METODOLOGIAS DE ANALISIS FOLIAR

Por: Felipe Caldern Senz y Margarita Pavlova Dr. Caldern Laboratorios Ltda., Junio 27 de 2001; Rev. Marzo 27 de 2004 www.drcalderonlabs.com Avda. 13 No. 87-81 Bogot D.C., Colombia S.A. acaldero@cable.net.co

Diagrama General Preparacion de la Muestra Digestin Hmeda Determinacin de K - Ca - Mg Determinacion de Sodio Determinacin de Fsforo Determinacin de los Elementos Menores Fe, Mn, Cu y Zn. Determinacin del Boro por el Mtodo de la Azometina-H. Determinacin del Boro por el Mtodo de la Quinalizarina. Determinacin del Azufre Determinacin del Nitrgeno Determinacin del Aluminio en Tejido Vegetal

Preparacin de la Muestra.
Las muestras que llegan al laboratorio se somenten al siguiente proceso de preparacin. 1. Limpieza de la muestra: La muestra fresca si contiene polvo o vestigios de contaminacin se lava con abundante agua destilada, y se deja secar un poco al aire. 2. Secado de la muestra: Se toma una cantidad de muestra de aproximadamente 100 grs, y se somete a un secado en estufa durante 24 a 48 horas a una temperatura entre 60 y 80C. 3. Molienda. Una vez seca la muestra, se muele y homogeniza en molino de cuchillas, se pasa por un tamiz plstico de 2 mm y se almacena para posterior anlisis. 4. Almacenamiento: Las muestras se almacenan en bolsas plsticas exentas de humedad, quedando listas para anlisis qumico. Nota: Siempre se deben preparar en el laboratorio laboratorio muestras patrn para Control de Calidad Analtico.

Digestin Hmeda
La muestra seca y molida se somete a una digestin hmeda donde se efecta la liberacin de los elementos minerales ( P, K, Ca, Mg, S, Mn, Cu, Fe, Zn y Na ) esta digestin se hace con una mezcla de HNO3 concentrado del 65% y HClO4 concentrado del 70%. (250 ml HNO3 + 100 ml HCLO4) Relacin de Mezcla 2.5 : 1

1. Procedimiento: Se pesan 0.5 gramos de muestra seca y molida, se lleva a un tubo de ensayo de 2.5 cm de dimetro x 35 cm de altura, se agrega de 2.5 a 3.0 mls de mezcla acida dependiendo del cultivo, luego se coloca en la placa de digestin. (La temperatura no debe pasar de 200C a mayor temperatura se puede volatilizar algo del Fsforo). Se toma como punto final de la digestin cuando aparecen humos blancos y ya el digerido se encuentra totalmente transparente. En este punto deben haber aproximadamente 0.5 mililitros de solucin. Se deja enfriar, se agregan 24.5 mls de agua destilada, se filtra en papel de filtro cuantitativo (Whatman 40 o similar). En este filtrado se encuentran listos para lectura el P, S, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn y el Na. El residuo contiene los materiales insolubles y la Slice cruda (SiO2). De este filtrado se toman las alicuotas correspondientes para el anlisis qumico. Las determinaciones de Cu, Mn, Fe, Zn y Na, se realizan directamente del filtrado de la digestin. La determinacin de Fosforo (P) se hace por Colorimetra. La determinacin de Azufre (S) se hace por turbidimetra con Cloruro de Bario. La determinacin de Boro (B) se hace por Colorimetra con Azometina-H. La determinacin de Nitrogeno (N) por Kjeldhal directamente de la muestra inicial.

