Sensores Qumicos y Biosensores de Contaminacin Ambiental

TEMA 4 TIPOS DE BIOSENSORES EN FUNCIN DEL BIO-RECEPTOR

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TEMA 4 TIPOS DE BIOSENSORES EN FUNCIN DEL BIO-RECEPTOR

CLASIFICACIN DE LOS BIOSENSORES En funcin del Tipo de deteccin En funcin del Tipo de interaccin En funcin del Tipo de receptor En funcin del sistema de transduccin

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CLASIFICACIN DE LOS BIOSENSORES La clasificacin de los biosensores se puede realizar atendiendo a diferentes criterios, como son el tipo de receptor utilizado, el tipo de interaccin con el analito, el tipo de deteccin usada o el sistema de transduccin. Existen mltiples elementos de reconocimiento y sistemas de transduccin. Estos componentes admiten diversas combinaciones. La eleccin del material biolgico/biomimtico depende de las caractersticas del compuesto a analizar, mientras que la eleccin del transductor est condicionada a la variacin en las propiedades fsico-qumicas del elemente de reconocimiento elegido como consecuencia de la interaccin. La tabla siguiente muestra un esquema de la clasificacin de los biosensores en funcin de distintos criterios. Tabla 4.1: Clasificacin de los biosensores Tipo de deteccin de la interaccin Directa Indirecta Tipo de receptor Enzima Tejido Receptor biolgico cidos nucleicos Anticuerpos Polmetros de impresin molecular Tipo de interaccin Biocataltica Afinidad Tipo de sistema de transduccin pico Electroqumico Piezoelctrico Termomtrico Nanomecnico

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En funcin del Tipo de deteccin . Deteccin directa Los sistemas que detectan directamente las interacciones estn basados en la medida de la variacin de propiedades pticas (e.g. ndice de refraccin), acsticas (e.g. frecuencia de resonancia), o elctricas (e.g. capacitancia) de la superficie activa del biosensor cuando se produce la interaccin, medida que no se debe ver afectada por la variacin de las propiedades del seno de la disolucin. Estamos ante los biosensores Intrinsecos o Activos que ya estudiamos en el primer capitulo de este e-libro. . Deteccin indirecta Sos sistemas que se emplean en la medida de la actividad de los marcadores. Los detectores ms empleados en los biosensores que utilizan marcadores, tanto homogneos como heterogneos, son instrumentos analticos convencionales provistos de celdas de medida especialmente diseadas para el trabajo en continuo, que miden propiedades pticas o elctricas generadas o modificadas por dichos marcadores. Es bastante habitual que la superficie activa del sensor est integrada dentro de la celda de medida del sistema de deteccin, aunque tambin existe un gran nmero de aplicaciones en las que las reacciones se llevan a cabo en un punto y los productos de las mismas se transportan mediante un sistema de flujo hasta la celda de medida. Este tipo de sistemas da lugar a los biosensores Activos Extrnsecos o semiactivos que se vieron el capitulo primero.

En funcin del Tipo de interaccin . Sensores Biocatalticos Son los biosensores mejor conocidos y los ms aplicados. Se basan en la utilizacin de biocatalizadores, que son elementos que favorecen que ocurra una reaccin qumica en la cual a partir de uno o varios sustratos se forman uno o varios productos conocidos sin consumo del biocatalizador, que se regenera y puede ser utilizado de nuevo. Estos biocatalizadores pueden ser sistemas que contienen enzimas o sistemas multienzimticos aislados, orgnulos celulares, clulas completas o tejidos animales o vegetales en los que estos sistemas se encuentran en su medio natural

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. Sensores de Bioafinidad Los sensores de bioafinidad se basan en la interaccin del analito de inters con el elemento de reconocimiento, sin que exista transformacin cataltica, sino que se produce una reaccin de equilibrio en la que se forma un complejo analito-receptor. Para medir la interaccin, normalmente, se suele utilizar un sistema de deteccin indirecta, un marcaje del receptor o bien de un elemento que compita con el analito por la unin al receptor. En ocasiones, puede utilizarse tambin un sistema de deteccin directa de la interaccin entre el receptor y el analito basndose en los cambios que se producen en la masa de la superficie, o bien por los cambios en las propiedades de la luz que se producen como consecuencia de esta unin. Existen distintos tipos de receptores de bioafinidad, los ms conocidos son: los anticuerpos, lectinas, receptores, clulas completas, cidos nucleicos, polmeros de impresin molecular (PIMs).

