Manual de Tcnicas Microbiolgicas

Para la Evaluacin de la Calidad Ambiental de Ecosistemas Marino costeros

HONORABLE AYUNTAMIENTO DE SOLIDARIDAD 2008-2011

CRDITOS COMIT EDITORIAL

Honorable Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad

C. Eduardo Romn Quian Alcocer Presidente Direccin General de Ordenamiento Ambiental y Urbano Arq. Jorge Alonso Durn Rodrguez Director General Direccin de Medio Ambiente M. en C. Gladys Prez de la Fuente Directora MANUAL DE TCNICAS MICROBIOLGICAS PARA EVALUACIN DE LA CALIDAD AMBIENTAL DE ECOSISTEMAS MARINO COSTEROS Ministerio de Ciencia, Tecnologa y Medio Ambiente Instituto de Oceanologa, Cuba Departamento de Microbiologa-Necton Dra. Mara Elena Miravet Regalado M. en C. Diana Iris Enrquez Lavandera Dra. Margarita Lugioyo Gallardo Universidad Nacional Autnoma de Mxico Instituto de Biologa Departamento de Botnica Dra. Mara del Carmen Gonzlez Villaseor Colaboradores Direccin de Medio Ambiente M. en C. Gladys Prez de la Fuente Directora M. en C. Nuria Joseph Montero Lic. Mara Cristina Cap de Paz Tcnico Francisca Rodrguez Acosta

PREFACIO
Estamos conscientes de la importancia de este libro para los especialistas de habla hispana que se desenvuelven en el tema del medio ambiente e incluso, para los estudiantes que se inician en esta lnea, ya que brindan los detalles necesarios para determinar la calidad ambiental del ecosistema marino a partir de diferentes indicadores microbiolgicos, que como es conocido, permite tomar medidas inmediatas para la proteccin y/o recuperacin de las condiciones naturales. El presente Manual, resume las tcnicas y metodologas de microbiologa marinas ms utilizadas para abordar los aspectos siguientes: evaluacin de la calidad del agua de uso recreativo, desde el punto de vista higinico sanitario, evaluacin de la calidad ambiental de las aguas y sedimentos en los diferentes ecosistemas marinos (arrecifes, manglares, pastos marinos, playas), determinacin de microorganismos indicadores del grado de contaminacin tanto orgnica, como por la presencia hidrocarburos, en la zona costera marina, velocidad de autodepuracin de las aguas marinas (importante para inferir la capacidad de recuperacin), parmetros microbiolgicos tiles en estudios de factibilidad para situar granjas para cultivo de organismos marinos, indicadores microbiolgicos necesarios para hacer lneas bases en sitios de desarrollo turstico, en aquellos donde se siten plataformas petroleras u otras industrias.

Adems de los indicadores de calidad ambiental, se incluyen tcnicas para aislar microorganismos de peces, crustceos, algas y otros organismos marinos con diversos fines, y de inters biotecnolgico como:

tcnicas para aislar microorganismos marinos productores de sustancias biolgicamente activas (tensoactivos, polisacridos y luciferasa), tcnicas para estudiar la diversidad de hongos marinos en playas, manglares, y arrecifes.

El Manual ofrece tambin detalles explcitos y recomendaciones prcticas para facilitar el montaje de las tcnicas e interpretacin de los resultados, y constituye un basamento adecuado para estudios de pre y postgrado de microbilogos y bilogos marinos. Se merece destacar que es una importante contribucin para el Programa Integral de Playas Limpias en Mxico, en el cual participa el H. Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad, a travs del Comit Local de Playas Limpias de la Zona Norte del Estado de Quintana Roo.

Editores

PRLOGO
La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a ms de 3 mil 500 millones de aos y una parte importante de sta ha ocurrido en el medio marino. Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes trficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la regeneracin de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos. Los microorganismos marinos juegan un papel importante en los ciclos biogeoqumicos de carbono, el nitrgeno, el azufre, el fsforo, el hierro y los metales trazas, pero adems constituyen nuevas fuentes de produccin de sustancias biolgicamente activas de inters para las industrias mdico-farmacutica, petrolera, alimenticia, etc. Este Manual de Tcnicas de Microbiologa Marina, est dirigido a estudiantes, docentes y especialistas de Amrica Latina que se proponen a estudiar e investigar diferentes aspectos relacionados con las bacterias y los hongos que habitan en el ecosistema marino. Su principal ventaja es que en l se han recopilado tcnicas y metodologas de trabajo muy utilizadas en esta especialidad, que se encuentran dispersas en diferentes publicaciones en otros idiomas, lo que facilita al usuario de habla hispana su consulta en un nico documento. Otro aspecto importante de este documento, es que sirve de apoyo a los profesores en la preparacin y desarrollo de los programas dre educacin superior relacionados con las ciencias marinas, y a los jvenes graduados que se inician en los trabajos de ecologa microbiana marina. El manual se ha conformado dividido en seis captulos. En el primero se abordan aspectos tericos generales sobre la distribucin e importancia de los microorganismos marinos en el ecosistema y algunas generalidades de los principales biotopos que caracterizan nuestra regin. El segundo captulo reune algunas de las tcnicas ms utilizadas de enumeracin de bacterias hetertrofas, sulfatoreductoras y coliformes, de suma importancia en estudios de contaminacin orgnica y fecal en aguas marino costeras, as como las tcnicas de aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos y productoras de tensioactivos, productoras de polisacridos, bacterias luminicentes, bacterias asociadas a peces invertebrados marinos, y bacterias asociadas a macroalgas y fanergamas marinas. En el tercer captulo se describen tcnicas y metodologas de aislamiento de hongos marinos de playas, pastos marinos, manglares, y hongos asociados a gorgnidos, hacindose referencia a las claves ms actualizadas de identeificacin de estos microorganismos. El cuarto captulo explica los mtodos que se utilizan para la conservacin de bacterias y hongos en el laboratorio, brindando referencias que permiten profundizar en detalles especficos para cada caso. En el captulo quinto se describen las tcnicas de conteo total de mecroorganismos empleando microscopa de epifluorescencia, la determinacin de bimasa a partir del

volumen celular y el conteo total y varios mtodos para determinar la productividad bacteriana. Tambin, se presentan las tcnicas para determinar la productividad bacteriana. Tambin, se presentan las tcnicas para determ,inar la fotosntesis, produccin primaria y respiracin, aspectos sumamente importantes en los estudios sobre el funcionamiento del medio marino, y por ltimo, se describen las tcnicas para determinar la intensidad de los procesos de descomposicin aerobia y anaerobia de la materia orgnica, respectivamente, empleando mtodos que no requieren de una infraestructura compleja y recursos sofisticados. El captulo sexto y final, brinda la composicin de los medios de cultivo que se han citado en los captulos dos y tres, lo que permite disponer de toda la informacin tcnica necesaria para realizar las tcnicas descritas. Las tcnicas que se describen en este manual han sido probadas con xito en el Laboratorio de Microbiologa Marina del Instituto de Oceana de Cuba y en el Laboratorio de Ascomicetos del Instituto de Biologa de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Resulta meritorio el empeo colectivo de las autoras de poner a disponer del alumnos y profesores el resultado de sus experiencias para contribuir al conocimiento del mundo marino. Esperamos que el noble propsito de las autoras les permita a los lectores seguir los caminos de los nuevos conocimientos para habitar un mundo ms sano y mejor.

Dra. Lina Domnguez Acosta Viceministro Ministerio de Ciencia , Tecnologa y Medio Ambiente de Cuba

Hay ms microorganismos en el mar que estrellas en el universo Copley, J. 2002. All at sea. Nature 415: 572-574.

NDICE
PREFACIO PRLOGO CAPTULO 1. Introduccin. 1.1. Distribucin de los microorganismos en el mar ........................................................ 4 1.2. Importancia de los microorganismos marinos ............................................................ 6 1.3. Caractersticas de los Ecosistemas marinos ............................................................... 9 CAPTULO 2. Tcnicas de Bacteriologa. 2.1. Enumeracin de bacterias hetertrofas aerobias mesfilas ........................................ 2.2. Enumeracin de bacterias sulfatoreductoras .............................................................. 2.3. Enumeracin de Coliformes totales y fecales ............................................................ 2.4. Enumeracin de Estreptococos fecales ...................................................................... 2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos .......................................... 2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas ............................. 2.7. Aislamiento de bacterias productoras de polisacridos extracelulares ....................... 2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes ...................................................................... 2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos ........................................ 2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanergamas marinas............... CAPTULO 3. Tcnicas Micolgicas. 3.1. Aislamiento de hongos en las playas .......................................................................... 3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos ............................................................ 3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle .............................................................. 3.4. Aislamiento de hongos asociados a organismos marinos ........................................... 21 28 32 40 46 51 56 60 64 73 79 84 88 92

CAPTULO 4. Mtodos de Conservacin. 4.1. Bacterias ..................................................................................................................... 99 4.2. Hongos ........................................................................................................................ 405 CAPTULO 5. Tcnicas y Mtodos en Ecologa microbiana. 5.1. Conteo Directo del Nmero Total de microorganismos ............................................. 5.2. Determinacin de biomasa ......................................................................................... 5.3. Determinacin de la Productividad bacteriana ........................................................... 5.4. Determinacin de la Fotosntesis, la Produccin primaria y la Respiracin ............... 5.5. Determinacin de la intensidad del proceso de mineralizacin aerobia de la materia orgnica ..................................................................................................... 5.6. Determinacin de la intensidad del proceso de mineralizacin anaerobia de la materia orgnica en los sedimentos ................................................................... 111 117 123 131 137 142

CAPTULO 6. Medios de Cultivo. 6.1. Bacterias ..................................................................................................................... 147 6.2. Hongos ........................................................................................................................ 160

Captulo 1 Introduccin

INTRODUCCIN Microorganismo es un trmino que incluye distintas formas de vida que comparten la caracterstica comn de tener un tamao menor de 200 m (Tabla 1). Estas formas de vida pueden pertenecer a cualquiera de los tres dominios de la vida que existen en nuestro planeta, Archaea, Bacteria y Eukarya (Woese et al. 1990), e incluye desde procariotas (bacterias y arqueas) hasta eucariotas (algas y protistas fagotrofos), tanto auttrofos como hetertrofos. Asimismo, dentro del mbito de estudio de la Microbiologa se incluyen los virus y otros agentes subvricos que no presentan estructura celular (Lpez y Zaballos, 2005). Recientemente, se ha propuesto un nuevo dominio biolgico denominado Akamara para incluir estas formas de vida (Hurst, 2000). Dentro de este nuevo dominio se propone incluir dos reinos, Euviria (virus verdaderos) y Viroidia (viroides y virusoides), y una organizacin en phyla, clases, rdenes, gneros y especies similar a la del resto de seres vivos (Hurst, 2000). Tabla 1. Diferentes categoras en que se agrupan los microorganismos de acuerdo a su tamao (Tomado de Sherr, E. y Sherr, B. 2000. Marine microbes: an overview. En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss, New York. 13-46).

Categora
Femtoplancton Picoplancton

Grupo Microbiano
Viruses Procariotes Bacterias Fotoauttrofos Proclorofitas Cianobacterias cocoides Cianobacteriasfilamentosas Quimioauttrofas Hetertrofas Archaea Picoalgas Flagelados picohetertrofos

Tamao (m)
0.01-0.2

0.5 1.0 0.5 2.0 1.0 2.0 7-10 ancho <= 100 longitud 0.3-1.0 0.3-1.0 1.0-2.0 2.0-20

Nanoplancton

Nanoalgas Nanoheterotrficos(flagelados) Microalgas Protistas microhetertrofas Ciliados Dinoflagelados hetertrofos

Microplancton

20-200

Pgina

INTRODUCCIN 1.1. Distribucin de los microorganismos en el mar. En el mar, los microorganismos se encuentran distribuidos en toda su extensin: desde la costa hasta zonas ocenicas muy distantes, y desde la superficie hasta profundidades abismales, ocupando una gran variedad de habitats. En la distribucin y abundancia de los microorganismos marinos en el ocano se reconoce que influyen, de manera general, tres gradientes: Gradiente de profundidad, en el cual vara la cantidad y calidad de la luz, la concentracin de nutrientes, la temperatura y la presin, Gradiente nertico-ocenico, en el cual vara la disponibilidad de materia orgnica teniendo en cuenta que en las aguas costerasnerticas hay mayor influencia del escurrimiento terrgeno y el aporte de los ros, y Gradiente latitudinal, que ocurre debido a las variaciones en la energa solar, es decir, las bajas latitudes reciben ms energa por m2 que las altas latitudes, crendose vientos que causan mezclas, afloramientos y corrientes en el ocano. Para facilitar su estudio, el ecosistema marino se ha dividido de manera emprica (Fig.1).

Fig.1. Habitats marinos (Tomado de Taylor, B.F. 1992. Marine Habitats, Bacteria. Enciclopedia of Microbiology, Vol.3, p.29-44). Una primera subdivisin se hizo entre las aguas (hbitat pelgico) y los sedimentos (hbitat bntico). Ambos habitats pueden corresponder a zonas de plataformas insulares o continentales conocidas como nerticas (desde la costa 4

INTRODUCCIN hasta 100 m de profundidad), o a zonas ocenicas de mas de 100 m de profundidad, hasta profundidades abismales. Tambin la interfase superficie del mar-atmsfera constituye un hbitat especializado donde habitan organismos llamados neuston. Otro hbitat lo constituyen los vegetales y organismos marinos vertebrados o invertebrados que proveen a los microorganismos de sus propios cuerpos como superficies sobre las cuales pueden formar sus colonias, e incluso, establecer relaciones de interaccin muchas veces de beneficio mutuo. Los restos de plantas y animales (detritus) y en general, los agregados de materia orgnica (nieve marina), las partculas fecales e inorgnicas, as como las estructuras sumergidas construidas por el hombre, constituyen tambin superficies inanimadas que promueven el crecimiento microbiano en el medio marino. La composicin qumica de los agregados es heterognea, contienen cantidades significativas de carbohidratos y protenas por lo que constituyen un micro hbitat rico en nutrientes con concentraciones de carbono y nitrgeno varios rdenes de magnitud mayor que la encontrada en las aguas circundantes (Alldredge y Silver, 1988). En estos agregados se han registrado elevadas tasas de produccin primaria (Gotschalk y Alldredge, 1989) y se ha comprobado que las bacterias que se desarrollan en ellos suelen ser fcilmente cultivables y de tamao mayor que las de vida libre (Eguchi y Kawai, 1992). Los agregados constituyen reservorios de nutrientes para las bacterias de vida libre, que pueden tomar su alimento directamente de ellos, aunque tambin se ha constatado que las clulas que forman parte de los agregados son responsables de la solubilizacin de las partculas de detritos mediante actividad exohidrolasa, produciendo la liberacin de carbono orgnico al medio circundante (Smith et al. 1992). Los compuestos de bajo peso molecular solubilizados pueden ser entonces utilizados por la comunidad de bacterias pelgicas oligotrficas. En la zona costera, la celulosa es el componente predominante del detritus. Proviene tanto de la vegetacin costera como de la submarina. Las partculas de materia orgnica estn formadas por protenas, polisacridos (incluyendo quitina) y lpidos; algunos de estos compuestos son degradados por los microorganismos en la columna de agua y otros menos asequibles a la actividad microbiana (refractarios) se depositan en el fondo donde ocurre su descomposicin final. Pgina 5

INTRODUCCIN Las partculas inorgnicas llegan al mar a travs del escurrimiento terrgeno y los ros y tambin, provienen de dientes, esqueletos y conchas de organismos marinos. En resumen, los microorganismos pueden encontrarse libres en la columna de agua formando parte del plancton, en los sedimentos, o adheridos a organismos o sustratos inanimados. 1.2. Importancia de los microorganismos marinos. La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a ms de 3 500 millones de aos y una parte importante de sta ha ocurrido en el medio marino. Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes trficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la regeneracin de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos (Lpez y Zaballo, 2005). Dentro de la diversidad de microorganismos que habitan en el medio marino, las bacterias y los hongos juegan un papel predominante, ya que se ocupan de descomponer la materia orgnica presente en el mar dando lugar a compuestos menos complejos asequibles a otros organismos de la trama alimentaria. Un ejemplo importante es la capacidad de los hongos de despolimerizar la celulosa y la pectina en la materia vegetal residual, con lo cual ablandan y ayudan a la descomposicin de dicho material, hacindolo accesible para otros invertebrados que pueden as devorarlo. Paralelo al proceso de descomposicin, las bacterias y los hongos asimilan los compuestos orgnicos disueltos para formar su propia biomasa, la que a su vez, queda disponible para ser consumida como alimento por protozoos y flagelados, as como por otros organismos. Esta va microbiana de reincorporacin de materia orgnica a la trama alimentaria se conoce como lazo microbiano (microbial loop, Azam, 1998) y es de suma importancia en el funcionamiento del ecosistema marino. En aguas ocenicas profundas donde la presin hidrosttica es como promedio, 400 veces mayor que en la superficie, la temperatura es baja, y por lo general, la materia orgnica es escasa, existen bacterias barotolerantes y barfilas adaptadas a la escasez de materia orgnica (oligotrficas) y a las bajas temperaturas (psicrfilas) que juegan un papel preponderante en la descomposicin de los restos fecales producidos por los organismos (Taylor, 1992).

INTRODUCCIN Tambin, existen bacterias que viven en el intestino de anfpodos de aguas profundas proveyndolos de nutrientes que no pueden absorber por otras vas. Un descubrimiento de gran impacto fue conocer que determinados microorganismos quimiolitotrfos viven en asociacin directa con invertebrados (gusanos tubcolas) que habitan en fuentes hidrotermales submarinas que expulsan fluidos a 270-380C. Estos invertebrados dependen de la actividad de los microorganismos que crecen a expensas de las fuentes de energa inorgnicas procedentes de las propias fuentes hidrotermales, e incorporan dixido de carbono, que se encuentra en abundancia en el agua de mar en forma de CO32- y HCO3-, a la forma orgnica. Estos microorganismos quimiolitotrfos proporcionan alimento a los animales, ya que estos se nutren de los productos de excrecin de los simbiontes y de las clulas muertas de los mismos, por lo que se consideran la base de la corta trama alimentaria en la que se encuentran los organismos que viven junto a las fuentes hidrotermales (Madigan et al. 1999). Los microorganismos juegan un papel importante en los ciclos biogeoqumicos del carbono, el nitrgeno, el azufre, el fsforo, el hierro y los metales trazas. En la mayora de los ecosistemas, el nitrgeno es eficientemente reciclado debido a la actividad descomponedora de los microorganismos que da lugar a formas inorgnicas como nitratos o amonio. En los pastos marinos, el nitrgeno es fijado por las cianobacterias que viven en las hojas y por las bacterias anaerobias que viven en las races, en los rizomas y en los sedimentos. En los sedimentos, la oxidacin de la materia orgnica ocurre a partir del uso de diferentes aceptores de electrones en la medida que aumenta la profundidad y cambia la disponibilidad de estos compuestos (Fig.2).

Fig.2. Distribucin tpica de los compuestos aceptores de electrones que utilizan las bacterias en los sedimentos (Tomado de Taylor, 1992). Pgina 7

INTRODUCCIN Cuando se agota el oxgeno, ms del 50% de la mineralizacin de la materia orgnica ocurre gracias a la actividad de las bacterias sulfatoreductoras, las cuales llevan a cabo este proceso a partir de la reduccin de sulfatos en condiciones anaerobias. Entre los ciclos del azufre y el hierro se producen interacciones complejas en muchos ambientes. Una de las formas ms corrientes del hierro y el azufre es la pirita (FeS2), la cual forma una estructura cristalina altamente insoluble. La oxidacin bacteriana de este compuesto tiene gran importancia para el desarrollo de las condiciones de acidez en las minas y en los drenajes mineros, y tambin, en el proceso de lixiviacin de los metales. Otra actividad de importancia econmica y ambiental donde participan los microorganismos es la descomposicin del petrleo y sus derivados. La eliminacin del petrleo o de otros contaminantes mediante el uso de microorganismos se conoce como bioremediacin y ha sido ampliamente utilizado para descontaminar zonas donde se han producido vertidos de crudos. Tambin, se conoce que existen hongos y bacterias capaces de degradar compuestos qumicos sintticos (xenobiticos) como los plaguicidas y herbicidas, lo cual es de gran utilidad para el saneamiento del medio ambiente, pero adems, tiene un significado evolutivo, ya que estos compuestos no existan en la Tierra hasta hace poco ms de 50 aos (Madigan et al. 1999). Desde el punto de vista biotecnolgico, adems de la bioremediacin, se reconoce la importancia de los microorganismos marinos como potenciales productores de sustancias biolgicamente activas para la industria mdicofarmacetica. Los grupos de microorganismos ms estudiados con estos fines son las microalgas, las bacterias y los hongos marinos (Fenical y Jensen, 1993; De la Rosa y Gamboa, 2003). Existen numerosas publicaciones de diferentes autores que refieren la deteccin de microorganismos productores de antibiticos, agentes antitumorales, antivirales y enzimas (Atlas y Bartha, 2002; De la Rosa y Gamboa, 2003; Nishihara et al. 2008), sin embargo, an existen microorganismos que no crecen en los medios de cultivo tradicionales, o despus de crecer, pierden la capacidad de producir determinado compuesto. El hecho de que las condiciones que prevalecen en el medio marino sean difciles de reproducir en laboratorio provoca que un elevadsimo porcentaje de estas bacterias (hasta un 99%) no haya podido ser cultivado, y por tanto, se desconozca qu papel ecolgico juegan de manera individual. Hoy en da es posible tambin abordar el estudio de la dinmica de un ecosistema natural a nivel genmico. Mediante el anlisis de los genomas com8

INTRODUCCIN pletos se puede intentar reconstruir el funcionamiento de los microorganismos, as como su potencial fisiolgico y metablico, y relacionarlo con los compuestos existentes en el ambiente en el que se desarrollan (Lpez y Zaballos, 2005; Amann y Fuchs, 2008). 1.3. Caractersticas de los ecosistemas marinos. Arrecifes coralinos. Los arrecifes coralinos son estructuras geolgicas slidas, masivas, de origen biolgico, y con formas variadas, que cubren la matriz rocosa de algunos fondos marinos tropicales y subtropicales. stos crecen hacia la superficie y son creados por organismos fijos al fondo que forman esqueletos ptreos de carbonato de calcio. En el Gran Caribe, los organismos fijos que los conforman son principalmente, los corales ptreos, las esponjas, los octocorales, las ascidias y las algas, y los mviles, una rica fauna de peces e invertebrados. Los arrecifes coralinos, adems de una alta diversidad biolgica, poseen grandes valores naturales y socio-econmicos. Tienen gran valor intrnseco por su carcter nico. A pesar de su muy limitada extensin sobre el ocano, los arrecifes coralinos albergan la cuarta parte de las especies marinas del mundo (Alcolado, 2006). Ms del 25% de las capturas comerciales de los pases en desarrollo provienen de especies que habitan o guardan alguna relacin de dependencia con ese biotopo (Jameson et al. 1995). Segn Costanza et al. (1997) los arrecifes del mundo en conjunto proveen bienes y servicios por valor de cerca de 375 000 millones de USD/ao. Spalding et al. (2001) estimaron un total mundial de 284 300 km2 de arrecifes, por tanto, estas dos cifras arrojan un estimado grueso de ingresos de 1 319 millones de USD/ao por km2 de arrecife (Alcolado 2006). En los arrecifes habita una gran diversidad de microorganismos, vegetales e invertebrados portadores de sustancias biolgicamente activas, que se emplean o constituyen recursos potenciales como frmacos y reactivos de inters bioqumico. Muchas de sus especies se utilizan para la elaboracin de objetos de artesana y bisutera. Los arrecifes constituyen una de las principales fbricas de la arena blanca que nutre las playas, principal recurso turstico de la mayora de los pases caribeos. Sus barreras o crestas brindan proteccin a las costas contra la erosin producida por el oleaje y tambin protegen poblados y edificaciones de las costas. Adems de constituir un extraordinario atractivo para el turismo de buceo, los arrecifes coralinos poseen un gran valor educacional, cientfico y tico. Segn Alcolado (2006) tambin son indicadores de la calidad de las aguas marinas y de los efectos de los cambios climticos globales. Pgina 9

INTRODUCCIN Sobre la diversidad de bacterias y hongos en arrecifes de coral, existe escasa informacin, el mayor nfasis se ha puesto en el estudio del efecto de los microorganismos sobre la salud de los arrecifes, ya que algunas enfermedades de los corales se han atribuido a la accin de microorganismos patgenos especficos (Borneman, 2008). Los fondos duros no arrecifales. Los fondos duros no arrecifales se localizan en las macrolagunas, fuera de las zonas pre-arrecifales y arrecifales. Se caracterizan por poseer bsicamente un fondo rocoso cubierto por una capa de arena predominantemente delgada o localmente ausente, y a menudo, por parches de pastos marinos o de pequeos depsitos de arena. Con frecuencia suelen presentar corales aislados, tpicamente del gnero Solenastrea o pequeos cabezos coralinos y gorgneas de los gneros Pterogorgia y Pseudopterogorgia entre otros. Tiende a ser un biotopo ms bien mixto a manera de mosaico, lo que lo hace portador de una notable diversidad de especies, en comparacin con la que corresponde a los biotopos componentes. A diferencia de los arrecifes sus aguas son menos transparentes por la mayor concentracin de fitoplancton. No deben confundirse con los fondos de cabezos o de arrecifes de parche, ni con los que algunos denominan fondos duros no colonizados o comunidades de corales, ya que no son arrecifes porque el cubrimiento de corales es inferior al 10%. Estos aparecen comnmente dentro del perfil de los arrecifes a poca profundidad (generalmente a menos de 6 m de profundidad) y se corresponden con la terraza somera o superior, conocida como zona de Pseudopterogorgia (Goreau, 1959), pavimento rocoso o explanada abrasiva. Tambin aparecen en bajos de muy escasa profundidad formando crestas que actan como rompientes. Este biotopo sostiene una pesca que incluye esponjas, langostas y varias especies de peces. Alberga especies de corales que son muy raras en los arrecifes coralinos. Algunos sitios pueden resultar de inters contemplativo para el turismo de naturaleza y la recreacin (Alcolado, 2006). Fondos de sedimentos no consolidados. Biotopo arenoso y de playa. El biotopo arenoso o arenal puede ser: desde puramente arenoso hasta areno-fangoso, segn la proporcin de fango o cieno (partculas ms finas). Su existencia se debe a la relativa inestabilidad producida por un fuerte hidrodinamismo (oleaje y corrientes) que limitan la deposicin de sedimentos de fango o cieno y de materia orgnica particulada, e impiden el desarrollo de yerbas marinas. En Cuba la composicin de la arena tiende a estar dominada por restos de algas calcreas, de moluscos y de corales, aunque en lugares especficos est compuesta mayormente por oolita (granos de arena casi esfricos que se forman por deposicin de carbonato de calcio bajo condiciones fsicas especficas de temperatura, salinidad, y pH). 10

INTRODUCCIN Debido a su inestabilidad, este biotopo se caracteriza por su relativamente baja diversidad de especies y poca productividad. En l pueden habitar macroalgas (comnmente algas verdes calcreas como Halimeda, Penicillus, Udotea, Rhipocephalus, etc.) o delgados tapices de microfitobentos. Ejemplos de este tipo de fondo son las playas, mdanos, bancos, depsitos en lechos rocosos, cangilones de arrecifes y algunas terrazas arrecifales. Constituye un hbitat de especies especializadas, brinda refugio y alimento a algunas especies que se entierran en la arena (rayas, algunos peces telesteos, poliquetos, holoturias, etc.), proporciona arena para las playas y construcciones y contribuye a la formacin y mantenimiento de las dunas de las playas y las cuencas arenosas. Biotopo fangoso. Como su nombre lo indica, el fondo fangoso o fanguizal, est formado por sedimentos en que predomina la fraccin fangosa o cieno. De acuerdo a la granulometra y la hidrodinmica local, los fangos pueden ser ms o menos blandos o compactos, llegando a ser casi lquidos cuando son pelticos, es decir, el dimetro promedio de las partculas es menor de 0.0625 mm. La falta de luz, la sedimentacin excesiva y la liquidez del fondo suelen ser las causas que impiden el desarrollo de las yerbas marinas en ellos. Los fangos lquidos son menos propicios para el desarrollo del bentos que los ms compactos y estables. Si bien su diversidad de especies es comparativamente baja, su productividad neta (explotable) puede ser localmente alta. Su ambiente como regla es fluctuante e impredecible, y adems se caracteriza por un rgimen hidrodinmico comparativamente dbil. Es tpico de ambientes eutrofizados y tambin, de plataformas profundas protegidas, donde la luz que llega al fondo es insuficiente para el desarrollo de pastos marinos. Como fauna tpica pueden mencionarse camarones, telestceos, algunas esponjas, erizos irregulares y peces. Los fondos fangosos saludables son altamente productivos y constituyen una fuente de importantes recursos pesqueros como camarones, moluscos y peces. Este biotopo, mediante la descomposicin de materia orgnica que produce e importa, genera y exporta nutrientes a otros ecosistemas marinos (Alcolado, 2006). Pastos marinos (vegetacin sumergida). Los pastos marinos, conocidos como seibadales, son fondos de sedimentos no consolidados con desarrollo de yerbas marinas (fanergamas) y algas. Las yerbas son principalmente Thalassia testudinum, Syringodium filiformis y Halodule wrighti. En lugares afectados por altas salinidades o en mdanos muy bajos sometidos a altas temperaturas suele dominar H. wrighti. Estos despliegan una alta productividad neta que es exportada a los arrecifes y explotada por el hombre.

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INTRODUCCIN Los pastos marinos son la principal va de entrada de la energa que garantiza la productividad biolgica y pesquera en la plataforma cubana y constituyen una fuerte reserva ecolgica de materia y energa en forma de biomasa, parte de la cual es exportada a los arrecifes y al ocano lo que en cierta medida aumenta la productividad de stos biotopos. Se ha estimado el valor de los bienes y servicios de los pastos marinos en unos 19 000 USD/ha ao, tomando como referencia solamente su importancia en el reciclaje de nutrientes (Constanza et al. 1997). Tambin actan como estabilizadores del fondo, previniendo su erosin y la afectacin de los arrecifes y de las playas colindantes, regulan la concentracin de oxgeno y gas carbnico en el mar, y condicionan fuertemente los procesos biogeoqumicos locales. Muchos pastos marinos son formadores de gran parte de las arenas de las playas gracias al desarrollo de algas calcreas, principalmente Halimeda (Alcolado, 2006). Las lagunas costeras y estuarios Las lagunas costeras son cuerpos de agua relativamente pequeos, poco profundos (menos de 2 m), con conexin limitada, permanente o temporal con el mar. Poseen, en su mayora, considerable aporte de agua dulce, sedimentos, nutrientes y materia orgnica procedentes de tierra, lo que determina en parte su alta productividad biolgica, o en caso de exceso de los dos ltimos, su degradacin. El sedimento principal es el fango o cieno de color oscuro, casi siempre con penetrante olor a sulfuro de hidrgeno. Cerca de las desembocaduras puede haber sustrato rocoso a causa de las corrientes de marea que impiden la acumulacin de sedimentos. Se caracterizan por sufrir fluctuaciones relativamente grandes en la salinidad y temperatura, y en muchos casos de la propia biota. Generalmente, estn bordeadas por bosques de mangle y pueden abundar los pastos marinos sobre todo, hacia las orillas. Las lagunas costeras constituyen el hbitat de diferentes fases de la vida (larvas, juveniles y adultos) de muchos recursos pesqueros como camarones, lisas, rbalos, corvinas, sbalos, ostiones, etc.. En ellas y su entorno suelen habitar de forma permanente o temporal numerosas especies de aves y otros organismos silvestres, algunos en peligro de extincin, como el manat. En cierta medida las lagunas costeras protegen a los ecosistemas exteriores contra pulsos de excesivos nutrientes y de sedimentos suspendidos, al retenerlos (efecto amortiguador). Muchas poseen gran valor paisajstico, recreativo y turstico. Las lagunas y estuarios son los ecosistemas marinos de mayor productividad pesquera, y son zonas potenciales para el desarrollo del maricultivo. Por otra parte, son reas de reproduccin y cra de camarones y de otras especies comerciales (Alcolado 2006).