Determinacin de K - Ca - Mg
Del filtrado de la digestin se toman 0.5 ml, se le agregan 48.5 ml agua destilada y 1 ml de Oxido de Lantano al 5%. De esto resulta una relacin de Dilucin de 50/0.5 ml, se agita y se lee en el espectrofotmetro de absorcin atmica. Clculos %K = (ppm K leidas x V.aforamiento x Dilucin x 100)/(106 x 0.5 gramos x 0.5 ) = ppmK x 0.5 Ca = (ppmCa x 25 x 50 x 100)/(10E6 x 0.5 g x 0.5) = ppm Ca x 0.5 %Mg = (ppmMg x 25 x 50 x 100) / (10E6 x 0.5 g x 0.5) = ppm Mg x 0.5 Reactivos y Equipos Reactivos: Oxido de Lantano al 5% (P/V) se pesan 58.64 grm de Oxido de Lantano (La203), se agregan 200 mls de agua destilada y 200 mls de HCL concentrado, se agita hasta completa disolucin se deja enfriar y se afora a 1 litro con agua destilada. Solucione Patrones Primarios de K , Ca, Mg, de 1000 ppm. Para K : Se pesan 2.2283 gramos de K2SO4 y se disuelven en aprox. en 200 ml de agua destilada. Para Ca: Se pesan 2.4972 gramos de CaCO3 y se disuelven en aprox 50 ml de agua destilada, se agrega HCL 6 N en una mnima cantidad hasta disolucin completa y se

agrega 200 ml de agua destilada. Para Mg : Se pesan 8.8213 de (CH3COO)2 Mg.4H2O) y se disuelven en 200 ml de agua destilada. Finalmente se mezclan estas tres soluciones y se afora a 1 lt con agua destilada, quedando un patrn mixto de K, Ca, Mg, de 1000 ppm de c/u. Patrones secundarios Se preparan patrones de trabajo de 0.25 , -0.5, 1, 2, 4, 8, 16 ppm de K, Ca, Mg: Se toma la alicuota correspondiente, se adiciona 2 mls de solucin de Oxido de Lantano, ay se afora a 100 mls con agua destilada. Equipos Espectofotometro de absorcin Atmica. Vasos de precipitacin de 100 mls Balones de 1 litro Varillas de vidrio Tubos de digestin Plancha para digestin Pipetas 0.5-1-2 10 mls

Determinacin de Sodio.
El Sodio se determina por lectura directa en el fitrado obtenido de la digestin hmeda por el mtodo de emisin de llama. - Clculos: ppm de Na= (ppm leidas Na x V. aforamiento) / (gr de muestra) = ppm leidas x 25 /0.5 = ppm leidas de Na x 50 - Reactivos: - Patrn primario de Na de 1000 ppm: Se pesan 2.5420 gms de NaCl y se aforan a 1 litro con agua destilada. - Patrones secundarios: A partir del patrn primario, se preparan patrones de 2, 4, 10, 20, 40, 80 ppm aforados a 100 mls en mezcla acida. - Mezcla acida: Se prepara una mezcla de H2SO4 al 0.025 N y HCL al 0.05 N.

Determinacin de Fsforo.
El mtodo utilizado es el de Molibdato-Vanadato de Amonio dando lugar a la formacin de un complejo de color amarillo.

- Procedimiento: Se toma una Alcuota de 0.5 ml del filtrado de la digestin, se agregan 2 ml de agua destilada y 1 ml de la solucin Molibdato-Vanadato de Amonio, desarrollndose inmediatamente el color amarillo, se deja 5 minutos en reposo, y se lee a una longitud de onda de 430 nm. - Para los patrones se procede de igual manera que para las muestras, tomndose 2.5 de cada patrn + 1 ml de la solucin Molibdato-Vanadato de Amonio. - Clculos: Constante K = Concentracin / Absorbancia % P= K x abs x V. Aforamiento x Alcuota x 100 / ( 10 (6) x 0.5 gramos x 0.5) = K x abs x 0025 Reactivos y Equipos Molibdato de Amonio (NH4)6 Mo7 024. 4H2O al 5% (Solucin A) se pesan 12.5 gramos de Molibdato de Amonio, se agrega 150 mls de agua destilada, se calienta suavemente hasta completa disolucin y se afora a 250 mls. Vanadato de Amonio NH4VO3 0.25% (Solucin B) se pesan 0.625 gramos se agrega 125 mls de agua destilada, se agrega 62.5 ml de HNO3 consentrado, se deja enfriar y se afora a 250 mls. En un baln de 500 mls se disuelve Solucin A (Molibdato de Amonio) sobre solucin B (Vanadato de Amonio) en una proporcin 1 : 1. Solucin Patrn de Primario de P (100 ppm). Se pesan 0.439 gramos de KH2PO4, se agregan 300 mls de agua destilada y 10 ml de H2SO4 10 N y se afora a 1 litro con agua destilada. Acido sulfurico 10 N (H2SO4); A partir de H2SO4 %, d = 1,84 se toman 280.31 gr y se aforan a 1 litro con agua destilada. - Soluciones Patrones Secundarios: A partir del patrn primario, se preparan patrones de 3 - 5 - 8 ppm y se aforan a 100 mls con agua destilada. Equipos: Colormetro Vasos de precipitacin Tubos de ensayo Pipetas