En funcin del Tipo de receptor . Enzimas Las enzimas son protenas capaces de catalizar una reaccin qumica. Reaccionan de manera selectiva con un analito o familia de analitos, acelerando la reaccin qumica, y sin consumirse. El mecanismo bsico de la catlisis enzimtica es el siguiente, E + S E-S E + P Donde S es el sustrato, E el enzima, E-S el complejo enzima-sustrato y P el producto. La actividad enzimtica, est regulada por el pH del medio, la fuerza inica, la temperatura y, requiere en algunos casos, la presencia de un cofactor. El cofactor es un producto qumico no proteico necesario para que la reaccin enzimtica se lleve a cabo, por ejemplo NAD+ u oxgeno. Tema 4 5

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Los enzimas estn formados por una estructura tridimensional compuesta por pptidos, con una zona activa que reacciona con el sustrato. Esta zona activa, que confiere especificidad a la enzima, suele estar situada en el interior del enzima. Existen diferentes tipos de enzimas, clasificados segn el tipo de reaccin que llevan a cabo: Transferasas, catalizan la transferencia de un grupo qumico, de un sustrato a otro. Hidrolasas, catalizan reacciones de hidrlisis. Liasas, catalizan adiciones de grupos a dobles enlaces o formaciones de dobles enlaces por eliminacin de grupos. Isomerasas, catalizan la interconversin de ismeros. Ligasas, catalizan la formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N por reacciones de condensacin acopladas a la hidrlisis de ATP. Oxidoreductasas, catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir, transferencia de hidrgeno o electrones de un sustrato a otro. Debido a esta capacidad redox, son el candidato ideal para su utilizacin como bioreceptores en biosensores electroqumicos. Los enzimas fueron los primeros bioreceptores utilizados, y siguen siendo hoy en da los ms empleados para la fabricacin de biosensores. Entre las enzimas disponibles comercialmente las ms utilizadas suelen ser las xidoreductasas. Son enzimas muy estables que catalizan fenmenos de oxidacin o reduccin utilizando oxgeno o cofactores. Una de las grandes ventajas de la utilizacin de enzimas, a parte de su alta selectividad, es su menor tiempo de respuesta en relacin con los otros tipos de bioreceptores, y el que sean autoregenerables. Como inconvenientes, s debe tener en cuenta que pierden actividad al ser inmovilizadas sobre la superficie del electrodo y tienen un tiempo de vida relativamente corto.

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. Tejidos Los tejidos orgnicos pueden ser utilizados como elemento de reconocimiento prcticamente sin preparacin. Generalmente, tienen una gran variedad de enzimas inmovilizados, y por tanto no son tan selectivos como otros materiales biolgicos. Por el contrario, estn en su medio natural y es ms difcil su degradacin, lo que aumenta el tiempo de vida del biosensor. Pueden utilizarse distintos tejidos como hojas, races, frutas o semillas, en rodajas o bien en forma de homogeneizados. Suelen ir asociados a transductores electroqumicos. Como ventajas destacan: el bajo coste, que evitan procesos de extraccin y purificacin de enzimas, elevada estabilidad, y simplicidad de construccin. Sin embargo presentan una respuesta lenta, una limitada selectividad y baja sensibilidad. . Clulas completas Pueden ser clulas bacterianas, fngicas, protozoos o clulas procedentes de organismos superiores y pueden ser viables o no viables. Se utiliza como elemento biolgico una clula completa, que posee en su interior mltiples sistemas multienzimticos en su medio natural. La mayor limitacin a la hora de utilizar clulas completas es la difusin de sustratos y productos a travs de la membrana celular, que da como resultado una respuesta ms lenta comparada con los sensores basados en enzimas. En comparacin con enzimas purificadas, tienen una menor especificidad debido a reacciones catalizadas por otras enzimas presentes en la clula. Las clulas se pueden inmovilizar en membranas de acetato o celulosa, o atraparse en una matriz, como un gel de agar. . Microorganismos Los microorganismos tienen una gran importancia en diferentes procesos biotecnolgicos, en la industria vitivincola, en procesos de sntesis de frmacos, o en tratamientos de agua. Muchos biosensores basados en clulas han sido desarrollados para el control de dichos procesos. Los microorganismos pueden asimilar compuestos orgnicos y generar un cambio que es detectado por el transductor. Existen Tema 4 7