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INTRODUCCIN Manglares. Se localizan en las costas de origen biolgico, acumulativas, cenagosas y en esteros con escurrimientos de agua dulce, aunque tambin en ambientes salinos como por ejemplo, los cayos que bordean la plataforma submarina cubana, muchos de ellos formados por los propios manglares. En zonas con aportes de aguas dulces y nutrientes los bosques de mangle alcanzan 20-25 m de altura y una alta densidad, mientras que en aguas muy saladas y pobres en nutrientes pueden ser de pequea talla, achaparrados o enanos. Los bosques de manglar pueden ser monodominantes o mixtos (Menndez-Cabrera y Priego-Santander, 1994). Asociados al bosque de manglar habita una rica fauna, destacndose las aves endmicas o de hbitat reducidos, algunas de las cuales lo utilizan como rea de anidamiento y/o refugio, y muchas son migratorias. Sobre las races de los mangles y alrededor de estos, habita una gran diversidad de organismos, algunos de forma permanente (esponjas, ascidias, hidrozoos, anmonas, briosos, crustceos, peces, etc.), otros de trnsito como peces en etapas juveniles y crustceos. Las races de los manglares sirven de sustrato a numerosos invertebrados y peces. Entre los primeros prevalecen los crustceos y moluscos. Adems, se fijan al mangle escaramujos, varias algas epfitas y esponjas que son hospederos de numerosos organismos, como los ascidiceos coloniales y los celenterados. La composicin de la ictiofauna del manglar depende de las caractersticas ambientales de cada sitio. Asociados a los manglares estuarinos prodominan los peces tpicos de las lagunas costeras: robalos (Centropomidae), mojarras y pataos (Gerridae), lisas (Mugilidae), corvinas (Sciaenidae) y algunas especies arrecifales altamente tolerantes a diferentes salinidades como algunos pargos (Lutjanus griseus, L. apodus y L. jocu) o sus etapas juveniles. En los manglares de los cayos, donde prevalecen aguas con salinidad y transparencia ms parecidas a las de los arrecifes coralinos, habitan peces tpicos de ese biotopo ms algunas poco comunes en estos, como las sardinas (Clupeidae), mojarras, pataos y otros. Los manglares aportan energa al ecosistema acutico, mediante sus hojas, ramas y races (y su microbiota asociada), las cuales pasan a formar parte del detrito acumulado en los sedimentos. Las races de los mangles sirven de refugio a las etapas juveniles de langostas y peces. La mayora de los peces del manglar forman parte de las pesqueras que se realizan en el complejo seibadalarrecife. En la parte area los manglares proveen madera, lea, carbn, taninos para curtir pieles, y productos apcolas como miel, cera y propleos. Adems, Pgina 13

INTRODUCCIN los manglares protegen las costas de la erosin provocada por el oleaje, el viento y las corrientes costeras y filtran los contaminantes y los sedimentos evitando que lleguen a los arrecifes coralinos y otros biotopos. De vital importancia es la proteccin que brindan a la poblacin e infraestructuras costeras contra las violentas penetraciones del mar y el efecto de los huracanes. Costa rocosa baja y costa acantilada. La costa rocosa baja y la costa acantilada, por su constitucin rocosa predominantemente crsica, gozan de una gran solidez, aunque el batir constante del oleaje y el intemperismo tallan el complicado microrelieve (mezcla de grietas, puntas y crestas afiladas, concavidades) y macrorelieve (cavernas, buzamientos, charcas, fracturas, desprendimientos, etc.) que los caracteriza. El ambiente a que est sometida la biota en estos sitios es harto severo, con una mezcla casi constante (pero con pulsos extremos de insolacin, rociamiento, desecacin, mareas, inundacin, golpes de olas, lluvias, etc.). La flora y la fauna, estn generalmente distribuidas a manera de cinturones sucesivos perpendiculares al gradiente de influencia marina y de la altura de la costa. En estas costas son tpicos los cangrejos grpsidos, gran diversidad de moluscos como quitones, neritas, litorinas, siguas, mejillones, etc. Las algas en el estrato ms baado por el mar son variadas y las especies dominantes dependen mayormente del grado de eutrofizacin y agitacin del agua, la estacin del ao, y el rgimen de desecacin; este ltimo determinado en gran medida por la inclinacin y la distancia del sitio al nivel medio de las mareas. En los lugares con aguas extremadamente eutrofizadas suelen ser abundantes las algas del gnero Ulva. En las charcas suelen estar presentes de manera casi siempre temporal peces clnidos, eletridos, gbidos y ciprinodontidos. Estos ltimos son peces de agua dulce, algunas de cuyas especies resisten altas salinidades (Alcolado 2006).

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INTRODUCCIN BIBLIOGRAFIA Alcolado, P 2006. .M. Caractersticas ambientales de los ecosistemas marinos costeros principales de Cuba. En: La Biodiversidad marina de Cuba. R. Claro (Ed.). Instituto de Oceanologa. CD ROOM. Alldredge, A.L. y Silver, M.W 1988. . Characteristics, dynamics, and significance of marine snow. Prog. Oceanogr. 20:41-82. Amann, R. y Fuchs, B.M. 2008. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescente in situ hybridization techniques. Nature Reviews. Vol.6: 339-348. Atlas, R. y Bartha R. 2002. Ecologa microbiana y Microbiologa ambiental. Addison Wesley Person Education. S.A. Madrid, Espaa. 677 p. Azam, F. 1998. Microbial Control of Oceanic Carbon Flux:The Plot Thickens. Science. Vol. 280:694-696. Borneman, E. 2008. Arrecife Vivo No.12. http://www.arrecifevivo.co. Costanza, R., dArge, R., de Groot, R., Farber, S., Grasso, M., Hannon, B., Naeem, S., Limburg, K., Paruelo, J., ONeil,l R.V Raskin, R., Sutton, P y van ., . den Belt, M. 1997. The value of the worlds ecosystem services and natural capital. Nature 279: 253-260. De la Rosa, S. y Gamboa, M. 2003. Microorganismos acuticos: una farmacia por visitar. Ciencia Ergo Sum. Universidad Autnoma de Mxico, Toluca. 11 (002): 186-190. Eguchi, M. y Kawai, A. 1992. Distribution of oligotrophic and eutrophic bacteria in fish culturing inland bays. Nippon Suisan Gakkaishi 58:119-125. Fenical, W y Jensen, P . .R.1993. Marine Microorganisms: A New Biomedical Resource. p. 419-457. En: Marine Biotechnology, Vol.1: Pharmaceutical and Bioactive Natural Products. (Ed) D.H. Attaway y O.R. Zaborsky. Plenum Press, New York.

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INTRODUCCIN Smith, D.C., Simon, M., Alldredge, A.L., y Azam, F. 1992. Intense hydrolitic enzyme activity on marine aggregates and implications for rapid particle dissolution. Nature 359: 139-142. Spalding, M.D., Ravilioris, C. y Green, E. P 2001. . World Atlas of Coral Reefs. Prepared at the UNEP World Conservation Monitoring Centre. University of California Press, Berkeley, USA, 424 p. Woese, C.R., Kandler, O. y Wheelis, M.L. 1990. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 4576-4579.

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Captulo 2 Tcnicas de Bacteriologa

TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.1. Enumeracin de bacterias hetertrofas aerobias mesfilas Dentro de las comunidades microbianas las bacterias hetertrofas constituyen, despus de los virus, la poblacin ms numerosa (Marie et al. 1999) en los ecosistemas acuticos. Este grupo de bacterias comprende una amplia diversidad de gneros y en trminos numricos de abundancia, constituyen el componente biolgico ms importante involucrado en la transformacin y mineralizacin de la materia orgnica en la biosfera (Cho y Azam, 1988), ya que controlan los flujos de nutrientes en el sistema a travs de la mineralizacin de la materia orgnica (Schut et al. 1997) y la produccin secundaria de carbono (Azam et al. 1983). Adems, son capaces de utilizar la materia orgnica disuelta (MOD) que deriva de los organismos auttrofos y de la actividad metablica de otros organismos hetertrofos de mayores dimensiones presentes en el ambiente pelgico (Lpez y Zaballos, 2005). Las bacterias hetertrofas contribuyen a los ciclos de carbono y nutrientes por dos vas principales: a travs de la produccin de biomasa bacteriana (produccin secundaria) y mediante la remineralizacin del carbono orgnico y los nutrientes (del Giorgio y Cole, 1998). Objetivo: Determinar la concentracin de bacterias hetertrofas aerobias mesfilas en muestras de agua y sedimentos marinos. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Erlenmeyers. Frascos de vidrio estriles de 250 mL de capacidad. Frascos de vidrio estriles de 50 mL de capacidad. Pipetas de 10 y de 1 mL. Tubos de ensayo con tapones de algodn. Gradillas. Placas Petri. Esptulas de vidrio estriles. Tubo plstico para la toma de muestra de sedimento (corer). Jeringuilla despuntada. Papel de pH. Reactivos y medios de cultivo. Soluciones para ajustar el pH del medio. Buffer Fosfato. Medio 2216E para bacterias marinas (Oppenheimer y ZoBell, 1952).

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Equipos. Autoclave. Bao termostatado. Incubadora bacteriolgica. Detalles experimentales. Para el recuento y aislamiento de bacterias hetertrofas se pueden utilizar varios medios de cultivo: 2216E (Oppenheimer y ZoBell, 1952), Medio 6 (Gorbienko, 1961), Agar marino, etc. Actualmente se considera que el Agar marino comercial desarrollado a partir de Oppenheimer y ZoBell, (1952) est muy cargado en nutrientes e inhibe el crecimiento de bacterias oligotrficas, por lo que se han desarrollado una variedad de medios con bajas concentraciones de nutrientes para aislar este tipo de bacterias (Weiner et al. 1980; Austing y Allen, 1982). En la preparacin del medio de cultivo cuando se va a trabajar con muestras de aguas marinas se puede emplear agua de mar sin diluir (salinidad promedio entre 32 y 35 /oo), o diluida con agua corriente (750 mL agua de mar y 250 mL de agua corriente), en dependencia de la salinidad del lugar de aislamiento. Cuando se trata de bacterias aisladas de aguas interiores (lagos, ros, subterrneas), se puede utilizar agua destilada o agua corriente. Despus de esterilizar el medio a 121C 15 min el pH debe ajustarse hasta 7.0-7.2 para el caso de siembra de muestras marinas, y hasta 6.9 para muestras de aguas interiores. Cuando se siembra una porcin o dilucin de la muestra por vertido en placa (pour plates) se debe tener en cuenta que el medio de cultivo tenga la temperatura apropiada (entre 42C y 45C) para evitar la muerte de las clulas por exceso de temperatura. Cuando la temperatura del medio al verterlo en las placas es superior a 50C generalmente el vapor de agua que desprende se condensa en la tapa de la caja Petri y si no se elimina esta agua puede causar un crecimiento continuo o mezclado de colonias sobre el medio, lo que impide el recuento de colonias individuales y/o el aislamiento de cultivos puros (Schneider y Rheinheimer, 1988). Si se emplea el mtodo de siembra en superficie (spread plates) se vierte el agar en las placas y se deja secar en una estufa a 45C toda la noche antes de usarlas. Posteriormente, se extiende por toda la superficie del medio un volumen no mayor a 0.1 mL de la dilucin apropiada, utilizando una esptula de vidrio estril. La placa se incuba hasta que aparezcan las colonias.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Procedimiento. Muestras de agua de mar. Mtodo de siembra por vertido en placa (pour plates). Las muestras de agua se colectan preferiblemente por triplicado utilizando frascos de vidrio estriles de 250 mL de capacidad. A partir de cada muestra de agua se hacen las diluciones a conveniencia, segn el tipo de agua (Tabla 2), en agua de mar estril. Tabla 2. Diluciones recomendadas segn el tipo de muestra

Tipo de muestra
Aguas superficiales limpias

Diluciones
10-1, 10-2, 10-3, 10-4

Aguas moderadamente contami10-2, 10-3, 10-4, 10-5 nadas o aguas residuales tratadas Aguas contaminadas o aguas re10-4, 10-5, 10-6, 10-7 siduales sin tratamiento Nota: Dilucin 10-1 es igual a 1/10, es decir, 1 mL de muestra en 9 mL de diluyente (agua de mar estril, en este caso), dilucin 10-2 es igual a 1/100, es decir, 1 mL de muestra en 99 mL de diluyente, y as sucesivamente. De cada muestra o dilucin se vierte 1 mL en placas Petri (Colwell y Grigorova, 1986). Seguidamente, se aaden de 12 a 15 mL del Medio 2216E para bacterias marinas hetertrofas (Oppenheimer y ZoBell, 1952) previamente fundido y mantenido en un bao de Mara a una temperatura de 43-45C. Se mezcla los volmenes de muestra (o dilucin) aadidos con el medio de cultivo mediante movimientos suaves y rotatorios de la placa, y se deja solidificar. Se debe preparar una placa control conteniendo nicamente el medio de cultivo y una segunda placa control conteniendo el medio de cultivo y el agua de dilucin. Las placas se incuban a la temperatura seleccionada, teniendo en cuenta el rango ptimo de temperatura para el crecimiento de bacterias mesfilas (entre 25 y 40C) y la temperatura del agua en el lugar donde se tom la muestra, y se realiza el conteo de colonias a las 24, 48 y 72 h de incubacin con ayuda de un contador de colonias o empleado un microscopio estereoscpico. Se recomienda contar las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300 colonias, excepto en el caso de que el medio inoculado con 1 mL de agua no diluida contenga menos de 30 colonias. Pgina 23

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Si el conteo no se realiza inmediatamente despus del tiempo de incubacin, las placas se pueden conservar en refrigeracin hasta que se efecte el conteo siempre que este perodo no exceda las 24 h. Mtodo de siembra en superficie (spread plate). Si la siembra es en superficie se vierte 0.1 mL de la muestra, o de la dilucin, sobre el medio ya solidificado y se riega sobre la superficie con la ayuda de una esptula de vidrio estril (esptula Drygalski). Es importante que la superficie est bien seca para que el lquido que se extiende por la superficie empape rpidamente el medio. Durante esta operacin, debe tenerse cuidado de no romper la superficie del agar. Muestras de sedimentos. Los sedimentos se colectan con un tubo plstico o corer, si hay inters en seleccionar una profundidad especfica, o directamente de la capa superficial, se pueden emplear frascos de vidrio estriles de 50 mL de capacidad. De cada muestra se toma 1 cm3 con una jeringuilla despuntada estril y se aade a un tubo conteniendo 10 mL de agua de mar estril o Buffer Fosfato. Se agita por unos minutos el tubo en un vortex para propiciar la separacin de las clulas de las partculas de sedimento y se deja reposar por 2 o 3 min. Tambin se puede emplear ultrasonido para la separacin de las clulas adheridas a las partculas (Torreton, 1991). A partir del sobrenadante se hacen diluciones seriadas en agua de mar estril o Buffer Fosfato, hasta 10-6 u otra dilucin mayor si se cree conveniente, y se procede igual que se describi para la siembra de muestras de agua anteriormente. Conteo y clculos. El nmero de colonias obtenido en un conteo de viables depende no slo del tamao del inculo, sino tambin del medio de cultivo empleado, la temperatura y el tiempo de incubacin. No todas las clulas desarrollarn las colonias al mismo tiempo ni del mismo tamao, por lo que deben establecerse bien estos requisitos para evitar errores. El conteo de viables se expresa como unidades formadoras de colonias, en lugar de clulas viables, ya que una unidad de colonia puede contener ms de una clula. Para el clculo del nmero de unidades formadoras de colonia por mililitro, se cuentan las colonias crecidas en las placas, se calcula la media aritmtica entre las rplicas y se multiplica el promedio del nmero de colonias por el reciproco de la dilucin usada. Los resultados se reportan en Unidades Formadoras de Colonias por mililitros (UFC/mL) para las muestras de agua.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA En el caso de las muestras de sedimentos se puede dar el resultado en UFC/g de peso hmedo o de peso seco, para lo cual: 1g UFC/g (peso seco) = UFC/g (peso hmedo) x ------------------------------Peso seco de la muestra (g) El procedimiento habitual es determinar el peso seco despus de secar las muestras durante una noche a 90 - 110C. La masa seca de las clulas bacterianas es aproximadamente, entre el 10 y el 20% de la masa hmeda.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Austin, B. y Allen, D.A. 1982. Microbiology of laboratory-hatched brine shrimp (Artemia). Aquaculture. 26:369-383. Azam, F., Fenchel, T., Field, J.Q., Meyer-Reil, R.A., y Thingstad, F. 1983. The cycling of organic matter by bacterioplanktonic pelagic marine systems: Microenvironmental considerations. En M. J. R. Fashman (ed.) Flows of Energy and Materials in Marine Ecosystems: Theory and Practice. NATO Conf. Series 4, Marine Sciences. Plenum Press, New York, pp. 345-360. Cho, B.C., y Azam, F. 1988. Major role of bacteria in biogeochemical fluxes in the oceans interior. Nature 332: 441-443. Colwell, R. R. y Grigorova, R. 1987. Methods in Microbiology. Vol.19. Current Methods for Classifications and Identification of Microorganisms. Ed. Acad. Press. 518pp. Gorvenko, Y. A. 1961. Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivo para bacterias marinas hetertroas. En ruso. Mikrobiol. 30 (1): 168-172. Lpez Lpez A., Zaballos M. 2005. Diversidad y actividad procaritica en ecosistemas marinos. Ecosistemas. 2005/2. http://www.revistaecosistemas.net/articulo.asp. Marie, D., Brussaard, C., Thyrhaug, R., Bratbak, G., y Vaulot, D. 1999. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl Environ Microbiol 65: 4552. Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. 1999. Brock. Biologa de los microorganismos. 8va Ed. Print. Hall Iberia, Madrid. 1064p. Oppenheimer, C.H. y ZoBell, C. E. 1952. The growth and viability of sixty three species of marine bacteria as influenced by hydrostatic pressure. Journal Marine Research 11:10-18.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.2. Enumeracin de bacterias sulfatoreductoras Las bacterias sulfatoreductoras (BSR) son una de las formas de vida mas antigas del planeta, datan de al menos 2.72 mil millones de aos (NAI, 2003). Constituyen un grupo diverso de bacterias con capacidades metablicas diferentes, agrupadas por la caracterstica comn que tienen de usar el sulfato como aceptor terminal de electrones durante la respiracin anaerobia. Las BSR son anaerobias y requieren un potencial redox bajo (alrededor de -100 mV), para poder crecer. Sin embargo, el hecho de poseer enzimas como la superoxido dismutasa y la catalasa les permite sobrevivir en agua de mar oxigenada hasta niveles de tolerancia especficos de cada cepa (Cypionka et al. 1985). La ubicuidad de las BSR en el agua de mar ha producido problemas de corrosin, toxicidad y prdidas en las industrias del petrleo y gas donde se utilizan grandes volmenes de agua de mar como lastre y para el mantenimiento de la presin (Battersby et al. 1985). Las BSR son abundantes en fondos fangosos con o sin vegetacin (Smith et al. 2004), siendo mas activas en los 20 cm superiores de los sedimentos costeros donde hay abundantes sulfatos y condiciones reducidas de potencial redox. Generalmente, en estos sedimentos los sulfatos no son limitantes (aproximadamente, >2mM SO42-), por tanto, predomina la respiracin anaerobia mediante sulfatos como aceptor de electrones, pudiendo llegar a representar el 50% de la mineralizacin de carbono orgnico. Las BSR juegan un papel importante en el ciclo del azufre en el ocano removiendo la mayor parte del sulfato (aproximadamente 1011 kg) que llega al mar cada ao por el aporte de los ros debido al escurrimiento terrgeno (Battersby, 1988). Objetivo: Determinar el nmero de bacterias sulfatoreductoras en muestras de aguas y sedimentos marinos por el mtodo de Nmero Ms Probable. Materiales, reactivos, medio de cultivo y equipos empleados. Materiales. Frascos de vidrio de 150 mL de capacidad. Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad. Pipetas estriles de 10 y 1 mL. Tubos con tapas de rosca.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Reactivos y medio de cultivo. Buffer Fosfato. Medio API (Overzil, 1970). Equipos. Incubadora bacteriolgica. Jarra mezcladora estril. Zaranda. Detalles experimentales. La mayora de las BSR crece bien a temperaturas entre 25 y 35C, aunque usualmente se cultivan a una temperatura de incubacin de 30C. El sustrato es el factor selectivo determinante para el crecimiento de un tipo u otro de BSR procedente de aguas marinas o de otro medio en particular, por tanto, existen varios medios de cultivos recomendados para los diferentes tipos de BSR. En este acpite se utiliza el medio API (American Petroleum Institute) recomendado por Overzil, (1970), y se emplea la metodologa de diluciones seriadas en tubos mltiples para determinar el Nmero Mas Probable (NMP). Procedimiento. Se inoculan 10, 1 y 0.1 mL de la muestra de agua de mar en series de cinco tubos estriles y posteriormente, se le aade 10 mL de medio API a la primera serie de cinco tubos (muestra sin diluir) y 9 mL a las series siguientes de tubos (diluciones 1/10 y 1/100, respectivamente). Se cierra cada tubo con tapa de rosca y despus de rotularlos convenientemente, se incuban a 30C de 2 a 4 semanas. Debe prepararse un tubo control sin inculo. Se consideran positivos aquellos tubos donde ocurre un cambio de color de rojo a negro. En el caso de que sean muestras de sedimento, se toman 50g de muestra del horizonte seleccionado, y se suspenden en 450 mL de agua de mar estril o en Buffer Fosfato. Se homogenizan en una jarra mezcladora estril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obtenindose de esta forma la dilucin 1:10. A partir de esta dilucin, se preparan las restantes diluciones decimales: se toma 1 mL de la dilucin 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de agua de mar estril o Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obtenindose as la dilucin 1:100. Si se requiere mayor nmero de diluciones se seguir el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estril para cada dilucin. Posteriormente, se inoculan series de 5 tubos y se rellenan con medio API. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilucin 1:10 se les aaden 10 mL de medio API y constituyen las porciones de 1g. Se tomarn 5 alcuotas de 1 mL cada una de la dilucin 1:10 y se inocularan en 5 tubos a los cuales se les aaden 10 mL de medio API, stos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarn 5 alcuotas de 1 mL cada una de la dilucin 1:100, 1:1000, 1:10000, as sucesivamente, hasta la ltima dilucin empleada y se inocularn en tubos que se llenan con el medio API, stos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y dems respectivamente. Se incuban los tubos a 30C Pgina 29

TCNICAS DE BACTERIOLOGA de 2 a 4 semanas y al igual que en el caso de las muestras de agua, un cambio de coloracin del medio de rojo a negro se considera positivo. Conteo y clculos La densidad de bacterias sulfatoreductoras en las muestras de agua se expresa como el NMP de BSR por 100 mL de muestra, y en el caso de los sedimentos, se puede expresar NMP de BSR/ 100g de peso seco o por gramo de peso hmedo. La Tabla de NMP tambin puede ser utilizada cuando volmenes mayores y menores de la muestra son inoculados. En este caso se procesa un cdigo formado por los nmeros de tubos con resultados positivos para BSR obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas, verificndose el valor de NMP correspondiente a el. Para el clculo del NMP de bacterias sulfatoreductoras en los sedimentos, el NMP/100g ser dada a travs de la siguiente frmula: NMP correspondiente al cdigo x 10 NMP/100g (peso seco)= ----------------------------------------------------Mayor vol. inoculado seleccionado para conformar el cdigo Ejemplo: Porciones en los tubos inoculados NMP del Cdigo 530 80

A B C D E

Clculo NMP/100g

1g + + + + + 5 0.1g + + + - 3 0.01g - - - - - 0

80x10/1 = 800

+ : tubos con cambio de color de rojo a negro - : tubos que no muestran cambio de color del medio NMP/100g (peso hmedo) = 800. NMP/ g (peso hmedo) = 8. Resultado del peso seco obtenido = 0.4g 1g (peso seco) NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso hmedo) x ----------------------Peso seco (g) Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g En los casos considerados como negativos (cdigo 000) el resultado se expresar como <0.2. 30

TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Battersby, N.S. 1988. Sulphate-Reducing Bacteria. En: Methods in Aquatic Bacteriology. Austin B. (Ed). John Wiley & Sons Ltd. p. 269-297. Battersby, N.S., Stewart, D.J. y Sharma, A.P 1985. . Microbiological problems in the offshore oil and gas industries. Journal of Applied Bacteriology. Symposium Supplement. p. 227S-235S. Cypionka, H., Widdel, F. y Pfennig, N. 1985. Survival of sulfate-reducing bacteria after oxygen stress, and growth in sulfatefree oxygen-sulfide gradients. FEMS Microbiology Ecology 31:39-45. NAI (NASA Astrobiology Institute). 2003. http://ciencia.astroseti.org/nasa. Overzil, W 1970. Quantitative erfassung sulatre-duzlerender. Bakterien. 2bl. . Bakt. (11) 124: 91-96. Smith, A. C., Kostka, J. E., Devereux, R. y Yates, D. F. 2004. Seasonal composition and activity of sulfate-reducing prokaryotic communities in seagrass bed sediments. Aquatic microbial ecology, 37, 183-195.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.3. Enumeracin de bacterias coliformes totales y fecales. Las bacterias coliformes son un grupo grande y heterogneo de bacilos gram negativos, anaerobios facultativos y asporgenos que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos cortos que pueden formar cadenas y en condiciones de cultivo desfavorables (por ejemplo, exposicin a la penicilina) aparecen formas filamentosas largas. Dentro de los coliformes se agrupan: Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter. Actualmente dicha agrupacin incluye a los integrantes llamados organismos paraclicos: Serratia, Edwarsiella y Citrobacter, aunque algunos autores incluyen tambin Arizona y Providencia (Rojas y Coto 1989). Las bacterias coliformes constituyen una gran parte de la microbiota normal aerobia del intestino, dentro de l, estos microorganismos por lo general no provocan enfermedades y pueden incluso contribuir al funcionamiento normal y a la nutricin. Estas bacterias se transforman en patgenas cuando alcanzan tejidos fuera del intestino, particularmente las vas urinarias, las vas biliares, los pulmones, el peritoneo o las meninges, provocando inflamaciones en estos sitios (Jawetz, 1985). En las aguas la presencia de coliformes totales funciona como una alerta de que ocurri contaminacin, sin identificar el origen. Indican que hubo fallas en el tratamiento, en la distribucin o en las propias fuentes domiciliarias de agua. Su presencia acciona los mecanismos de control de calidad y de procesamiento dentro de las plantas de tratamientos de agua, e intensifica la vigilancia en las redes de distribucin (CYTED, 2002). Por otra parte, los coliformes fecales, cumplen todos los criterios usados para definir los coliformes totales, pero en adicin, estos son capaces de crecer y fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 44 0.2C en las primeras 48 h de incubacin. Por esta razn, algunos especialistas consideran que el trmino de coliformes fecales que se les aplica no es correcto y que debera utilizarse en su lugar coliformes termotolerantes (ISO, 1990). Aproximadamente el 95% del grupo de los coliformes presentes en heces fecales, estn formados por Escherichia coli y ciertas especies del gnero Klebsiella. Debido a que los coliformes fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal (WHO, 1999; CYTED, 2002). Cuando estn suficientemente diluidas en una gran masa de agua las bacterias coliformes fecales sobreviven slo por lapsos cortos de tiempo, por lo que su presencia puede tomarse, por lo general, como evidencia de contaminacin reciente. Sin embargo, en algunos ros y puertos que estn muy 32

TCNICAS DE BACTERIOLOGA contaminados con las aguas del desage urbano, las bacterias coliformes no slo sobreviven, sino que mantienen una poblacin significativa mediante multiplicacin lenta a partir de substancias orgnicas (Jawetz, 1985). En la actualidad muchos pases consideran las bacterias coliformes como indicadores de la calidad higinico sanitaria en las aguas costeras que se usan para el bao, aunque las concentraciones permisibles para estos microorganismos varan ligeramente de un lugar a otro (Norma cubana NC: 22-1999; Norma mexicana, 2004). Objetivo: Determinar el nmero de bacterias coliformes totales y fecales en muestras de agua y sedimentos marinos por el mtodo de diluciones seriadas en Tubos Mltiples. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Frascos de vidrio de 250 mL de capacidad estriles. Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad estriles. Pipetas de 10 y 1 mL estriles. Tubos de cultivo con tapn de algodn. Tubos Durham. Gradillas. Reactivos y Medios de Cultivo. Agua de mar estril, solucin salina o agua peptonada. Buffer Fosfato. Caldo Lactosado (Lactose Lauryl Tryptose Broth). Caldo Bilis Verde Brillante (Brilliant Green Lactose Broth). Caldo EC (EC Broth). Equipos Jarra mezcladora, Bao termostatado, Incubadora bacteriolgica, Detalles experimentales. Este procedimiento se puede aplicar para muestras de agua de diferentes fuentes: marinas, riverinas, potables, residuales, entre otras. Se utiliza el mtodo de Tubos Mltiples mediante siembra en medio lquido y el clculo del Nmero Ms probable (NMP). El mtodo se basa en el enriquecimiento de las muestras de agua en Caldo Lactosado, al cual se ha aadido un indicador de pH, a una temperatura de 35 2C, donde el cambio Pgina 33

TCNICAS DE BACTERIOLOGA de color del medio evidencia la presencia de microorganismos del grupo coliformes. Este primer paso se conoce como prueba presuntiva. Posteriormente, se hace una prueba confirmativa de la presencia de coliformes mediante la siembra de una asada tomada de los tubos que dieron positivos en la prueba anterior, en tubos con Caldo Bilis Verde Brillante. La turbidez y presencia de gas confirma la existencia de coliformes totales en la muestra analizada (Gonzlez et al. 2000). Actualmente, para detectar la presencia de coliformes existen algunos ensayos menos complejos que permiten obtener los resultados ms rpidos, pero slo puede considerarse una informacin preliminar (presencia-ausencia). En estas pruebas, se mezcla grandes volmenes de muestra de agua (100 mL) en una botella de cultivo con Caldo Lactosa Lauril Triptosa (LLTB) triple fuerza. Como indicador de pH se aade bromocresol prpura. Si los coliformes estn presentes, fermentan la lactosa produciendo cido y gas y cambiando de color el medio de prpura a amarillo. Para detectar coliformes y Escherichia coli, puede usarse la prueba del Colilert que consiste en mezclar 100 mL de muestra de agua con un medio que contiene como nicos nutrientes orto-nitrofenil,D-galactosido (ONPG) y 4-metil umbeliferil-,D-glucoronido (MUG). Si los coliformes estn presentes, el ONPG es metabolizado, resultando un color amarillo. Si hay presencia de E. coli, ser degradado el MUG a un producto fluorescente que puede detectarse por observacin en luz UV de larga longitud de onda. Procedimiento Determinacin del Nmero Ms Probable de Coliformes totales en muestras de agua por el mtodo de diluciones seriadas en tubos mltiples. Preparacin de las diluciones decimales. Las diluciones se harn en dependencia del tipo de agua a analizar. Tabla 3. Diluciones recomendadas segn el tipo de agua a analizar