Determinacin de los Elementos Menores Fe, Mn, Cu y Zn.

Del filtrado obtenido en la digestin hmeda se lee directamente por absorcin Atmica : Cu, Mn, Fe, y Zn. Clculos ppm totales = ppm leidas x V aforamiento / gr de Muestra ppm Cu = ppm Cu leidas x 25 / 0.5 ppm Mn = ppm Mn leidas x 25 / 0.5 ppm Fe = ppm Fe leidas x 25 / 0.5 ppm Zn = ppm Zn leidas x 25 /0.5 = = = = ppm Cu leidas x 50 ppm Mn leidas x 50 ppm Fe leidas x 50 ppm Zn leidas x 50

Reactivos y Equipos
Patron Primario Mixto de Cu - Mn - Fe - Zn de 1000 ppm Para Cobre: Se pesa 1 gramo de Cobre metlico en un volumen minimo de HNO3 realcin 1 : 1 y se diluye en 200 mls de agua destilada. Para Manganeso: Se pesan 3.076 gr de Sulfato de Manganeso MnSO4 . H2O diluyendo en 200 mls con agua destilada. Para Hierro: Se pesan 7.016 gr de Sulfato Ferroso Amonico (NH4)2 Fe (SO4)2. 6 H2O diluyendose en 200 mls de agua destilada. Para Zinc : Se pesan 100 gramos de Zinc matlico en una cantidad minima HCl relacin ( 1 : 1 ) diluyndose en 200 mls con agua destilada. Preparadas estas soluciones se mezclan y se aforan a 1 litro con agua destilada quedando el patrn primario mixto de 1000 ppm de Cu, Mn, Fe, Zn.

Patrones secundarios:
A partir del patrn primario se prepara un patrn primario de 100 ppm que se afora a 1 litro con agua destilada y a partir del patron de 100 ppm se preparan patrones secundarios de 0.5, 1-2-4-8-16 y 32 ppm aforndose a 100 mls con mezcla acida. - Mezcla Acida: Se prepara una mezcla de H2SO4 al 0.25 % y HCl al 0.05 %. - Equipos: Espectofotometro de absorcin Atmica.

Balones volumtricos de 1 litro Vasos de precipitados Pipetas Varillas de vidrio

Determinacin del Boro Foliar por el Mtodo de la Azometina-H.

Se pesan 0.5 gramos de muestra seca y molida. Se hace digestin con mezcla acida HNO3 HClO4 despus de la digestin se afora a 25 mls con H2O destilada y se filtra. Del filtrado se toman 0.5 ml, se agrega 5 ml del reactivo del desarrollo de color y se deja reposar durante una hora a temperatura ambiente. Se lee en el colorimetro a 420 mm.

