas. A anlise confirma alm da presena de vitexina, a existncia da aglicona hispidulina.

Figura 27: Anlise comparativa da folhas jovens (A) e velhas (B) da espcie P. Alata. Condies -1 experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Para as flores da espcie, o eletroferograma (Figura 28) mostrou a presena da vitexina e hispidulina. Uma anlise comparativa (Figura 29) mostra que a concentrao destas espcies, marcadas pela vitexina, maior em flores abertas e em botes grandes, e menor em flores fechadas e botes pequenos.

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Figura 28: Separao dos compostos presentes nas flores da espcie P. Alata. Condies -1 experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

Figura 29: Anlise comparativa das flores da espcie P. Alata. Flores abertas (A), flores fechadas (B), brotos grandes (C) e brotos pequenos (D). Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 -1 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

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15

4.2.5. Extratos de cremes de uso contnuo

Foram feitas anlises de dois cremes de uso dirio (creme para o dia e creme para a noite), adicionados de extrato de Passiflora Alata. A anlise dos cremes (Figura 30) confirmou a presena do flavonide marcador da espcie Passiflora Alata, a vitexina, alm de outros dois compostos fenlicos com caractersticas de flavonides (espectro UV/VIS e tempo de migrao).

Figura 30: Anlise comparativa dos cremes de uso contnuo, adicionados de estrato de P. Alata. -1 Creme dia (A) e creme noite (B). Condies experimentais: eletrlito constitudo por 25 mmolL de TBS e 14% de metanol; injeo hidrodinmica 50 mbar por 3s; tenso aplicada 30 kV com polaridade positiva e deteco direta em 200 nm.

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5. CONCLUSO

O estudo mostrou que a tcnica de eletroforese capilar uma ferramenta rpida e eficaz na separao de dezoito flavonides, duas cumarinas e um estilbeno, com tempos de anlise inferiores a 6,5 minutos. O uso de modelos e softwares matemticos durante o planejamento fatorial, facilitou a otimizao do mtodo com uma boa correlao de 0,9959 entre os valores de mobilidade tericos e experimentais, mostrando a validade do modelo obtido. A aplicao do mtodo em diferentes extratos vegetais e cosmticos, sem necessidade de muitos tratamentos prvios, mostrou a versatilidade do mtodo, reforando sua capacidade de aplicao a anlises de rotina.

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REFERNCIAS

1. SILVA, M. B. S. Flavonides com capacidade antioxidante. Faculdade de Cincias e Tecnologia, Universidade de Nova de Lisboa.

2. ABIHPEC Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmtica. Dados de mercado. Panorama do Setor 2007-2008. Disponvel em: http://www.abihpec.org.br/dadosdomercado_panorama_setor.php. Acesso em: 13/08/08.

3. COSMTICA NATURAL. Bem-vindo ao Cosmetica-Natural.org. Disponvel em: http://www.cosmetica-natural.org/. Acesso em: 13/08/08.

4. YUNES, R. et al. Frmacos e fitoterpicos: a necessidade do desenvolvimento da indstria de fitoterpicos e fitofrmacos no Brasil. Qumica Nova. v. 24, p.150, 2001.

5. PENG, Y. et al. Quantitative and qualitative analysis of flavonoid markers in Frucus aurantii of different geographical origin by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, v. 830, p. 224, 2005.

6. RIJKE, E., et al. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A, v. 1112, p. 31-63, 2006.

7. WANG, S-P., HUANG, K-J. Determination of flavonoids by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, v. 1032, p. 273-279, 2004.

8. ALVES, C. Q. et al. Avaliao da atividade antioxidante de flavonides. Dilogos & Cincia Revista da Faculdade de Tecnologia e Cincias, Ano 5, n. 12, 2007. Disponvel em: http://dialogos.ftc.br. Acessado em 21/05/08.

42

9. FERREIRA, A. L. A. et al. Radicais livres: conceitos, doenas relacionadas, sistemas de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associao Mdica Brasileira. v. 43, p. 61-68, 1997.

10. BIANCHI, M. L. P. et al. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Revista de Nutrio. v. 12, p. 123-130, 1999.

11. MOLNR-PERL, I., FZFAI Zs. Chromatographic, capillary electroforetic and capillary electrochromatographic techniques in the analysis of flavonoids. Journal of Chromatography A. v. 1073, p. 201-227, 2005.

12. HAN, J. et al. Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray

ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography B, v. 848, p. 355362, 2006.

13. WANG, H. et al. Determination of flavonols in green and black tea leaves and green tea infusions by high-performance liquid chromatography. Food Research International, v. 34, p. 223-227, 2001.

14. FIGUEIRINHA A. et al. Cymbopogon citrates leaves: Characterization of flavonoids by HPLC-PDA-ESI-NS/MS. Food Chemistry, v.110, p. 718-728, 2008.

