AISLAMIENTO DEL ARN DE LEVADURA

Gonzlez, T. Martnez, G. Ocampo, M. Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Qumica, Universidad del Valle, Cali, Colombia. Dirigido al profesor: Jaime Restrepo Laboratorio: 25/10/10 Entrega: 06/11/2010

Resumen: se aisl ARN de levadura mediante un protocolo que incluy dos etapas: homogenizacin y purificacin. En la primera etapa, se disolvi la levadura en agua, calentando hasta 37 C y agregando una solucin de lisis, en este caso se utiliz fenol concentrado. La posterior centrifugacin de la solucin obtenida, contena el ARN como sobrenadante, este sobrenadante se aisl y se le adicion etanol frio para precipitar y purificar el ARN, lo que constituy la segunda etapa del proceso. En la determinacin cualitativa y cuantitativa del ARN aislado, se recurri a una tcnica espectroscpica. Se prepar una curva de calibracin utilizando soluciones de ARN estndar y adicionando orcinol- FeCl 3 en medio caliente, el resultado fu una solucin de color verde fcilmente cuantificable por espectroscopa en el rango visible (a una longitud de onda de 665 mn), al ARN aislado tambin se le hizo reaccionar con estos mismo reactivos en iguales condiciones y se le tom la absorbancia; con este resultado y la ecuacin de la recta obtenida por mnimos cuadrados, se determin una concentracin de 0.133 % de ARN en 5 g de levadura. Por otro lado, se tom un espectro ultravioleta del ARN de levadura aislado, en el cual se observan 2 bandas, a 207.0 y 269.0 nm, propias de los sistemas de dobles enlaces conjugados presentes en la molcula de las purinas y pirimidinas del acido nucleco analizado.

1. Introduccin 1.1 ARN El cido ribonucleico (ARN o RNA, de RiboNucleic Acid, su nombre en ingls) es un cido nucleico formado por una cadena de ribonucletidos.

mitocondrias. En las clulas de organismos superiores hay tres tipos de ARN: ARN mensajero (mARN), ARN ribosomal (rADN), y ARN de transferencia (tADN), todos los cuales participan activamente en la sntesis de protenas. Algunas molculas de ARN presentan actividad cataltica, y son conocidas como ribozimas. La mayora de los ARN son autocatalticos, ya que catalizan su propio procesamiento. Su hallazgo es relativamente reciente, y antes se consideraba que solo las protenas eran las nicas macromolculas capaces de poseer actividad cataltica. El ARN es el vehculo molecular que transporta la informacin gentica del DNA para la sntesis de protenas. Las protenas son los productos finales de la expresin del DNA de la celula. La informacin que reside en el DNA se emplea para construir mRNA (transcripcin), que a sus ves, retransmite el mensaje a la maquinaria celular encargada de la sntesis proteica. De esta manera, el mRNA sirve de intermediario para llevar la informacin del DNA.

Ilustracin 1 Estructura del ARN

La mayora del ARN se encuentra en el citoplasma como ARN soluble y ARN ribosomal, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el ncleo y un poco cantidad se halla tambin en el las

1.2 Levaduras Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscpicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposicin mediante fermentacin de diversos cuerpos orgnicos, principalmente los azcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

Gotero, Jeringa, Vidrio reloj. Plancha calentadora/agitadora, Spectronic con sus respectivas celdas

Mtodo: 1) Extraccin-homogenizacin En un vaso, adicionar 5 g de Levadura de pan seca y 20 mL de agua destilada, agitar hasta disolver completamente y calentar a 37C durante 15 minutos. Adicionar 25 mL de Fenol Concentrado Agitar durante 30 minutos y transferir el contenido del vaso a los tubos de centrifuga, someter a centrifugacin durante diez minutos

Ilustracin 2

La estructura de las levaduras es muy parecida a la de las clulas comunes por que consta de las mismas partes de la clula animal. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulacin con las mnimas precauciones 1.3 Objetivos Utilizando un protocolo sencillo de homogenizacin y purificacin, se pretende aislar el ARN de levadura. Realizar determinaciones cuantitativas de concentracin de ARN mediante una reaccin con Orcinol, cuantificando posteriormente con una tcnica de espectroscopia visible. Observar las bandas de absorcin en el ultravioleta propias del acido ribonucleico. 2. Materiales y mtodos
Tabla 1 Materiales y Reactivos 3 Vasos de 100 ml Bao de hielo. Bao Mara Orcinol, FeCl3 NaCl 0.25 M, Acetato de sodio 200g/L pH 5 Etanol, Levadura de pan seca, Fenol Pipeta pasteur RNA patrn estndar al 0.5%

