Quim. Nova, Vol. 25, No.

5, 856-865, 2002

Assuntos Gerais

RECOMENDAES PARA CALIBRAO EM QUMICA ANALTICA - PARTE I. FUNDAMENTOS E CALIBRAO COM UM COMPONENTE (CALIBRAO UNIVARIADA)# Bencio de Barros Neto Departamento de Qumica Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Luis Freire, s/n, 50740-540 Recife - PE Maria Fernanda Pimentel Departamento de Engenharia Qumica, Universidade Federal de Pernambuco, Rua Teresa Mllia, s/n, 50740-521 Recife - PE Mrio Csar Ugulino Arajo* Departamento de Qumica, Universidade Federal da Paraba - Campus I, CP 5093, 58059-900 Joo Pessoa - PB Recebido em 13/12/01

This paper is a translation from IUPAC nomenclature document by K. Danzer and L. A. Currie (Pure Appl. Chem., 1998, 70(4), 993-1014). Its goal is to establish an uniform and meaningful approach to terminology (in Portuguese), notation, and formulation for calibation in analytical chemistry. In this first part, general fundamentals of calibration are presented, namely for both relationships of qualitative and quantitative variables (relations between variables characterizing certain types analytes of the measured function on the other hand and between variables characterizing the amount or concentration of the chemical species and the intensities of the measured signals, on the other hand). On this basis, the fundamentals of the common single component calibration (Univariate Calibration) which models the relationship y = f(x) between the signal intensities y and the amounts or concentrations x of the analyte under given conditions are represented. Additional papers will be prepared dealing with extensive relationships between several intensities and analyte contents, namely with multivariate calibrations and with optimization and experimental design.

INTRODUO A calibrao, em geral, uma operao que relaciona uma grandeza de sada com uma grandeza de entrada, para um sistema de medida sob determinadas condies. No processo de medio qumica (PMQ)1, as grandezas de entrada so grandezas analticas que caracterizam os tipos de analitos (espcies qumicas), qi, e suas quantidades ou concentraes, x. As grandezas de sada so representadas por valores medidos, isto , sinais observados em posies zj com intensidades yzj. O caso mais comum, no qual se determina uma relao entre a quantidade ou concentrao (contedo) de um certo analito, xqi, e a intensidade de um sinal, yzj, apenas um caso especial de calibrao. Em um sentido mais amplo, a calibrao em Qumica Analtica se refere relao entre uma funo analtica, x = f(q), que representa um perfil de distribuio de analitos e suas quantidades ou con-

centraes em uma dada amostra-teste (Figura 1, lado esquerdo), e uma funo medida y = g(z), que pode ser representada por um espectro, um cromatograma, etc. (Figura 1, lado direito)2. Existem portanto quatro grandezas, q, x, z e y, que precisam ser relacionadas entre si, numa situao que pode ser caracterizada pelo diagrama pseudo-tetradimensional da Figura 2. A relao entre a espcie e seu sinal caracterstico aparece em primeiro plano. Por trs dela, a relao entre o sinal e a concentrao estabelecida. Juntas, estas duas relaes estabelecem a composio da amostra. Estas relaes gerais se refletem em trs aplicaes analticas relevantes: 1. Calibrao q-z: Calibrao de grandezas que caracterizam posies tpicas de sinal, z, para identificao de componentes e anlise qualitativa:

z = f ( q) + e z L q + e z

Figura 1. Relao entre a funo analtica x = f (q) e a funo medida y = g (z ) *e-mail: laqa@quimica.ufpb.br # O presente artigo uma traduo para o portugus (aprovada pelo Comit Brasileiro para Assuntos de Qumica junto IUPAC), do artigo Guidelines for Calibration in Analytical Chemistry. Part 1. Fundamentals and Single Component Calibration publicado em Pure Appl. Chem. 1998, 70, 993, preparado por K. Danzer e L. A. Currie.