Tipo de muestra
Aguas superficiales limpias
0 -1

Diluciones
10 ,10 , 10-2, 10-3, 10-4

Aguas moderadamente contami10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 nadas o aguas residuales tratadas Aguas contaminadas o aguas re10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 siduales sin tratamiento Se toma aspticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un tubo de ensayo con 9 mL de agua de mar estril, solucin salina o agua peptonada, obtenindose una dilucin de 1:10. Se homogeniza, se toma 1 mL y se lleva a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solucin de la dilucin, se homogeniza, y se obtiene una dilucin 1:100. De ser necesarias ms diluciones se seguir el mismo procedimiento (Se utilizar una pipeta para cada dilucin). 34

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Prueba presuntiva. Se toman 10 mL de muestra empleando una pipeta estril graduada de 10 mL y se transfieren a un tubo de ensayo que contenga 10 mL de Caldo Lactosado de doble concentracin y se mezcla el contenido. Se repite cinco veces este procedimiento. Para agua de mar se realiza adems lo siguiente: se toman 5 mL de agua y se aade 1 mL en cada uno de los tubos con medio a simple concentracin de la segunda hilera y se toman 0.5 mL de muestra y se aade 0.1 mL en cada tubo de la tercera hilera con medio Caldo Lactosado de simple concentracin. Cuando se analiza agua no tratada, se inoculan porciones de la muestra y sus diluciones respectivas. Se incuban los tubos entre 35 0.5C durante 24 - 48 h. Al cabo de 24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido algn cambio de color y turbidez, se reincuban y se examinan nuevamente despus de otras 24 h (48 en total). La produccin de cido o gas dentro de las 48 3 h constituye una reaccin presuntiva positiva y la ausencia de formacin de cido o gas al finalizar las 48 3 h constituye una prueba negativa. Prueba confirmativa. A partir de cada uno de los tubos presumiblemente positivo en Caldo Lactosado, se inoculan con un asa de platino tubos que contengan Caldo Bilis Verde Brillante y tubos de fermentacin Durham invertidos. Se incuban de 35 0.5C por 48 h y se observa la produccin de gas. La produccin de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido Durham dentro de las 48 3 h es considerada una fase confirmativa positiva. Recomendaciones importantes. 1. Utilice una pipeta estril para la inoculacin de cada tubo. Si la pipeta se contamina antes de que la transferencia se haya completado, reemplace con otra pipeta estril. Tome precauciones cuando retire la pipeta del pipetero, para evitar contaminaciones. No arrastre la punta de la pipeta sobre la parte final expuesta de las otras pipetas del pipetero o sobre los bordes y cuellos de los tubos de la dilucin. Cuando remueva la muestra, no inserte las pipetas mas de 2.5 cm por debajo de la superficie de la muestra. 2. Cuando descargue las porciones de muestra, sostenga la pipeta en un ngulo de aproximadamente 4C, con la punta tocando el cuello del tubo de ensayo. 3. En el examen de residuales o de agua turbia, utilice un inoculo de 0.1 mL de la muestra original o prepare una dilucin adecuada. Pgina 35

TCNICAS DE BACTERIOLOGA 4. Lmite del nmero de muestras a ser analizadas de forma tal, que el tiempo entre la inoculacin de la primera muestra y la ltima no excedan los 20 min (Preferiblemente 10 min). Determinacin del Nmero Ms Probable de Coliformes fecales. A partir de cada uno de los tubos gas positivos en Caldo Bilis Verde Brillante, se inoculan con un asa tubos que contengan caldo EC y tubos de fermentacin Durham. Se incubaran a 44.5 + 0.1C durante 24 - 48 h. Antes de la inoculacin los tubos se mantendrn sumergidos, a un nivel por encima del medio de cultivo, en un bao termostatado a 44.5 oC durante 30 min. La produccin de gas en un tubo de fermentacin Durham dentro de 24 h o menos se considera una reaccin positiva. Clculos y expresin de los resultados. La densidad de coliformes (totales y fecales) se expresa como el NMP de coliformes totales o fecales, segn se trate, por 100 mL de la muestra de agua. Para formar el cdigo se seleccionan las diluciones segn los nmeros de tubos positivos y negativos obtenidos en las tres series de diluciones consecutivas inoculadas. El NMP/100 mL de agua se obtendr a travs de la siguiente frmula: NMP correspondiente al cdigo de la tabla x 10 -----------------------------------------------------------------Mayor volumen inoculado seleccionado para formar el cdigo

NMP/100 mL =

Ejemplo 1: Volmenes de agua inoculados Tubos A B C D E Clculo NMP/100mL 50x10/1 = 500

Cdigo

NMP

1mL + + + + + 5 0.1mL + + - - - 2 0.01mL - - - - - 0

520

50

Se selecciona la serie donde los tubos sean positivos en su mayora y las dos diluciones siguientes para formar el cdigo. 36

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Ejemplo2: Volmenes Tubos de agua A B C D E inoculados 10 mL 1 mL 0.1 mL 0.01 mL +++ +++ + - + - + + 5 - 3 - 1 - 1 Clculo NMP/100mL 140x10/10 = 140

Cdigo

NMP

}2

532

140

En este ejemplo el resultado positivo de la ltima dilucin se adiciona al de la serie anterior para formar el cdigo. Determinacin de Coliformes totales y fecales en muestras de sedimentos Preparacin de las diluciones decimales. Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homogenizan en una jarra mezcladora estril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obtenindose de esta forma la dilucin 1:10. Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de contaminacin de la muestra. Se toma 1 mL de la dilucin 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obtenindose as la dilucin 1:100. Si se requiere mayor nmero de diluciones se seguir el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estril para cada dilucin. Prueba presuntiva. Se inoculan series de cinco tubos (a, b, c, d, e) de Caldo Lactosado con tubos de fermentacin de Durham invertidos. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilucin 1:10 contienen 10 mL de Caldo Lactosado de doble concentracin y constituyen las porciones de 1g. Se tomarn 5 alcuotas de 1 mL cada una de la dilucin 1:10 y se inocularan en 5 tubos que contienen 10 mL de Caldo Lactosado de simple concentracin, stos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarn 5 alcuotas de 1 mL cada una de la dilucin 1:100, 1:1000, 1:10000, as sucesivamente hasta la ltima dilucin empleada y se inocularn respectivamente en tubos con Caldo Lactosado de simple concentracin y con tubos de Durham invertidos, stos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y dems respectivamente. Se incuba a 35 0.5C. Despus de 24 2 h se observar si hay presencia de cido o gas en los tubos invertidos, si no hay, se reincuban hasta las 48 3 h. La produccin de cido o gas dentro de las 48 3 h constituye una reaccin presuntiva positiva y la ausencia de formacin de cido o gas al finalizar las 48 3 h constituye una prueba negativa. Pgina 37

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Prueba confirmativa De todos los tubos que resultaron positivos en la fase presuntiva se toma muestra con asa de platino y se inoculan tubos conteniendo Caldo Bilis Verde Brillante. Se incuban los tubos a 35 0.5C por 48 3 h. La produccin de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido de Caldo Bilis Verde Brillante dentro de las 48 3 h es considerada una fase confirmativa positiva. Se calcula el valor NMP del nmero de tubos positivos de Caldo Bilis Verde Brillante. Clculos y expresin de los resultados La densidad de coliformes totales se expresa como el NMP de coliformes totales por g de peso seco. NMP correspondiente al cdigo x 10 NMP/100g (peso seco) = -----------------------------------------------------Mayor volumen inoculado seleccionado para conformar el cdigo Ejemplo 1: Volmenes de agua inoculados Tubos A B C D E Clculo NMP/100g 80x10/1 = 800

Cdigo

NMP

1g + + + + + 5 0.1g + + + - - 3 0.01g - - - - - 0

530

80

+ presencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante - ausencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante NMP/100g (peso hmedo) = 800 NMP/ g (peso hmedo) = 8 Resultado del peso seco obtenido (ejemplo) = 0.4g 1g (peso seco) NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso hmedo) x ----------------------Peso seco (g) Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g En los casos considerados como negativos (cdigo 000) el resultado se expresar como <0.2. 38

TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Clark, J.A. 1990. The presence- absence test for monitoring water quality. En: Drinking Water Microbiology. [Ed] G.A. McFeters. Springer- Verlag, New York, 369-411. CYTED. 2002. Indicadores de Contaminacin fecal. Agua potable para comunidades rurales, rehso y tratamientos de aguas residuales domsticas. Red Iberoamericana de Potabilizacin del Agua. 224-229. Gonzlez M.I., Surez M., Torres V Cisneros E., Sentmanat L.H. y Leyva .T., Y. 2000. Manual de tcnicas microbiolgicas para el control sanitario de aguas mineromedicinales y peloides. Ciudad de la Habana, INHEM, 122 pp. ISO 9308-2:1990. Water quality-Detection and enumeration of coliform organisms, termotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli - Part 2: Multiple tube (most probable number) method. 4 pp. Jawetz, E. 1985. Microbiologa de ambientes especiales. En: Manual de Microbiologa mdica. p. 90-92. Norma Cubana NC: 22:99. 1999. Lugares de Bao en costas y en masas de aguas interiores. Requisitos Higinicos-Sanitarios. Norma Mexicana. 2004. Lineamientos para determinar la Calidad de agua de Mar para uso recreativo con contacto primario. Secretara de Salud, Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios. 15 pp. Rojas, N. y Coto, O. 1989. Familia Enterobacteriaceae. En: Temas de Microbiologa Clnica. T. I. p.38-40. World Health Organization. 1998. Guidelines for Safe Recreational-water Environments: Coastal and Freshwaters. Consultation Draft. Geneva. World Health Organization. 1999. Health-based Monitoring of Recreational Waters: The Feasibility of a New Approach (The Annapolis Protocol). Protection of the Human Environment Water, Sanitation and Health Series. Geneva. 50 pp. Pgina 39

TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.4. Enumeracin de estreptococos fecales. Los estreptococos fecales son cocos Gram positivos, no mviles, catalasa negativa, anaerobios facultativos que se agrupan en cadenas cortas, pares y clulas simples. Pueden crecer en presencia de sales biliares, en concentraciones de azida de sodio inhibitorias para organismos coliformes y otras bacterias Gram negativas y a temperatura de 45 C. Hidrolizan la esculina y algunas especies resisten calentamiento a 60 C por 30 min, crecen en Caldo Nutriente conteniendo 6.5% de cloruro de sodio y a pH 9.6. El hbitat de los estreptococos fecales es el intestino de humanos y muchos animales de sangre caliente, aunque con frecuencia se encuentran en infecciones urinarias, leche, productos lcteos, carnes, aguas y suelos (Surez, 2002). Aunque este grupo de microorganismos ha sido utilizado por las autoridades sanitarias de diferentes pases para evaluar la calidad sanitaria de sus aguas costeras, en los ltimos aos se ha incrementado la utilizacin de los enterococos fecales en lugar de los estreptococos (Secretaria de Salud, 2004). Los enterococos fecales son un subgrupo de los estreptococos fecales, que generalmente se usa para referirse a las especies Enterococcus faecalis y sus variedades, y a E. faecium, las cuales tienen mucha importancia clnica. Segn Surez (2002) se ha propuesto que sea adoptado el trmino enterococos y estreptococos intestinales, ya que las especies de origen fecal o intestinal pertenecen principalmente a los gneros Enterococcus y Streptococcus. Para la deteccin y enumeracin de estos microorganismos se utiliza el mtodo de Tubos Mltiples mediante siembra en medio lquido y el clculo del Nmero Ms Probable (NMP), aunque tambin puede emplearse la tcnica de Filtro de Membrana y por vertido en placa, en dependencia del tipo de muestra a analizar. Tejedor et al. (2005) incuban las membranas en Agar Slanetz a 37 C por 24 h, las transfieren a placas de Agar Bilis-Esculina-Azida e incuban a 35 C entre 1 y 4 h. Las colonias crecidas formadas por cocos gram positivos, catalasa negativos y que hidrolizan la esculina, los consideran estreptococos fecales. El mtodo de Tubos Mltiples se basa en el enriquecimiento de las muestras de agua en Caldo Azida-Dextrosa donde el cambio de color del medio de prpura a amarillo evidencia la presencia de este tipo de microorganismo.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Objetivo: Determinar el nmero de estreptococos fecales en muestras de agua y sedimentos marinos por el mtodo de diluciones seriadas en Tubos Mltiples. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados Materiales. Frascos de vidrio estriles de 250 mL . Tubos de ensayo. Gradillas. Pipeta de 10 mL. Pipeta de 0.1 mL. Placas Petri. Reactivos y medios de cultivo. Caldo Azida-Dextrosa a doble concentracin. Caldo Azida-Dextrosa a simple concentracin. Buffer Fosfato. Caldo KF 1.5 concentrado y de simple concentracin. Agar Tristona Soya (ATS). Caldo Etil Violeta Azida o Medio selectivo para enterococos Pfizer (PSE). Agar Slanetz-Bartley . Caldo Corazn. Equipos. Incubadora bacteriolgica. Procedimiento . Colecta de las muestras de aguas. La colecta de las muestras de aguas se debe realizar con frascos de vidrio estriles, preferiblemente durante el horario de marea baja. Si no se procesa inmediatamente, la muestra deber permanecer refrigerada (sin llegar nunca a la congelacin) hasta el momento de su procesamiento. El anlisis debe realizarse tan pronto como sea posible, para minimizar los cambios en la poblacin microbiana y si la muestra ha sido mantenida en fro, el tiempo mximo recomendado es de 24 h. Determinacin del Nmero Ms Probable de estreptococos fecales en muestras de aguas marinas. Preparacin de las diluciones decimales. Se toma aspticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un tubo de ensayo con 9 mL de solucin salina, agua de mar estril o agua peptoPgina 41

TCNICAS DE BACTERIOLOGA nada, obtenindose una dilucin 1:10. Se homogeniza, se toma 1 mL y se aade a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solucin de disolucin, se homogeniza, y se obtiene una dilucin 1:100. De ser necesaria mas diluciones se seguir el mismo procedimiento, cuidando utilizar una pipeta para cada dilucin. Se recomienda marcar cada tubo de la serie con el nmero de la muestra y dilucin. Dicho rotulo deber hacerse en direccin vertical, para evitar confusiones entre diluciones. Prueba presuntiva. A partir de la muestra de agua se toman 5 porciones de 10 mL cada una, empleando pipetas estriles graduadas de 10 mL, y se transfieren a tubos de ensayo que contienen 10 mL de Caldo Azida-Dextrosa de doble concentracin. Se homogeniza el contenido. Seguidamente, se toman 5 mL de la muestra y se aade 1 mL a cada uno de los tubos de la segunda hilera con medio de simple concentracin y a continuacin, se toman otros 0.5 mL de muestra y se aade 0.1 mL de la misma en cada tubo de la tercera hilera con medio de simple concentracin. Se incuban todos los tubos a 35 0.5 C .durante 48 h. Al cabo de 24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido cambio de color, se re-incuban y se examinan nuevamente despus de otras 24 h (48 en total). El cambio de color de amarillo a prpura dentro de las 48 h del ensayo, constituye una prueba presuntiva positiva. Prueba confirmativa Se toma con un asa muestra de los tubos que dieron positivos en la fase presuntiva y se siembra en Caldo Etil Violeta Azida o en medio selectivo para enterococos Pfizer (PSE). Los tubos se incuban a 35 oC durante 48 h y las placas con medio PSE durante 24 2 h. En el caldo la respuesta positiva se manifiesta por presencia de turbidez y un botn color prpura en el fondo del tubo y en el medio PSE por la presencia de colonias marrn con halos marrones. Clculos. A partir de los tubos considerados positivos se conforma el cdigo y se consulta la tabla de Nmero Ms Probable (NMP) que corresponda, segn el nmero de tubos utilizados como rplicas.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Los resultados del NMP de estreptococos fecales se expresan en NMP por 100 mL. Si se usaron para la siembra porciones de 1.0, 0.1 y 0.01 mL, el NMP se calcula por la tabla y se registra multiplicando por 10 la cifra correspondiente; o si se us una combinacin en porciones de 0.1, 0.01 y 0.001 mL la cifra de la tabla se multiplica por 100. Determinacin del Nmero Ms Probable de Estreptococos fecales en muestras de sedimentos. Preparacin de las diluciones decimales. Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homogenizan en una jarra mezcladora estril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obtenindose de esta forma la dilucin 1:10. Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de contaminacin de la muestra. Se toma 1 mL de la dilucin 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obtenindose as la dilucin 1:100. Si se requiere mayor nmero de diluciones se seguir el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estril para cada dilucin. Fase presuntiva. Se procede de igual forma que se explica para las muestras de agua, pero el medio utilizado es Caldo KF 1.5 concentrado y de simple concentracin. Se incuba a 37 C por 48 h. La aparicin de una coloracin amarilla en los tubos de Caldo KF debido a la produccin de cido indica una reaccin positiva. Fase confirmativa. De todos los tubos positivos en la prueba presuntiva se toma muestra con un asa y se siembra por estras en placas de Agar Slanetz-Bartley. Las placas se incuban a 37 C 48 h. De las colonias crecidas, se seleccionan al menos tres colonias y se siembran cada una en Caldo Corazn. Se incuban a 37 C por 24 h y a partir de cada colonia crecida en Caldo Corazn realizar las siguientes pruebas: Coloracin de Gram (cocos Gram +, mayormente en pares cadenas cortas). Siembra en placas de Agar Nutriente para la prueba de Catalasa (-). Pgina 43

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Crecimiento en Agar Bilis Esculina (+). Crecimiento a 45 oC (+). Crecimiento en medio con 6.5% de cloruro de sodio (+ o -). Clculos La densidad de estreptococos fecales se expresa como el NMP de estreptococos fecales por gramo de peso seco. El clculo se realiza de acuerdo al resultado de la fase confirmativa y se expresa segn se explica en el Cap.2.3 para muestras de sedimentos.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Gonzlez, M. I., Surez, M., Torres, T., Cisneros, E. y Senmanat, L. 1996. Manual de tcnicas microbiolgicas para el control sanitario de aguas mineromedicinales y peloides. Inst. Nac. Higiene, Epidemiologa y Microbiologa. Cuba. Norma Cubana NC: 22-1999. Lugares de Bao en costas y en masas de aguas interiores. Requisitos Higinicos-Sanitarios. Secretara de Salud. 2004. Lineamientos para determinar la calidad de agua de mar para uso recreativo con contacto primario. Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios. Mxico. 13pp. Surez, M. 2002. Tendencia actual del Estretococo como indicador de contaminacin fecal. Revista Cubana de Higiene y Epidemiologa 40 (1): 38-43. Tejedor M.T., Pita, M.L., Viera, C., Morn, L. Gonzlez, M., Fernndez, C. y Martn, M. 2005. Calidad bacteriolgica de las aguas de playas en Gran Canarias (Islas Canarias, Espaa). Higiene y Sanidad Ambiental. 5:120-122

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos. La biodegradacin o bioxidacin, es el mecanismo ms importante, efectivo y econmico para la eliminacin final de los hidrocarburos no voltiles del petrleo presentes en el medio marino. Bajo su accin se ponen en juego mltiples reacciones de oxidacin que conducen a la formacin de hidrocarburos de menor peso molecular, adems de la formacin de dixido de carbono, agua y biomasa microbiana. Las diferencias en la composicin y concentracin de hidrocarburos en el petrleo determinan una alta especificidad en el proceso de oxidacin microbiana (Jackson y Pardue, 1999). En el ambiente marino las n-parafinas son degradadas ms rpidamente, seguido por los aromticos, isoalcanos, cicloparafinas, y policclicos aromticos de cadenas largas (Prince, 1993). Cuando se trata de petrleos pesados se mantiene esta secuencia de degradacin incluidas las resinas y los asfaltenos, compuestos de alto peso molecular (Haines et al. 1996). La microbiota marina capaz de utilizar los crudos o fracciones refinadas del petrleo como nica fuente de carbono y energa, est ampliamente representada en diversos gneros. Sin embargo, sta solo se corresponde con el 1 % de la poblacin hetertrofa total en ecosistemas no contaminados y puede alcanzar hasta un 10 % cuando ocurre un derrame de petrleo (Venosa et al. 2000). Entre las bacterias hidrocarbonoclastas marinas que refiere la literatura especializada se incluyen los gneros Pseudomonas, Rhodococcus, Flavobacterium, Acinetobacter, Achromabacter, Bacillus, Corynebacterium y Mycobacterium; entre las levaduras los gneros Candida y Rhodotorula son los ms representativos, mientras que entre los hongos filamentosos los ms frecuentes son Cladosporium, Penicillium y Aspergillus. La capacidad de los microorganismos biodegradadores de petrleo y sus derivados tiene implicacin prctica para el saneamiento de ambientes impactados por petrleo, tanto en aguas marinas como interiores, en la industria de extraccin de crudos (donde se emplean directamente o sus metabolitos), en la obtencin de biomasa microbiana y solventes, as como, en la transformacin de esteroides.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Objetivo: Aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos de muestras de agua y sedimentos marinos. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos Materiales Frascos de vidrio estriles de 250 mL de capacidad. Placas Petri. Replicador. Pipetas. Reactivos y medios de cultivo. Petrleo pesado. Petrleo ligero. Combustible Diesel. Equipos. Incubadora bacteriolgica. Procedimiento. Para la colecta de muestras, tanto de agua como de sedimentos superficiales, se pueden emplear frascos de vidrio estriles de 250 mL de capacidad. Si las muestras no pueden procesarse de inmediato, deben conservarse en refrigeracin por un mximo de 4 h. En el caso de las muestras de agua, se puede sembrar directamente 1 mL de la muestra en un erlenmeyer conteniendo 100 mL de medio salino descrito por Vela y Ralston (1978) empleando como fuente de carbono petrleo pesado, petrleo ligero o combustible Diesel indistintamente, al 2%. En el caso de las muestras de sedimentos, se hacen diluciones seriadas en agua de mar estril hasta 1:100 y se siembra 1 mL de cada dilucin en erlenmeyers conteniendo cada uno 100 mL del mismo medio salino citado anteriormente, con la fuente de carbono seleccionada. C. Los erlenmeyers inoculados se colocan en zaranda termostatada a 28

Cada cinco das, y por tres veces sucesivas, se hacen subcultivos empleando el mismo medio de cultivo (esttico) y se incuba a 28C 2 C. Luego de 15 das de incubacin, se inoculan diluciones seriadas de los subcultivos en placas Petri conteniendo medio para bacterias hetertrofas (Gorvienko, 1961), en agar GELP (Van Uden y Fell, 1968) y en agar petrleo (Finnerty y Singer, 1984), respectivamente, y se incuban todas las placas a 28 C 2 por 72 h.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Una vez crecidas las colonias, se conservan en tubos de cultivo con estos mismos medios. Los cultivos mixtos capaces de degradar petrleo se aslan, conservndolos despus del enriquecimiento en medio lquido con pases mensuales a medio salino fresco con petrleo como nica fuente de carbono. Para detectar la capacidad de cada cepa de degradar hidrocarburos aromticos, cclicos y combustible diesel se siembra en placas Petri conteniendo medio Vela y Ralston (1978) agarizado, utilizando un replicador mltiple (Shiaris y Cooney, 1983). Para la siembra con replicador, se preparan suspensiones de cultivos jvenes (24h) de cada cepa en agua de mar estril y se aade una gota de cada suspensin celular en una placa estril de porcelana con pocitos. El replicador mltiple estril se aplica sobre los pocitos que contienen las suspensiones celulares y luego se aplica sobre el medio salino agarizado contenido en placas Petri. Para el caso de los hidrocarburos aromticos y cclicos, previamente se aplican, sobre el medio salino agarizado, soluciones al 0.5% P/V de estos sustratos en acetona; mientras que para los cclicos voltiles se conservan las placas inoculadas dentro de un recipiente en atmsfera del compuesto voltil. Se deben preparar controles utilizando el medio salino agarizado con la fuente de carbono seleccionada sin inocular.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Finnerty, W y Singer, M.E. 1984. .R. A microbial biosurfactant. Physiology and Applications. Development Industrial Microbiology, 25:31-40. Gorvienko, Y. A. 1961. Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos hetertrofos. Mikrobiologia, 30 (1): 168-172. Haines, J. R., Wrenn, B.A., Holder, E. L., Strohmeirer, K.L., Herrington, R.T. y Venosa, A.D. 1996. Measurement of hydrocarbon-degrading microbial populations by a 96-well most probable-number procedure. J. Ind. Microbiol. 16(1): 36-41. Jackson, W A. y Pardue, J. H. 1999. . Potential for intrinsic and enhanced crude oil biodegradation in Louisianas freshwater marshes. Wetlands. 19(1): 28-34. Prince, R.C 1993. Petroleum spill bioremediation in marine environments. Crit. Rev. Microbiol. 19:217-242. Shiaris, M. P y Cooney. J. J. 1983. . Replica plating method for estimating phenanthrene -utilizing and phenanthrene- cometabolizing microorganisms. Applied and Environmental Microbioloy, 45 (2):706-710. Solans, A.M. 1985. Biodegradacin microbiana en la contaminacin por hidrocarburos. Mundo Cientfico 1 (8): 913-920. Swannell, R.P Mitchel, D., Waterhouse, J.C., Miskin, I.P Head, I.M., Petch, .J., ., S., Jones, D.M., Willis, A., Lee, K. y Lepo, J. E. 2000. Impact of bioremediation treatments on the biodegradation of buried oil predominant bacterial populations. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology. Van Uden, N. y Fell, J.W 1968. . Marine Yeast. In Advances in Microbiology of the Sea. (eds.) M. R. Droap y E. J. Ferguson. 1:167-201.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Vela, G. R. y Ralston, J. R. 1978. The effect of temperature on phenol degradation in waste water.Canadian Journal of Microbioloy, 24(11):366-370. Venosa, A.D., Stephen, J.R., Macnaughton, S.J., Chang, Y. y White, D.C. 2000. Microbial population during bioremediation of an experimental oil spill. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas Los biotensioactivos son molculas con una parte polar (hidrfila) y una parte apolar (hidrfoba) producidos durante el crecimiento de una gran variedad de microorganismos sobre sustratos de diferente naturaleza (Lang y Wullbrandt, 1999, Banat et al. 2000; Kenneth et al. 2001). Numerosos autores han referido la produccin de agentes con actividad superficial a partir de la degradacin microbiana de sustratos hidrfobos. Durante este proceso aumenta la superficie de contacto entre las fases inmiscibles favorecindose el transporte del sustrato hacia la clula necesario para llevar a cabo los procesos metablicos que conducen a la multiplicacin celular (Khler et al. 2000; Iwabuchi et al. 2002). La produccin de biotensioactivos a partir de fuentes de carbono hidrosolubles se utiliza con frecuencia por la simplicidad del proceso fermentativo y su fcil comercializacin, aunque las funciones fisiolgicas de su produccin en presencia de estas fuentes, no han sido totalmente aclaradas. Los biotensoactivos se clasifican atendiendo a su naturaleza qumica en: glicolpidos, lipopolisacridos, fosfolpidos, cidos grasos, aminolpidos, lipoprotenas y lipopptidos (Lang y Wullbrandt, 1999). La amplia variedad de estructura posibilita diversas aplicaciones en la industria como emulgentes, detergentes, humectantes, espumantes, floculantes, inhibidores de la corrosin, entre otras. Estos compuestos pueden ser utilizados en procesos de polimerizacin, mediante emulsiones, para pinturas y cubiertas de papel; en el tratamiento de asfaltos, cemento, textiles y fibras, metales; as como en el tratamiento de las aguas (Kosaric, 1993; Desai y Banat, 1997). El uso de tensioactivos de origen biolgico, no txicos y biodegradables, constituye una alternativa atractiva de aplicacin en la industria teniendo en cuenta su eficacia y la tendencia actual de disminuir el uso de productos obtenidos por sntesis qumica (Aynechi, 1998; Banat et al. 2000). Objetivo: Detectar bacterias productoras de tensioactivos entre aislados provenientes de muestras de agua y sedimentos marinos Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados Materiales. Tubos de cultivo. Placas Petri. Papel de filtro Whatman. Membranas de acetato de celulosa de 0.22 m de dimetro de poro Pgina 51

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Reactivos y medios de cultivo. Glbulos rojos de carnero. Hexadecano. Medio salino. Equipos. Incubadora bacteriolgica. Zaranda termostatada. Centrfuga. Tensimetro. Agitador magntico. Procedimiento. A partir de cultivos axnicos de bacterias aisladas de aguas o sedimentos marinos, se realiza una primera seleccin de aquellos aislados potencialmente productores de tensioactivos por el mtodo de lisis de los glbulos rojos (Mulligan et al. 1989). Este mtodo se basa en la actividad hemoltica que presentan estos compuestos, que provocan zonas claras de hemlisis ( hemlisis) alrededor de las colonias de microorganismos potencialmente productores de agentes con actividad superficial. Una vez seleccionados los aislados que provocaron la hemlisis de los glbulos rojos, se siembra una asada de cada cultivo, en tubos conteniendo caldo nutriente al 0.8 % y se incuban a temperatura ambiente por 18-24 h. Posteriormente, a partir de estos caldos inoculados se siembra un volumen tal que contenga 108 celulas/mL en erlenmeyers conteniendo 200 mL de un medio basal (Finnerty, 1994), conteniendo hexadecano al 2% como nica fuente de carbono y energa (pueden usarse tambien almidn, arabinosa, lactosa, glucosa, etc.). Debe prepararse un tubo control con medio de cultivo estril. Luego de 72 - 96 h de incubacin a 28-30 C en zaranda termostatada, se procede a evaluar los cultivos en cuanto a crecimiento celular y actividad superficial con respecto al medio de cultivo estril. Para la determinacin de la actividad superficial se procede a obtener el caldo libre de clulas por centrifugacin a 7 025 x g a 4 C durante 20 min. El sobrenadante se filtra primero por papel de filtro Whatman para separar la capa oleosa y despus, por filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.22 m de dimetro de poro para eliminar las clulas. La actividad superficial del sobrenadante se evala a partir de la tensin superficial y tensin interfacial las cuales se determinan por el mtodo de anillo de Du Noy (Lin, 1996) utilizando para esto un tensimetro. La determinacin de tensin interfacial del caldo fermentado puede ser realizada utilizando como fase oleosa keroseno, hexadecano u otro hidrocarburo. 52