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publicaciones donde se utilizan sensores amperorntricos con microorganismos inmovilizados para el control de calidad de aguas residuales basados en el seguimiento de la respiracin celular.

. Anticuerpos Los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig) son protenas complejas que elaboran los animales vertebrados al ser estimulados con un antgeno (molcula extraa para el organismo) y que tienen la capacidad de reaccionar especficamente con l. Los anticuerpos son glucoprotenas que contienen un 82-96% de pptidos y un 4-18% de hidratos de carbono. La estructura bsica de la molcula de todas las inmunoglobulinas es una unidad estructural compuesta por dos cadenas polipeptdicas ligeras, idnticas, y otras dos cadenas polipeptdicas pesadas, tambin idnticas, enlazadas por puente disulfuro (figura 4.1 ).

N N

N N

PUENTES DISULFURO CADENAS LIGERAS CADENAS PESADAS

Fa F
C C

Fig 4.1. Unidad estructural bsica de un anticuerpo con sus distintos fragmentos caractersticos, Fab y Fac, las cuatro cadenas polipeptdicas que la constituyen y los extremos carboxlico, C, y amino terminal, N. La molcula de inmunoglobulina es bifuncional, lo que permite una distincin estructural bien diferenciada en dos regiones o fragmentos: una regin que interviene en

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la unin especfica con el antgeno, denominada Fab, que constituye la regin variable de la inmunoglobulina. La secuencia de los aminocidos de la regin Fab es especifica de cada anticuerpo, confirindole su carcter nico. El fragmento Fc no posee capacidad de unin al antgeno y constituye la regin constante de la molcula, est formada por la unidad C-terminal de la cadena pesada, es la una regin responsable de la unin a los tejidos y molculas del husped. Las interacciones antgeno-anticuerpo constituyen la base de todas las tcnicas inmunolgicas. Estudios del inmunocomplejo mediante cristalografa de Rayos X ponen de manifiesto que dicha reaccin tiene lugar entre los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras. Los mecanismos de unin de un anticuerpo con su antgeno tienen lugar a travs de la formacin de mltiples uniones no covalentes entre el antgeno y los aminocidos de los residuos finales de los Fab. Las fuerzas de atraccin involucradas en las uniones son enlaces de hidrgeno, fuerzas electrostticas, fuerzas de Van der Waals y fuerzas hidrfobas. Adems, un anticuerpo y su antgeno poseen estructuras complementarias, la fuerza de estos enlaces no covalentes depende de la cercana entre los grupos que interactan, aumentando a medida que disminuye la distancia. Por tanto, las interacciones antgenoanticuerpo se van a producir a distancias muy cortas lo que confiere una gran selectividad a esta reaccin, ya que, a esa distancia las repulsiones estricas cobran una gran importancia. As, slo el antgeno que produjo la respuesta inmune o molculas muy semejantes van a ser capaces de reaccionar con el anticuerpo, mientras que el resto, al no tener la distribucin espacial adecuada, ser discriminado por las repulsiones estricas. La fuerza de una unin antgeno-anticuerpo se denomina afinidad del anticuerpo y viene determinada por la suma de las electrnicas. fuerzas de atraccin y repulsin de las nubes

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Todas las reacciones antgeno-anticuerpo son reversibles, por lo que se les puede aplicar la ley de accin de masas que permite calcular la constante de equilibrio K, o constante de afinidad.