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Recomendaes para Calibrao em Qumica Analtica

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onde f representa a relao funcional entre z e q, ez representa o erro de medio em z e L o operador (aproximadamente) linear que transforma qi (que uma grandeza especfica do componente, como nmero atmico, nmero de massa, ou um valor de energia tpico) em z. 2. Calibrao y x: Calibrao de grandezas que caracterizam a intensidade de uma resposta observada y para um dado analito qi, em anlises quantitativas de um componente:

analticos que caracterizam os tipos de espcies qumicas) o ajuste de um modelo (estimativa e validao de seus parmetros) para a relao entre z e q, para fins de identificao e anlise qualitativa usando-se a Eq. (1). z = f(q) + ez L . q + ez (1)

y = F ( x) + e y M x + e y
onde F a relao funcional entre y e x (a funo de calibrao, em sentido mais estrito), ey representa o erro de medio em y, e M o operador aproximadamente linear que transforma x em y. 3. Calibrao quantitativa multicomponente: Y = A.X + E onde Y representa a matriz dos valores medidos, X a matriz das concentraes ou quantidades dos analitos, A a matriz de sensibilidade que transforma X em Y, e E a matriz dos erros. A calibrao quantitativa multicomponente, que ser o tema de um segundo artigo, feita atravs de tcnicas de regresso mltipla ou multivariada.

Na prtica analtica, a calibrao q z refere-se localizao de sinais em uma configurao caracterstica da espcie presente, em escalas de energia ou proporcionais energia, como comprimentos de onda, freqncias ou razes massa/carga em espectrmetros de massas, ou o tempo em cromatogramas. Na identificao e na anlise qualitativa, o operador linear L pode ser2: i. uma funo determinstica baseada em leis naturais, z = fdet(q), como a lei de Moseley sobre a dependncia das freqncias de raios-X em relao ao nmero atmico3, ou ii. uma funo emprica, z = femp(q), como os ndices de Kovats para normalizao de tempos de reteno com base em uma srie homloga de referncia, em cromatografia gasosa4, ou iii. uma relao emprica, z = emp(q), representada por tabelas e atlas, como a tabela de Colthup para vibraes caractersticas5, os atlas do ferro em espectroscopia de emisso atmica6 e outros tipos de tabelas de comprimentos de onda7. Enquanto que as relaes z = fdet(q) so conhecidas com base em leis naturais, as funes empricas z = femp(q) para identificao e anlise qualitativa geralmente so estimadas atravs de um ajuste por mnimos quadrados (linear) de valores z observados para uma srie de padres dos componentes puros ou para um padro multicomponente. Calibraes por meio de relaes empricas z = emp(q) dadas por tabelas, atlas e grficos so obtidas atravs da classificao dos resultados experimentais. Calibrao para anlise quantitativa a determinao da relao funcional entre y e x, da forma: y = F(x) + ey (2)

onde F a funo de calibrao. Na maioria dos casos, a funo de calibrao precisa considerar a influncia de todos os constituintes e interferentes relevantes sobre a resposta. Portanto, y depende de um vetor x = (xa, xb ... xm, xn ... xq) que contm as quantidades ou concentraes do analito de interesse, xa, dos componentes que o acompanham, (xb...xm), e dos fatores interferentes, (xn ... xq):
Figura 2. Representao pseudo-tetradimensional da ligao entre a calibrao qualitativa e a calibrao quantitativa. A relao q-z corresponde a uma funo determinstica, (i). Freqentemente existem relaes empricas, como (ii) e (iii)

y = F (N ) + e y

(4)

FUNDAMENTOS Calibrao em Qumica Analtica a operao que determina a relao funcional entre valores medidos (intensidades y de sinais em certas posies zj) e grandezas analticas caracterizando os tipos de analitos qi e suas quantidades ou concentraes x. A calibrao inclui a seleo do modelo (isto , a especificao da sua forma funcional), a estimativa dos parmetros do modelo e dos erros associados a essas estimativas, e a validao do modelo. Calibrao para identificao de espcies e anlise qualitativa (calibrao q z, ou, mais especificamente, calibrao de parmetros
a

Nas circunstncias mais desejveis, a Eq. (4) uma equao vetorial linear. O emprego da Eq. (4) para o ajuste de modelos assunto para o planejamento experimental e a otimizao, que sero abordados em um terceiro artigo. Na calibrao mais simples, de acordo com a Eq. (2), para uma dada quantidade ou concentrao de x = xaonde no seja preciso considerar outros componentes e fatores interferentes, y uma grandeza escalar. No caso mais geral, y pode ser uma funo da varivel z. A relao bsica assume ento a forma: y(z) = M(z)x + ey (4a)

e passa a representar um perfil de distribuio caracterstico, como um espectro de um componente puro. Funo de avaliao1,8 Em geral, a funo de avaliao a (funo analtica) o inverso da funo de calibrao da Eq. 2:

Evaluation. (N.T.)