(2) Purificacin por precipitacin Separar el sobrenadante donde se encuentra el ARN en un vaso limpio y seco, descartando el precipitado. Adicionar 3 mL de acetato de sodio pH 5 Precipitar el ARN por adicin de dos volmenes de EtOH absoluto fro por volumen de sobrenadante separado, Agitar suavemente y dejear la mezcla en reposo en la nevera por 30 minutos para obtener un mayor rendimiento. Someter a centrifugacin por diez minutos. Separar el precipitado (es all donde se encuentra el ARN). Disolver el ARN en un volumen de 15 mL de solucin de NaCl 0.25 M y transferir la solucin a un tubo de ensayo limpio y seco.

Determinacin del ARN extrado: El ARN obtenido se hacer reaccionar con Orcinol en medio cido catalizador, que al calentar forma una solucin verde, para su cuantificacin, se prepara una curva de calibracin con soluciones patrn de ARN estndar bajo las mismas condiciones, los volmenes adicionados de muestra y de estndares se muestran en la siguiente tabla:

10 tubos de ensayo con gradilla. Centrifuga 2 Vasos de 250 mL,Probeta 100 ml Pipetas graduadas de 0,5,1,2,5,10 ml

Tabla 2 Volmenes en mL adicionados de cada reactivo, incluyendo las muestras de ARN Tubo # Solucin de RNA estndar al 0.5% (mL) Blanco 1 2 3 4 5* 6*

Tabla 4 Datos estadsticos de la curva de calibracin

0.0

0.5

1.5

2.0

1.0 2.0

Ecuacin: Y= a + bX 2 R =0.90269 Valor Intercepto (a) 1.5465 Pendiente (b) 2.51 Para el tubo 5: 

Error estndar 0.06401 0.4674

Orcinol con 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3,0 FeCl3 (ml) Agua destilada 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1.0 0.0 (ml) *5y 6 corresponden a la muestras de RNA obtenido de la levadura La absorbancia de las diferentes soluciones se mide a una longitud de onda de 665 nm.

En los 15 mL de la solucin de NaCl con ARN, contiene aproximadamente 0.1% m/v en ARN.    Para el tubo 6:  

3. Datos, clculos y resultados Para realizar los clculos del porcentaje del ARN extrado de la levadura, se tuvo en cuanta que el extracto final se obtuvo a un volumen de 15 mL.
Tabla 3

En los 15 mL de la solucin de NaCl con ARN, contiene aproximadamente 0.18 % m/v en ARN.  

 Tubo 1 2 3 4 5 6 Concentracin ARN en %m/v 0,05 0,1 0,15 0,2 Determinado Determinado ABS 1,637 1,829 1,965 2,010 0.765 1.203

4. Anlisis En general, dada su complejidad macromolecular, el ARN como el ADN son difciles de separar de los componentes de membrana, protena residual o aadida (tales como las enzimas de restriccin) y otras molculas solubles (como polisacridos). Los mtodos drsticos alteran sus estructuras y sus caractersticas. El mtodo utilizado fue un mtodo suave elaborado con el fin de eliminar la impureza de la preparacin teniendo en cuenta las propiedades fisicoqumicas del acido nuclicos a aislar. El protocolo de extraccin utilizado, se fundament en una etapa de homogenizacin y una de precipitacin o purificacin de la levadura. La utilizacin de la levadura como fuente de ARN, se basa en que, no se necesita tratamientos enzimticos o mecnicos robustos para esta extraccin, debido a que, las clulas de la levadura son muy parecidas a la de los animales, y estas son clulas que usualmente pueden ser lisadas con un tratamiento suave, a diferencia de otros tejidos, de vegetales especialmente.