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Los valores de tensin superficial y tensin interfacial que determinan las caractersticas tensiomtricas de los caldos de cultivo fermentados permiten clasificar los microorganismos como productores o no de estas sustancias. Segn proponen Finnerty y Singer (1984) las clases generales se pueden considerar como un mtodo vlido para reconocer y seleccionar microorganismos capaces de sintetizar productos con actividad superficial. Segn ese criterio, los microorganismos se clasifican en tres grupos: Aquellos que disminuyen la tensin superficial del medio de cultivo. Los que aumentan la tensin superficial del medio. Los que no modifican la tensin superficial del medio de cultivo. La determinacin de la concentracin micelar crtica (CMC) se define como la concentracin de tensioactivo necesaria para iniciar la formacin de micelas (Kim et al. 2000; balos, 2001). La CMC es una medida de la eficiencia y concentracin de los tensioactivos ya que representa la concentracin a partir de la cual, al saturarse la superficie y comenzar el proceso de formacin de micelas, no se produce una disminucin significativa de la tensin superficial (Songh y Rosen, 1996). El valor absoluto de este ndice est dado, fundamentalmente, por las caractersticas del tensioactivo (concentracin, balance hidrfilo lipflo, estructura, etc.). La concentracin micelar crtica (CMC) se determina grficamente a partir de la bisectriz del ngulo que forman las dos partes rectas de la curva caracterstica de un grfico de Tensin Superficial vs. diluciones de tensioactivos en agua destilada (Kim y Vipulanandan, 1998; balos, 2001). Tambin la determinacin del nmero de saponificacin permite conocer la concentracin de tensioactivos aninicos, muchos de los cuales, han sido obtenidos a partir de microorganismos (Inczdy, 1981). La actividad emulsionante se determina mezclando volmenes iguales del medio de cultivo fermentado y keroseno, con un agitador magntico a alta velocidad por 10 min (Cooper y Goldenberg, 1987). Transcurridas 24 h de reposo, se miden la altura de la capa emulsionada y la altura total. El cociente de ambos valores multiplicado por 100 representa el ndice de emulsin. Deben realizarse tres repeticiones de cada prueba.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA balos, A. 2001. Produccin de ramnolpidos por Pseudomonas aeruginosa AT10 aplicando la Metodologa de Superficie de Respuesta. Caracterizacin y aplicacin del producto. Tesis de Doctorado. Facultad de Farmacia. Departamento de Microbiologa y Parasitologa Sanitarias. Universidad de Barcelona. Espaa. Aynechi, N. 1998. Oil Spill Response. Interdisciplinary Minor in Global Sustainability. University of California, Irvine. Student papers, Spring. http://darwin.bio.uci. edu/~sustain/global/sensem/S98/Aynechi/Oil.html. Banat, I., Makkar, R. y Cameotra, S. 2000. Potential commercial applications of microbial surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 495-508. Cooper, D.G. y Goldenberg, B. G. 1987. Surface - active agents from two Bacillus species. Applied and Environmental Microbiology, 53 (2): 224-229. Desai J.A., y Banat I.M. 1997. Microbial Production of Surfactants and their Commercial Potencial. Microbiology and Molecular Biology Reviews, mar, 61(1):47-64. Finnerty, N.R. 1994. Biosurfactants in enviromental Biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 5(3): 291-295. Finnerty, W R. y Singer, M.E. 1984. . A microbial biosurfactant. Physiology and Applications. Development Industrial Microbiology, 25:31-40. Inczdy, J., Jonge, J y Reisz, T. 1981. Analitikai Laboratoiumi Gyakorlatok. Ed. Vezprm. Vol. I: 60-63. Iwabuchi N., Sunairim, M., Urai, M., Itoh, C., Anzai, H., Nakajima, M. y Harayama, H. 2002. Extracellular polysaccharides of Rhodococcus rhodochrous S-2 stimulate the degradation of aromatic components in crude oil by indigenous marine bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 68 (5): 2337-43.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Kenneth. N. T., Yakimov, M. M. y Golyshin, P 2001. .N. Hydrocarbonoclastic Bacteria: Novel Marine Bacteria that Grow Only on Oil. Informe Cientfico Final de Proyecto de Investigacin. Instituto Sperimentale. Messina/Italia. Kim S. H., Lim E. J., Lee S., Lee J. D. y Lee T. H. 2000. Purification and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. L-417. Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 249253. Kim, S. y Vipulanandan R. 1998. Removal of Lead from Wastewater Using a Biosurfactant http//www.dotincsolution.com. Khler, T., Kocjancic, L., Barja, F., van Delden, C. y Pechre, J.C. 2000. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. J. of Bacteriol. 182, 5990-5996. Kosaric, N. 1993. Biosurfactants. New York. Marcel Desai J.D y A.J. Desai. Lang, S. y Wullbrandt, D. 1999. Rhamnose lipids- biosntesis, microbial producction and application potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:22-32. Lin, S. C. 1996. Biosurfactants: Recent Advances. J Chem. Technol. Biotechnol. 66:109-120. Mulligan, C. N., Chow, T. Y. K. y Gibbs, B.F. 1989. Citado por Desai J. D. y A. J. Desai, M. 1993. Biosurfactants. Production. Properties. Aplications. Rosenberg, E. 1986. Microbial Surfactants. Crit. Review Microbiology, 3:109-132. Song, L. D. y Rosen, M. J. 1996. Surface properties, micellization and premicellar agregation of gemini surfactatns with rigid and flexible sparcers. Lagmuir. 12, 1149.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Cap.2.7. Aislamiento de bacterias extracelulares

productoras

de

polisacridos

Para mantener la estructura celular los microorganismos sintetizan polisacridos o macromolculas con componentes sacardicos como constituyentes de la pared celular, sin embargo, muchas especies tambin excretan polisacridos al medio circundante. A veces estos compuestos extracelulares pueden observarse con el microscopio ptico formando una especie de cpsula alrededor de las clulas y otras veces, se observa una matriz viscosa y amorfa conocida como biofilm o biopelcula, donde quedan atrapadas numerosas clulas. En ambientes marinos oligotrficos el crecimiento de bacterias adheridas a superficies se considera una estrategia nutricional, ya que sobre las superficies suelen concentrarse nutrientes que son utilizados por estos microorganismos. Miles y Morris, (1989), afirman que estos polisacridos extracelulares protegen a las bacterias contra la desecacin y el ataque de bacterifagos. Segn Mancuso et al. (2005), los exopolisacridos microbianos son abundantes en el ecosistema marino de la Antrtica, lo que posiblemente, contribuya a la sobrevivencia de las comunidades microbianas ante las condiciones extremas de temperatura, salinidad, y disponibilidad de nutrientes. Estos autores tambin refieren que en las aguas hidrotermales profundas, caracterizadas por la existencia de altas presiones, temperaturas extremas y presencia de metales pesados, los exopolisacridos producidos por los microorganismos que ah habitan son inusuales y pueden tener un elevado valor comercial. La composicin qumica de los exopolmeros ha sido ampliamente estudiada ya que se consideran inmungenos y antgenos bacterianos importantes relacionados con infecciones en plantas, animales y humanos. Entre las especies de bacterias que ms se estudian actualmente por su capacidad de producir biofilm y ser causa de mltiples enfermedades se encuentran el Staphylococcus epidermidis y otras del gnero Staphylococcus, incluyendo S. aureus. Estas bacterias patgenas se adhieren a dispositivos plsticos (prtesis ortopdicas, vlvulas cardiacas artificiales, marcapasos, etc.) y comienzan a formar el biofilm, que impide la desecacin, la accin de fagocitos y anticuerpos que tratan de eliminarlos. En cultivos puros de estas bacterias se ha encontrado que las molculas de antibiticos no logran atravesar la estrecha red de glicoprotenas del biofilm para llegar a su sitio de accin (Diemond y Miranda, 2007). Muchos polisacridos producidos por bacterias han sido caracterizados y comercializados, como el alginato, el xantano y el curdlano, por su aplicacin como aditivo en la industria alimenticia, farmacutica (Colliec-Jouault et al. 2004), de cosmticos (Sutherland, 1989) y en la industrial petrolera . 56

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Objetivo: Aislar bacterias productoras de polisacridos de sedimentos marinos o de portaobjetos qumicamente limpios sumergidos en el mar. Materiales, Reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Portaobjetos. Tubos de cultivo. Pipetas estriles. Erlenmeyers de 500 mL. Papel de filtro Whatman GF/F. Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.22 micras de dimetro de poro. Membrana de dilisis de 12 000 cutoff. Varilla de vidrio. Reactivos y medios de Cultivo. Agua de mar estril. Agua destilada. Etanol absoluto (99%). Equipos. Cmara de Newbauer. Zaranda rotatoria. Centrifuga refrigerada. Roto evaporador. Cmara fra. Liofilizadora. Detalles experimentales. Existen diferentes medios de cultivo para la produccin microbiana de polisacridos o glicoproteinas extracelulares. En todos los casos el denominador comn es que en el medio de cultivo se emplea como fuente de carbono glucosa, sucrosa, galactosa u otro azcar. En ocasiones, se han encontrado bacterias capaces de producir dos tipos diferentes de polisacridos durante una misma fermentacin, asociados a diferentes fases de crecimiento (Christensen et al. 1985). Harada et al. (1987) refieren que Nakanishi et al. (1974, 1976) demostraron que el medio de cultivo con anilina azul es muy til para la deteccin de colonias que tienen la capacidad de producir curdlano porque ste forma un complejo con el colorante y se observan las colonias azules. Pgina 57

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Procedimiento. Los cultivos de bacterias que producen polisacridos extracelulares por lo regular son mucosos y con frecuencia provienen de muestras de sedimentos, de organismos, u objetos sumergidos, que brindan una superficie donde las clulas pueden adherirse. En este procedimiento se parte de cultivos puros de bacterias hetertrofas aisladas de sedimentos marinos o de portaobjetos (qumicamente limpios) que se encontraron sumergidos en el mar por 72 h. Las colonias aisladas, de las cuales nos interesa conocer cules son capaces de producir polisacridos extracelulares, se mantienen en tubos con medio Agar marino. De cada cultivo a evaluar, se prepara una suspensin celular con agua de mar estril, y se cuenta el nmero de clulas en cmara de Newbauer. De esta suspensin se inocula un volumen tal que al aadir en 200 mL del medio seleccionado (medio PS o medio Okami, u otro) la concentracin final resulte 108 clulas/mL. Los 200 mL del medio de cultivo deben estar contenidos en un erlenmeyer de 500 mL o 1 L de capacidad con tapn de gasa que permita una adecuada aireacin. El erlenmeyer con el medio inoculado se coloca en zaranda rotatoria (150 rpm) a 25 C por cinco das. Se centrifuga a 4 800 x g a 4 C por 20 min para remover las clulas, y el sobrenadante resultante se filtra, primero por papel Whatman GF/F y despus por membrana de acetato de celulosa de 0.22 m de dimetro de poro. El filtrado se concentra en un rotoevaporador a temperatura ambiente hasta la mitad de su volumen, y se dializa exhaustivamente por membrana de 12 000 cutoff durante 24 h contra agua destilada, para eliminar restos de glucosa que no hayan sido consumidos. Al filtrado dializado se le aade 2 vol. de etanol (99%) fro, se deja reposar por unas h, preferiblemente en cmara fra, y posteriormente, se recoge el precipitado obtenido con una varilla de vidrio. En ocasiones se liofiliza para su conservacin a largo plazo. Al polmero obtenido se le determina sus propiedades fsicas y su composicin qumica. En algunos casos, en dependencia de los objetivos de la investigacin, tambin se le mide su viscosidad especfica y sus propiedades reolgicas.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Christensen, B. E., Kjosbakken, J. y Smidsrd, O. 1985. Partial chemical and physical characterization of two extracellular polysaccharides produced by marine, periphytic Pseudomonas sp. Strain NCMB 2021. Applied and Environmental Microbiology. Vol.50 (4):837-845. Diemond, J. B. y Miranda, G. 2007. Biofilm: amenaza latente o factor de proteccin? Estado del arte. Enfermedades Infecciosas y Microbiologa, vol. 27 (1). Harada, T., Sato, S. y Harada, A. 1987. Curdlan. Bulletin of Kobe Womens University. Vol. 20:143-164. Mancuso Nichols, C.A., Guezennec, J. y Bowman, J.P 2005. . Bacterial Exopolysaccharides from Extreme Marine Environments with Special Consideration of the Southern Ocean, Sea Ice, and Deep-Sea Hydrothermal Vents: A Review. 2005. Marine Biotechnology. Vol. 7(4): 253-271. Miles, M. J. y Morris, V J. 1989. . Naturally-evolved changes in bacterial polysaccharides. (Ed) Society for Experimental Biology, Gran Bretaa . 403-416. Sutherland, I. W 1989. . Microbial polysaccharides - A comparison with eukaryotic polymers. (Ed) Society for Experimental Biology, Gran Bretaa . 389-402. Colliec-Jouault, S., Zanchetta, P Helley, D., Ratiskol, J., Sinquin, C., Fischer, ., A.M. y Guezennec, J. 2004. Microbial polysaccharides of marine origin and their potential in human therapeutics. Pathol. Biol. Paris. Vol. 52 (3):127-130

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes. Las bacterias luminiscentes pueden encontrarse en aguas costeras, ocenicas y en ambientes no marinos, generalmente, como simbiontes en los rganos luminosos de diferentes organismos hospederos. Aunque no contribuyen a la fosforescencia del ocano, (la cual es causada por algunos dinoflagelados, hidrozoos, poliquetos, moluscos, crustceos y peces), participan en el reciclaje de nutrientes y muchas de ellas, forman parte de la flora intestinal de los peces (Goto, 1980). Las bacterias luminiscentes emiten luz continuamente, slo que a diferentes intensidades, en dependencia del contenido celular especfico de enzima y sustratos que participan en la reaccin. Estos niveles de enzima y sustratos son diferentes de acuerdo a una variedad de factores que inducen o reprimen la biosntesis (Nealson, 1977). Los mecanismos que intervienen en el control de la luminiscencia indican que la sntesis de luciferasa, al igual que la represin de esta enzima, ocurre en determinadas condiciones y que la luminiscencia no significa una ventaja selectiva para las bacterias. La luz es emitida como resultado de una reaccin de oxidacin de luciferina donde interviene como catalizadora la enzima luciferasa y como oxidante el oxgeno. Se conoce que en bajas concentraciones (menores de 0.5%) el oxgeno resulta limitante y en condiciones de anaerobiosis estricta, cesa la luminiscencia (Hasting, 1978). El uso de bacterias luminiscentes para detectar la presencia de oxgeno en bajas concentraciones fue probado por Beijerinck en 1902 en experimentos para detectar el oxgeno formado por la fotosntesis en un extracto de hojas de trbol machacadas (Hasting, 1978). Entre las aplicaciones de las bacterias luminiscentes se encuentran la deteccin de micotoxinas en productos agrcolas (Yates y Porter, 1982), la deteccin de antibiticos que inhiben la sntesis de protenas (Naven et al. 1984), y la deteccin de compuestos de bajo peso molecular con actividad antitumoral potencial (Steinberg et al. 1985). Actualmente tambin existen sistemas de ensayos que utilizan las bacterias luminiscentes liofilizadas o desecadas para determinar toxicidad del agua como el BioFix Lumi y el producto Microtox desarrollado por AZUR Environment, (Strategic Diagnostics, Inc. Neware, DE, USA), recomendado para medir la toxicidad aguda de efluentes industriales lquidos por su rapidez, alta sensibilidad y reproducibilidad y segn Doherty (2001), el Microtox tambin se puede utilizar para medir la toxicidad en suelos y sedimentos. 60

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Objetivo: Aislar bacterias luminiscentes de muestras de agua de mar. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Tubos de cultivo con tapn de algodn. Pipetas estriles. Placas Petri. Reactivos y medios de cultivo. Medio lquido LM (Baumann y Baumann, 1981). Equipos. Incubadora bacteriolgica. Luminmetro, Bioluminmetro o Fotmetro. Detalles experimentales. Cuando se realiza el aislamiento de bacterias luminiscentes a partir de muestras de aguas se recomienda utilizar cultivos enriquecidos en medio lquido LM (Baumann y Baumann, 1981). Procedimiento. Se preparan tubos de cultivo con 9 mL de medio lquido LM (Baumann y Baumann, 1981), a los cuales se les aade 1 mL de muestra, y se incuban a 25 oC hasta siete das. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin, se realizan diluciones seriadas hasta 10-8 empleando el mismo medio de cultivo y se siembra superficialmente 0.1 mL de cada dilucin en placas Petri con el medio LM agarizado. Las placas sembradas se incuban a determinada temperatura, en dependencia de la especie que nos interese aislar, y se revisan cada 24 h hasta tres das. Las placas deben chequearse en la oscuridad, esperando unos segundos que la visin del observador se adapte para captar si es visible la luminiscencia. Cuando el crecimiento es positivo, se observar una luminiscencia caracterstica (Foto 1) que puede cuantificarse empleando un luminmetro, un bioiluminmetro o un fotmetro (Foto 2).

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Foto 1. Apariencia de un cultivo de bacteria luminiscente en erlenmeyer con medio lquido.

Foto 2. Fotmetro modelo 500 Analyzer

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Baumann, P y Baumann, L. 1981. . The marine Gram negative Eubacteria: genera Photobacterium, Beneckea, Alteromonas, Pseudomonas, and Alcaligenes. En: The Procaryotes, vol.2, M.P .Starrr et al. (eds.). Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N.Y., pp.13021331. Doherty, F. G. 2001. A Review of the Microtox Toxicity Test System for Assessing the Toxocity of Soils and Sediments. Water Quality research Journal Canada 36:475-518. Goto, T. 1980. Bioluminiscence of Marine Organisms. In: Marine Natural Products. Acad. Press. p. 179-222. Hasting, J.W 1978. . Bacterial Bioluminiscence: An Overview. In: Methods in Enzymology, Vol LVII Acad. Press p. 125-135. Naven, A., Potasman, I., Bassan, H. y Ulitzur, S. 1984. A new rapid sensitive bioluminiscence assay for antibiotics that inhibit protein synthesis. Journal of Applied Bacteriology 56:457-463. Nealson, K. 1977. Autoinduction of bacterial luciferasa: Occurrence, mechanism and significance. Archives Microbiology. 112:73-79. Steinberg, D. A., Peterson, G. A., White R. J., y Maiese, W M. 1985. . The stimulation of bioluminiscence in Photobacterium leiognathi as a potential prescreen for antitumor agents. The Journal of Antibiotics. Vol. XXXVIII No.10:1401-1407. Yates, I. E. y Porter, J. K. 1982. Bacterial Bioluminiscence as a Bioassay for Mycotoxins. Applied and Environmental Microbiology, Vol.44, No.5:1072-1075.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos. Las bacterias que viven asociadas a peces e invertebrados marinos pueden ser patgenas o formar parte de su microbiota normal, sin embargo, se conoce ms sobre las patgenas, debido al inters que existe por evitar o controlar las enfermedades en los organismos que son consumidos por el hombre. Las infecciones causadas por bacterias en peces e invertebrados marinos son ms frecuentes entre los organismos en cultivo que entre los de vida libre, y es uno de los aspectos que se le presta mayor atencin en la acuicultura. Segn Sanders y Fryer (1988) a nivel mundial se han aislado aproximadamente, 35 especies de bacterias, pertenecientes a 21 gneros, asociadas a peces enfermos. Desde el punto de vista ecolgico, la flora bacteriana de invertebrados acuticos constituye un componente significativo de los microorganismos que contribuyen, de manera global, a la productividad en lagos y ocanos (Tietjen, 1980). Tambin, existen evidencias de que algunas bacterias son consumidas por el fitoplancton (Bird y Kalff, 1986), as como por invertebrados de niveles trficos superiores, lo que puede influir en el flujo de energa en la trama alimenticia (Jannach, 1985). Otro aspecto de inters es la capacidad de algunas bacterias que viven asociadas a peces e invertebrados de producir antibiticos y enzimas de inters mdico farmacutico (Nishihara et al. 2008). Objetivo: Aislar bacterias de peces e invertebrados marinos. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Aplicador estril. Tijeras quirrgicas estriles o bistur. Pinzas. Jeringuilla estril. Pipetas estriles. Placas Petri estriles.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Reactivos y medios de cultivo. Agua destilada estril. Tintura de yodo o etanol 10 70%. Tincin Gram. Agar infusin cerebro-corazn (BHI) o el Agar triptona soya (TSA) suplementado con NaCl (1-3%). Agar Marino. Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa (TCBS). Agar nutriente. Caldo tioglicolato. Medio lquido tripticasa- peptona- glucosa. Agar Cytophaga. Agar KDM-2. Mueller -Hinton suplementado con 0.1% de L-cistena. Agar sangre. Medio Lwenstein-Jensen, Medio Ogawa o Medio Sauton para mico bacterias. Agar feniletil (BBL). Equipos. Homogenizador. Incubadora bacteriolgica. Cmara hmeda. Detalles experimentales. No existe un solo mtodo para aislar todos los microorganismos que pueden encontrarse en un organismo, pero en todos los casos, es recomendable obtener informacin sobre las caractersticas biolgicas bsicas del organismo con que vamos a trabajar, ya que esta informacin puede resultar de utilidad a la hora de escoger el mtodo de aislamiento y el medio de cultivo a emplear. Tanto los peces como los invertebrados colectados deben analizarse tan pronto como sea posible para evitar cambios en la microbiota durante el almacenamiento. Procedimiento. Peces. Si trata de peces enfermos, se recomienda primeramente, realizar una detallada descripcin de la lesin (superficial o interna) y consultar la literatura existente para orientarse sobre el posible agente causante de la enfermedad, ya que existe bastante informacin sobre las especies microbianas patgenas en peces. Pgina 65

TCNICAS DE BACTERIOLOGA En general, para el aislamiento se desinfecta el rea donde vayamos a trabajar con tintura de yodo o etanol al 70%, se toma una muestra directamente de la lesin con un aplicador estril o se corta parte del tejido con tijeras quirrgicas estriles y se homogeniza en una pequea cantidad de agua destilada estril. Una vez se observe que la muestra est uniformemente desintegrada, se deja reposar por unos min y se siembra una porcin del sobrenadante en el medio seleccionado. Especies de los gneros Vibrio y Aeromonas se consideran constituyentes de la flora normal de peces de aguas marinas y dulces, aunque algunas causan vibriosis, furunculosis y septicemias. Para el aislamiento de vibrios se pueden emplear el Agar infusin cerebro-corazn (BHI) o el Agar triptona soya (TSA) suplementado con NaCl (1-3%) o preparado con agua de mar estril. Tambin se puede usar Agar Marino y el Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa (TCBS), este ltimo es selectivo para vibrios enteropatgenos como el V. cholerae y el V. parahaemolyticus. Para el aislamiento de Aeromonas salmonicida, la especie patgena de peces ms ampliamente distribuida en el mundo, se emplea BHI y TSA. Despus de incubar a 25 C de 2 a 3 das, aparecern colonias circulares, elevadas y traslcidas. Las cepas tpicas producen un pigmento carmelita soluble en agua que se difunde al medio alrededor de la colonia. Aeromonas hydrophila, A. caviae y A. sobria pueden aislarse de la superficie externa o de los intestinos de los peces usando medio BHI y TSA o Agar nutriente. En Agar nutriente despus de 24 a 48 h de incubacin a 25 C aparecern colonias blancas, convexas, de bordes circulares y entero. Otra bacteria aislada de peces es la especie Plesiomonas shigelloides que puede crecer en los medios BHI y TSA. Pasteurella piscicida es una especie patgena de peces que fue descrita en 1963 a partir de una mortandad masiva de perchas blancas (Roccus americanus) y lubinas (R. saxatilis) que tuvo lugar en la costa este de Estados Unidos. Esta bacteria crece en los medios BHI y TSA con al menos, 0.5% de NaCl y temperatura de incubacin entre 17 y 31C. Todos los gneros de la familia Enterobacteriaceae, excepto Erwinia, pueden considerarse aislamientos potenciales de peces y como grupo, se consideran, patgenos oportunistas. Tres especies de los gneros Edwardsiella y Yersinia son reconocidos como importantes patgenos de peces: E. tarda, E. ictaluri y Y. ruckeri, Edwardsiella tarda y E. ictaluri crecen en medio BHI o 66

TCNICAS DE BACTERIOLOGA TSA. En ambos medios, se debe incubar de 2 a 3 das a una temperatura entre 22 y 26 C. Las colonias son pequeas, transparentes, circulares, elevadas y convexas. Tambin se puede favorecer el aislamiento de E. tarda inoculando la muestra homogenizada de tejido lesionado en Caldo tioglicolato 4 das a temperatura de 22 C previo al cultivo en BHI. La especie Yersinia ruckeri es causante de la enfermedad entrica boca roja en salmones, muy conocida en el norte y sur de Amrica, Europa y Australia. Esta bacteria puede aislarse en los medios de cultivo BHI y en TSA donde crece formando colonias pequeas, suaves, circulares y elevadas despus de 48 h de incubacin a 20-25 C. Tambin puede emplearse un medio de cultivo diferencial (Medio Shorts-Waltman). Las colonias de Y. ruckeri son verdes y estn rodeadas de una zona clara producida por la hidrlisis. Con frecuencia, tambin se aslan de peces especies de la Familia Pseudomonadaceae, algunas de las cuales, pueden causar septicemias. Para aislar estas especies se pueden emplear los medios BHI, TSA o Agar nutriente, y temperatura de incubacin entre 20 y 25 C. Pseudomonas chlororaphis crece en agar nutriente produciendo un pigmento verde que forma cristales semejantes a agujas y P. fluorescens forma colonias redondas, brillosas y produce un pigmento amarillo-verdoso que se difunde en el medio y es soluble en agua. Las colonias de estas dos especies fluorecen cuando se exponen a luz UV . De la Familia Cytophagaceae, dos especies estn consideradas patgenas potenciales de peces de agua dulce: Flexibacter columnaris y Citophaga psychrophila, mientras que, Flexibacter maritimus y Sporocytophaga se han descrito como patgenas de peces marinos. Flexibacter columnaris causa lesiones amarillentas externas en las agallas y sobre la superficie del cuerpo. Se pueden aislar bacterias de esta especie sembrando tejido homogenizado en Agar Cytophaga e incubando las placas a 25 C de 3 a 5 das. Las colonias son amarillas con el centro extendido, retorcido, bordes rizoides y adheridos a la superficie del agar. De la superficie externa de las agallas de salmones en cultivo que presentan signos de la enfermedad conocida como bacterial gill tambin se ha aislado bacterias pertenecientes al gnero Flavobacterium. Estas bacterias pueden aislarse sembrando tejido infectado directamente en Agar Cytophaga o en TSA muy diluido (20 veces). Despus de cinco das de incubacin a 18 C crecern colonias redondas, transparentes, suaves y de color amarillo claro. Pgina 67

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Las especies de Flavobacterium aisladas de peces (F. aquatile y F. balustinum) difieren de otras especies de este gnero por su incapacidad para crecer a 37 C y su habilidad para hidrolizar almidn. Cuando se estudia la microbiota normal de los peces se encuentra una poblacin significativa de bacterias no patgenas en formas de bacilos pleomrficos gram positivas que no forman esporas, pertenecientes a los gneros Renibacterium, Lactobacillus y Eubacterium. Renibacterium salmoninarum es una bacteria parsita obligada de peces que ha sido aislada de salmones de vida libre o de cultivo. Para aislarla se emplea el medio Agar KDM-2, aunque tambin se puede reemplazar el suero fetal bovino que contiene este medio por carbono activado al 0.1%. Otro medio que se usa es el Mueller.-Hinton suplementado con 0.1% de L-cistena o el Agar KDM-2 adicionndole antibiticos selectivos. En Agar KDM-2 las colonias son circulares, convexas, de color blanco hasta amarillo crema. La temperatura ptima de crecimiento es de 15 a 18 C y requiere de cinco a seis semanas para que aparezcan las colonias. Las colonias contaminantes que crecen rpido deben eliminarse aspticamente de las placas para lograr aislar posteriormente las de crecimiento ms lento. La especie Eubacterium tarantellus ha sido aislada del cerebro de peces estuarinos empleando medio tioglicolato o Agar BHI e incubando anaerobicamente a 25 C. Las colonias, visibles despus de 48 h de incubacin, tienen de 2 a 5 mm de dimetro, son traslcidas, planas, rizoides con una apariencia de remolino. En placas con medio BHI con sangre de oveja ocurre hemlisis. Morfolgicamente, las clulas de esta bacteria forman largas cadenas o filamentos de bacilos pleomrficos. Como parte de la flora normal de peces de agua dulce y marina tambin se han aislado especies del gnero Lactobacillus, reconocindose slo la especie L. pisccola como patgena. Para su aislamiento se pueden emplear los medios BHI o TSA, y una temperatura de incubacin de 25 C. A los 2 das aparecern colonias no pigmentadas con un dimetro menor a 2 mm, redondas y completas. Aunque los cultivos jvenes son Gram positivos, con frecuencia despus de 24 h se observan como Gram variables. Entre los cocos Gram positivos, el Staphylococcus epidermidis fue aislado e identificado en 1976 y 1977 de brotes de enfermedades en serviola y breca roja en Japn. Esta especie forma colonias circulares, convexas, lisas y blancas o blanco-amarillentas en medio BHI despus de incubar a 25 C.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA Especies de Streptococcus tambin se han aislado de peces enfermos de aguas dulces y marinas, sin embargo, no se han identificado los nombres. Para mayor rapidez, se ha determinado el antgeno del grupo Lancefield a que pertenecen. Del grupo de bacilos y cocos Gram positivos formadores de endosporas, se han aislado especies no patgenas del gnero Bacillus de la superficie externa y del tracto digestivo de peces. Estas bacterias pueden aislarse empleando los medios BHI, TSA o Agar nutriente y temperatura de incubacin de 20 a 25 C. Del gnero Clostridium se conoce que la toxina tipo E de la especie C. botulinum caus la muerte en salmones en cultivo en Estados Unidos, Inglaterra y Dinamarca (Eklund et al. 1984), sin embargo el C. botulinum no es una especie invasiva y se considera que la muerte de los peces ocurre por el canibalismo de peces que se encuentran en descomposicin en el fondo anxico de los estanques y presentan la toxina. Para aislar esta especie del contenido intestinal y los tejidos de los peces se usa un medio enriquecido con yema de huevo, Agar sangre y medio lquido tripticasa- peptona- glucosa. Se incuba en anaerobiosis estricta a 25-30 C. Tambin se ha aislado esta bacteria directamente a partir de muestras de sedimentos del estanque donde ha ocurrido la muerte de peces por la ingestin de la toxina tipo E. Entre las micobacterias, tres especies han sido descritas como patgenas de peces: Mycobacterium marinum, M. fortuitum y M. chelonei. El crecimiento de estas bacterias requiere adicionar al medio de cultivo basal factores de crecimiento y generalmente, cuando se aslan por primera vez se necesitan periodos de incubacin de hasta 30 das. Se han descrito cuatro formulaciones de medios de cultivo especficos para el aislamiento de estas bacterias: Lwenstein-Jensen, Petrognani, Ogawa y Sauton. Dos especies de bacterias pertenecientes al gnero Nocardia se han aislado de peces: Nocardia asteroides y N. campachi. Pueden aislarse de los rganos internos o de las lesiones (frecuentemente en las agallas) empleando medios bacteriolgicos como el BHI, el TSA o el Agar Nutriente y temperatura de incubacin de 20-30 C. Invertebrados marinos. Los crustceos deben manipularse cuidadosamente para evitar daos en sus carapachos que pueden provocar que se contamine su hemolinfa, y transportarse en cmara hmeda para evitar la desecacin. Si no es posible transportarlos en agua de mar con adecuada oxigenacin, es preferible congelarlos. Pgina 69

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Para detectar la bacteria patgena Aerococcus viridans Subs. homari (Stewart, 1984) causante de la enfermedad conocida como Gaffkaemia en langostas se requiere del anlisis de la hemolinfa. La hemolinfa se extrae del seno cardiaco de los animales por puncin a travs de la membrana intersegmental usando una jeringuilla estril de 5 mL. Esta membrana se localiza entre la parte posterior del carapacho y el abdomen, cuidando no tocar el hepatopancreas. Otra variante es obtener la hemolinfa del seno ventral pinchando en la membrana no calcificada en la base de las patas natatorias. Para evitar la contaminacin, el sitio donde se pinche debe desinfectarse con tintura de yodo o etanol al 70% antes de hacer la puncin. La hemolinfa se puede examinar directamente con una tincin Gram o se puede sembrar en medio de cultivo selectivo para el microorganismo patgeno como el Medio Gaffkya (Stewart et al. 1966). Se inocula 0.5 mL de hemolinfa en 4.5 mL de caldo y se incuba por 5 das a 28 C. Los tubos que muestren produccin de cido deben subcultivarse en Agar feniletil u otro medio nutriente no selectivo. Las colonias de Aerococcus viridans Subs. homari estn formadas por cocos gram positivos en ttradas y son catalasa negativa. La extraccin de los rganos internos de los crustceos para su anlisis es posible slo con el animal muerto, ya que as se puede remover fcilmente el carapacho. Es frecuente observar lesiones necrticas en los exoesqueletos de los crustceos que pueden deberse a la accin de bacterias quitinolticas que pueden aislarse directamente tomando muestra de la lesin y sembrando en un medio especfico como el descrito por West y Colwell (1984), o cortando una muestra de la parte infectada con un instrumento estril, homogenizar en agua estril y sembrar una alcuota. En cuanto a los moluscos, estos despus de colectados deben lavarse con abundante agua para remover el fango de sus conchas y posteriormente, deben transportarse al laboratorio en cmara hmeda a una temperatura entre 8 y 10 C. Los moluscos bivalvos no deben introducirse en agua durante la transportacin porque continuarn filtrando, lo que puede alterar el conteo de su microbiota bacteriana en pocas horas. En general, los moluscos deben abrirse con la concha plana o somera hacia arriba, cortarse las ataduras de sus msculos y retirar esta concha, para dejar los rganos internos en la concha ms profunda.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA En moluscos bibalvos grandes, si es necesario colectar diferentes rganos internos para examen bacteriolgico, la vscera entera del animal debe ser enjuagada con agua estril pera remover las bacterias de la superficie y el fluido asociado con el rgano. Este lquido tambin puede ser extrado antes de extraer el rgano usando una pipeta estril. En general, para el anlisis de las bacterias presentes en los invertebrados debe desintegrase el organismo y homogenizar la vscera o el pedazo de tejido. Homogenizar la muestra facilita la inoculacin en medio de cultivo, sobretodo, si se quiere contar el nmero de clulas. Se puede batir a 12000 rev min -1 por hasta 2 min con intervalos de 15 seg, para evitar el calentamiento de la muestra. Tambin se puede usar un digestor (Stomacher) por un tiempo de hasta 10 min o hasta que se visualice que la muestra se desintegr completamente. Debe emplearse un diluyente adecuado, como es agua filtrada y autoclaveada, preferiblemente tomada del lugar donde se colect el organismo, que asegure la sobrevivencia de las bacterias hasta que se realice la siembra. Para erizos marinos se emplea un procedimiento que es aplicable a los invertebrados grandes. Se abre la testa del erizo con unas tijeras estriles y se toman muestras del fluido intestinal y de varias membranas internas por diseccin y aspiracin, usando jeringuillas y agujas y lavando repetidamente las superficies, respectivamente. Allongi (1985) describi un procedimiento usando ultrasonido para la separacin de bacterias de la superficie de poliquetos, pero debe emplearse con cuidado para evitar la destruccin de las clulas bacterianas durante el tratamiento.