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x = F-1 (y)

(5)

y = Ax + ey

(9)

desde que a relao entre o valor medido y e a concentrao ou quantidade do analito x tenha sido obtida por calibrao, que o usual em Qumica Analtica. Entretanto, dependendo na natureza do mtodo analtico, existem outros tipos de procedimento de avaliao, como os baseados em leis naturais. A determinao das quantidades ou concentraes dos analitos pode ser baseada em medidas absolutas, medidas relativas ou medidas de referncia9. Medidas absolutas, medidas definidas e medidas de referncia so baseadas em equaes do tipo geral: y=A.x (6)

onde a sensibilidade A geralmente definida como a derivada dy/dx. No caso de modelos lineares, A dado por Dy/Dx1. Para esses trs tipos de medidas analticas, a sensibilidade dada por relaes matemticas bem definidas, a saber: (a) Medidas absolutas: Por grandezas fundamentais, como a constante de Faraday e razes entre as massas atmicas e molares; (b) Medidas definidas: Por grandezas fundamentais combinadas com constantes empricas conhecidas e transferveis (por exemplo, coeficiente de absoro molar, condutividade a uma diluio definida, coeficientes de difuso para um determinado meio), e algumas vezes complementadas por um fator emprico (ttulo, por exemplo); (c) Medidas de referncia direta: Pela relao entre o valor medido e o teor ou concentrao de um material de referncia (R): A = yR / xR (7)

os mtodos podem ser calibrados robustamente, sob condies experimentais fixas. Sob condies operacionais padronizadas, os coeficientes de sensibilidade experimentais (fatores de sensibilidade) so transferveis ao longo do tempo e entre laboratrios. Por causa desta transferibilidade, tais mtodos s vezes so denominados de mtodos isento de padro e. Mtodos deste tipo tm sido desenvolvidos, por exemplo, em espectrografia de emisso10, em espectroscopia de massas com fonte de centelha11, e em espectroscopia de fluorescncia de raios-X 12, para anlise multielementar semiquantitativa. Deve-se distinguir os mtodos isento de padro dos mtodos sem calibrao. Estes ltimos usam medidas absolutas, como j foi mencionado9. CALIBRAO POR MNIMOS QUADRADOS Modelo linear de calibrao Admitindo-se que os erros nas medidas tm mdia zero e no so correlacionados, uma funo linear (Eq. 8) pode ser ajustada aos valores experimentais usando-se a estimativa por mnimos quadrados (MQ), tambm chamada de estimativa por mnimos quadrados ordinrios (MQO). 2. Com as relaes fundamentais Modelo : yi = B + A xi + e yi = E ( yi ) + e yi (10a)

Estimativa: yi = B + Axi Resduo: d yi = yi - yi = yi - B - Axi

(10b) (10c)

Medidas absolutas no necessitam de calibrao permanenteb. Medidas definidas ou medidas de referncia direta precisam apenas de uma medida para comparao (como um padro titulomtrico) ou de uma medida de referncia (material de referncia ou amostra fortificada, isto , contendo uma quantidade adicionada conhecidac) Medidas de referncia indiretas se baseiam em funes de calibrao empricas, que so freqentemente descritas por modelos lineares: y = B + Ax + ey (8)

onde E(yi) o valor esperado de yi, o critrio geral dos mnimos quadrados expresso pela soma quadrtica residualf, SQr 13, dada por

SQr = [( yi - yi ) / I i ) 2 = (d yi / I i ) 2
i =1 i =1

(11)g

onde si o desvio padro no ponto i e m o nmero de medidas da calibrao [V. Eq. (20)].
Nota 1: Um critrio correspondente pode ser formulado para a determinao de x a partir de y (admitido sem erro) pela estimativa x = B y + Ay y , mas este modelo geralmente no relevante para a calibrao analtica.

onde a interseo B corresponde ao branco experimental e o coeficiente angular A corresponde sensibilidade experimental. Os parmetros A e B normalmente so estimados usando regresso linear com ajuste por mnimos quadradosd. O termo ey representa o erro nas medidas de y. Na prtica analtica, alguns mtodos que em princpio usam medidas definidas (como espectrofotometria ou polarografia) tambm so calibrados por mnimos quadrados, para que sejam obtidas estimativas confiveis de A. Funes de calibrao correspondendo Eq. (8) geralmente no so transferveis ao longo do tempo, nem de um laboratrio para outro. Entretanto, no caso de relaes sem branco ou corrigidas em relao ao branco, dadas por

A SQr deve ser minimizada de acordo com a Equao (12):

(d yi /I i ) 2 = min
i =1

(12)

! O smbolo = significa que a expresso no lado esquerdo tem de assumir seu valor mnimo. Dependendo do comportamento dos erros, o critrio dos mnimos quadrados deve ser modificado, como est especificado a seguir.