Grfica 1 Curva de calibracin de soluciones patrn de ARN

subsecuentes, debido a que algunas de ellas tienden a adherirse al acido nuclicos y degradarlo.

Ilustracin 3

En general, el aislamiento del ARN, se puede considerar como una extraccin liquido-liquido (extraccin de acido nuclicos por solubilidad en fases inmiscibles); este mtodo se bas en la separacin de fases por centrifugacin del homogenizado acuoso de clulas (levadura disuelta en agua, en caliente) y una solucin de fenol concentrado. Cuando la levadura disuelta en agua, es expuesta a la solucin concentrada de fenol (solucin de lisis), esta ltima rompe los enlaces de hidrgeno en las macromolculas, causando desnaturalizacin de las protenas y por tanto la lisis celular. La utilizacin del fenol concentrado, permiti la ruptura de la pared celular de manera que las clulas puedieran ser lisadas con mayor facilidad, debido a que la levadura posee una parad celular considerablemente dura. La pared celular de la levadura esta constituida por polisacridos y glicoprotenas en forma de una red tridimensional que funciona como una estructura altamente dinmica y adaptable al medio que la rodea. La pared celular de la levadura es capaz de adaptarse a cambios fisiolgicos y morfolgicos o a las condiciones ambientales de su entorno. Luego de la lisis celular, se encuentran los componentes intracelulares en la solucin que contiene ADN, ARN, protenas, lpidos y carbohidratos, constituyendo una solucin turbia. Al centrifugar la solucin turbia producto de la lisis celular con el fenol, aparecen dos fases: la fase inferior de fenol o fase orgnica, que contiene el ADN (el ADN es precipitado debido a que el fenol utilizado no estaba tamponificado), protenas desnaturalizadas, lpidos de membrana, polisacridos y otros restos celulares, en la fase superior acuosa contiene glcidos y ARN. La protena desnaturalizada se halla presente en ambas fases y es removida ulteriormente por centrifugacin. La remocin de protenas es importante, para evitar que puedan interferir con los procedimientos

Ilustracin 4 Pared celular de la levadura

Las interacciones entre el agua y los grupos fosfato ayudan a remover especies mezcladas con el RNA, para as poder liberarlo. La centrifugacin ayuda a separar los componentes innecesarios del compuesto de inters que es el RNA. Por si sola la centrifugacin no logra precipitar el RNA y es la adicin del fenol la que permite obtener una mayor cantidad de dicho cido. Para evitar la perdida y degradacin del RNA, el compuesto resultante se llev al bao de hielo. Desde el punto de vista de la molcula de RNA, las fuerzas responsables de las conformaciones de las estructuras de los cidos nuclicos son lo suficientemente resistentes como para mantener la integridad estructural, pero a la vez son tan dbiles como para exhibir una flexibilidad conformacional. Los enlaces covalentes, las fuerzas de Van der Waals, los enlaces de hidrgeno y las interacciones electrostticas se ven afectadas durante todos los tratamientos realizados a la muestra de levadura. Se tiene que los efectos electrostticos son los que determinan estructura y la forma de la cadena, a la vez los efectos hidroflicos estabilizan los apareamientos de las bases de RNA en solucin acuosa.