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TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Allongi, D.M.1985. Microbes, meiofauna, and bacterial productivity on tubes constructed by the polychaete Capitella capitata. Marine Progress Series, 23:207-208. Bird, D. y Kalff, J. 1986. Bacterial grazing by planktonic lake algae. Science, New York, 231:493-495. Eklund, M. W Poysky, F. T., Peterson, M.E., Peck, L. W y Brunson, W ., . .D. 1984. Type E botulism in salmonids and conditions contributing to outbreaks. Aquaculture, 41:293-309. Jannach, H. W 1985. . Deep sea life on the basis of chemical synthesis. Naturwissenshaften, 72: 85290. Nishihara, M., Kamata, M., Koyama, T. y Yazawa, K. 2008. New Phospholipase A1-producing Bacteria from a Marine Fish. Marine Biotechnology. (Ed) Springer New York. Vol.10, No.4:382-387. Sanders, J. E. y Fryer, J. L. 1988. Cap.5. Bacteria of Fish. En: Methods in Aquatic Bacteriology. (Ed.) B. Austin. p.115-142. Tietjen, J. H. 1980. Microbial-meiofaunal interrelationship: a review. En: Microbiology-1980. (Ed.) D. Schlessinger. ASM, Washigton DC. p. 335-338. Stewart, J. E.1984. Lobster diseases. Helgolander Meeresunters uchungen, 37:243-254. Walkman, W y Shorts, E. B. 1984. .D. A medium for the isolation and differentiation of Yersinia ruckeri. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 41: 804-806. West, P 1988. .A. Bacteria of Aquatic Invertebrates. En: Methods in Aquatic Bacteriology. B. Austin (Ed.) pp.143-170. West, P A. y Colwell, R. R. 1984. . Identification and classification of Vibrionaceae-An overview. En: Vibrios in the Enrvironment. (Ed) R.R. Colwell Wiley, New York. p. 285-363. 72

TCNICAS DE BACTERIOLOGA 2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanergamas marinas. Las macroalgas se caracterizan por tener organizacin celular, denominndose talo el vegetal completo. En zonas templadas las macroalgas pueden formar densos bosques submarinos de ms de 20 m de alto. Se conocen tres filos de macroalgas: Rhodophyta (algas rojas), Ochrophyta (algas pardas) y Chlorophyta (algas verdes). Por su parte, las fanergamas (Magnoliophyta) son plantas superiores con flores, sin tallo desarrollado, adheridas al sustrato por rizoides y con una morfologa adecuada para soportar la presin hidrosttica. A nivel mundial, existen alrededor de 15 000 especies de algas, de las cuales ms del 50 % son macroalgas marinas; mientras que de las fanergamas, que forman los pastizales marinos en las plataformas continentales e insulares, se han registrado 45 especies. La zona de mayor diversidad es el Indo-Pacfico, en biotopos de fondos duros y pastizales (Surez, 2006). El macrofitobentos sirve de refugio y alimento a una fauna muy diversa y constituye la base de la produccin primaria en la zona nertica. Tambin, pueden ser indicadoras de impacto ambiental, ya que su aparicin masiva puede ser la respuesta a la eutrofizacin del medio o a la desaparicin masiva de herbvoros por causas naturales o antrpicas. De muchas especies del macrofitobentos se obtiene alimento humano y pienso animal, y adems, se ha utilizado para la recuperacin de los suelos. De algunas algas se han obtenido sustancias bioactivas como: antitumorales, antinflamatorios, antioxidantes y otros, que forman parte de muchos medicamentos. Entre los productos ms tradicionales obtenidos de las algas estn sus ficocoloides (agar, alginatos y carragenanos) utilizados en varias industrias, como la alimenticia y la de cosmticos, entre otras (Surez, 2006). Objetivo: Observacin y aislamiento de bacterias de macroalgas y fanergamas marinas. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Bolsas de plstico estriles Tijeras estriles Pinzas Cristalizadora Cubreobjetos Placas Petri Pipetas. Pgina 73

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Reactivos y medios de cultivo. Solucin fenlica de azul de anilina. Fenol.3.75g Azul de anilina soluble en agua0.05g cido actico 20% (v/v)..100 mL Esta solucin se debe pasar por un filtro Whatman No.1 antes de usarse. Es estable a temperatura ambiente por un perodo de 3 meses. Glicerina o barniz de uas. Metanol. Solucin de eosina amarilla (BDH, 0.2g/L). Aceite de inmersin. Equipos. Homogenizador, Digestor (Stomacher) o Sonicador Microscopio biolgico. Incubadora bacteriolgica. Detalles experimentales. Aunque el objetivo que se persiga sea el aislamiento de bacterias epfitas de macroalgas y fanergamas marinas, se recomienda ante todo hacer una observacin directa sobre la parte de la planta que se vaya a estudiar. Esta observacin directa es sencilla y puede brindarnos informacin sobre las diferentes formas de bacterias que ah se encuentran. Si las muestras colectadas no se pueden observar inmediatamente, se pueden conservar en una solucin acuosa de thiomersal (BDH, 0.2g/L). Procedimiento. Observacin directa. Se colectan las muestras en bolsas plsticas conteniendo agua del lugar de la colecta y se trasladan al laboratorio donde se limpian de otros organismos. Se corta con un bistur o unas tijeras estriles la parte de la planta que se va a estudiar, y se coloca en una placa Petri estril. Para realizar observaciones empleando microscopa de campo claro, se recomienda teir con una solucin fenlica de azul de anilina. Una vez teido el material por unos 2 a 3 min, se cubre con un cubreobjeto, se coloca una gota de aceite de inmersin y se observan las bacterias al microscopio biolgico. La preparacin puede guardarse sellada con glicerina o con barniz de uas. Si el material presenta una pigmentacin muy oscura y se hace difcil la observacin a la luz del microscopio, se requiere decolorar la muestra antes de teirla. 74

TCNICAS DE BACTERIOLOGA Para macrfitas acuticas, el metanol es un buen decolorante, aunque tambin se puede emplear cloroformo o cloro gaseoso. La planta se sumerge en una cristalizadota con metanol durante toda una noche. Este tratamiento tiene el inconveniente que algunas bacterias pueden ser lavadas de la planta, por lo que no las tendremos en cuenta. Cuando la planta absorbe la solucin fenlica de azul de anilina, se dificulta la observacin de las bacterias epfitas, por lo que se puede hacer una pretincin. La pretincin se hace tiendo primero la planta con una solucin de eosina amarilla (BDH, 0.2g/L) por 1 h. Despus se procede a la tincin con la solucin fenlica de azul de anilina, y se observarn las bacterias epfitas de color rojo oscuro sobre un fondo naranja claro. Existen otros procedimientos para observar bacterias epfitas como son microscopia de fluorescencia o electrnica, a los que no se harn referencias. Aislamiento. Para el aislamiento debe emplearse un medio de cultivo acorde con las bacterias que se quieren aislar. No existe un medio donde puedan crecer todas las bacterias de una poblacin, por lo que a veces, se escoge un atributo especfico y se prepara el medio acorde con estos requerimientos, obtenindose entonces un cultivo de una sub poblacin. Tradicionalmente, para separar las bacterias de la superficie de la planta se emplean procedimientos de homogenizacin, digestin o ultrasonido pero en todos los casos debe tenerse sumo cuidado de no daar las clulas, y adems, se debe evaluar la eficiencia del tratamiento. Una vez que las bacterias son removidas de la planta por el tratamiento que se haya aplicado, se trata la suspensin como cualquier otra, procedindose a la siembra en el medio de cultivo seleccionado. Para aislar bacterias de plantas de agua dulce Fry y Humphrey (1978) describieron el Medio Casena-peptona-almidn. Debe tenerse en cuenta que las hojas ms viejas tiene mayor cantidad de bacterias que las hojas ms jvenes y tambin, que la cantidad de bacterias difiere de una parte de la planta a otra y de una especie a otra. Para la identificacin de bacterias aisladas de plantas vasculares y algas macrfitas se utilizan los mismos esquemas que se emplean para bacterias acuticas, debiendo tenerse en cuenta que la composicin de especies tambin vara con la edad de la planta y la especie. Pgina 75

TCNICAS DE BACTERIOLOGA BIBLIOGRAFIA Baker, J. H. Epiphytic Bacteria. En: Methods in Aquatic Bacteriology. (Ed.) B. Austin. p. 171-191. Fry, J. C. y Humphrey, N. C. B. 1978. Techniques for the studies of bacteria epiphytyc on aquatic macrophytes. En: Tecniques for the Study of Mixed Populations. (Eds.) D. W Lovelook y R. . Davis. Academic Press, London. p. 1-29. Surez, A. 2006. El macrofitobentos, Reino VEGETAL. P .18-21. En: La Biodiversidad Marina de Cuba. (Ed.) R. Claro. Instituto de Oceanologa. Soporte Electrnico.

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Captulo 3 Tcnicas Micolgicas

TCNICAS MICOLGICAS 3.1. Aislamiento de hongos en las playas. Aislamiento de hongos arencolas. El espacio que media entre los granos de arena de las playas, alberga una gran variedad de animales y plantas microscpicas, donde tambin estn incluidos los hongos marinos. Los hongos marinos que habitan entre los granos de arena de las playas se conocen como hongos arencolas. Este grupo posee una importancia ecolgica relevante porque juegan un papel primordial como descomponedores primarios de la mayora de los sustratos orgnicos que se encuentran en la playa, principalmente lignocelulsicos, por lo que contribuyen a remineralizar y reciclar los nutrientes en ese ambiente (Hyde et al. 1998). A escala internacional, el ambiente marino arencola ha sido poco explorado desde el punto de vista micolgico, por lo que la biodiversidad de hongos presentes en este medio an ofrece la posibilidad de descubrir nuevas especies. Objetivos: Aislar e identificar hongos arencolas a partir de restos vegetales cubiertos de arena. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Pinzas y agujas de diseccin. Portaobjetos. Cubreobjetos 18 x 18 mm y de 24 x 24 mm. Bolsas de polietileno con cierre hermtico. Lupa. Reactivos. Blsamo de Canad para elaborar preparaciones microscpicas permanentes. Barniz de uas transparente para sellar las preparaciones. Equipos Microscopio estereoscpico. Microscopio biolgico. Procedimiento. La colecta de muestras debe realizarse a lo largo de la zona intermareal o anteplaya, durante la marea baja. Se toman 30 unidades de muestra formadas por restos orgnicos (restos de madera, algas, etc.) cubiertos ligeramente con arena hmeda y se colocan de manera individual, en bolsas de polietileno cerradas hermticamente (Foto 3). Pgina 79

TCNICAS MICOLGICAS Foto.3. Bolsa de polietileno con restos vegetales cubiertos de arena.

Las muestras se incuban por un perodo de cuatro meses, a temperatura ambiente, siguiendo el mtodo de incubacin de restos vegetales en cmara hmeda (Volkmann-Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1993; Gonzlez y Herrera, 1993). Despus de incubadas, las muestras se revisan al microscopio estereoscpico para localizar las estructuras de reproduccin de los hongos sobre los diferentes restos vegetales (Foto 4). Foto.4. Ascocarpos de Corollospora maritima sobre granos de arena despus de cuatro meses de incubacin.

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TCNICAS MICOLGICAS Las estructuras fngicas encontradas se prepararan en fresco para ser identificadas al microscopio ptico mediante la Clave de identificacin que propone Hyde et al. (2000). La conservacin de las especies identificadas se realiza mediante preparaciones microscpicas permanentes (Ver Cap.4). Aislamiento de hongos en la espuma de mar. La morfologa de las ascosporas y conidios de los hongos marinos favorece su transporte a travs del oleaje, quedando muchas atrapadas entre las burbujas de aire de la espuma de mar. En la espuma de mar los hongos ms comunes son los arencolas, entre los que se encuentran las especies Corollospora sp y Varicosporina ramulosa (Cap, 1986). Tambin, pueden encontrarse Dendryphiella arenaria y Lepthospaheria sp. (Vrijmoed, 2000). Las esporas fngicas encontradas en la espuma de mar pueden caracterizar la micobiota de una playa en particular (Kirk, 1983; Vrijmoed, 2000). Objetivos: Aislar e identificar hongos de la espuma de mar aplicando el mtodo de incubacin de restos vegetales en cmara hmeda. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Espumadera o beaker. Frascos estriles de boca ancha de 250 mL. Pipeta estril. Portaobjetos. Cubreobjetos 18 x 18 mm y de 24 x 24 mm. Reactivos. Blsamo de Canad para elaborar preparaciones microscpicas permanentes 50 mL. Barniz de uas transparente para sellar las preparaciones. Formalina al 45% Equipos Refrigerador Microscopio biolgico. Procedimiento

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TCNICAS MICOLGICAS La espuma de mar se colecta fcilmente a lo largo de la costa, cuidando no colectar restos de arena o agua (Foto 5). Para esto puede utilizarse una espumadera convexa o un beaker. Foto.5. Espuma de mar que arriba a la zona intermareal.

La espuma se vierte en frascos estriles de 250 mL de boca ancha. Las muestras son refrigeradas por dos horas a 5 C para evitar la germinacin de las esporas. A continuacin, se deja que la espuma se disuelva y las esporas precipiten. Se toma parte del precipitado con una pipeta y se realiza una preparacin en fresco para observar al microscopio biolgico. Las esporas fngicas se observan con un aumento de 40 x, preferiblemente utilizando microscopa de campo oscuro o contraste de fase, donde las esporas se distinguen por refraccin de las partculas amorfas no refractarias. Si las muestras no pueden ser analizadas inmediatamente, se le adiciona formalina al 45% a la espuma disuelta hasta obtener una concentracin final del 5%.

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TCNICAS MICOLGICAS BIBLIOGRAFA Cap de Paz, M. C. 1986. Nuevos registros para la micobiota marina cubana. Fungi: Ascomycotina y Deuteromycotina). Rep. Invest. Inst. Oceanologa No. 50. Ed. Academia de Ciencias de Cuba. Figueira, D. y Barata, M. 2007. Marine fungi from two sandy beaches in Portugal. Mycologia 99:1: 20-23 Gonzlez, M. C. y Herrera, T. 1993. Micromicetes endopsamfilos de Barra Navidad, Jalisco, Mxico. Rev. Mex. Micol. 9: 19-33. Hyde, K. D., Gareth E.B., Leao, E., Pointing, S.B., Poonyth, A.D. y Vrijmoed, L.L.P 1998. . Role of fungy in marine environment. Biodiversity and Conservation Vol.7: 1147-1161. Hyde, K. D., Sarma, V V y Jones, E. B. G. 2000. . Morphology and taxonomy of higher marine fungi. In: Marine Mycology -A practical Approach (Eds. K. D. Hyde y S.B. Pointing). Fungal Diversity Press Series, Hong Kong, Vol. 1, p. 172-204. Kirk, P W 1983. . . Direct enumeration of marine arenicolous fungi. Mycologia 75: 670- 682 Kohlmeyer, J. y Volkamann-Kohlmeyer, B. 1991. Ilustrated key to filamentous marine fungi. Bot. Mar. 34: 1-69. Volkmann-Kohlmeyer, B. y Kohlmeyer, J. 1993. Biogeografic observations on pacific marine fungi. Mycology, 85: 337- 346. Volkmann-Kohlmeyer, B. y Kohlmeyer, J. 1996. How to prepare truly permanent microscope slides. Mycology 10: 107- 108. Vrijmoed L.L.P 2000. . Isolation and culture of higher filamentous. In: Marine Mycology -A practical Approach (Eds. K. D. Hyde y S. B. Pointing), Fungal Diversity Press Series, Hong Kong: 1-20.

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TCNICAS MICOLGICAS 3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos. Los pastos marinos son comunidades conformadas por angiospermas que se han adaptado a vivir en condiciones de inmersin permanente en el mar (Hemminga y Duarte, 2000). Numerosas especies de estas como: Posidonia oceanica, Ruppia maritima, Thalassia testudium, Zostera marina, Syringodium filiforme y Halodule wrightii, son fcilmente colonizados por hongos marinos (Kohlmeyer-Volkmann Kohlmeyer, 1991). Las estructuras superiores no sumergidas de estas plantas pueden estar habitadas por hongos terrestres. Las hojas de angiospermas marinas frecuentemente son trasladadas por las corrientes hasta los manglares o las orillas de las playas cercanas a los mismos, donde se acumulan hasta su descomposicin, por lo que el intercambio puede ir en uno y otro sentido (Hemminga y Duarte, 2000). En la regin litoral del occidente de Cuba existe una arribazon casi constante de Thalassia testudinum (Foto 6), que es la especie predominante en los pastos marinos de la plataforma insular cubana (Surez, 2006). Foto 6. Praderas de Thalassia testudinum frecuentes en los fondos de la plataforma submarina cubana.

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TCNICAS MICOLGICAS Objetivos: Determinar la abundancia de hongos marinos en los pastos marinos. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Bolsas de polietileno estriles con cierre hermtico. Bistur. Cubres y portaobjetos. Reactivos. Blsamo de Canad para elaborar preparaciones microscpicas permanentes. Barniz de uas transparente para sellar las preparaciones. Equipos. Microscopio estereoscpico. Microscopio biolgico. Procedimiento. La colecta de los rizomas, tallos y hojas de los vegetales que forman los pastos marinos se puede realizar directamente por un buzo o utilizando una draga. Las muestras colectadas se colocan en bolsas de polietileno estriles con cierre hermtico para su traslado al laboratorio. Las manchas carmelitas y blanquecinas en los extremos de las hojas indican el ataque de hongos. Los cuerpos fructferos pueden ser encontrados directamente sobre las hojas, o desarrollarse despus de incubar las hojas daadas, aproximadamente, por un mes. Los ascocarpos y picnidios estn casi siempre embebidos en el sustrato, en este caso, en los tallos y hojas, lo que dificulta su visualizacin desde el exterior, por tanto, la cutcula o las clulas de las capas externas de tallos y hojas deben cortarse tangencialmente con una cuchilla debajo del microscopio estereoscopio. Tambin estas muestras pueden ser divididas longitudinalmente con el fin de hacer visibles las esporas, las cuales estn generalmente dispuestas en filas paralelas al axis largo del tallo. Las manchas negras en los tallos y en la envoltura de las hojas indican la presencia de ascocarpos ocultos (Foto 7).

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TCNICAS MICOLGICAS Foto 7. Ascocarpos de Lindra marinera embebidos en una hoja de Thalassia testudinum.

Una vez extradas estas estructuras de reproduccin se realiza una preparacin en fresco para su identificacin y posteriormente, se procede a la elaboracin de la preparacin microscpica permanente para mantener en coleccin. Si se quiere obtener cultivos puros de estos hongos se puede empler el medio de cultivo Thalassia agar (Meyer y Simms, 1965).

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TCNICAS MICOLGICAS BIBLIOGRAFA Alcolado P Garca, E. y Espinosa N. 1999. ., Proteccin de la Biodiversidad y Desarrollo Sostenible en el Ecosistema Sabana- Camaguey. GEF-PNUD SabanaCamaguey CUB/92/G31. 145 pp. Surez, A. 2006. El macrofitobentos, Reino VEGETAL. P .18-21. En: La Biodiversidad Marina de Cuba. (Ed.) R. Claro. Instituto de Oceanologa. Soporte Electrnico. Hemminga M. A. y Duarte, C. M. 2000. Seagrass Ecology. University Press, Cambridge, 298pp. Kohlmeyer, J. y Volkamann-Kohlmeyer, B. 1991. Ilustrated key to filamentous marine fungi. Bot. Mar. 34: 1-69.

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TCNICAS MICOLGICAS 3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle. Los manglares juegan un papel importante en la productividad de las zonas costeras de diversas partes del mundo, sin embargo, a pesar de su magnitud, importancia ecolgica y significacin econmica, no poseen un nivel de estudios que permita evaluar la riqueza biolgica que alberga en toda su extensin. Los manglares del Caribe antillano acogen en sus races una gran diversidad de organismos como hongos, algas, esponjas, ascidias etc., algunos de los cuales son fuentes potenciales de frmacos (Garateix y Ortiz, 2007). Por esto, el conocimiento integral del estado de conservacin del ecosistema de manglar as como, el estudio de su biota asociada adquiere una gran importancia, adems de contribuir al conocimiento y preservacin de la biodiversidad marina. Las hojas secas y ramas de muchos de los rboles y arbustos que componen el bosque de manglar caen al agua espontneamente o forzadas por las lluvias y el viento. All se disponen entre las races donde son usadas como substrato, refugio o ingeridas como alimento por dismiles organismos, hasta ser completamente destruidas con la ayuda de los microorganismos. Todo ello permite que estos fondos, y los que se extienden a continuacin del manglar, sean ricos en nutrientes derivados de la descomposicin de la materia orgnica generada por el bosque y los organismos que en l habitan (Bulte et al. 2005). Los manglares son el medio ideal para el crecimiento y reproduccin de los hongos, lo que se corrobora con la variedad de especies encontradas en estudios recientes (Besitulo et al. 2002; NievesRivera, 2005). De la parte sumergida del manglar han sido aislados ascomicetes, lo que ratifica la amplia distribucin geogrfica de este grupo. Sin dudas, este ecosistema aporta sustratos favorables para el crecimiento de los hongos, en especial los ligncolas (Hype y Sarma, 2000), aunque la mayor diversidad de hongos est generalmente asociada al material que permanece sumergido por largos periodos de tiempo (Foto 8).

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TCNICAS MICOLGICAS Foto. 8. Mangle sumergido, sustrato ideal para ser colonizado por los hongos marinos.

Objetivos: Aislar e identificar hongos marinos asociados a hojas, ramas y races de mangle sumergidos. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Tijeras. Bistur. Bolsas de polietileno estriles con cierre hermtico. Porta y cubre objetos para preparaciones microscpicas permanentes. Reactivos. Blsamo de Canad para elaborar preparaciones microscpicas permanentes. Barniz de uas transparente para sellar las preparaciones. Equipos. Refrigerador. Microscopio estereoscpico . Microscopio biolgico. Procedimiento. Las muestras de las races y ramas de mangle sumergidas se cortan justo encima del sedimento, desechndose las partes embebidas en el suelo, pues Pgina 89

TCNICAS MICOLGICAS

generalmente carecen de oxgeno y estn pobladas por bacterias anaerobias, como lo indica el color negro y el fuerte olor a H2S. Debe tenerse el cuidado de colectar solamente aquellas partes que estn sumergidas, al menos, en algn momento del da, nunca aquellas que se encuentren por encima de la superficie del agua, pues estarn habitadas por hongos terrestres. Se toman pedazos de hojas, races o ramas que hayan perdido la corteza, o que presenten manchas, pues aqu se desarrollan los cuerpos fructferos y conidios de los hongos con mayor facilidad (Foto 9). Foto 9. Hojas de Rhizophora mangle colonizada por el hongo mitosprico Cercospora sp.

Las muestras se colocarn en bolsas de polietieno estriles y sern examinadas o conservadas a 5 C en el laboratorio. Posteriormente, se realizan preparaciones microscpicas para examinar el material y se identifican las especies emplendose las claves Kohlmeyer y Kohlmeyer, (1979), Jones y Hyde, (1988) y Hyde y Sarma, (2000).

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TCNICAS MICOLGICAS BIBLIOGRAFIA Abdel-Wahab,M.A. y El-Sharouny, H.M. 2002. Ecology of subtropical mangrove fungi with emphasis on Kandelia randel mycota. En: Hyde, K.D.(ed). Fungi in marine environment.. Fung. Divers. Res. 7:247-265. Besitulo, A.D., Sarma V .y Hyde, K.D. 2002 Mangrove fungi from Siargio Is.V land, Philippines. In: Fungi in Marine Environments (ed. K.D. Hyde). Fungal Diversity Research Series 7:267-283. Bulte, E., Hctor, A. y Larigauderie, A. 2005. Ecoservices: Assessing the impacts of biodiversity changes on ecosystem functioning and services. Diversitas Rep. No. 3, 40 p. Garateix, A. y Ortiz, E. 2007. Cap. Usos y Servicios de la Biodiversidad. En: La Biodiversidad Marina de Cuba. R. Claro (ed). Instituto de Oceanologa. ISBN 978-959-298-001-3 Hyde, K. D. y Sarma V V 2000. . . A pictorial key to higher marine fungi In: Marine Mycology -A practical Approach (Eds. K. D. Hyde y S. B. Pointing), Fungal Diversity Press Series, Hong Kong, Vol.1, p. 205-270. Hyde, K.D. 1990. A comparison of the intertidal mycota of five mangrove tree species. Asian Marine Biology 7: 93-107. ISME, 1993. Conservation and Sustainable Utilization of Mangrove Forest in Latin America and Africa Regions: Part 1 Latin America. Mangrove Ecosystems Technical Reports. Vol. 2. ISME, Okinawa, Japn. 272 p. Nieves Rivera, A.M. 2005. Coastal mycology of Puerto Rico: a survey and Biological aspects of marine estuarine, and mangrove fungi. Tesis Doctoral. Universidad de Puerto Rico Mayaguez -Campos. Schmit, J. P y Shearer, C.A. 2003. . A checklist of mangrove- associated fungi, their geographical distribution and knows host plant. Mycotaxon 85: 423- 477.

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TCNICAS MICOLGICAS 3.4. Aislamientos de hongos asociados a organismos marinos. La presencia de hongos filamentosos en sustratos calcreos sumergidos por lo general, pasa inadvertida, sin embargo, la presencia de estos microorganismos en los arrecifes coralinos ha sido descrita por Kohlmeyer y Volkmann- Kohlmeyer (1987, 1989, 1992). Estos autores identificaron 22 especies de ascomicetes y hongos anamrficos asociados a esponjas costrosas, algas coralinas, fragmentos de corales y moluscos. Las investigaciones acerca de los hongos asociados a los arrecifes coralinos se han dirigido principalmente, al estudio de enfermedades en corales blandos como los abanicos de mar (Gorgoniidae) (Geriser et al. 1998; Borneman, 2008), y sus sntomas en varios hospederos, usualmente en forma de necrosis del tejido o biomineralizacion (Rand et al. 2000). Datos recientes sealan la especie Aspergillus sydowii como responsable de la destruccin masiva de corales en el mar Caribe (Harwksworth, 2003). A pesar del inters del tema, los estudios sobre la biodiversidad de hongos marinos, as como sobre las interacciones de los hongos con los organismos que viven en los arrecifes, son an insuficientes (Morrison-Gardiner, 2002). Objetivo: Aislamiento e identificacin de hongos marinos asociados a gorgnidos. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Bolsas Ziploc estriles. Nevera o hielera (4oC de temperatura). Papel de filtro. Cajas Petri. Pinzas. Tubos de cultivo. Reactivos y medios de cultivo. Caldo Extracto de Malta. Harina de maz agua de mar con antibiticos (estreptomicina 0.6 mL, penicilina 1mL y cloranfenicol 2.5 mL). Jugo de ocho verduras- agar (J8V). Solucin de hipoclorito de sodio al 0.06%.