Ac + Ac Ac-Ag
K= [Ac-Ag] / [Ac] [Ag] siendo: Ac: Anticuerpo Ag: Antgeno [Ac-Ag]: Complejo anticuerpo-antgeno K = Constante de afinidad La deteccin de cada antgeno requiere la produccin de un anticuerpo particular, su aislamiento y en ocasiones su purificacin. Dependiendo del modo en cmo se obtengan, los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos policlonales poseen mayor sensibilidad y menor especificidad que los monoclonales. La deteccin del complejo antgeno-anticuerpo se puede hacer directamente, aunque para aumentar la sensibilidad se suelen acoplar enzimas para el marcaje de los anticuerpos o los antgenos. Si se marcan los antgenos da lugar a un biosensor competitivo y si se marca los anticuerpos se obtiene un biosensor no competitivo (figuras 4.2 y 4.3). En los biosensores competitivos existe una competencia entre el antgeno marcado (enzima, fluorforo, radioistopo, etc.), y el no marcado por ocupar los sitios de unin del anticuerpo, detectndose cuantitativamente el complejo antgeno marcadoanticuerpo, formado en el reactor y relacionando la seal analtica con la concentracin del analito. En los biosensores no competitivos la especie marcada es el anticuerpo (o anticuerpos) y se encuentra/n en exceso con respecto al analito. En su formato ms sencillo (anticuerpo marcado) el exceso de anticuerpo tras la formacin del complejo con el analito es eliminado del medio de reaccin mediante la adicin de un absorbente en el que se ha inmovilizado el antgeno correspondiente.

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Fig.4.2. Esquema de un biosensor competitivo

Fig.4.3. Esquema de un biosensor no competitivo Como ejemplo mostraremos el funcionamiento de un ELISA (Exime Linked

immunosorbent Assay) es un tipo de bio/inmunosensor en fase heterognea que utiliza una enzima como especie marcadora. Los ELISAs aplicados al anlisis de plaguicidas estn basados siempre en un formato competitivo. En los inmunosensores competitivos, la relacin entre la seal registrada y la concentracin de analito no es lineal, sino que las curvas de calibrado, seal vs. logaritmo de la concentracin de analito, tienen forma sigmoide (Figura 4.4), cuyo ajuste matemtico corresponde a la ecuacin de segundo grado:

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Seal =

Amax Amin + Amin [analito] b 1+ ( ) I 50

En esta ecuacin, Amax es la asntota mxima correspondiente a la seal en ausencia de analito, Amin es la asntota mnima que corresponde a la seal en exceso de analito, b es la pendiente de la curva en el punto de inflexin, e I50 es el valor de la concentracin de analito en dicho punto.

Figura 4.4: Curva de calibrado tpica en inmunosensores competitivos (concentracin de analito expresada en unidades logartmicas) Los valores de I50 y de la pendiente b son de suma importancia, ya que son indicativos de la sensibilidad y rango de trabajo de la tcnica analtica. En sistemas que dan lugar a este tipo de curvas de calibrado, el rango de cuantificacin o rango dinmico (RD) del mtodo se define como el rango de concentraciones de analito que producen seales entre el 80% y el 20% del intervalo definido por las asntotas mxima y mnima. La sensibilidad del anlisis es un concepto controvertido en el caso de inmunosensores competitivos, ya que la pendiente de la curva de competicin (seal vs. concentracin de analito, en unidades no logartmicas), tradicionalmente considerada como la sensibilidad de cualquier tcnica analtica, es muy variable dentro del RD. La solucin
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ms elegante consiste en asociar directamente la sensibilidad del ensayo al valor mnimo de concentracin de analito que genera una seal significativamente diferente a la del blanco. As pues, se toma como lmite de deteccin (LD) la concentracin de analito que origina una disminucin de la seal con respecto al blanco del 10%. Los valores del LD y de los extremos del RD vienen directamente definidos por los parmetros I50 y b.