15. MERKEN, H. M., BEECHER G. R. Measurement of food flavonoids by HighPerformance Liquid Chromatography: A Review. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 48, p. 577-599, 2000.

16. FARAG, M. A. et al. Metabolic profiling and systematic identification of flavonides in roots and cell suspension cultures of Medicago. Phytochemistry, v.68. p. 342-354, 2006.

43

17. LAI, J-P. et al. Identification and characterization of major flavonoids and caffeoylquinic acids in three Compositae plants. Journal of Chromatography B, v. 848, p. 215-225, 2007.

18. SURYAWANSHI, S. et al. Simultaneous estimation of mangiferin and four secoiridoid glycosides in rat plasma using liquid chromatography and its application to pharmacokinetic study of herbal preparation. Journal of Chromatography B, v. 858, p. 211-219, 2007.

19. HAN, J. et al. Caracterization of phenolic compounds in the Chinese herbal drug Artemisia annua by liquid chromatography coupled to eletrospray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 47, p. 516-525, 2008.

20. FZFAI, Zs., MOLNR-PERL, I. Gas chromatographic-mass spectrometric fragmentation study os flavonoids as their trimethylsilyl derivatives: Analysis of flavonoids, sugar, carboxylic anda mino acids in model systems and in citrus fruits. Journal of Chromatography A. v. 1149, p. 88-101, 2007.

21. CANINI, A. et al. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from Carica papaya L. leaf. Journal of Food Composition and Analysis. v. 20, p. 584-590, 2007.

22. ZHANG, K., ZUO, Y. GC-MS Determination os Flavonoids and Phenolic and Benzoic Acids in Human Plasma after Consumption of Cranberry Juice. Journal of Agricultutal and Food Chemistry. v. 52, p. 222-227, 2004.

23. XU, X., Yu, L., CHEN, G. Determination of Flavonoids in Portulaca oleracea L. by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 41, p. 493-499, 2006.

24. POLEK M., et al. Use of molybdate as novel complex-forming selector in the analysis of polyhydric phenols by capillary zone electrophoresis. Talanta. v. 69, p. 192-198, 2006.

44

25. LUO, M. et al. Separation and determination of flavonoids in Lamiophlomis rotate by capillary electrophoresis using borate as electrolyte. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 44, p. 881-886, 2007.

26. ZHANG S. et al. Simultaneous determination of flavonoids in chrysanthemum by capillary zone electrophoresis with running buffer modifiers. Talanta. v. 76, p. 780-784, 2008.

27. URBONAVIIT A., et al. Capillary electrophoretic analysis of flavonoids in single-styled hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) ethanolic extracts. Journal of Chromatography A. v. 1112, p. 339-344, 2006.

28. AFRA, J., et al. Determination of selected antioxidants in Melissae herba by isotachophoresis and capillary zone electrophoresis in the column-coupling configuration. Journal of Chromatography A. v. 1171, p. 124-132, 2007.

29. KOEVAR N., et al. Comparison of capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography for determination of flavonoids in Achillea millefolium. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 46, p. 609-614, 2008.

30. SUNTORNSUK L. Capillary electrophoresis of phytochemical substances. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 27, p. 679-698, 2002.

31. TSAO, R., DENG, Z. Separation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals. Journal of Chromatography B. v. 812, p. 85-99, 2004.

32. SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. Princpios de anlise instrumental. Taduo de Ignez Caracelli [et al.] 5. Ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. cap. 30.

33. TAVARES, M. F. M. Eletroforese Capilar: Conceitos Bsicos. Qumica Nova, v. 19, p.173-180, 1996.

45

34. TAVARES, M. F. M. Mecanismos de separao em Eletroforese Capilar. Qumica Nova, v. 20, p.493-498, 1997.

35. HELALI, N. Capillary zone electrophoresis method for the determination of famotidine and related impurities in pharmaceuticals. Talanta. v. 74, p. 694, 2008.

36. LIANG, Y-Z. Quality control of herbal medicines. Journal of Chromatography B. v. 812, p.56-57, 2004.

37. URBONAVIIT, A. et al. Capillary electrophoretic analysis of flavonoids in single-styled hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) ethanolic extracts. Journal of Chromatography A. v. 1112, p. 339-341, 2006.

38. SILVA, J. A. F. et al. Terminologia para as tcnicas analticas de eletromigrao em capilares. Qumica Nova. v. 30, p. 740-744, 2007.

39.

Chemkeys.

Eletroforese

capilar.

Disponvel

em:.

http://www.chemkeys.com/artigo/1/0. Acesso em 02/10/2008.

40. FREITAS, M. S. M. Flavonides e nutrientes minerais em folhas de maracujazeiro amarelo e deficincia de macronutrientes e boro em maracujazeiro doce. 2006. 119f. Tese (Doutorado em Produo Vegetal) Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Rio de Janeiro.