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TCNICAS MICOLGICAS Equipos. Microscopio estereoscpico. Microscopio biolgico. Nevera porttil o hielera. Procesamiento. El procedimiento que se describe a continuacin es el mtodo de Morrison-Gardier (2002) modificado (Medina, 2005). En el rea de muestreo, se toma una muestra del gorgnido o coral blando y se divide en seis submuestras que se colocan inmediatamente, de manera individual, en bolsas Ziploc estriles. Las bolsas con las submuestras se cierran convenientemente y se transportan al laboratorio en una nevera o hielera a 4 C aproximadamente, para su procesamiento antes de las 2 h de colectadas. Debe preparase un control negativo y otro positivo. Para el control negativo se toma un tubo de cultivo con 10 mL de agua destilada estril y se vierte en una bolsa Ziploc estril con pedazos de papel de filtro. Este control demuestra la esterilidad del material y del proceso al no obtener crecimiento de ningn hongo al final del procedimiento. Para preparar el control positivo se toma un tubo de cultivo con 10 mL de caldo extracto de malta y se inocula con Aspergillus fumigatus. El tubo con el caldo inoculado se vierte sobre los pedazos de papel de filtro contenidos en una bolsa Ziploc estril. Esto demuestra que el mtodo es efectivo si al obtener al final del proceso solamente el hongo que se inocula inicialmente. En el laboratorio, las submuestras del gorgnido o coral blando se cortan con tijeras flameadas y estriles, ayudndose de unas pinzas estriles, para obtener 120 pedazos pequeos (aproximadamente de 5 cm2 del tejido del organismo), y se desinfectan superficialmente con solucin de hipoclorito de sodio al 0.06 % y agua de mar estril. Sobre la superficie de cinco placas Petri conteniendo medio de cultivo harina de maz-agua de mar (HMA) con antibiticos (estreptomicina 0.6 mL, penicilina 1mL y cloranfenicol 2.5 mL para 1 L de medio), se colocan cuatro pedacitos separados del tejido del organismo (inculos) y de la misma forma, se procesan las submuestras restantes. Procesamiento de los controles: Del control negativo, se colocan 20 pedazos de papel de filtro embebido con el agua destilada estril en cinco cajas Petri con medio HMA y para el control positivo, de igual manera, se colocan Pgina 93

TCNICAS MICOLGICAS 20 pedazos de papel de filtro inoculados con A. fumigatus en cinco cajas Petri con medio HMA. Todas las cajas Petri (muestras y controles) se incuban a temperatura ambiente por 25 das y se revisan diariamente. Todas las colonias de hongos obtenidas que crecen con diferente morfologa, se transfirieren a cajas de Petri con medio de cultivo jugo de ocho verduras agar (V8A) y se valora su incidencia. Posteriormente, las colonias se pasan a tubo con este mismo medio. Para la identificacin de los hongos obtenidos, se consultan las claves taxonmicas especializadas como Barnett y Hunter (1998), Kohlmeyer y Volkmann-Kohlmeyer (1991) y Hyde y Pointing (2000).

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TCNICAS MICOLGICAS BIBLIOGRAFA Barnett, H. L. y Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. 4th ed. USA: APS Press. 218 pp. Borneman, E. 2008. Arrecife Vivo No.12. http://www.arecifevivo.com Geriser, D.M., Taylor, J. W Ritchie, K. B., Smith, G. W 1998. Cause of sea fan ., . death in the West Indies. Nature 394: 137-138. Harwksworth, D. L. 2003. Aspergillosis in sea fans. Mycological Research 107: 129-130. Hyde, K, D. y Sarma, V V 2000. . . A pictoral key to higher marine fungi In: Marine Mycology -A practical Approach. (Eds.) K. D. Hyde y S.B. Pointing. Fungal Diversity Press Series 1. Hong Kong: 205-270. Kohlmeyer, J. y Volkmann-Kohlmeyer, B. 1987. Koralionastetaceae Fam Nov. (Ascomycetes) from Coral Rock. Mycologia 79: 764-778. Kohlmeyer, J. y Volkmann- Kohlmeyer, B. 1989. A new Lulworthia (Ascomycotina) fron corals. Mycologia 81: 289-292. Kohlmeyer, J. y Volkamann- Kohlmeyer, B. 1991. Ilustrated key to filamentous marine fungi. Botanica Marina. 34: 1-69. Kohlmeyer, J. y Volkmann- Kohlmeyer, B. 1992. Two ascomycotina from coral reefs in the Caribbean and Australia. Crypt. Bot. 2: 367-374. Medina Ortz, M.C. 2005. Estudio preliminar de los hongos marinos asociados a Pacifigorgia sp. del arrecife de las Islas Marietas, Baha de Banderas, Nayarit, Mxico. Tesis de Licenciatura. Instituto de Biologa. UNAM. 79 p. Morrison-Gardiner, S. 2002. Dominant fungi from Australian coral reefs. Fungal Diversity 9: 105-121. Rand, T. G., Bunkley-Williams, L., Wlliams, E. H. 2000. A hyphomycete fungus, Paecilomyces lilacinus, associated with wasting disease in two species of Tilapia from Puerto Rico. Journal of Aquatic Animal Health 12: 149-156. Pgina 95

Captulo 4 Mtodos de Conservacin

MTODOS DE CONSERVACIN 4.1. Conservacin de Bacterias. Para conservar correctamente las cepas de microorganismos en los laboratorios deben cumplirse tres requisitos: que el cultivo est puro, que durante el tiempo de conservacin sobrevivan, al menos, el 70-80 % de las clulas, y que estas clulas permanezcan genticamente estables (Garca y Uruburu, 2001). Teniendo en cuenta que no existe un mtodo general para la conservacin de microorganismos, debe determinarse cual es el ms apropiado para cada caso particular. Existen varios mtodos de conservacin, que se utilizan segn el objetivo del trabajo, los requerimientos del microorganismo a conservar, las posibilidades tcnicas del laboratorio y la disponibilidad de recursos. Estos mtodos pueden dividirse en tres grupos: Mtodos de conservacin a largo plazo Mtodos alternativos Mtodos restringidos Mtodos de conservacin a largo plazo. Los mtodos de conservacin a largo plazo son los mejores porque garantizan al mximo la estabilidad gentica ya que se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, lo que evita la aparicin de generaciones sucesivas, sin que las clulas mueran. No obstante esta ventaja, no se puede descartar que ocurra algn cambio originado en la etapa de preparacin de las condiciones para la aplicacin del mtodo. A este grupo pertenecen dos mtodos: la congelacin y la liofilizacin. Conservacin por congelacin. Consiste en la congelacin de las clulas en suspensin en un lquido conteniendo un agente crioprotector. Los tubos cerrados o sellados se guardan a temperatura inferior a cero grado celsius (-195 C) en nitrgeno lquido, o bien en la fase gaseosa del nitrgeno lquido con una temperatura de -140 C. En el mercado existen varios tipos de armarios congeladores, de los cuales los ms aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de -70 C. Para conservan las cepas en estos armarios se utilizan unos tubos plsticos esterilizables resistentes a la congelacin, que se cierran hermticamente conocidos como criotubos. Se recomienda preparar varios lotes de tubos por cepa y utilizar uno para cada ocasin necesaria, lo que evita la congelacin y descongelacin sucesiva de las cepas. Tambin, se pueden preparar tubos con criobolas impregnadas con la solucin celular a congelar. Pgina 99

MTODOS DE CONSERVACIN El mtodo de las criobolas no debe emplearse con microorganismos anaerobios, ya que al estar las clulas adheridas a una superficie, hay un mayor contacto con el oxgeno y puede afectarse la viabilidad. En cuanto a los agentes crioprotectores, aunque existen muchos compuestos que se pueden usar, como el dimetilsulfxido, la leche descremada y algunos azcares, el agente ms utilizado es el glicerol a una concentracin del 15 al 20%. Para trabajar con clulas que estn conservadas por congelacin, solo se tiene que incubar nuevamente a una mayor temperatura. Se recomienda que las variaciones de temperatura, para congelar o descongelar, sean rpidas y se recomienda descongelar las clulas a una temperatura de 37 C. Este mtodo tiene algunos inconvenientes, entre estos, que requiere equipos especializados y que algn fallo en el sistema puede producir una subida de temperatura durante el almacenamiento. Conservacin por liofilizacin. Consiste en la sublimacin del hielo en las clulas, por tanto, primero hay que congelar el agua libre en las clulas y luego eliminarla mediante el vaco. Para realizar este proceso se utilizan los liofilizadores. Este es un mtodo muy recomendado por la comodidad que tiene el almacenamiento y el envo de los liofilizados. El almacenamiento puede hacerse a temperatura ambiente (18 C -20 C). Para liofilizar no debe utilizarse glicerol como agente crioprotector, debido a su elevado punto de evaporacin y su higroscopicidad que provoca que los liofilizados queden muy viscosos. Tampoco debe utilizarse dimeltilsulfxido, porque es algo txico y al concentrarse puede daar las clulas. Las suspensiones celulares para liofilizar deben tener una concentracin de 108 -109 clulas/mL y la temperatura durante la sublimacin debe ser lo ms baja posible. Hay algunos microorganismos que no resisten la liofilizacin, y entonces hay que recurrir a otros mtodos. Mtodos alternativos de conservacin. Estos mtodos se utilizan cuando la cepa no resiste los mtodos anteriores o cuando carecemos de los equipos y recursos necesarios. En este caso, se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos. 100

MTODOS DE CONSERVACIN Pueden ser: Conservacin por transferencia peridica. Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril. Conservacin por transferencia peridica. Este mtodo consiste en guardar la cepa en un tubo con el mismo medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, no puede permanecer por tiempo indefinido en el mismo tubo, pues las clulas excretan productos txicos del propio metabolismo que se acumulan y provocan envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio fresco. Este mtodo es el peor para mantener la estabilidad gentica, ya que al cabo del tiempo, las clulas que se estn guardando son descendientes lejanas de las que se tenan originalmente y es posible que ya no conserven algunas de sus caractersticas. Con el fin de alargar los periodos entre las resiembras, se recomienda disminuir la cantidad de inculo, o rebajar la proporcin de algunos nutrientes en el medio de cultivo, inocular en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, y tambin, almacenar los cultivos a 4-8 C. Para evitar la desecacin del medio de cultivo, se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estril. La transferencia peridica tambin facilita la contaminacin de los cultivos, teniendo en cuenta que requieren de una manipulacin ms seguida. Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril. Consiste en suspender en agua estril o en agua de mar al 75% estril, clulas del cultivo que se quiere conservar. Si se preparan las suspensiones en criotubos, la concentracin celular (para bacterias y levaduras) no debe ser mayor a 104-105 clulas/mL. Este mtodo ha mostrado altos porcentajes de viabilidad en periodos hasta de 5 aos, pero aunque la estabilidad para caracteres morfolgicos y fisiolgicos es buena, no se ha comprobado la estabilidad de caracteres especficos como virulencia, poder fermentativo, etc.

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MTODOS DE CONSERVACIN Mtodos restringidos Los mtodos restringidos son aquellos que no se emplean habitualmente, pero que pueden usarse cuando hay que conservar microorganismos que no resisten la liofilizacin o la congelacin. Se basan en la paralizacin del crecimiento por eliminacin del agua disponible para las clulas. Desecacin en papel de filtro. Se utiliza papel Whatman No.3 (bastante absorbente) que se impregna con una solucin muy densa de clulas y se deja secar al aire en condiciones estriles. Tambin puede utilizarse el procedimiento de desecacin lquida (L-Dry) en el cual, se usa el liofilizador pero sin que se haya hecho una congelacin previa de las clulas. Debe evitarse que un vaco excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelacin descontrolada de las clulas. Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc. Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern de desecar. Ese mtodo es muy bueno para microorganismos productores de esporas. Consiste en esterilizar en autoclave pequeas porciones de suelo o arena, en tubos con tapa de rosca, por dos das sucesivos, y posteriormente, aadirle a cada tubo 1 mL de la suspensin de clulas del microorganismo (o suspensin de esporas), y colocar los tubos con las tapas cerradas suavemente, en una desecadora con slica gel cerrando la tapa de la desecadora firmemente. Luego, sacar los tubos, cerrar las tapas fuertemente y colocarlos en otra desecadora que puede mantenerse en el refrigerador a temperatura entre 5 y 8 C. Tambin, pueden emplearse discos o tiras de papel embebidos en una suspensin del cultivo que se quiere conservar. Los discos se secan y mantienen igual que se describi antes, en tubos con tapas de rosca. Para revivir las clulas se toma un disco o una tira con una pinza estril y se coloca en otro tubo con medio adecuado, con cuidado no contaminar el stock. Desecacin en bolitas de alginato. Las clulas se encuentran en una matriz de alginato y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados hermticamente y a temperaturas entre 4 y 18 C, e incluso a -80 C debido al bajo contenido de agua y la proteccin que ofrece el alginato.

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MTODOS DE CONSERVACIN Desecacin en sal gruesa para halobacterias. Se mezclan las clulas con sal y se dejan desecar espontneamente. En este mtodo, la desecacin no es total debido a la higroscopicidad de la sal, pero las clulas dejan de multiplicarse por insuficiencia de agua disponible.

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MTODOS DE CONSERVACIN BIBLIOGRAFIA Day, J.G. y M.R. McLellan (eds.).1995. Cryopreservation and freeze-drying protocols. Humana Press. Totowa. New Jersey. Garca, M.D. y Uruburu, F. Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). http://www.uv.es/cect Hunter-Cevera, J.C. y A. Belt (eds.). 1996. Maintaining cultures for biotechnology and industry. Acad. Press. London.

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MTODOS DE CONSERVACIN 4.2. Conservacin de Hongos. Hay varias formas de preservar los hongos, entre estas se encuentran: conservacin en cultivos puros, congelados, deshidratados, en lquidos o en preparaciones permanentes. No existen reglas que establezcan la superioridad de un mtodo con respecto a otro, pero probablemente, la congelacin, la liofilizacin y las preparaciones permanentes sean los ms acertados. Congelacin. Los hongos que viven en la madera y en las algas se conservan muy bien mantenidos a temperaturas cercanas a los -18 C (Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1979). Los ascomycetes y deuteromycetes permanecen morfolgicamente inalterables an despus de repetidos procesos de congelacin y descongelacin. Para evitar la deshidratacin del sustrato durante la refrigeracin, este se guarda en bolsas plsticas con agua salada. Los hongos almacenados de esta forma pueden permanecer as indefinidamente sin que vare su morfologa. Deshidratacin. La aplicacin de las tcnicas de deshidratacin depende del sustrato en que ha sido encontrado el hongo. Los materiales duros o gruesos como la madera, corteza, rizomas o algas calcreas se pueden secar al aire libre y a la sombra. Las algas ms blandas se secan prensando entre pedazos de tela (Dawson, 1967, citado por Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1979). Con los sustratos secos se hacen cultivos puros segn el mtodo descrito por Pollack (1967), citado por Kohlmeyer y Kohlmeyer (1979). Para remover el agar seco de la placa Petri, se vierten 15 mL de Agar glicerol caliente (2.5%) en la tapa de la placa y se pone a flotar el cultivo en el agar caliente hasta que este se solidifique. Luego se destapa con la placa invertida, se separa y se seca completamente. La liofilizacin de los hongos marinos se recomienda cuando se dispone de buenos equipos. Este mtodo garantiza una mejor conservacin del material, evitando la ruptura de los cuerpos fructferos que tiende a ocurrir con el secado al aire libre. Conservacin en lquidos. Los lquidos que ms se usan en la preservacin de los hongos marinos son las soluciones de etanol (70%) y de formol (5%) preparadas con agua de mar, aunque no siempre se obtienen buenos resultados. Las ascas, el tejido intersticial y los apndices de las esporas son estructuras muy delicadas y pueden encogerse, perdiendo su utilidad para trabajos futuros, por tanto, la identifiPgina 105

MTODOS DE CONSERVACIN cacin de especies conservadas en etanol o formol es dudosa. El uso de estos compuestos como fijadores es conveniente si el material se secciona despus de la deshidratacin y es embebido en cera, pero siempre es mejor conservar el sustrato vivo en un criostato. Los lquidos que contengan esporas deben examinarse lo ms rpido posible despus de la colecta. Pueden conservarse aadiendo formalina hasta obtener una solucin al 5%. Preparaciones microscpicas permanentes. Las preparaciones microscpicas permanentes se realizan con el objetivo de conservar los materiales observados y protegerlos de la deshidratacin para que puedan ser utilizados en futuras investigaciones, adems de que son constancia de la existencia de las especies descritas. La tcnica del doble cubreobjetos descrita por Volkmann-Kohlmeyer y Kohlmeyer (1996) es una de las ms utilizadas. Procedimiento. Colocar un cubreobjeto (de 22 mm x 22 mm) sobre un portaobjetos (de 26 mm x 76 mm) y hacer que este se adhiera al porta aadiendo unas gotas de agua destilada a ambos lados del cubreobjetos. Seguidamente, colocar una gota grande de agua destilada en el centro del cubre, y en ella el material. Despus, cubrir con un cubreobjeto ms pequeo (de 18 mm x 18 mm) e inmediatamente, hacer las observaciones microscpicas del material vivo para asegurarnos que se encuentra la estructura que deseamos conservar. Despus de las observaciones, adicionar una gota de glicerina al agua por uno de los lados y guardar el cubreobjetos en una atmsfera seca para que el agua se evapore. Limpiar los residuos y sellar la preparacin por los bordes con esmalte de uas. Separar el cubreobjeto grande del portaobjetos y colocar una gota grande de Blsamo de Canad sobre el cubreobjeto pequeo. Virar la preparacin sobre la gota de montaje y colocar sobre el portaobjetos. La gota de Blsamo de Canad sale hacia los bordes y rodea las terminaciones del cubreobjetos pequeo y de esta forma, se cubre permanentemente el anillo de esmalte de uas. Despus de rotuladas convenientemente las preparaciones con los datos de la especie, sustrato, lugar de colecta y fecha, se guardan en cajas apropiadas. 106

MTODOS DE CONSERVACIN BIBLIOGRAFIA Kohlmeyer, J. y Kohlmeyer, E. 1979. Marine mycology.The higher marine fungi. Academic Press, New York. Volkmann-Kohlmeyer, B. y Kohlmeyer, J.1996. How to prepare truly permanent microscope slides. Mycologia 10:107- 108.

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Captulo 5 Tcnicas y Mtodos en Ecologa Microbiana

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA 5.1. Conteo directo del nmero total de microorganismos. El nmero total de microorganismos es una informacin importante para entender el papel ecolgico de las bacterias en cualquier ecosistema. A partir de este valor se pueden calcular la biomasa y la productividad bacteriana en el medio marino, lo cual es de mucho inters para la elaboracin de modelos trficos. El conteo directo del nmero total de microorganismos empleando microscopa epifluorescente se considera el mejor mtodo disponible en la actualidad para la enumeracin de bacterias en muestras naturales. Este mtodo tiene la ventaja de que permite un estimado ms exacto del nmero total de bacterias, ya que incluye el conteo de clulas vivas, muertas, activas e inactivas y viables no cultivables. Los colorantes ms empleados en esta tcnica son la naranja de acridina (3,6-bis[dimetilamino]acridinium cloruro) y el DAPI (4,6-diamidino-2fenilindol), los cuales permiten identificar las bacterias no slo por su color, sino tambin, por su forma y tamao. En general, el mtodo se basa en la filtracin de la muestra a travs de un filtro de membrana que es sometido posteriormente a tincin con el colorante seleccionado. Kepner y Pratt (1994) hicieron un detallado anlisis de las ventajas e inconvenientes del mtodo e incluyen recomendaciones para que se generalice un nico procedimiento y se brinde mayor informacin sobre los detalles tcnicos en las publicaciones, de manera que los resultados obtenidos por diferentes autores puedan ser comparados. Objetivo: Determinar el nmero total de microorganismos en una muestra de agua de mar. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Filtros de membrana de policarbonato de 0.2 de dimetro de poro. Reactivos a. Preservativos. Glutaraldehdo buffereado 10% (w/v). 0.40 g de NaH2PO4. 1.23 g de Na2HPO4. 80 mL de agua destilada. 20 mL de 50% (w/w) glutaraldehdo. Formalina. Pgina 111

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA b. Dispersantes. 0.1 M tetrazolium Ppi. 44.61 g de Na4P2O7. 10 H2O. 1L de agua destilada. c. Fluorocromo: solucin patrn de naranja de acridina al 1%. Equipos. Microscopio epifluorescente. Bomba de vaco. Portafiltros. Detalles experimentales. Preservacin de las muestras. Las muestras para conteo directo de bacterias deben preservarse enseguida, si no van a ser procesadas inmediatamente despus tomadas, ya que en menos de 24 h pueden ocurrir cambios en el nmero, el tamao y hasta en la forma celular de las bacterias en las muestras. Los preservativos ms utilizados son el formaldehdo al 4%, la formalina (solucin acuosa de formaldehdo al 40% vol/vol), el glutaraldehdo al 1%, la mezcla lugol-formalina-tiosulfato, el glutaraldehdo al 4% congelado, y una combinacin de glutaraldehdo y paraformaldehdo. Aunque se use un preservativo qumico, es recomendable que se guarden en fro (4 o 5 C) y en oscuridad hasta su procesamiento, que en cualquier caso, es mejor hacerlo lo ms rpido posible despus de colectada la muestra. Desagregacin y dispersin de las partculas en muestras de sedimentos. En las muestras de sedimentos, las partculas de sedimento, algas u otras partculas de materia no viva pueden interferir en la visualizacin de los microorganismos, por tanto, antes de la filtracin, es necesario separar las bacterias adheridas a partculas y detritus. Para esto se puede usar agitacin, digestiones, ultrasonido, u otros tratamientos que combinan dispersantes qumicos como el Tween 80 o el Tritn X-100, con la agitacin mecnica de la muestra. Membranas de filtracin. Las membranas de policarbonato deben teirse antes de la filtracin para reducir la fluorescencia del fondo y aumentar el contraste, lo que favorece el conteo. El colorante ms usado es el Irgaln negro (2g/L en solucin de cido actico al 2%) en el cual se sumergen las membranas de 2 hasta 24 h. Despus se lavan en agua previamente esterilizada por filtracin, y se secan a temperatura ambiente 112

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA En el mercado se pueden adquirir membranas ya teidas (Black policarbonate membrane), lo que facilita las operaciones. La presin de vaco que se aplique para la filtracin debe ser mnima para evitar el rompimiento de las clulas y su penetracin en la membrana. Se recomienda aplicar una presin menor de 30 mm Hg (<4 kPa) y membranas de policarbonato con un dimetro de poro de 0.2 m. El tiempo de la tincin vara de acuerdo con el colorante y el tipo de muestra (Tabla 4) pero generalmente, es menor el tiempo que se requiere cuando se usa naranja de acridina que el colorante 46 diamino-2- fenilindol (DAPI). Tabla 4. Tiempo de exposicin empleado para tinciones usando como colorantes naranja de acridina (NA) o 46 diamino-2- fenilindol (DAPI), n: nmero de muestras comparadas. Tomado de Kepner y Pratt, (1994). Tiempo de exposicin (min) (promedio+ D.S.) Suelos/ Agua dulce Agua marina Superficies sedimentos 3.1+ 1.8 3.5 + 3.8 4.5 + 6.1 2.8 +2-5 8.4 + 6.5 9.6 + 6.2 10.0 + 5.0 5.5 15 12 7 1

Colorante NA DAPI n

Cuando es de inters del tcnico el conteo de fototrofos, se recomienda usar DAPI como colorante en lugar de naranja de acridina porque ste ltimo puede enmascarar la autofluorescencia roja de la clorofila. El volumen de muestra a filtrar tambin es importante; generalmente se usan volmenes desde 0.5 hasta 15 mL, recomendndose un volumen mnimo de 2 mL para membranas de 25 mm de dimetro. Mtodo de conteo. Para el conteo se usa una rejilla ocular cuadriculada y un aumento de 1250 X. La precisin del conteo depende del nmero de bacterias contadas. Asumiendo que las bacterias se distribuyen en la membrana siguiendo una distribucin de Poisson y para reducir el 95 % de intervalo de confianza al 10 % de la media, la mayora de los investigadores cuentan por lo menos, 400 clulas por filtro. Para aumentar la exactitud del conteo, se recomienda hacer rplicas al nivel de submuestras y filtros. Pgina 113

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA No puede dejar de considerarse el error que introduce cada observador. Este error no puede evitarse pero s disminuye cuando la persona que cuenta gana en experiencia en el reconocimiento de la morfologa de las bacterias. Procedimiento. Colectar las muestras de agua con frascos estriles de 200 mL de capacidad y preservar con glutaraldehdo bufereado (concentracin final, 1%) o con formalina (concentracin final, 2 %). Aadirle la naranja de acridina teniendo en cuenta que la concentracin final debe ser 0.01% (W/V). Se tie por 3 min si son muestras de aguas y por 4 min si son de sedimentos, y se procede a la filtracin por membrana de policarbonato de 0.2 m de dimetro de poro. El volumen de agua a filtrar puede determinarse por prueba y error, pudiendo variar desde 0.5 hasta 15 mL, de acuerdo a las caractersticas del lugar. Si son aguas oligotrficas, como las ocenicas, de 10 a 15 mL ser suficiente, y en aguas eutrficas o mesotrficas (con mayor cantidad de clulas), el volumen requerido es menor. Si se filtran pequeas cantidades de agua puede usarse una jeringuilla estril, cuidando ejercer una presin homognea. Si se requiere filtrar mayores cantidades, puede usarse una bomba de vaco y <4 kPa de presin. Lavar la membrana con agua (esterilizada previamente por filtracin), empleando igual volumen que el de la muestra filtrada, para remover el exceso de colorante que pueda quedar. Desconectar el vaco, safar el portafiltro y retirar la membrana con unas pinzas. Coloque una pequea gota de aceite de inmersin no fluorescente sobre un portaobjeto limpio y rotulado. Asegrese que quede hacia arriba el lado correcto de la membrana. Coloque otra gota de aceite de inmersin sobre la membrana y cbrala con un cubreobjeto. Presione el cubreobjeto para eliminar las burbujas de aire si fuera necesario. Si no puede contarse inmediatamente, el portaobjeto puede guardarse en refrigeracin (4 C) y oscuridad hasta 1 mes, pero es recomendable contar el mismo da. 114

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Conteo y clculos Determine el rea efectiva de filtracin, teniendo en cuenta que el rea que queda disponible para el paso del agua, despus de puesta la membrana en el portafiltro es menor. Determine el rea del campo del ocular (o de la rejilla que utilizar) con el aumento que usar para el conteo y una regla micromtrica. Cuente un mnimo de 400 clulas por filtro, garantizar un 95% de intervalo de confiabilidad. Cuando se usa naranja de acridina las clulas pueden verse de color naranja, rojizo o verdes. El conteo se hace mejor en un cuarto oscuro. Para calcular el nmero total de bacterias en la muestra original se utiliza la siguiente frmula: NTB = (N x At) / (d x Vf x G x Ag) donde, NTB: nmero total de bacterias (clulas/mL) N: nmero de clulas contadas (clulas) At: rea efectiva del filtro (mm2 o micras cuadradas) Vf: volumen de la muestra diluida (mL) d: factor de dilucin, que incluye el preservativo y el dispersante si se aadi tambin, (Vfinal/Vmuestra) (mL) final. Se puede hacer un blanco y restarle la densidad de clulas del clculo

En el caso de muestras de suelos o sedimentos, el nmero total de bacterias se reporta por volumen de sedimento (cm3) o por gramo (peso seco). Si se trata de bacterias asociadas a superficies, se expresa en nmero de clulas por unidad de rea (mm2).

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA Hobbie, J. E., Daley, R. J. y Jasper, S.1977. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by epifluorescence microscopy. Applied Environmental Microbiology 33:1225-1228. Kepner, R. L. y Pratt, J. R. 1994. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environment Samples: Past and Present. Microbial Review vol.58, 4:603-615.