. Receptores En las membranas celulares existen distintos receptores moleculares y protenas de unin que pueden aislarse e inmovilizarse en diferentes superficies y utilizarse como elementos de reconocimiento asociados a diversos transductores. Pueden utilizarse para determinar compuestos txicos que ejercen su accin en los organismos mediante la unin a dianas especficas como el caso de los ganglisidos que se utilizan como receptores para detectar la toxina colrica.

. cidos nuclicos La alta especificidad de los pares de bases (adenida/ timina y citosina/ guanina) distribuidas a lo largo de la doble hlice que forma la cadena de ADN, hace de este material de gran inters en la fabricacin de biosensores. Corno en otros biosensores, las cadenas cortas de ADN (ssADN) estn inmovilizadas sobre superficies en forma de electrodos, chips o cristales segn el tipo de transductor utilizado. La hibridacin de esta molcula inmovilizada con su par es detectada por el transductor. Estos biosensores, tambin conocidos como gene chips se usan para el reconocimiento y cuantificacin de ADNs diana en muestras de inters. Como en el caso de los anticuerpos, este tipo de material no tiene capacidad cataltica, por tanto, para su deteccin necesita ser marcado. Empleando, por tanto, marcadores fluorescentes o enzimticos y se pueden acoplar a transductores pticos o electroqumicos.

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. Polmeros de impresin molecular (MIPs) El diseo y sntesis de sistemas receptores biomimticos capaces de ligar una molcula diana con una afinidad y especificidad similar a los anticuerpos ha sido un tema tratado en bioqumica desde hace mucho tiempo. La impresin molecular de polmeros sintticos es una tcnica que est siendo crecientemente adoptada para generar receptores artificiales macromoleculares Y en los ltimos aos, estos polmeros generados por impresin molecular (Molecularly Imprinted Polymers, MIPs) estn apareciendo como una nueva alternativa al uso de anticuerpos como herramientas analticas. Mediante la tecnologa de impresin molecular, resulta posible la sntesis de polmeros muy estables con propiedades de reconocimiento molecular selectivo. Los sitios de reconocimiento dentro de la matriz del polmero son complementarios al analito en la forma y posicin de los grupos funcionales. La tcnica de la impresin molecular se basa en la preparacin de un polmero altamente entrecruzado alrededor de un analito molde en presencia de un monmero adecuado. En un primer paso, es necesario poner en contacto el analito con el monmero con el fin de formar un complejo de prepolimerizacin estable, y posteriormente se inicia la polimerizacin en presencia de un entrecruzante adecuado. El complejo entre monmeros y la molcula puede ser formado va enlaces covalentes o va interacciones no covalentes, como enlaces de hidrgeno, enlaces inicos, fuerzas de Van Der Waals, interacciones electrostticas,... A partir de estas uniones los monmeros funcionales se organizan en torno al analito, polimerizan y junto con las unidades de entrecruzamiento generan una red tridimensional. Por ltimo, la molcula molde se extrae de esta matriz para dejar libres los puntos de reconocimiento mediante diversas tcnicas (reaccin de hidrlisis para la ruptura de enlaces covalentes o extraccin con disolventes en la va de preparacin no covalente). (figura 4.5).

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1 a 3 2 b

Figura 4.5. Representacin esquemtica del proceso de impresin molecular. 1: Monmeros funcionales; 2: Entrecruzante; 3: Molcula plantilla a: Ensamblaje del complejo de prepolimerizacin; b: Polimerizacin; c: Extraccin el analito dejando libres los sitios de enlace Algunos de estos polmeros tienen selectividad y sensibilidad afines, y constantes de afinidad comparables con otros sistemas de reconocimiento natural como los anticuerpos poli y monoclonales, por esta razn las impresiones moleculares se han denominado "anticuerpos de plstico". A este respecto, las impresiones moleculares pueden usarse en lugar de un anticuerpo, bien formando un biosensor o como material de extraccin en fase slida y poseen, al contrario que los materiales biolgicos como anticuerpos, una gran estabilidad y resistencia, hacindolos ideales para el trabajo de biosensores. Entre las ventajas e inconvenientes de los MIPs destacan: Ventajas: sensibilidad y selectividad elevadas; posibilidad de desarrollar PIMs destinados a muy diversos analitos incluyendo especies para las que an no se ha encontrado un elemento de reconocimiento biolgico; produccin con un bajo coste a gran escala y tiempos de vida largo: estabilidad qumica, trmica y mecnica altas.