Reactivos
Solucin patrn primario de Boro 100 ppm: Se disuelven 0.5716 gramos de H3BO3 en agua destilada aforando a un litro manteniendolo en una botella plastica. Patrones Secundarios Se preparan a partir del patrn de 100 ppm, patrones de 2.5, 5.0, 7.5 10 y 15 ppm aforando a 100 mls con HCl al 1%. Estas soluciones son estables. Solucin Azometina H Se disuelven 0.9 gramos de Azometina H y 2 gramos de Acido Ascorbico en 100 mls de agua. Se guarda la solucin en la nevera y gastarla antes de 14 das. Solucin Reguladora Se disuelven 140 gramos de CH3 COONH4, 10 gramos de CH3 COOK, 4 gramos de sal Disodica del Acido Nitrilotriacetico al 99%, 10 gramos del acido Etilendinitrilo tetraacetico y 350 mls al 10% v/v de Acido Acetico y diluir con H2O a 1 litro. Esta solucin es estable. Reactivo Desarrollo Color Tomar 35 mls del reactivo de Azometina H y 75 mls de la solucin reguladora en un baln de 250 mls y se afora con H2O destilada. ( Este reactivo se prepara en el momento de trabajo). Calculos:

Determinacin del Boro Foliar por el Mtodo de la Quinalizarina.

Principio del mtodo:
Este mtodo de anlisis del Boro se realiza en tres (3) etapas: a) Mineralizacin de la muestra por via seca mediante una calcinacin a una temperatura de 550C. b) Extraccin del Boro con H2SO4 5N. c) Colormetria con Quinalizarina (1,3,5,8 Tetrahidroxi-Antraquinona) formando un complejo de color Violeta (Lila).

Procedimiento:
Se pesan 0.5 gramos de muestra seca, se lleva a un crisol de porcelana y se empieza la calcinacin en una mufla hasta obtener cenizas blancas o grises dependiendo del cultivo, se deja enfriar, se diluye con 10 ml de H2SO4 5N, se calienta hasta comienzo de los primeros hervores, se deja reposar durante 1 hora y se filtra ( papel filtro Whatman 40). Del filtrado se toman 0.5 ml, se agregan 5 mls del reactivo de Quinalizarina, se agita, se tapa y se dejan en cuarto oscuro durante 20 minutos, luego se hace lectura de Boro en el Colormetro a una longitud de onda de 620 nm. De igual manera se procede con los patrones y el blanco. Se utilizan patrones de 2-4-6 ppm. Par el blanco se toma 0.5 mls de H2SO4 5N + 5 mls de reactivo de Quinalizarina Clculos: ppm B = ppm leidas x volumen de aforamiento / (gr de Muestra) = ppm leidas x 10 / 0.5 = ppm B leidas x 20 Las ppm de Boro leidas se obtienen mediante la curva donde se grafica concentracin de los patrones versus sus absorbancias respectivas. Reactivos y Equipos: - Acido Sulfrico Concentrado H2SO4 (Grado reactivo) 95 - 96 % - Acido Sulfrico H2SO4 5N se toman 140,16 mls de Acido Sulfrico concentrado del 95 % de d=1.84 aforandose a 1 litro con agua destilada. Reactivo de Quinalizarina: C14 H8 O6 10 miligramos/litro: Se pesan 0.01 gramos de Quinalizarina aforndolo a 1 litro con Acido Sulfrico concentrado (H2SO4).

Patrn Primario de Boro de 100 ppm Se pesan 0,572 gramos de Acido Borico (H3BO3) y se afora a 1 litro con agua destilada. Patrones Secundarios: Se preparan a partir del patron primario patrones de 2 - 4 - 6 ppm afrandose a 100 mls con Acido Sulfrico 5N ( H2SO4 5N ). Equipos: Colormetro Tubos Coleman libres de Boro. Crisoles de porcelana Mufla Pipetas Vasos de precipitado Varillas de vidrio

Determinacin del Azufre

El Azufre se determina por turbidimetra con Cloruro de Bario (BaCl2) al 10% y Glicerina, directamente del filtrado obtenido de la digestin hmeda.