La purificacin, incluy una disolucin de la fase acuosa en una solucin de acetato de sodio pH 5, y una precipitacin con etanol frio durante treinta minutos,para obtener un mayor rendimiento en la obtencin de un ARN mas limpio, todo esto con el objetivo de eliminar trazas de ribunucleasas (ARNasa) que son enzimas (nucleasas) que catalizan la hidrlisis de ARN en componentes ms pequeos; estas enzimas pueden ser introducidas a lo largo del proceso, generndose por bacterias u otros factores propios de la manipulacin. Este proceso de purificacin tambin permite separar el ARN de materiales contaminantes, como ADN y protenas. Esta es una tcnica muy empleada para purificar cidos nuclicos de oligonucletidos, nucletidos, sales y otras impurezas. Bajo estas condiciones, el polmero de ARN se agrega y precipita mientras que los componentes de bajo peso molecular permanecen en suspensin. Cada uno de los pasos realizados, se llevaron a cabo en condiciones de baja temperatura para incrementar la eficiencia de la purificacin del ARN, evitando la desnaturalizacin de la muestra. En general, dada su complejidad macromolecular, el ARN como el ADN son difciles de separar de los componentes de membrana, protena residual o aadida (tales como las enzimas de restriccin) y otras molculas solubles (como polisacridos). Los mtodos drsticos alteran sus estructuras y sus caractersticas. El mtodo utilizado fue un mtodo suave elaborado con el fin de eliminar la impureza de la preparacin teniendo en cuanta las propiedades fisicoqumicas del acido nucleco. En este mtodo, no se utiliz enzimas proteolticas (como la proteinasa K) para eliminar protenas asociadas ni tampoco se hizo utiliz qumicos que eliminaran las ribonucleasas, por tanto, es factible que trazas de estos se quedasen en la solucin y degradaran en ciertas proporciones el ARN que se pretenda aislar. Una completa extraccin de cidos nuclicos fue fundamental para la determinacin indirecta que se realiz utilizando una curva de calibracin de soluciones estndar apoyndose en una versin modificada de una reaccin de Bial. La determinacin del ARN, se realiz por espectrofotometra visible, por tanto, el anlisis cuantitativo incluy una curva de calibracin de

soluciones estndar de ARN. La reaccin colorida, fue producto de la reaccin entre la solucin de ARN y una solucin de Orcinol con un acido de Lewis, el FeCl3 como acido catalizador. El cido catalizador FeCl 3, hidroliza las uniones fosfodiester y N-glicosdicas, liberando ribosa, bases pricas, pirimidnicas y acido fosfrico. La ribosa, que es una pentosa, en medio cido se deshidrata originando furfural que reacciona con el orcinol por medio de una condensacin, dando un producto verde que demuestra la presencia de ARN, cabe resaltar que para el ADN o para cualquier pentosa, tambin se obtiene un mismo resultado, sin embargo, interferencias por este tipo se descartan debido al proceso de extraccin y purificacin llevado a cabo. En las siguientes ilustraciones se muestra las reacciones llevadas a cabo:
O

Ilustracin 5 Formacin del furfural a partir de la hidrolisis de la ribosa


OH OH

H 3C

H 3C


OH HC O OH C O

-H2O

De la investigacin sobre el RNA, se concluye que es el encargado de transmitir las instrucciones a cada clula del cuerpo, para as mantener un correcto funcionamiento en el organismo En la separacin de compuestos a estudiar es importante tener presente las propiedades de los solventes y las interacciones de estos con los compuestos que se vayan a separar

H 3C

H 3C

OH

bis-(3,5-dioxi-metil-f enil furfural-metano)

9-Furan-2-yl-6-hydroxy-1,8-dimethylxanthen-3-one Complejo verde que absorbe a 665 nm

Ilustracin 6 Condensacin del furfural con el orcinol

La reaccin que se lleva a cabo entre el furfural y el orcinol, puede verse como una doble alquilacin de un anillo aromtico, donde, se produce una sustitucin aromtica por un grupo electrfilo en cada anillo aromtico; la polarizacin del grupo carbonilo contribuye a la reactividad del furfural en la proporcin aldhica, el tomo de C polarizado positivamente, acta como un electrfilo. El orcinol, es un compuesto aromtico fuertemente activado por los grupos hidroxilo y el grupo alqulico CH3 que contiene, esta activacin est dirigida a las posiciones orto y para con relacin a cada grupo, por tanto en estas posiciones es en donde se realiza la sustitucin electroflica, la mayor probabilidad de sustitucin es los anillos es la que se refleja en la ilustracin 6. Las molculas de ARN reaccionan indirectamente con orcinol en presencia de cloruro frrico como catalizador y a su vez las pentosas de nucletidos de purina del ARN al ser calentadas se deshidratan y dan unos compuestos de tipo aldehdo conocidos como furfurales. Los furfurales son compuestos derivados del furano que reaccionan con el orcinol en presencia de cantidades catalticas de cloruro frrico dando soluciones de color verde, sufriendo deshidratacin y luego deshidrogenacin. La reaccin esta dada por:

5. Conclusiones


El RNA es de gran importancia en cuanto al entorno biolgico, pues es el ayudante del DNA al realizar la labor de transcripcin de la informacin