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Inconvenientes: en general, las constantes de afinidad son bajas, es decir, que la tendencia del analito y del MIP a unirse es pequea. Esto implica mayores tiempos de anlisis; requiere altas concentraciones de molcula molde; el procedimiento de sntesis de los PIMs conlleva mltiples prdidas de material til y se obtienen redes con una distribucin poco homognea de los puntos de unin; es difcil operar en medios acuosos porque no se produce el reconocimiento del analito.

En funcin del sistema de transduccin

Existen varios tipos de transductores: electroqumicos, pticos, piezoelctricos (msicos, gravimtricos, acsticos), termomtricos y nanomecnicos. Dependiendo de la naturaleza de la interaccin entre el elemento de reconocimiento y la especie de inters se puede utilizar un tipo de transductor u otro. De ellos destacaremos los dos ms utilizados: pticos y electroqumicos. . Transductor ptico Los transductores pticos se basan en la medicin de las variaciones que se producen en las propiedades de la luz como consecuencia de la interaccin fsica o qumica entre el analito a detectar y el elemento biolgico de reconocimiento del biosensor. Las bases fsicas de este tipo de sensores son los cambios que ocurren en absorcin, fluorescencia, luminiscencia, dispersin o ndice de refraccin, cuando la luz se refleja en las superficies de reconocimiento. En el caso de los biosensores de deteccin directa, existen varias tecnologas aplicables a la medida de estas propiedades pticas superficiales, que daran lugar a los
biosensores intrinsecos o activos, que estudiamos en el primer captulo de este e- libro.

Las ms utilizadas son las siguientes: Reflexin total interna. Esta tecnologa es capaz de detectar minsculos cambios

producidos en el ndice de refraccin de la superficie modificada con un receptor (anticuerpo, ac. nuclico, MIP, etc.) y una delgada capa de su inmediata vecindad, cambios producidos al unirse una molcula de tamao considerable a esta superficie. La tcnica est basada en el fenmeno de la reflexin total de la luz cuando sta incide desde un medio pticamente ms denso (e.g. vidrio o plstico) hacia otro menos denso Tema 4 16

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(e.g. aire o agua), con un ngulo de incidencia igual o superior a un ngulo crtico. En condiciones de reflexin total, la onda incidente penetra a travs de la interfase entre los dos medios hasta una profundidad igual o menor que la longitud de onda, de ah que a este sistema de deteccin se le llame tambin onda evanescente. Los reactivos con actividad inmunolgica se inmovilizan sobre la superficie del medio pticamente ms denso, de modo que la unin de especies procedentes de la disolucin (medio de menor densidad) modifica el ndice de refraccin de una capa delgada sobre la interfase, y esta modificacin se traduce en una variacin de las propiedades de la onda evanescente. Este sistema de deteccin se esquematiza en la Figura 4.6.

Figura 4.6: Esquema de la deteccin de uniones inmunoqunticas por reflexin total interna La onda evanescente tambin se puede utilizar como fuente excitadora de un fluorforo, de modo que la fluorescencia se produce nicamente en las molculas adsorbidas sobre la inrmmosuperficie y no en las que estn en la disolucin. Este sistema es capaz de detectar los marcadores fluorescentes unidos al inmunoadsorbente sin necesidad de eliminar la disolucin que contiene las sustancias no adsorbidas. Resonancia de plasmn de superficie. Esta tcnica, relacionada con las de reflexin total interna, est basada en la excitacin colectiva de los electrones de una delgada pelcula

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metlica colocada sobre un soporte slido. La superficie inmunoactiva del sensor se encuentra al otro lado de la pelcula metlica. La excitacin provoca una absorcin total de luz (resonancia) cuando sta incide sobre la pelcula metlica a travs del soporte con un ngulo concreto . El ngulo crtico de incidencia que provoca la resonancia depende de los ndices de refraccin de las zonas a ambos lados de la capa de metal, de modo que la variacin del ndice de refraccin en la inmunosuperficie se traduce en una modificacin del ngulo de resonancia. Un esquema de esta tcnica se muestra en la Figura 4.7.