Procedimiento
Se toma 1 ml del filtrado + 4 mls de agua destilada, + 2 mls de solucin de (BaCl2 /Glicerina), se agita y se lee en el colormetro a una lngitud de onda de 800 nm. Para los patrones se procede de la misma manera que con las muestras. Clculos: CteK = Concentracin patrones /Absorbancia % S = CteK x Absorbancia x V. Aforamiento x 100 / Gramos de muestra % S = CteK x Absorbancia x 25 x 100 /106 x 0.5 % S = CteK x Absorbancia x 0.005

Reactivos y Equipos
Cloruro de Bario al 10% (BaCl2) Se toman 100 gramos de Cloruro de Bario y se afora a un litro con agua destilada.

Solucin de Glicerina-Cloruro de Bario Se toman 500 mls de BaCl2 al 10%, se agregan 250 mls de Glicerina, se agita y se afora a un litro con agua destilada. Patrn primario de S de 1000 ppm Se pesan 4.1195 gramos de Sulfato de Amonio (NH4)2 SO4 y se afora a un litro de agua destilada. Patrones Secundarios A partir del patrn primario se preparan patrones de trabajo de 40, 60, 80 y 120 ppm aforando la respectiva cantidad a 100 ml con agua destilada. Equipos Colormetro Agitador magntico Pipetas Balones volumtricos Tubos de ensayo

Determinacin del Nitrgeno

Metodo Micro-Kjeldhal (Rev. Dic/2000)
El mtodo utilizado es el de Micro-Kjeldhal mediante una digestin del tejido vegetal con H2SO4 concentrado utilizando como catalizador una mezcla propietaria de Sulfato de Cobre, Sulfato de Sodio anhidro, Yeso y Caoln para controlar la espuma y la la temperatura de ebullicin. Ver en la parte corrspondiente a la preparacin de reactivos.

Marcha analtica
Digestin Se pesan 0.25 gramos de muestra seca, se lleva a un tubo de digestin Kjeldhal de 25 x 300 mm, se agrega 2.5 gr de Catalizador (aprox. una cucharadita de 2.5 ml ), se agregan 8 ml de H2SO4 concentrado, se coloca en la placa de calefaccin y se empieza la digestin a 340 C, hasta que el digerido tome un color claro azul verdozo. Se deja enfriar. Destilacin Se traslada el digerido, el cual despues del enfriamiento puede quedar parcialemte slido, a un tubo de destilacin de 250 ml, mediante ayuda con 25 ml de agua. Acto seguido se inicia

el procesio de destilacin en arrastre con vapor, aplicando 25 ml de agua y 65 ml de solucin de hidrxido de Sodio (Soda Custica) al 40 %. Se recibe el destilado en un recipiente que contiene 50 ml de solucin de Acido Brico al 4 % con Indicador Mixto. Se termina cuando en el recipiente se ha completado un volmen de 100 mls del destilado, el cual se valora con H2SO4 1/7 N. Calculos 1 ml de H2SO4 N/7 neutralizan 2 meq de NH4 N= V. H2SO4 x 2 x 100/grs de muestra x 1000 gramos de muestra = 0.25 gramos Observacin: Siempre se hace un blanco de H2SO4 con el que se hace la digestin. Reactivos Equipos - Acido Sulfrico Concentrado. - Sulfato de Sodio Anhidro Na2SO4. - Acido sulfrico N/7: Se toman 3,97 mls de Acido Sulfrico y se aforan a 1 litro con agua destilada. - Sulfato de Cobre (CuSO4.5H2O) - Hidroxido de Sodio NaOH (40%) se pesan 400 gramos de NaOH, se disuelven y aforan a 1000 ml con agua destilada. - Acido Brico H3BO4 (al 4% ) se pesan 40 gramos de H3BO4, se disuelven y aforan a 1 litro con agua destilada. Antes de aforar se agregan 40 gotas de NaOH al 1% y 160 gotas de indicador mixto (Rojo de Metilo y Verde Bromocresol). Catalizador: - Sulfato de Sodio Anhidro ................ 1000 gr - Sulfato de Cobre Pentahidratado ..... 50 gr - Yeso .............................................. 100 gr - Caoln ............................................ 100 gr Indicador Mixto: - Se pesa 0.5 gr de Verde Bromocresol y 0.1 gr de Rojo de Metilo y se disuelven en 100 ml de Etanol.