Exceto pelo fato de que ambas as constantes de sensibilidade A e as condies em que elas so vlidas (por exemplo, as condies em que uma reao se processa quantitativamente) so algumas vezes determinadas terica ou experimentalmente (N. A.) c Spiked (N.T.). d Mtodos grficos ainda so s vezes aplicados. Ultimamente tem-se usado redes neurais para ajustar modelos de calibrao, particularmente para relaes no lineares (N.A.). e Standard-free (N.T.). f No documento original da IUPAC usa-se sum of squares of deviations. Preferimos a traduo soma quadrtica residual, porque se trata de desvios dos valores observados em relao aos valores dados pelo modelo (N.T.). g A soma quadrtica vem da funo de verossimilhana, L = (2p)-1 s1-1 s2-1 ... sn-1 exp(-1/2 SQr), que o produto das probabilidades de que os valores ^ medidos yi correspondam s estimativas yi. Quando L mximo, SQr torna-se mnimo (N.A.).

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Recomendaes para Calibrao em Qumica Analtica

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(1) Os erros esto somente (ou principalmente) nos valores medidos para a varivel dependente, y: Asx << sy (13)

Alm disto, os erros sy so constantes nos diversos pontos da calibrao (Homoscedasticidade):

2 2 I y1 = I y 2 = ...I 2 = I 2 yn y

(14a)

ou, se expressados pelas estimativas de s,

2 2 s y1 = s y2 = ... = s 2n = s 2 y y = = =

(14b)

De acordo com a Eq. (2), as calibraes experimentais so realizadas principalmente fazendo-se determinaes em uma srie de amostras de calibrao contendo o analito de interesse em quantidades adequadas. Se possvel, os analistas usam materiais cujas concentraes so conhecidas com o mximo de confiana, isto , com alta preciso e exatido. Na prtica analtica, usam-se como amostras de calibrao materiais de referncia certificados, padres contendo um ou vrios componentes, e materiais padro sintticos. As quantidades ou concentraes das amostras de calibrao so tomadas como verdadeiras e isentas de erro, ou ento admite-se que, de acordo com a Eq. (13), os erros aleatrios de x so desprezveis em relao aos de y. Nessas condies, deve-se usar a funo de calibrao: y = B x + Ax x + e y (18)

onde a significa igualdade para um dado risco estatstico de erro, a. = Somente se houver homoscedasticidade, e se os erros em x puderem ser desprezados de acordo com a Eq. 13, que o critrio dos mnimos quadrados se reduz a:

Se houver homoscedasticidade, os parmetros Bx e Ax so estimados pelo algoritmo gaussiano (normal) dos mnimos quadrados14, 15:

i =1

yi

= min

(15)

Ax = Qxy / Qxx Bx = ( y - Ax x) / m

(19) (20)

e o critrio clssico dos mnimos quadrados gaussianos, normais ou ordinrios (MQ, MQN ou MQO) pode ser aplicado. (2) Quando os erros sy nas medidas variam (isto , as Eqs. 14 no so vlidas), a heteroscedasticidade tem de ser admitida e o critrio de mnimos quadrados da Eq. (12) se transforma em:

onde m o nmero total de experimentos da calibrao (ndice j) usados para construir a funo de calibrao, com os seguintes somatrios:
Q xx = ( x j - x ) 2 = x 2 - ( x j ) 2 / m j

(d yi /I yi ) 2 = min
i =1

(16)

(21a) (21b) (21c)

Deste critrio resulta o modelo de mnimos quadrados ponderados (MQP), como se mostrar mais adiante. (3) No caso mais geral, se ambas as variveis esto sujeitas a erros, e portanto a Eq.(13) no obedecida, tem-se
2 I i2 = I 2 + A 2I xi yi

Q yy = ( y j - y ) 2 = y 2 - ( y j ) 2 / m j Qxy = ( x j - x ) ( y j - y ) = ( x j y j ) - ( m x y )
O coeficiente de correlao,