Figura 4.7 : Esquema de la deteccin de uniones inmunoqumicas por resonancia de plasmn de superficie Este sistema de deteccin es capaz de monitorizar interacciones en tiempo real, de modo que es de gran ayuda en el estudio de la cintica de las reacciones inmunolgicas. Cuando el sistema transductor ptico se basa en las detecciones indirectas de las interacciones, se emplean marcadores, dando lugar a los biosensores Activos
Extrinsecos o semiactivos, como ya vimos.

Los instrumentos pticos son muy populares en la deteccin de los marcadores habitualmente utilizados en inmunosensores, ya que prcticamente todos ellos pueden cuantificarse mediante alguno de los mtodos pticos usados en anlisis de rutina. Los instrumentos ms utilizados son los luminmetros, fluormetros especialmente, ya que

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los productos fluorescentes o quimiluminiscentes, bien sean productos de reacciones de enzimas marcadoras o sean stos los propios marcadores, se pueden detectar con una gran sensibilidad, mucho mayor que en la deteccin espectrofotomtrica. Esta gran sensibilidad est favorecida por la amplificacin de seal producida por los marcadores enzimticos. A ello hay que unir una alta selectividad, derivada especialmente del uso de fluorforos con gran rendimiento cuntico y un desplazamiento de Stokes muy alto, as como la posibilidad de operar, en ocasiones, con resolucin de tiempo. Una variante muy atractiva consiste en el uso de fibras pticas, con el ingrediente bioactivo inmovilizado en el extremo. La medida de la actividad del marcador que se une a dicho ingrediente se realiza a travs de la misma fibra, dando lugar a los biosensores de fibra ptica u optrodos, ampliamente utilizados y con un gran nmero de variantes. Todas las ventajas exhibidas por la deteccin ptica hacen que sta sea la tcnica ms habitualmente utilizada y recomendada a nivel comercial en los sensores en general, y en los biosensores en particular. Empleando un sistema de transduccin ptico podemos adems diferenciar entre
biosensores hidrestrticos (estticos) e hidrodinmicos (dinmicos). La medida en los

biosensores hidrostticos se realiza por inmersin del dispositivo en la disolucin del analito a determinar, mientras que en los hidrodinmicos o biosensores en flujo, la fase reactiva se acopla a un sistema de propulsin que se encarga de bombear las disoluciones de reactivos y muestra hasta ella. La fase reactiva va a contener el antgeno o el anticuerpo, dependiendo del formato de ensayo empleado, inmovilizado en una fase slida empaquetada en una clula de flujo. Las fases slidas ms comnmente empleadas en los procesos de inmovilizacin se describirn en el captulo siguiente. Los biosensores en flujo pueden presentar dos configuraciones dependiendo de si la clula de flujo est o no situada fsicamente en el detector (figura 4.8). En el ltimo caso, es necesario transmitir la seal analtica hasta el detector mediante una fibra ptica, con el fin de integrar la reaccin inmunolgica con la deteccin (deteccin in-situ).

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a)

1 2

3 4

Desecho

b)
1 2 4

Desecho

Figura 4.8.- Esquema de biosoensores en flujo a) fase slida integrada en el detector b) fibra ptica. 1.- Bomba peristltica, 2.- Vlvula de inyeccin, 3.- Detector, 4.- Clula de flujo, 5.- Fuente de radiacin. Los biosensores hidrodinmicos presentan todas las ventajas inherentes a los mtodos de anlisis en flujo como son la alta reproducibilidad, precisin, sencillez, versatilidad y alta frecuencia de muestreo, por lo que son mucho ms frecuentes que los hidroestticos.