Hidroxido de Sodio al 1%: Se pesa 1 gramo de NaOH y se afora a 100 mls con agua destilada. Equipos - Equipo Kjeldhal - Vasos de precipitado de 250 mls - Tubos de Digestin de 25 x 300 mm - Tubo Kjeldhal de 250 mls - Pipetas de 25 mls - Buretas - Probetas

Metodo Semi-Micro Keldhal Marcha analtica

Digestin: Se pesan 0.5 gramos de muestra seca, se lleva a un baln de digestin Kjeldhal de 250 ml, se agrega 20 mls de H2SO4 concentrado, de 0.5 a 1 gramo de Catalizador, se coloca en la placa de calefaccin y se empieza la digestin, hasta que el digerido tome un color claro azul verdozo. Se deja enfriar. Destilacin Se aade 130 mls de agua destilada, y 70 mls de NaOH al 40%, dos a tres granallas de Zinc y se inicia la destilacin. Se termina cuando el recipiente que contienen 25 mls de H3BO4, se han recibido 100 mls del destilado, el cual se valora con H2SO4 1/7 N. Clculos 1 ml de H2SO4 N/7 neutralizan 2 meq de NH4 N= V. H2SO4 x 2 x 100/grs de muestra x 1000 gramos de muestra = 0.5 gramos Observacin: Siempre se hace un blanco de H2SO4 con el que se hace la digestin. Reactivos: - Acido Sulfrico concentrado. - Sulfato de Sodio Anhidro NaSO4. - Acido sulfrico N/7: Se toman 3,97 mls de Acido Sulfrico y se aforan a 1 litro con agua destilada. - Granallas de Zinc. - Sulfato de Cobre (CuSO4.5H2O) - Hidroxido de Sodio NaOH (40%) se pesan 40 gramos de NaOH, se disuelven y aforan a 1000 ml con agua destilada. - Acido Brico H3BO4 (al 4% ) se pesan 40 gramos de H3BO4, se disuelven y aforan a 1

litro con agua destilada. Antes de aforar se agregan 40 gotas de NaOH al 1% y 160 gotas de indicador mixto ( Rojo de Metilo y Verde Bromocresol). - Indicador Mixto: Se prepara con verde Bromocresol al 0,25% y rojo de metilo al 0,05% en Etanol. - Hidroxido de Sodio al 1%: Se pesa 1 gramo de NaOH y se afora a 100 mls con agua destilada. - Catalizador: 5 grs de Sulfato de Sodio Anhidro mas 0.5 gr de Sulfato de Cobre. Equipos: - Equipo Kjeldhal - Vasos de precipitado de 250 mls - Balones Kjeldhal de 250 mls - Pipetas de 25 mls - Buretas - Probetas

Determinacin del Aluminio en Tejido Vegetal

Se toman 0,5 gramos de muestra seca, se hace digestin en mezcla acida ( HNO3+ HClO4 ). Una vez hecha la digestin se afora a 25 mls de agua destilada. Procedimiento Del filtrado se toma 1ml de muestra, se agrega 9 mls de agua destilada, 0,5 nm despus de haber estado 40 minutos en reposo. Patrones: Se toman 10 mls de cada patrn y se procede de igual manera que en las mustras. Se utilizan patrones de 0.5, 1.0, 2.0 y 4 ppm Clculos: V.af x K. Abs 25 x K x Abs ppm Al = -------------- = ------------- = K x Abs x 50 grs muestra 0,5 V af = Volumn aforamiento K = Constante ( concentracin patrones ) Abs = Absorbancia gr = Gramos muestra.