(17)

rxy = Qxy / Qxx Qxy

(22)

Neste caso, em que h erro no valor medido e na quantidade ou 2 concentrao do analito, deve-se minimizar a soma dos termos d x + y (Figura 3), e fazer o ajuste por mnimos quadrados ortogonais. Os diferentes modelos de mnimos quadrados que podem ser calculados so mostrados esquematicamente na Figura 3.

que uma medida da relao entre duas variveis aleatrias, no tem nenhum significado na calibrao feita nas condies mencionadas, porque os valores de x em um experimento de calibrao no so grandezas aleatrias.
Nota 2: O coeficiente de correlao HNO faz sentido para a relao entre variveis aleatrias, mas no deve ser usado na calibrao.

Para avaliao das medidas analticas, normalmente se aplica a funo inversa da funo de calibrao [Eq. (18)], dada por:

x = ( y - Bx ) / Ax

(23)

desde que as condies (1) e (2) mencionadas acima sejam satisfeitas.

Nota 3: Na realidade, a relao entre os valores medidos, y, e a quantidade ou concentrao do analito, x, deve ser caracterizada por um modelo de calibrao tridimensional2: y = f (xverdad , xestim) (i)

Figura 3. Diferentes ajustes por mnimos quadrados. B y , Bx , Ay e Ax so as estimativas de B y , Bx , Ay e Ax

A escolha do modelo a ser usado na calibrao analtica depende da concordncia com as condies mencionadas acima e do procedimento de calibrao.

onde xverdad a concentrao do material de referncia (certificado) usado na calibrao, que considerada como ver^ dadeira (sem erro). J a varivel xestim = x uma varivel aleatria, afetada por erros. No se pode determinar, a priori, se a condio da Eq.(13) satisfeita ou no por xestim.

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Barros Neto et al. Do modelo tridimensional (i) resultam as trs relaes bidimensionais seguintes: a funo de calibrao: y = fC (xverdad) + ey (por exemplo, de acordo com a Eq. 18); a funo de avaliao analtica, xestim = fA(y) + ex (por exemplo, de acordo com a Eq. 23); e a funo de validao (funo de tendncia h, funo de recuperao): xestim = fV (xverdad) + ex (iv) (iii) (ii)

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Estimativa do desvio padro da estimativa de uma mdia y e na posio xi

s ye = s y , x

2 1 ( xi - x ) + m Q xx

(27)

Estimativa do desvio padro de um valor previsto y p na posio xi

s y = s y,x 1 +
p

2 1 ( xi - x ) + m Q xx

(28)

Estimativa do desvio padro de uma mdia y p prevista a partir de n repeties na posio xi

s y = s y, x
p

2 1 1 ( xi - x ) + + n m Q xx

(29)

Estimativa do desvio padro de uma mdia x p prevista a partir de n repeties na posio xi

que caracteriza a exatido dos resultados analticos. Somente para as funes de validao em que xestim = xverdad, a relao tridimensional (i) torna-se bidimensional e a calibrao comum, por mnimos quadrados, se justifica.

s x = s y,x / A
p

1 1 ( yi - y ) 2 + + n m A 2 Q xx

(30)

Erros na calibrao linear e sua estimativa por mnimos quadrados ordinrios Fundamentalmente, as incertezas dos valores de y estimados pela calibrao, de acordo com a Eq.(18), por exemplo, e dos resultados analticos (quantidades ou concentraes dos analitos) estimados atravs dos modelos de calibrao, por exemplo de acordo com a Eq.(23), diferem entre si. A incerteza nos valores de y na calibrao caracterizada pelo intervalo de confiana, cnf (y) = Dyc, enquanto a incerteza nos valores estimados de x caracterizada pelo intervalo de previso, prv(x) = Dyp. O intervalo de previso de um valor medido de y, prv(y) = Dyy, tambm tem o seu papel na definio do valor crtico (limite de deciso), do limite de deteco, e do limite de quantificao1, 16-19. A preciso na calibrao caracterizada pelos seguintes erros especiais: Desvio padro residual
sy, x =

A regio de confiana, RC, da reta de calibrao, mostrada na Figura 4, dada por

RC = y s ye

2 F= ; gl1=2; gl 2=m-2

(31)

( y

- y j )2 = m-2
j

( y j - Bx - Ax x j ) 2 m-2

(24)