. Transductor Electroqumico Los transductores electroqumicos transforman la seal que se produce por la interaccin entre el sistema de reconocimiento y el analito a detectar en una seal elctrica. Proporcionan informacin analtica cuantitativa o semicuantitativa especfica. El elemento de reconocimiento biolgico y el elemento de transduccin deben estar en contacto. Se diferencian cuatro tipos de biosensores electroqumicos que son conductimtricos, potenciomtricos, amperomtricos e impedimtricos en funcin de si detectan cambios en la conductividad, en el potencial, en una corriente generada o en la impedancia.

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De todas las posibilidades que ofrecen las tcnicas de deteccin de especies electroactivas, la amperometra es la mayormente utilizada, sobre todo en la medida de la actividad de una enzima marcadora que origine un producto electroactivo. Tambin se encuentran casos en los que la especie electroactiva es el propio marcador. Esta deteccin se ha utilizado en muchas aplicaciones, alcanzndose sensibilidades excepcionales. Entre las ventajas de este tipo de trnsducutor se cuentan: son econmicos, con posibilidad de produccin masiva, fcil miniaturizacin, respuesta rpida, alta sensibilidad y posibilidad de automatizacin. No obstante, son sistemas bastante vulnerables, adems, hay muchas sustancias electroactivas y, por tanto, posibles interferentes, en todos los casos es necesaria la utilizacin de electrodos de referencia (excepto en los conductimtricos). . Transductor de oscilador piezolctrico Este sistema est basado en la medida de la frecuencia de resonancia de un cristal piezolctrico, generalmente de cuarzo, que depende de la masa total del cristal. Al aumentar la masa del cristal por interaccin inmunoqumica, se produce una variacin en la frecuencia de resonancia.

. Transductor de onda acstica superficial Este modo de deteccin utiliza tambin cristales piezolctricos en los que se genera una onda superficial mediante un electrodo emisor de radiofrecuencias, que se recoge en el mismo electrodo o en otro. La propagacin de esta onda es muy sensible a pequeos cambios en la superficie del cristal. En general, Los sistemas de transduccin piezoelctricos, msicos, gravimtricos o acsticos miden cambios directos de masa inducidos por la formacin del complejo antgeno-anticuerpo.

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.Transductor nanomecnico En los transductores nanomecnicos el elemento de reconocimiento biolgico se inmoviliza sobre la superficie de una micropalanca de silicio, que se sumerge en una muestra lquida. Generalmente se utilizan anticuerpos. La interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito produce un cambio diferencial en la tensin superficial del lquido y la micropalanca sufre una respuesta de tipo nanomecnico que consiste en un cambio de la deflexin y/o de la frecuencia de resonancia.

Desde hace muy pocos aos, uno de los desarrollos clave dentro del rea de biosensores es la miniaturizacin de los dispositivos mediante la utilizacin de las micro y nanotecnologas. Surge as el concepto de nanobiosensor, trmino que designa a aquellos biosensores cuyas propiedades vienen moduladas por la escala nanotecnolgica con la que estn fabricados. Es de esperar que en el futuro los nanobiosensores tengan una sensibilidad mucho ms alta que la de los dispositivos convencionales. Adems podran ser fcilmente introducidos en el interior del cuerpo humano, por lo que podran proporcionar datos mucho ms fiables del estado de salud de un paciente y adems podran utilizarse como sistemas de anlisis individualizados y personalizados en cualquier entorno, incluido el del hogar. Dentro de los incipientes desarrollo de nanobiosensores son de destacar los nanobiosensores basados en nanopartculas de oro o magnticas, que se estn empleando para la deteccin precoz de cncer y Alzehimer, los nanobiosensores tipo FET basados en nanotubos de carbono y los biosensores nanomecnicos, que han surgido como reemplazo de los biochips de ADN.

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