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA 5.2. Determinacin de biomasa. Las bacterias marinas son las principales consumidores del carbono orgnico disuelto (COD) que existe en el ocano, el cual, representa una parte significativa del pool de carbono orgnico que existe en la biosfera. Paralelamente al consumo de COD las bacterias llevan a cabo el proceso de mineralizacin mediante el cual el COD se convierte en CO2 con la consiguiente produccin de biomasa (materia orgnica particulada), la cual es consumida a su vez por los organismos de niveles trficos superiores. La biomasa bacteriana puede considerarse como el carbono celular asociado a la clula intacta, independientemente de que se encuentre viva o muerta, activa o inactiva, y constituye uno de los parmetros ms importantes en los estudios de Ecologa Microbiana ya que a partir de este valor, se puede evaluar su disponibilidad como alimento para otros organismos de la trama alimentaria (Bratbak, 1993; Ducklow, 2000). Para la estimacin de la biomasa microbiana existen varios mtodos entre los cuales se encuentran: A partir del nmero total de microorganismos y el clculo del biovolumen promedio (Alongi, 1988; Bratbak, 1993; Fukuda et al. 1998; Heinanen, 1992; Norland, 1993). A partir de la determinacin del trifosfato de adenosina (ATP) (Holm-Hansen, 1969). A partir de las mediciones del cido murmico como un componente de la pared de las clulas procariticas (Morearty, 1975). A partir de la determinacin de lipopolisacridos (Dobbs y Findlay, 1993). En la actualidad la determinacin de la biomasa bacteriana a partir del conteo total y el clculo del biovolumen es uno de los mtodos ms empleados ya que es fcil y rpido. Para expresar la biomasa en unidades de carbono se debe utilizar un coeficiente de conversin, el cual debe ser determinado para el lugar donde se est investigando, ya que en dependencia de las condiciones ambientales vara. En la literatura especializada estn reportados diferentes coeficientes que tambin pueden ser utilizados segn las condiciones y tipo de ecosistema (Tabla 5). Dos de los coeficientes ms usados para convertir las densidades bacterianas en unidades de concentracin de carbono son: 2.2 x 1013 gC/m3 = 18 mol C/L-volumen celular (Bratbak y Dundas, 1984). 16 moles C/L- volumen celular (Christian y Karl, 1994). Pgina 117

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Tabla 5. Valores de volumen celular y factores de conversin expresados en unidades de carbono a partir de diferentes metodologas y condiciones de cultivo (Tomado de Marine Microbiology. Methods in Microbiology Vol. 30. Ed. John H. Paul. Academic Press. 2001).
Biovolumen (BV) (m3) Factor de conversin (FC) (fgC/m3) FC variacin

Fuente

Tipo de cultivo

Mtodo de determinacin del biovolumen

BVmedio

variacin

Cultivo puro de agua de mar

Medio natural enriquecido

Microscopio electrnico y fotomicrografa epifluorescente

0.376

0.11 0.71

567

238-964

MicroscoMedio pia epifluoAguas de n a t u r a l rescencia y estuario no enrianlisis de quecido imgenes MicroscoMedio pia epifluoA g u a natural rescencia y dulce no enrirejilla ocuquecido lar Cultivo puro de agua de mar Medio Contador natural de enriquepartculas cido

0.195

0.08 0.34

351

178728

0.163

0.09 0.26

106

39 188

1.253

0.52 2.02

209

155292

Medio Contador Agua de n a t u r a l de mar no enripartculas quecido Medio A g u a natural dulce enriquecido Fotomicrografa epifluorescente

0.290

0.17 0.53

186

84-353

0.545

0.17 1.75

136

59252

118

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Objetivo: Determinar la biomasa bacteriana en una muestra de agua de mar a partir del nmero total de microorganismos y el biovolumen celular. Materiales, reactivos y equipos empleados Materiales. Frascos de vidrio, estriles, de 250 mL de capacidad. Filtros GF/F de 47 mm. Membranas de acetato de celulosa de dimetro de poro de 0.2 m. Reactivos. a. Preservativos (Ver Cap. 5.1). Naranja de acridina. Equipos. Equipo de refrigeracin (15 20 C). Microscopio de epifluorescencia. Bomba de vaco. Balanza analtica. Desecadora. Autoanalizador de carbono. Estufa. Sistema computadorizado para la captacin y procesamiento. de imgenes. Procedimiento. Las muestras colectadas, tanto de aguas como de sedimentos, se preservan inmediatamente despus de tomadas, utilizando una solucin acuosa de formaldehdo a una concentracin final del 4 % vol/vol. Posteriormente, los frascos deben ser guardados en refrigeracin (15 20 C) hasta su procesamiento. Una vez en el laboratorio, se realiza el conteo total de microorganismos utilizando el mtodo de conteo directo con el empleo de un colorante fluorescente (naranja de acridina) y microscopa de epifluorescencia. (Ver Cap.5.1). Clculo del biovolumen Para el clculo del biovolumen, se determina el volumen de las diferentes formas celulares, tomando como base la forma geomtrica que ms se asemeja: cocos (esfera), formas bacilares (cilindro y elipsoide promediando ambos). De cada muestra se realizan mediciones de no menos de 30 clulas. En el caso de los cocos, se determina su dimetro y para los bacilos se tiene en cuenta el largo y el ancho. Las mediciones se pueden realizar directamente en el microscopio Pgina 119

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA biolgico, a partir de una tincin y empleando regla micromtrica, o tambin, se pueden obtener las imgenes utilizando un sistema digitalizado de imgenes de video el cual es capaz de captar las clulas teidas con un fluorocromo en un campo del microscopio. Esta metodologa presenta una notable ventaja ya que la imagen digitalizada puede ser almacenada, editada y analizada. Clculos. Volumen esfera = 4 r 3 / 3 donde: : 3.1416 r: radio de la esfera Volumen para forma bacilares1 = A 2 / 4 (L A / 3) donde: : 3.1416 L: largo del bacilo A: ancho del bacilo Volumen para forma bacilares2 (elipsoide) = A 2 L / 6 donde: A: ancho del elipsoide. L: largo del elipsoide. El biovolumen medio se obtiene por la suma del volumen medio de las diferentes formas celulares de la muestra. Biovolumen medio = (Volumen medio cocos + Volumen medio bacilos). Determinacin del coeficiente de conversin. Tomar alrededor de 50 muestras de agua en estaciones con diferentes caractersticas (costeras, ocenicas). Filtrar un volumen entre 250 300 mL a travs de una membrana de acetato de celulosa de dimetro de poro de 1 m con el fin de eliminar la mayor cantidad de los organismos consumidores de bacterias. A continuacin, inocular los frascos con agua filtrada de cada estacin hasta obtener una concentracin de inculo del 10% e incubar durante 24 h en agitacin a temperatura ambiente. Posteriormente, se filtran los diferentes cultivos a travs de filtros GF/F de 47 mm (previamente pesados en balanza analtica), los cuales se colocarn en una estufa a 60 C durante 24 h. Finalmente, se pesan los filtros y se conservan en desecadora hasta su procesamiento. El procedimiento de cada muestra se realiza por triplicado. Para la determinacin de la concentracin de carbono celular se emplea un analizador de carbono. 120

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA Alongi, D. 1988. Bacterial productivity and microbial biomass in Tropical mangrove sediments. Microbial Ecology 15:59-79. Bratbak, G. 1993. Microscope methods for measuring bacterial biovolumen: epifluorescence microscopy Scanning Electron microscopy and Trasmission electron microscopy. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Lewis Publishers, New York. p. 303-307. Dobbs, F.C. y Findlay, R.H. 1993. Analysis of microbial lipids to determinative biomass and detect the response of sedimentary microorganisms to disturbance. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Paul F. Kemp, Barry, F. Sherr, Evelyn B. Sherr (eds.). p. 347-358. Ducklow, H.W 2000. . Bacterial Production and Biomass in the Oceans (Chapter 4). En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss, New York. p. 85-120. Fukuda, R., Ogawa, H., Nagata, T. y Koike, I. 1998. Direct determination of carbon and nitrogen contents of natural bacterial assemblages in marine environments. Applied Environmental Microbiology 64: 3352-3358. Heinanen, A. 1992. Measuring thymidine incorporation in the open Baltic Sea, a brackish water estuary: comments in saturation level of thymidine 1-2. En Bacterioplankton in the open Baltic Sea. Finnish Marine Research No. 260. Hobbie, J. E., Daley, R. J. y Jasper, S. 1977. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by epifluorescence microscopy. Applied Environmental Microbiology. 33:1225-1228. Holm-Hansen, O. y Pearl, H.W 1972. . The application of ATP determination for estimation of microbial biomass and metabolic activity. Memories Instituto Italiano Hidrobiologia 29:149-168. Karl, D.M. 1993. Microbial biomass estimation determined from the measurement of particulate Adenosine-5- Triphosphate. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. P Kemp; B. Sherr; E. Sherr y J. Cole (eds.). Lewis Publisher. p. . 359-368. Pgina 121

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Morearty, D.J.W 1975. . A method for estimating the biomass of bacteria in aquatic sediments and its applications to trophic studies. Oecologia 20: 219-230. Norland, S. 1993. The relationship between biomass and volume of bacteria. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. P Kemp; B. Sherr; E. Sherr y J. Cole . (eds.). Lewis Publisher. p. 303-307. Paul, J. H. (ed.) 2001. Marine Microbiology. Methods in Microbiology. Vol. 30. Acad. Press

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA 5.3. Determinacin de la Productividad bacteriana (Pb). La produccin bacteriana es una medida de la sntesis de materia orgnica por las bacterias, expresada en trminos de nmero de clulas o biomasa, por unidad de volumen o peso y por unidad de tiempo. Se conoce tambien como produccin secundaria porque se refiere a la sntesis de biomasa bacteriana a partir de precursores orgnicos y algunos nutrientes inorgnicos. La produccin bacteriana es un proceso clave que origina el flujo de materia orgnica disuelta a travz del lazo microbiano (microbial loop), por lo que su estimacin establece la importancia de la trama alimentaria va microorganismos en el ecosistema marino. Existen varios mtodos para determinar la produccin bacteriana, entre estos se encuentran: A partir del conteo directo del nmero total de microorganismos. A partir de la incorporacin de compuestos radioisotpicos como 3H-timidina o 3H-leucina . Objetivo: Determinar la productividad bacteriana en una muestra de agua de mar Detalles experimentales. Para minimizar las interferencias que provoca la manipulacin de las muestras en la veracidad de los resultados, se recomiendan tomar algunas medidas desde el momento en que se colectan las muestras. Por ejemplo, la temperatura es un factor de suma importancia en las reacciones enzimticas a nivel celular, por tanto, si no se puede incubar in situ, la temperatura de incubacin de las muestras debe ser igual a la del lugar de donde se tom la muestra. Si la transportacin de los frascos con muestras hasta el laboratorio es demorada, debe tenerse en cuenta en el anlisis de los resultados el efecto botella que provoca un aumento del nmero y la actividad celular de hasta tres rdenes en magnitud, an mantenindolas a bajas temperaturas (Ferguson et al. 1984). Este inconveniente slo se elimina reduciendo el tiempo entre la colecta y el procesamiento o tomando grandes volmenes de muestra, lo cual, no resulta prctico. Otro aspecto que interfiere es la presencia de depredadores, como los protozoos. Para excluirlos, las muestras se pre filtran por mallas de dimetro de poro desde 1 hasta 3.0 m, pero tambin el hecho de que estos organismos no estn presentes, puede alterar en cierto sentido, la actividad de las bacterias. La pre filtracin tambin puede causar lesiones al fitoplancton y ste expulsar Pgina 123

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA al medio aminas primarias, las que a su vez, pueden provocar un aumento en el nmero y actividad de las clulas (Ferguson et al. 1984). Se reconoce que es imposible llevar a cabo un experimento sin determinada influencia de la manipulacin, pero an as, debe realizarse un esfuerzo para que sean mnimos los efectos y en todo caso, tenerlos en cuenta a la hora de interpretar los resultados obtenidos. Mtodo a partir del Conteo Directo del Nmero Total de microorganismos. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales Los mismos que se usan para el Conteo Directo del Nmero Total de microorganismos (Ver Cap.5.1). Reactivos Los mismos que se usan para el Conteo Directo del Nmero Total de microorganismos. (Ver Cap.5.1). Procedimiento En cada estacin de muestreo, colectar cuatro muestras de agua con frascos estriles de 200 mL de capacidad. Dos de las muestras prefiltrarlas por malla de 3 m de dimetro para eliminar el microzooplancton presente en la muestra, evitando as las prdidas de biomasa bacteriana por el efecto de depredacin. Ambos grupos de pomos, filtrados y sin filtrar, se rotulan y se incuban, preferiblemente in situ, durante 6- 8 h. Despus del perodo de incubacin, todas las muestras se tratan segn el procedimiento descrito para el conteo directo del nmero total de microorganismos empleando colorantes fluorescentes y microscopa de epifluorescencia (Ver Cap. 5.1.). Clculos: Bo P = ____ + g Bf - Bo ________ , donde: t

P: Produccin bacteriana (mgC. m-3.d-1). Bo: Conteo total de microorganismos al inicio del experimentoen la muestra sin pre filtrar por malla (cl/mL). Bf : Conteo total de microorganismos al final del experimentoen la muestra sin pre filtrar por malla (cl/mL). 124

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA t x log 1.8 g: Tiempo de generacin* (horas)............... g = ________________ log Bff - logBof t: Tiempo de incubacin (horas). log 1.8: Es un valor emprico, teniendo en cuenta que en unapoblacin mixta de bacterias no todas las clulas seduplican al mismo tiempo. Bff : Conteo total de microorganismos al final del experimentoen la muestra pre filtrada por malla (cl/mL). Bof: Conteo total de microorganismos al inicio del experimentoen la muestra pre filtrada por malla (cl/mL). Tambin el tiempo de generacin puede calcularse por la siguiente frmula: t x 0.693 g =_____________ ln Bf ln Bof donde: g : Tiempo de generacin* (horas). t : Tiempo de incubacin (horas). ln Bf : logaritmo natural del nmero total de microorganismosal final del experimento en la muestra pre filtrada por malla(cl/mL). ln Bof : logaritmo natural del nmero total de microorganismosal inicio del experimento en la muestra pre filtrada pormalla (cl/mL). Con el valor del tiempo de generacin, se puede calcular la velocidad de crecimiento de las clulas en la muestra evaluada, mediante la siguiente frmula: = 0.693/g. donde: : velocidad de crecimiento (cl/horas). 0.693: ln 2. g: tiempo de generacin (horas). Mtodo a partir de la incorporacin de 3 H-thymidine La utilizacin de timidina exgena es exclusiva de los organismos procariontes, por tanto, su deteccin en el ADN bacteriano es un mtodo muy utilizado para evaluar la actividad bacteriana. Pgina 125

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA La timidina (timidina-2-deoxiribosa; Tdr) es un nucletido cuya nica funcin en la clula es participar en la sntesis del ADN. En esta reaccin interviene la enzima timidina- kinasa, la cual est presente en la mayora de los organismos, aunque hay algunas excepciones como son algunas especies de Pseudomonas, los hongos Neurospora crassa, Aspergillus nidulans y Saccharomyces cerevisiae, y en un grupo de cianobacterias (Moriarty, 1984). Este mtodo se ha aplicado con xito en aguas costeras (Fuhrman y Azam, 1980; Riemann y Sndergaard, 1984), aguas lacustres (Riemann y Sndergaard, 1984), y aguas ocenicas (Ducklow y Hill, 1985), considerndose uno de los ms precisos. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales Guantes de nitrilo. Membranas de filtro de acetato de celulosa de 0.45 m (Millipore). Tubos de microcentrfuga de 2.0 mL con tapas de rosca (Fisher 02-681-344 y 02-681-360). Pipetas y puntas estriles de: 10 l, 100 l, 2500 l Viales para lquido de centelleo (Fisher 03-337-26). Reactivos. Metil- 3H-thymidina (40-60 Ci/mmol) Amersham. cido tricloroactico 10% w/v (mantenido a 4C). cido tricloroactico 5% w/v (mantenido a 4C). Acetato de etilo. Etanol 100%. Lquido de centelleo Aquasol-2. Equipos. Incubadora regulada a la misma temperatura del lugar de dondese toma la muestra. Contador de partculas . Aspiradora. Contenedor de desechos radioactivos. Detalles experimentales Se recomienda filtrar por malla de 3 m a gravedad las muestras para excluir las prdidas de biomasa debidas a la depredacin (Azam, 1980). Debe tenerse en cuenta que una cantidad significativa de timidina puede ser incorporada al ARN, por lo que es importante purificar la fraccin de ADN antes de medir la radioactividad. 126

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Para determinar la produccin bacteriana por este mtodo se emplea una relacin emprica entre la incorporacin de timidina y la produccin de clulas (clulas producidas/Timidina incorporada) y se refiere en unidades de clulas/mL /h. Procedimiento, El procedimiento que se describe aqu es una modificacin que propusieron Riemann y Sndergaard (1984) al mtodo de Fuhrman y Azam (1980). Se toman rplicas de las muestras (10 mL) y se incuban con 2-20 nM de metil-3Htimidina (40-60 Ci/ mmol, Amersham) a la misma temperatura del lugar donde se colectaron las muestras. El tiempo de incubacin puede ser desde 30 hasta 120 min, debiendo chequearse durante el mismo si est ocurriendo la fijacin de timidina de forma lineal. El tiempo de incubacin depender de las muestras utilizadas, se recomienda que sea tan corto como sea posible. Despus de la incubacin, se toman submuestras de 3 mL y se colocan en un bao de hielo por 1 min y se les aade igual volumen de cido tricloroactico 10% (w/v) fro. Despus de incubar en hielo 5 min ms, la mezcla se filtra por membrana de acetato de celulosa 0.45 m de dimetro de poro (25 mm HA Millipore) y se lava 2 veces con 3 mL de cido tricloroactico 5 % (w/v) fro. Posteriormente, la membrana se coloca en el interior de un vial de centelleo y se le agrega 1 mL de etil acetato para disolverla (esto demora alrededor de 10 min). Se aade entonces 10 mL de lquido de centelleo Aquasol-2 y se determina la radioactividad en un contador Beckman LS-100C. Es importante preparar blancos usando formalina (concentracin final de 1% v/v formaldehdo) la cual se aade junto con la timidina a una muestra antes de la incubacin. Debe restarse a los conteos de la muestra, los conteos de los controles para corregir la interferencia por adsorcin y determinarse la eficiencia de las mediciones (quenching) con el fin de corregir los resultados. Clculos. Se han reportado diferentes factores de conversin para convertir los moles de timidina incorporada a nmero de clulas producidas (Fuhrman y Azam, 1980, 1982; Moriarty y Pollard, 1981, 1982; Kirchman et al. 1982), el ms utilizado es 1.3 x 1018 bacterias producidas/ mol de timidina incorporada (Fuhrman y Azam, 1980). Tambin, para convertir el nmero de clulas a unidades de carbono, se puede utilizar el coeficiente 1.7 x 10-15 g propuesto por Watson et al. (1977) y Furhman (1981). Pgina 127

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA El factor de conversin puede determinarse directamente midiendo la tasa de crecimiento de las bacterias en la muestra prefiltradas por malla e incubada en un tiempo t, utilizando conteo total por microscopia de epifluorescencia, y paralelamente, determinando la tasa de incorporacin de timidina titriada al ADN. Los incrementos en el nmero de clulas se plotean contra la cantidad total de timidina incorporada durante la incubacin (Kirchman et al. 1982).

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA BIBLIOGRAFA. Ducklow, H. W y Hill, S.M. 1985. . Tritiated thymidine incorporation and the growth of heterotrophic bacteria in warm core rings. Limnology and Oceanography, 30:260-272. Ferguson, R. L., Buckley, E. N. y Palumbo, A. V 1984. . Response of marine bacterioplankton to differential filtration and confinement. Applied and Environmental Microbiology. 47:49-55. Furhman, J. A. 1981. Influence of method on the apparent size distribution of bacterioplankton cells: epifluorescence microscopy compared to scanning electron microscopy. Marine Ecology Progress Series. 5: 103-106. Fuhrman, J. A. y Azam, F.1980. Bacterioplankton secondary production estimates for coastal waters of British Columbia, Antarctica and California. Applied and Environmental Microbiology. 39:1085-1095. Fuhrman, J. A. y Azam, F. 1982. Thymidine incorporation as a measure of heterotrophic bacterioplankton production in marine surface waters: evaluation and field results. Marine Biology. 66:109-120. Kirchman, D., Duckow, H. W y Mitchel, R. 1982. . Estimates of bacterial growth from changes in uptake rates and biomasa. Applied and Environmental Microbiology. 44: 1296-1307. Moriarty, D. J. W 1984. . Measurement of bacterial growth rates in some marine systems using the incorporation of tritiated thymidine into DNA. In: Heterotrophic Activity in the Sea. J.E. Hobbie y P LeB Williams (eds.). 217-231 .J. Moriarty, D. J. W y Pollard, P C. 1981. . . DNA synthesis as a measure of bacterial productivity in segrass sediments. Marine Ecology Progress Series. 5:151-156. Moriarty, D. J. W y Pollard, P C. 1982. . . Diel variation of bacterial productivity in seagrass (Zostera capricorni) beds measured by rat of thymidine incorporation into DNA. Marine Biology. 72:165-173.

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA OCarroll K. 1988. Assessment of Bacterial Activity. En: Methods in Aquatic bacteriology. B. Austin (ed.). 347-366. Riemann, B. y Sndergaard, M.1984. Measurement of diel rates of bacterial secondary production in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 47: 632-638. Romanenko, V y Kuznetsov, S.I. 1974. .I. Ecologa de microorganismos de aguas interiores. Manual de laboratorio. /En ruso/Ed. Nauka. 189 p. Smith, D. C. y Azam, F. 1992. A simple, economical method for measuring bacterial production synthesis rates in seawater. Marine Microbial Food Webs. 6:107-114. Watson, S., Novitsky, T., Quinby, I. y Valois, F. 1977. Determination of bacterial number and biomass in the marine environment. Appl. Environ. Microbiol. 33: 940-946

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA 5.4. Determinacin de la Fotosntesis, la Produccin primaria neta y la Respiracin. La fotosntesis es uno de los procesos ms importantes que tiene lugar en el ocano, ya que como resultado de esta actividad se produce oxgeno y materia orgnica. A escala local, la eficiencia de este proceso depende fundamentalmente de la intensidad de la radiacin solar, la abundancia y distribucin vertical de los organismos fotosintticos y la profundidad. Por cada gramo de oxigeno liberado por los organismos fotosintticos se sintetizan 1.43 g de CH2O, segn la ecuacin global: 6CO2 + 6H2O+ energa solar = C6H12O6 +6O2 Para determinar la intensidad de la fotosntesis puede medirse el consumo de dixido de carbono o la formacin de glucosa o de oxgeno. Determinar el consumo de agua no es razonable, ya que es infinitesimal en proporcin al promedio total de agua en la clula. Por consiguiente, si se determina la cantidad de oxgeno liberado durante el proceso de fotosntesis, es posible conocer la cantidad de materia orgnica sintetizada, asumiendo que el proceso en las muestras transcurre sin restricciones. La produccin primaria neta es la cantidad de carbono fijado por la fotosntesis que excede la demanda de la respiracin. En el ocano la productividad primaria no es uniforme ya que se encuentra limitada, principalmente, por la intensidad de la luz solar y la disponibilidad de nutrientes. La respiracin es el proceso contrario a la fotosntesis, es decir, se refiere al consumo de materia orgnica y oxgeno producindose CO2 y H2O. Este proceso puede representarse mediante la siguiente ecuacin: C6H12O6 + 6 O2 = 6CO2 + 6H2O+ energa Entre los mtodos ms conocidos para determinar fotosntesis estn: A partir de la determinacin de oxgeno disuelto en muestras incubadas de agua de mar (conocido como botellas claras y oscuras). Mediante el empleo de Na2H14CO3

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Objetivo: Determinar la intensidad del proceso de fotosntesis, produccin primaria neta y respiracin en una muestra de agua de mar. Materiales, reactivos y equipos empleados Materiales Botella oceanogrfica Nansen o Niskin. Frascos de Winkler estriles. Bolsas de polietileno negro. Cristalera necesaria para la determinacin del oxgeno disueltopor el mtodo de Winkler. Reactivos. Los que requiere la tcnica para determinar oxgeno disuelto por el mtodo de Winkler. Mtodo de las botellas claras y oscuras Este mtodo es sencillo y su empleo slo resulta vlido en zonas que no sean oligotrficas ya que no detecta cuando ocurren diferencias muy pequeas entre la produccin y el consumo de oxgeno. En estas condiciones se aconseja usar microelectrodos o emplear el mtodo radioisotpico . Procedimiento. Se colecta la muestra de agua de la profundidad fijada previamente, empleando para ello una botella Nansen, Niskin u otro muestreador adecuado. A partir de esta muestra, se rellenan cuatro frascos Winkler de 50 mL, cuidando que no queden burbujas de aire, y se tapan hermticamente. Dos de los frascos se utilizan para medir el oxgeno disuelto inmediatamente (control) y los otros dos frascos se incuban, preferiblemente, a la misma profundidad de donde se tom la muestra con la botella, cuidando forrar uno de los frascos con nylon de polietileno negro o con papel de aluminio para garantizar que no reciba luz. Transcurrido el tiempo de incubacin (de 6-8 o hasta 12 h), se determina el oxgeno disuelto en las muestras incubadas. Clculos. F = Pn R, donde: F: Fotosntesis (mgO2 / L . d-1). Pn: Produccin primaria neta (mgO2 / L . d-1). R: Respiracin (mgO2 / L . d-1). 132

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Pn = (Oc Oo) x 24 t R = (Ok Oo) x 24 t Oc: valor promedio de oxgeno disuelto en el frasco claroal final del tiempo de incubacin (mgO2 / L). Oo: valor promedio de oxgeno disuelto en el frasco oscuroal final del tiempo de incubacin (mg O2 / L). t: tiempo de incubacin (h). Ok: valor promedio de oxgeno disuelto en la muestra quese midi al inicio (Control) (mg O2/ L). Mtodo radioisotpico (Na2H14CO3). Materiales, reactivos y equipos empleados Frascos de vidrio de 100 mL de capacidad limpios y estrilescon tapas de goma y retapas metlicas. Ampulas de 5 mL de capacidad. Jeringuillas y agujas. Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.45 dedimetro de poro. Placas Petri medianas. Bolsas de polietileno negro. Pipetas de 1 mL. Viales con lquido de centelleo. Reactivos. NaOH 1 N. Formol 40%. Lquido de centelleo. HCl concentrado. HCl 5%. Na2H14CO3 actividad 10 Cu/mL Agua destilada. Equipos. Botella oceanogrfica Nansen o Niskin. Campana de extraccin de gases. Contador de partculas .

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Procedimiento. Preparacin de la solucin isotpica. El istopo (Na2H14CO3) se diluye con agua destilada hasta obtener una actividad final de 10 Cu/mL ajustndose el pH hasta 7 con NaOH 1 N. Una vez diluido, se distribuye en mpulas para su mejor manejo posterior y se sellan cuidadosamente. Las mpulas se esterilizan en autoclave a 110 C durante 30 min y se conservan en refrigeracin hasta su uso. La muestra de agua se colecta con la botella oceanogrfica a la profundidad seleccionada segn el objetivo del estudio. A partir de esta muestra, se rellenan seis frascos de vidrio de 100 mL de capacidad. En dos de estas submuestras se determina la concentracin de carbonatos y de CO2 libre segn la tcnica de Parson et al. (1984). A los cuatro frascos restantes se les aade por separado 1 mL de la solucin radioisotpica e inmediatamente, se colocan dos de ellos en una bolsa de polietileno negro y los otros dos se incuban a la luz. Si no existen condiciones propicias para incubar los cuatro frascos in situ (a la misma profundidad a que se tom la muestra), pueden colocarse en una cubeta adecuada con agua circulante tratando de mantener la temperatura constante y semejante a la temperatura del lugar de donde se tom la muestra. Despus de 8 a 12 h de incubacin, se le aade a cada frasco 1 mL de formol al 40% y seguidamente, se filtran 50 o 100 mL de muestra a travs de una membrana de acetato de celulosa de 0.45 de dimetro de poro. El volumen de muestra a filtrar est en dependencia de la abundancia de fitoplancton, si es poco abundante se filtran los 100 mL. Despus de filtrar, las membranas se colocan en una placa Petri pequea y se exponen destapadas en una atmsfera de HCl por 10 min en una campana de extraccin de gases y posteriormente, cada membrana se toma con pinzas y se introduce en el vial que contiene 10 mL de lquido centellante. Se agita suavemente y se lee cada muestra en el contador de partculas Al inicio de la experiencia deben preparase viales con lquido centellante y membranas a modo de control para as determinar las interferencias (quenching) y corregir el valor final de cada lectura en los frascos con las membranas empleadas en la filtracin de las muestras. Clculos. Ct = r x Ck x 24 , donde: Rxt Ct: Asimilacin oscura del CO2 (C/L . d-1). r: Diferencia de conteos entre muestras en los frascos incubadosen la luz y en la oscuridad (dpm). 134

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Ck Valor promedio de concentracin de carbonatos en lamuestra de aguas (C/L). R: radioactividad real del istopo utilizado (dpm). t: tiempo de incubacin de las muestras (h). En el caso que se quiera medir la intensidad de la fotosntesis en una muestra integrada, es decir, de varios horizontes mezclados, se requiere emplear un disco Secchi con el cual se medir la transparencia. Si la visibilidad del disco llega hasta 5 m, se recomienda tomar muestras cada 1 m de profundidad. La muestra integrada se obtiene a partir de la unin de muestras de igual volumen colectadas en las diferentes profundidades. El procedimiento que se sigue es el mismo que el descrito anteriormente para muestras no mezcladas. Clculos (Para muestras integradas). F = F1 x 0.7 x p Donde, F: magnitud de la intensidad de la fotosntesis (g C/m2). F1: intensidad de la fotosntesis en la muestra integrada (mg C/L). p: distancia de la superficie a la tercera parte de la visibilidad del disco Secchi. 0.7: coeficiente que caracteriza la atenuacin de la radiacincon la profundidad.

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA APHA, 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewaters. APHAAWWA-WPCF. 18th Ed. 1134 p. Parson, T., Maita, Y. y Llli, C. M. 1985. A Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. Pergamon Press. 175 pp. Pinet P 1998. .R. Biological Productivity in the Ocean. En: Invitation to Oceanography. Web enhanced (ed.) p.358-398. Romanenko, V y Kuznetsov, S. I. 1974. .I. Ecologa de microorganismos de aguas interiores. Manual de laboratorio. /En ruso/Ed. Nauka. 189 pp

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA 5.5. Determinacin de la intensidad del proceso de mineralizacin aerobia de la materia orgnica. El proceso de degradacin de la materia orgnica o mineralizacin se considera la actividad ms importante de las bacterias hetertrofas en el ocano. Mediante esta actividad se mantiene el equilibrio entre el material vivo y el muerto, por lo que constituye la clave del mecanismo de autodepuracin (Kirchman y Williams, 2000). Para determinar la intensidad con que ocurre el proceso de descomposicin aerobia de la materia orgnica en las aguas se asume que el oxgeno consumido por los organismos en una muestra incubada en la oscuridad durante un tiempo t, es directamente proporcional a la intensidad con que ocurre la destruccin de la materia orgnica (Romanenko y Kuznetsov, 1981), y que el 60 % del gasto total de oxgeno corresponde al consumo de los microorganismos (Vinberg y Shilo, 1979; Sorokin, 1980). Es cierto que el proceso de mineralizacin no es una actividad exclusiva de los microorganismos, tambin intervienen los procesos qumicos y fotoqumicos de oxidacin de la materia orgnica, pero hasta el momento no se ha demostrado que estos procesos tengan una participacin cuantitativamente importante (Williams, 2000). Objetivo: Determinar la intensidad del proceso de descomposicin aerobia de la materia orgnica en muestras de aguas y sedimentos marinos. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Frascos de vidrio de 50-100 mL de capacidad, limpios y estriles. Bolsas de polietileno negro. Cristalera para la determinacin de oxgeno disuelto segnel mtodo de Winkler. Tres tubos de vidrio o acrlico de 40 cm de longitud y 3.5 cmde dimetro interno. Tapones de goma para ambos extremos de cada tubo Manguera de goma fina Agitador de vidrio Reactivos. Los que requiere la tcnica para determinar oxgeno disueltopor el mtodo de Winkler.

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Equipos. Botellas oceanogrficas Nansen o Niskin. Detalles experimentales. Los frascos para la toma de muestras para llevar a cabo esta tcnica deben ser los mismos que se usan para las determinaciones de oxgeno por la tcnica de Winkler, por tanto, deben estar debidamente limpios y las tapas esmeriladas deben cerrar correctamente. Para incubar las muestras in situ si no se cuenta con estructuras para incubar directamente en el mar, se sumergen los frascos forrados en nylon negro o papel de aluminio (para lograr oscuridad) en cubetas plsticas con un flujo de agua circulante continuo, que permita mantener la temperatura, y se colocan a la intemperie en la cubierta de la embarcacin. Procedimiento. Muestras de aguas. A partir de la muestra de agua colectada con la botella oceanogrfica, se rellenan cuatro frascos de Winkler y se tapan con tapas esmeriladas, cuidando que no queden burbujas de aire. Inmediatamente, se fijan dos de las muestras para la valoracin del oxgeno disuelto siguiendo la tcnica del Winkler. Los otros dos frascos se ponen a incubar en la oscuridad, preferiblemente in situ, o en condiciones lo ms cercanas posible a las que existen en el lugar donde se colectaron. Pasado el tiempo de incubacin (entre 8 y 24 h) se fija el oxgeno en estos frascos y se procede a la valoracin del oxgeno disuelto siguiendo la tcnica de Winkler. Muestras de sedimentos. Se entierran dos tubos plsticos de 40 cm de longitud y 3.5 cm de dimetro en el sedimento hasta 10 cm de profundidad aproximadamente, y se tapan ambos extremos con tapones de goma para sacarlos cuidando no perder el sedimento. Se destapa uno de los extremos y se rellena con agua de la interfase agua-sedimento cuidando que no queden burbujas de aire en el agua. Otros dos tubos (controles) se rellenan slo con agua del lugar. Los cuatro tubos se incuban en la oscuridad durante 4-8 h (en dependencia de las caractersticas de cada lugar), y posteriormente, se destapan por el extremo superior contrario al tramo con sedimento y con una varilla de vidrio se revuelve suavemente la columna de agua para homogenizarla. 138

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Inmediatamente se determina el oxgeno disuelto en todos los tubos siguiendo la tcnica de Winkler y se aplica la frmula propuesta por Romanenko y Kuznetsov (1974). Clculos. Para las muestras de aguas: (O2i-O2 f) x 24 O2 consumido = t donde:

O2 consumido = Gasto total de oxgeno = Degradacin aerobia (mgO2/mL. d-1). O2i : Oxgeno disuelto determinado al inicio del tiempo de incubacin (mgO2/mL). O2f : Oxgeno disuelto determinado al final del tiempo de incubacin (mgO2/mL). 24 : horas que tiene un da. t : tiempo de incubacin (h). La respiracin debida al bacterioplancton representa el 60 % del total del gasto de oxgeno determinado en la destruccin de la materia orgnica en 24 h (Vinberg y Shilo, 1979; Sorokin, 1980). Para convertir el valor de oxgeno consumido en unidades de carbono, se multiplica por 0.37 (1 mg O2 = 0.3750 mg C) obtenindose mg C/mL.d-1 y para expresarlo en peso de materia orgnica se multiplica por 0.93 (1 mg O2 = 1 mg glucosa). Para muestras de sedimentos: O2= donde: O2 : oxgeno consumido (mgO2 / m2. d-1). d: diferencia entre los volmenes de tiosulfato consumidosen la valoracin del control y las muestras (mL). 8: peso del equivalente de oxgeno. N: normalidad de la solucin de tiosulfato. pr2: rea interior del tubo (cm2). Pgina 139 d x 8 x N x pr2 x L x 10000 x 24 ____________________________ , 50 x pr2 x t

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA L: altura del agua sobre el sedimento (cm). 10000: factor de conversin a m2. 24: factor de conversin a horas (h). 50: volumen de agua a valorar (mL). t: tiempo de incubacin (h).

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA American Public Health Association. 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th Ed. Washington, D.C. Kirchman, D. L. y Williams, J. Le B. 2000. Introduction. En: Microbial Ecology of the Oceans. D.L. Kirchman (eds.). Wiley-Liss Inc. 542p. Romanenko, V y Kuznetsov, S. I. 1981. .I. Ecologa de microorganismos de aguas interiores. Manual de laboratorio. /En ruso/Ed. Nauka. 189 p. Sorokin, Y. I. 1980. Microheterotrophic organisms in marine ecosystems. En: Analysis of Marine Ecosystems, Ed. Acad. Press, New York. p. 293-342. Stricklan, J. D. H. y Pearson, T. R. 1972. A Practical Handbook of Seawater Analysis. Bulletin of Fisheries Resources. Bd. Can. 167. 311p. Vinberg, T. y Shilo, M. 1979. Microbial Respiration. Usp. Souram. Biol. 21:401413. Williams, P le B. 2000. .J. Heterotrophic bacteria and the dynamics of dissolved organic material En: Microbial Ecology of the Oceans. D.L. Kirchman (ed.). 153- 200.

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA 5.6. Determinacin de la intensidad del proceso de mineralizacin anaerobia de la materia orgnica en los sedimentos. Para determinar el proceso anaerobio de degradacin de la materia orgnica, Romanenko y Kuznetsov (1981) describieron una tcnica que se basa en la determinacin del CO2 producido en la muestra de sedimento incubado en condiciones anxicas al final de un tiempo t de incubacin. Tambin es posible medir la actividad de descomposicin anaerbica a partir de sustratos marcados con 14C (metanognesis, degradacin de celulosa, etc.) 35S (sulfatoreduccin), en muestras de agua sedimentos incubadas durante un tiempo prefijado y a la temperatura que se registre en el propio lugar. Objetivo: Determinar la intensidad del proceso anaerobio de descomposicin de la materia orgnica en una muestra de sedimentos marinos. Materiales, reactivos y equipos Materiales Frascos de vidrio de 50-100 mL de capacidad, limpios y estriles. Bolsas de polietileno negro. Cristalera para la determinacin de oxgeno disuelto, segnel mtodo de Winkler. Tres tubos de vidrio o acrlico de 40 cm de longitud y 3.5 cmde dimetro interno. Tapones de goma para ambos extremos de cada tubo. Manguera de goma fina. Erlenmeyer estril. Agitador de vidrio. Reactivos. Carbonato de sodio 0.02 N. Fenolftalena. Procedimiento. La muestra de sedimentos se colecta de la misma forma que se describe en el Cap.5.5. para la determinacin del proceso de mineralizacin aerbica en muestras de sedimentos. La intensidad del proceso anaerobio de mineralizacin se calcula a partir de la determinacin del CO2 producido en una muestra de sedimento incubada durante 8 h (Romanenko y Kuznetsov, 1981). Para esto, se procede como se describi antes para la mineralizacin aerobia en los sedimentos slo que, se traspasa el agua del tubo a un erlenmeyer estril y se valora el cido carbnico libre con carbonato de sodio 0.02 N y fenolftalena como indicador. 142

TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA Al agua del tubo control se le determina la concentracin de oxgeno disuelto al final del tiempo de incubacin por el mtodo de Winkler y entonces se calcula la relacin C/CO2 segn la expresin de Romanenko y Kuznetsov (1981). Clculos. C/CO2 = (n x N x L x 1200 x 24) / t donde: C/CO2: cantidad de cido carbnico producido por la descomposicin (aerobia + anaerobia) de la materia orgnica (mg/m2 d-1). n: diferencia entre los mL de carbonato de sodio gastadosal valorar 100 mL de muestra y del control (mL). N: normalidad de la solucin de carbonato de sodio. L: longitud del tubo que qued relleno de agua por encimadel sedimento (cm). 1200: coeficiente de conversin a cm2. 24: para convertir el valor a un da (h). t: tiempo de incubacin (h). Entonces, la intensidad del proceso anaerobio de destruccin de la materia orgnica se calcula finalmente segn la expresin: DMOana = C/CO2 - (O2 x 0.44) donde, DMOana: intensidad del proceso de destruccin anaerobio de lamateria orgnica (mg/m-2 d-1). C/CO2: cantidad de cido carbnico producido por ladescomposicin (aerobia + anaerobia) de la materia orgnica(mg/m2 d-1). O2 x 0.44: destruccin aerobia determinada por el oxgeno consumido en el tubo control (O2 al inicio - O2 al final) y convertida a unidades de carbono mediante el coeficiente de conversin 0.85 (Romanenko y Kuznetsov, 1981).

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TCNICAS Y MTODOS EN ECOLOGA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA American Public Health Association. 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th Ed. Washington, D.C. Romanenko, V y Kuznetsov, S. I. 1981. .I. Ecologa de microorganismos de aguas interiores. Manual de laboratorio. /En ruso/Ed. Nauka. 189 p. Williams, P le B. 2000. .J. Heterotrophic bacteria and the dynamics of dissolved organic material En: Microbial Ecology of the Oceans. D.L. Kirchman (ed.). p. 153- 200.

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Captulo 6 Medios de Cultivo

MEDIOS DE CULTIVO 6.1. Bacterias. Medio 2216E (Oppenheimer y ZoBell, 1952). Peptona-----------------------5g Extracto de Levadura------1g FeSO4-------------------------0.1g Agar----------------------------15g Agua destilada---------------250 mL Agua de mar------------------750 mL pH: 7.2 0.2 Esterilizar a 1atm. 20 min. Medio para bacterias hetertrofas (Gorbienko, 1961). Extracto de carne-------------- 3g Extracto de levadura-----------5g Peptona bacteriolgica----- 5g Agar agar No 3 --------------- 20 g Agua de mar ------------------ 750mL Agua destilada---------------- 250 mL pH : 7.0 0.2 Esterilizar a 1atm. 20 min. Agar agua de mar (Austin y Allen, 1982). Lab-Lemco power (Oxoid)------------------8g Peptona bacteriologica---------------------10g Agar No.3 (Oxoid)----------------------------12g Agua de mar filtrada y envejecida--------750 mL Agua corriente---------------------------------250 mL pH : 7.0 0.2 Esterilizar a 1atm. 20 min. Agar estuarino (Weiner et al. 1980). Caldo marino Difco-------------------11.22g Agar bacteriolgico-------------------15g Agua desionizada---------------------1000 mL pH : 7.0 0.2 Hacer hervir la mezcla por 1 min. Esterilizar a 1atm. 15 min. Medio API para bacterias sulfatoreductoras (Overzil, 1970). Lactato de sodio.4g Extracto de levadura.1g Sulfato de Magnesio..0.2g Acido ascrbico..0.1g Pgina 147

MEDIOS DE CULTIVO Hidrgeno fosfato dipotasico0.01g Sulfato de amonio..0.2g Resazorina.0.001g Cloruro de sodio10g Agua destilada1 L pH : 7.3-7.8 Esterilizar a 1atm. 20 min. Caldo Lactosado. Extracto de carne ----------------------------------- 3.0 g Peptona ------------------------------------------------ 5.0 g Lactosa ------------------------------------------------ 5.0 g Agua destilada ---------------------------------------1000 mL pH : 6.9 0.2 Los ingredientes deshidratados se adicionan al agua, se mezclan vigorosamente y se calientan para disolverlos. El medio se distribuye en tubos de fermentacin de tal dimensin que el lquido en el tubo cubra el vial invertido al menos parcialmente despus de la esterilizacin a 121C por 15 min. Para preparar el Caldo Lactosado de doble concentracin se duplican los ingredientes en igual volumen de agua y se distribuye en tubos de 20 x 180 mm. Caldo Bilis Verde Brillante. Peptona-------------------------------------- 10.0 g Lactosa-------------------------------------- 10.0 g Bilis de buey-------------------------------- 20.0 g Verde brillante------------------------------ 0.0133 g Agua destilada---------------------------- 1000 mL pH : 7.2 0.2 Los ingredientes deshidratados se adicionan al agua, se mezclan vigorosamente y se calientan hasta disolverlos. Se esteriliza a 121 C por 15 min. El medio se distribuye en tubos de fermentacin de tal dimensin que el lquido cubra el tubo Durham invertido al menos, parcialmente despus de la esterilizacin. Caldo Lactosa Lauril Triptosa. Triptosa ------------------------------------------- 20.0 g Lactosa ------------------------------------------ 5.0 g

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MEDIOS DE CULTIVO Fosfato dipotsico ----------------------------- 2.75 g Fosfato monopotsico-------------------------2.75 g Cloruro de sodio ------------------------------- 5.0 g Lauril sulfato de sodio ------------------------ 0.1 g Agua destilada---------------------------------- 1000 mL pH : 6.8 0.2 Se disuelven los componentes en el agua destilada. Se puede adicionar 0.01 g/L de prpura de bromocresol al medio, como indicador de la produccin de cido y la confirmacin de crecimiento (este paso es opcional). Antes de la esterilizacin el medio se distribuye en tubos de fermentacin con tubos Durham invertidos y suficiente medio de cultivo para cubrirlo, al menos parcialmente, despus de la esterilizacin a 121 C durante 15 min. Agua Peptonada buffereada Peptona------------------------------------------------- 10.0 g Cloruro de sodio ----------------------------------------5.0 g Fosfato monohidrogenado de sodio ---------------3.5 g Fosfato dihidrogenado de potasio ------------------1.5 g Agua destilada ----------------------------------------1000 mL pH : 7.2 0.1 Se disuelven los componentes en el agua y se agitan hasta su completa disolucin. Si es necesario, se suministra calor. Se distribuyen segn los volmenes deseados en frascos de capacidad adecuada de acuerdo a las porciones de muestra a adicionar para la prueba. Esterilizar a 121 C durante 15 min. La preparacin de la solucin de doble concentracin es similar slo que la composicin de cada reactivo se debe multiplicar por el factor 2. Se almacena a temperatura ambiente por un perodo mximo de 4 semanas. Caldo EC Triptosa o Tripticasa---------------------------------------- 20.0 g Lactosa--------------------------------------------------------- 5.0 g Sales biliares mezcladas sales biliares No 3------- 1.5 g Fosfato hidrgeno dipotsico------------------------------- 4.0 g Fosfato dihidrogenado de potasio------------------------ 1.5 g Cloruro de sodio----------------------------------------------- 5.0 g Agua destilada-------------------------------------------------1000 mL pH : 6.9 0.2

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MEDIOS DE CULTIVO Los ingredientes se adicionan al agua, se mezclan vigorosamente y se calientan para disolverlos. El medio se distribuye en tubos de fermentacin cada uno con un tubo Durham invertido de forma tal que quede cubierto el vial al menos parcialmente despus de la esterilizacin a 121 C por 15 min. Buffer Fosfato. Solucin de Stock de Buffer Fosfato: Fosfato dihidrogenizado de potasio ---------------- 34.0 g Agua destilada ------------------------------------------- 500 mL pH : 7.2 0.5 Se ajusta el pH con solucin 1N de hidrxido de sodio y se diluye a 1 litro con agua destilada. Solucin de Agua Bufferada: Solucin de stock de buffer fosfato -------------------1.25 mL Solucin de cloruro de magnesio --------------------- 5.0 mL (81.1g de MgCl2.6H2O/L de agua destilada) Agua destilada ----------------------------------------- 1000 mL Se distribuyen las cantidades deseadas y se esteriliza en autoclave a 121 C por 15 min. Caldo Azida- Dextrosa. Extracto de carne --------------------------------- 4.5 g Triptona o polipeptona ----------------------------15.0 g Glucosa ----------------------------------------------7.5 g Cloruro de sodio ----------------------------------- 7.5 g Azida de sodio ------------------------------------- 0.2 g Agua destilada ------------------------------------- l000 mL pH : 7.2 0.2 Se disuelven 35 o 70 g/L en dependencia de si es simple o doble concentracin. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min. Caldo Etil Violeta Azida. Triptona ------------------------------------------- 20.0 g Glucosa -------------------------------------------- 5.0 g Cloruro de sodio --------------------------------- 5.0 g Fosfato dipotsico ------------------------------- 2.7 g Fosfato monopotsico --------------- -----------2.7 g Azida de sodio ------------------------- ---------- 0.4 g Etil violeta ------------------------------------------ 0.00083g Agua destilada ------------------------------------ 1000 mL pH : 6.8 0.2 150

MEDIOS DE CULTIVO Se adicionan 35.7 g a un litro de agua destilada. Se calienta hasta disolver. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 min. Medio Pfizer (PSE). Peptona C ------------------------------------------ 17.0 g Peptona B ------------------------------------------- 3.0 g Extracto de levadura ------------------------------ 5.0 g Bilis bacteriolgico --------------------------------10.0 g Cloruro de sodio ----------------------------------- 5.0 g Citrato de sodio ------------------------------------ 1.0 g Esculina --------------------------------------------- 1.0 g Citrato frrico de amonio ------------------------ 0.5 g Azida de sodio ------------------------------------- 0.25 g Agar --------------------------------------------------- 15.0 g Agua destilada ----------------------------------- 1000 mL pH : 7.1 Se disuelven los ingredientes en el agua destilada y se esteriliza a 121 C durante 15 min. El medio debe mantenerse por no ms de 4 h a 45-50 C, antes de verterlo en las placas. Se siembran las placas a partir de los tubos positivos de Caldo Dextrosa Azida. Agar Slanetz-Bartley (Selectivo para Enterococos). Triptosa --------------------------------------------20g Extracto de Levadura---------------------------5g D (+) Glucosa-------------------------------------2g Fosfato hidrgeno dipotasio------------------4g Azida de sodio-----------------------------------0.4g 2,3,5 trifeniltetrazolium cloruro--------------0.1g Agar-agar-----------------------------------------10g Agua destilada-----------------------------------1000 mL pH : 7.2 + 0.2 Esterilizar 20 min en calor (autoclave sin exceso de presin). Enfriar rpidamente. Agar Nutriente Peptona ------------------------------------------- 5.0 g Extracto de carne -------------------------------- 3.0 g Agar ----------------------------------------------- 15.0 g Agua destilada --------------------------------- 1000 mL pH : 6.8 0.2

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MEDIOS DE CULTIVO Se adicionan los ingredientes al agua, se mezclan vigorosamente y se calientan hasta disolverlos. El medio se distribuye en los tubos e inmediatamente despus de la esterilizacin a 121 C por 15 min, se colocan en posicin inclinada para que el agar solidifique con una superficie pendiente. Se vierten 15 mL del medio enfriado a 50 oC en placas Petri, despus de la esterilizacin, si va a utilizarse de esta forma. Agar Bilis Esculina Extracto de carne--------------------------------- 3.0 g Peptona-------------------------------------------- 5.0 g Agar------------------------------------------------- 15.0 g Bilis vacuna-------------------------------------- 40.0 g Citrato frrico------------------------------------ 0.5 g Agua destilada-----------------------------------1000 mL pH : 6.6 0.2 Se disuelven los tres primeros ingredientes en 400 mL de agua destilada. Se disuelve la bilis vacuna en 400 mL de agua destilada. Se disuelve el citrato frrico en 100 mL de agua destilada. Se combinan las soluciones y se mezclan bien. Se calientan hasta 100 C durante 10 min. Se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min. Enfriar hasta 50 C. Se agregan aspticamente 100 mL de agua destilada conteniendo un gramo de esculina, previamente calentada suavemente para obtener una solucin, y esterilizada por filtracin. Se distribuye en tubos con tapa de rosca estriles de 15 mm x 125 mm y se enfra en posicin de plano inclinado. Se inoculan aproximadamente 0.2 mL del cultivo en Caldo corazn con pipeta Pasteur. Se incuba a 35 0.5 C por 48 h. Si ms de la mitad del plano inclinado se ennegrece en 24 48 h, la prueba se considera positiva. Si menos de la mitad de la superficie se ennegrece no hay ennegrecimiento en 24 48 h, la prueba es negativa. Control positivo: Enterococcus faecalis Control negativo: Streptococcus pyogenes Agar Triptona-Soya (TSA) Casitona ------------------------------------------ 17.0 g Fitona --------------------------------------------- 3.0 g Cloruro de sodio ------------------------------- 5.0 g Dextrosa ------------------------------------------ 2.5 g Fosfato de potasio dibsico ------------------2.5 g Agar-------------------------------------------------15.0g Agua destilada -----------------------------------1000 mL pH : 7.3 0.2

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MEDIOS DE CULTIVO Se disuelven los ingredientes en el agua destilada por calentamiento durante 1 a 2 min. Se mezclan bien y se distribuye. Se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min. Control positivo: Streptococcus pneumoniae Control negativo: medio no inoculado Caldo KF Proteosa peptona----------------------------------- 10.0 g Extracto de levadura------------------------------- 10.0 g Cloruro de sodio----------------------------------- 5.0 g Glicerolfosfato de sodio--------------------------- 10.0 g Maltosa------------------------------------------------ 20.0 g Lactosa------------------------------------------------ 1.0 g Azida de sodio------------------------------------- 0.4 g Prpura de bromocresol------------------------- 0.015 g Agua destilada-------------------------------------- 1000 mL pH : 7.2 0.2 Se disuelven los ingredientes en el agua destilada. La esterilizacin es a 121 C por 10 min. Para preparar el Caldo KF 1.5 concentrado se realizan las pesadas correspondientes en igual volumen de agua y se distribuye en tubos de 20 mm x 180 mm. Se inoculan volmenes decrecientes de la muestra en los caldos 1.5 concentrados y de simple concentracin. Se incuba a 37 C durante 48 h. Una reaccin positiva es indicada por la aparicin de una coloracin amarilla en los tubos debido a la produccin de cido. Control positivo: Enterococcus faecalis Control negativo: Escherichia coli Medio salino Vela (Vela y Ralston, 1978). Solucin A: Ca (NO3)2 ---------- 30 g KNO3 ---------- 35 g NaHCO3 --------- 62.5 g Disolver en 2000 mL de H2O destilada. Utilizar 4 mL por litro de medio. Solucin B: FeSO4. 7 H2O ----------- 5 g MnCl2. H2O ------------ 3.5 g ZnSO4 -------------------- 0.75 g Disolver en 1000 mL de H2O destilada. Utilizar 2 mL por litroPgina 153

MEDIOS DE CULTIVO de medio. Solucin C: KH2PO4 -------- 10g Disolver en 100mL de agua destilada. Esterilizar por separado. Utilizar 1mL por litro de medio Se aaden 4 mL de solucin A y 2 mL de la solucin B en 900 mL de agua destilada y aparte, 1 mL de la solucin C en 99 mL de agua. Ajustar pH a 7. Esterilizar a 121C 15 min Medio basal (Finerty, 1994) (NH4)2SO4-------------------------5.3g MgSO4 7H2O---------------------0.2g CaCl2 2H2O-----------------------0.01g FeSO4 7H2O----------------------0.01g EDTA-NaOH-----------------------0.0014g Extracto de levadura-------------1g KH2PO4------------------------------4g Na2HPO4----------------------------6g Agua destilada---------------------1 L pH : 7 0.2 Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min. Suplementar con keroseno al 2% como nica fuente de carbono y energa. Pueden emplearse otras fuentes (previamente esterilizadas), como almidn, arabinosa, lactosa, glucosa, etc., tambin al 2%. Agar GELP (Van Uden y Fell,1968) Glucosa ----------------------20g Peptona_----------------------10g Extracto de levadura -------5g Agua de mar------------------ 1000 mL pH : 5 0.2 Esterilizar a 115 C 20 min Agar Petrleo (Finnerty y Singer, 1984) El agar petrleo se prepara por separado: 900 mL de Medio salino agarizado estril y 100 mL de una emulsin de petrleo crudo estril (10g de crudo / 100 mL de agua destilada, sonicacin a 60W; 20 min), enfriar a 50 C antes de mezclar. Mezclar y distribuir en placas de Petri. Medio PS (para bacterias productoras de polisacaridos) Glucosa------------------1% Peptona------------------0.5% 154

MEDIOS DE CULTIVO Agua de mar------------75% Agua destilada----------25% pH : 7.5 0.2 Esterilzar a 115 C por 15 min. Medio Okami (1986). Glucosa o sucrosa-------------- 0.6% Polypeptona---------------------- 0.5% Extracto de levadura------------ 0.1% Agua de mar---------------------- 100 mL pH : 7.5 0.2 Esterilzar a 115 C por 15 min. Medio LM (Baumann y Baumann, 1981). Estracto de levadura------------------------------5g. Tristona--------------------------------------------5g. Glicerol-----------------------------------------3 mL. CaCO2--------------------------------------------1g. Agua de mar----------------------------------750 mL. Agua destilada--------------------------------250 mL. pH : 7 0.2 Esterilizar a 1 atm, 15 min. Agar Infusin Cerebro-Corazn (BHI) Sustrato nutritivo (extracto de cerebro, extracto decorazn y peptona)-------------------------------27.5g. D (+) Glucosa---------------------------------------2g. Cloruro de sodio-------------------------------------5g. Hidrgeno fosfato disdico-----------------------2.5g. Agar--------------------------------------------------15g. Agua destilada---------------------------------1000 mL. pH : 7.4 + 0.2 a 25 C. Esterilizar en autoclave a 1 atm. 15 min. Agar Tiosulfato-citrato-bilis-sucrosa (TCBS Agar). Peptona de caseina------------------------------------5g. Peptona de carne--------------------------------------5g. Extracto de levadura----------------------------------5g. Citrato de sodio----------------------- --------------10g. Tiosulfato de sodio-----------------------------------10g. Ox bilis-------------------------------------------------5g. Carbonato de sodio -----------------------------------3g. Sucrosa------------------------------------------------20g. Pgina 155

MEDIOS DE CULTIVO Cloruro de sodio----------------------------10g Citrato de Fe (III)----------------------------1g Azul timol-------------------------------------0.04g Bromotimol azul----------------------------0.04g Agar-agar-------------------------------------14g Agua destilada-------------------------------1000 mL pH : 8.6+ 0.2 a 25 C No se esteriliza en autoclave. Caldo Tioglicolato Peptona de caseina----------------------15g Extracto de levadura---------------------5g D (+) Glucosa------------------------------5.5g L-cistina-------------------------------------0.5g Cloruro de sodio--------------------------2.5g Thioglicolato de sodio-------------------0.5g Resarzurina sdica----------------------0.001g Agar-agar----------------------------------0.75g Agua destilada----------------------------1000 mL pH : 7.1+ 0.2 a 25 C. Esterilizar a 1 atm 20 min. Debe usarse siempre acabado de preparar. Medio Waltman-Shorts (Waltman y Shorts, 1984) Tristona------------------------------------2g Extracto de levadura-------------------2g Tween 80------------------------------------10 mL NaCl------------------------------------------5g Cloruro de Calcio (CaCo2.2H2O)-----0.1g Bromotimol azul----------------------------0.003g Agar-------------------------------------------15g Agua destilada------------------------------980 mL pH : 7.4. Esterilizar a 1 atm 20 min Despus de estril y enfriado a 50 C, aadirle al medio 10 mL de una solucin de sucrosa (0.5g/mL) esterilizada por filtracin. Agar Cytophaga (Pacha y Ordal, 1967). Triptona-------------------------------------0.5g Extracto de levadura---------------------0.5g Acetato de sodio--------------------------0.2g Extracto de carne-------------------------0.2g Agar------------------------------------------9-11g Agua destilada----------------------------1000 mL 156

MEDIOS DE CULTIVO Los ingredientes del medio se disuelven en calor y el pH se ajusta a 7.27.4 antes de autoclavearlo 1 atm. 15 min. Agar KDM-2 (Evelyn, 1977). Peptona----------------------------------------10g Extracto Levadura---------------------------0.5g Cisteina-HCl----------------------------------1g Agar---------------------------------------------15g Agua destilada-------------------------------800 mL La peptona, el extracto de levadura y la cisteina se disuelven en el agua destilada y se ajusta el pH a 6.5 con NaOH. Se aade el agar, se disuelve con calor y este medio base se esteriliza a 1 atm. 15 min. Inmediatamente ante de usar el medio, se le aade 20% (v/v) suero de feto de ternero fro (45 C). El medio basal no debe guardarse ms de 3 meses. Como Renibacterium salmoninarum crece muy lento, es necesario que las placas inoculadas sean envueltas de forma ajustada, para asegurar la adecuada humedad durante el tiempo de incubacin. Medio Mueller-Hinton con 0.1% L-cisteina. Infusin de carne----------------------------------2g Hidrolizado de casena---------------------------17.5g Almidn-----------------------------------------------1.5g L-cisteina---------------------------------------------0.1% Agar-agar---------------------------------------------13g pH : 7.4 + 0.2 a 25 C Esterilizar en autoclave a 115 C 10 min Mantener en lugar seco a temperatura entre +15 y +25 oC y protegido de la luz. Se usa para siembra a profundidad o placa vertida y se incuba aerbicamente. Emulsin Egg Yolk. (Esta emulsin se usa como aditivo). A 500 mL de emulsin Egg Yolk se le aaden 4.25g de cloruro de sodio y se completa hasta 1L con agua destilada. Se mantiene en refrigeracin de 2 a 8 C. Cuando se vaya a usar, se agita para disolver el precipitado, se toman 100 mL y se mezclan con 900 mL de medio de cultivo estril y enfriado a 45-50 C. Se usa para siembra a profundidad. Agar sangre A una base de Caldo Corazn, se agrega agar de forma que quede al 1.2%. Se esteriliza en autoclave a 121 C por 15 min. Posteriormente, se funde la base esterilizada y se enfra en bao de agua a 50 C, se agrega sangre de Pgina 157

MEDIOS DE CULTIVO carnero desfibrinada o heparinizada estril atemperada en la cantidad necesaria para que la concentracin final sea de 7.5%. Se mezcla suave para evitar la formacin de burbujas. Se distribuye de 12 a 15 mL en placas Petri. Control positivo: Staphylococcus aureus (hemlisis alpha). Streptococcus pneumoniae (hemlisis betha). Control negativo: Streptococcus agalactiae. Medio Lwenstein-Jensen. Asparagina.3.6g. Fosfato Monopotsico..2.4g. Sulfato de magnesio.0.24g. Citrato de magnesio..0.6g. Harina de Papa..30g Verde malaquita.0.4g. Agua destilada600.0 mL. Medio Ogawa (Tsukamura, 1967). Glutamato de sodio1g. KH2PO4..1g. Agua destilada.100 mL. Huevos enteros200 mL. Glicerol...6 mL. Verde malaquita6 mL de una solucin al 2% (W/V). Se disuelve el glutamato de sodio y el KH2PO4 en agua destilada y se mezclan el resto de los ingredientes. El consumo de hierro se demuestra por el crecimiento de colonias naranja-rojizas en medio basal conteniendo citrato de amonio frrico 2% (w/v). Ajustar el pH a 6.8, repartir el medio en tubos de cultivo, esterilizar a 90 C por 1 h y poner en forma que se hagan planos inclinados. Medio Sauton (Tsukamura, 1965). Glicerol50 mL. Glutamato de sodio...4g. KH2PO4....0.5g. MgSO4.7 H2O.0.5g. Citrato de sodio..2g. Citrato de amonio frrico.................0.05g. Agar.................................................30g. Agua destilada.................................950 mL. 158

MEDIOS DE CULTIVO Los ingredientes se disuelven en agua destilada y se ajusta el pH a 7.0 con KOH al 10% (W/v). Se esteriliza en autoclave a 0.5 atm por 30 min. Medio Gaffkya (Steward et al. 1966). Glucosa6.5g Extracto Bacto levadura.4.5g Tryptona15g NaCl..6.4g Alcohol feniletil.2.5g Bromocreso prpua.0.008g Agua destilada..1 L pH : 7.4 Esterilizar en autoclave a 0.5 atm. 15 min. Se inocula 0.5 mL de hemolinfa en 4.5 mL de caldo y se incuba por 5 das a 28 C. Agar quitina (West y Colwell, 1984). La quitina cruda, powder (Sigma Chemical Co.) debe lavarse por 24 h alternando con 1M NaOH y 1M HCl por 5 veces. Seguidamente, el material se lava cuatro veces con etanol 95% y se deja secar completamente. Posteriormente, se disuelven con cuidado 20g de quitina en 600 mL de cido sulfrico 50% a temperatura ambiente y se filtra a travs de un wool de vidrio. La quitina precipita adicionando lentamente la solucin acidificada a 10 L de agua fra desionizada y neutralizando la mezcla con 10M NaOH. La suspensin as obtenida debe mantenerse 24 h a 4 C antes de centrifugar y lavar el precipitado varias veces con agua desionizada. La pasta coloidal de quitina debe suspenderse hasta una concentracin final de 10% (w/v) y esterilizarse en autoclave. Para usarla, se aade 1 mL de la suspensin de quitina coloidal a 9 mL de agar bacteriolgico fundido y aadido como una sobrecapa sobre un medio agar nutriente apropiado.

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MEDIOS DE CULTIVO 6.2. Hongos Harina de maz- agar- agua de mar (HMA) con antibiticos. Oxoid cornmeal agar..17 g. Agua de mar filtrada1 L. pH:7.2 Esterilizar a 1 atm 15 min. Suplementar antibiticos: estreptomicina 0.6 mL, penicilina 1mL y cloranfenicol 2.5 mL, por litro de medio. MEA o EMA (Agar Extracto de malta). Extracto de Malta......................................20.0g. Peptona........................................................1.0g. Glucosa......................................................20g. Agar...........................................................20g. Agua destilada.............................................1 L. pH:7.2 Esterilizar a 0.5 atm 15 min. CYA 25 y CYA (Agar Extracto de levadura Czapek). K2HPO4.......................................................1.0g. Concentrado de Czapek..............................10.0g. Extracto de levadura....................................5.0g. Sacarosa.....................................................30.0g. Agar.............................................................15.0g. Agua destilada..............................................1 L. pH:7.2 Esterilizar a 0.5 atm 30 min. Concentrado de Czapek. NaNO3....................................................30.0g. KCl...........................................................5.0g. Mg SO4.7H2O..........................................5.0g. Fe SO4....................................................0.1g.. Zn SO4..0.1g. Cu SO4.0.05g.

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MEDIOS DE CULTIVO Agua destilada1 L. pH: 7 Esterilizar a 1 atm 15 min. Medio Thalassia Agar (Meyer y Simms, 1965). Hojas de Thalassia maceradas.....................20g. Extracto de levadura......................................1 g. Agar................................................................18g. Agua de mar...................................................1 L. pH: 7.2 Esterilizar a 1 atm 15 min. Medio YSWA (Meyer y Simms, 1967). Extracto de levadura..................1g. Agua de mar..............................1 L. pH: 7.2 Esterilizar a 1 atm 15 min.

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