Note que o nmero de graus de liberdade gl = m 2, neste modelo com dois parmetros, dado pela Eq.(8). Para uma calibrao linear passando pela origem, dada pela Eq.(9), gl = m 1. Estimativa do desvio padro para a estimativa da interseo (branco) B

Figura 4. Reta de calibrao com as bandas relevantes de confiana e de previso: ysp o limite superior de previso, ysc o limite superior de confiana, yip o limite inferior de previso e yic o limite superior de confiana

Os seguintes intervalos, que resultam das Eqs. (24) a (30), so de interesse prtico: Intervalo de confiana da interseo (branco) B

sB = s y,x

1 x2 + m Q xx

(25)

cnf ( B) = B s B t= , gl =m- 2

(32)

Estimativa do desvio padro da estimativa do coeficiente angular A

s A = s y , x / Q xx

(26)

Intervalos de previso prv(B) de um nico valor de B (Eq.(33)) e de uma mdia B obtida a partir de n repeties (Eq.(34)). Este ltimo importante para a estimativa do limite de deteco a partir de brancos.

Bias. (N. T.)

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Recomendaes para Calibrao em Qumica Analtica

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prv( B) = B s y , x t= , gl = m - 2 1 +

1 x2 + m Q xx

(33)

s y , x ,w =

wi ( y - y) 2 m-2

(43)

prv( B ) = B s y , x t= , gl = m - 2

1 1 x2 + + n m Q xx

(34)

Intervalo de confiana para a estimativa de uma mdia y ic na posio xi

Outras medidas de incerteza podem ser estimadas por analogia com as Eqs (25) a (38). Alguns programas computacionais de anlise de regresso permitem que o usurio fornea uma estimativa da funo sy = f[E(y)], que ento usada para a ponderao. A deciso de usar (ou no) mnimos quadrados ponderados pode ser tomada a partir de testes estatsticos ou de modelos tericos. Ajuste por mnimos quadrados quando h erros em ambas as variveis (MQ ortogonais) Trs retas de calibrao so dadas na Figura 3. Uma o modelo para estimar y a partir de valores de x (praticamente) isentos de erro. Esta relao comumente usada para calibrao por mnimos quadrados ordinrios:

cnf ( y i ) = y ie s y , x t= , gl = m - 2

2 1 ( xi - x ) + m Q xx

(35)

Intervalo de previso de um valor previsto yip , na posio xi

prv( y i ) = y ip s y , x t= , gl =m-2 1 +

1 ( xi - x ) 2 + m Q xx

(36)

Intervalo de previso de uma mdia yip obtida a partir de n repeties na posio xi

y = B x + Ax x

(44)

prv( y i ) = y ip s y , x t= , gl =m-2

1 1 ( xi - x ) 2 + + n m Q xx

(37)

Outra reta um modelo formulado para estimar x a partir de valores de y, sob a condio de que sy << Asx:

Intervalo de previso de uma mdia xip obtida a partir de n repeties, para um valor medido yi

x = B y + Ay y

(45)
Nota 4: Deve-se notar explicitamente que a Eq.(45) no a funo inversa da Eq. (44) e portanto B y - Bx / Ax e Ay 1 / Ax . Nota 5: Em geral, a Eq.(45) no tem relevncia prtica em Qumica Analtica. Ela serve apenas como uma forma de estimar a linha de calibrao ortogonal dada pela Eq. (46).

prv( xi ) = xip (

s y,x A

)t= , gl =m-2

1 1 ( yi - y ) 2 + + 2 n m A Qxx

(38)

Estimativa por mnimos quadrados ponderados (MQP) Nos casos em que a homoscedasticidade descrita pela Eq.(14a) no se verifica, a estimativa do desvio padro s y muitas vezes uma funo do valor medido: sy = f (y) ou, estritamente falando, sy = f[E(y)], o que significa que o desvio padro pode ser uma funo do valor esperado de y. Nesse caso, o sistema de calibrao heteroscedstico e deve-se aplicar o ajuste por mnimos quadrados ponderados20,21. As diferentes varincias nos pontos da calibrao so levadas em conta usando-se ponderao. Na ponderao pela varincia, os pesos so:

A funo de calibrao quando existem erros em ambas as variveis,

y=B +A x

(46)

w yi =

1/ s 2 yi (
i =1 p

(39)

1/ s 2 ) / yi

deve ser determinada por mnimos quadrados ortogonais, onde os erros na varivel independente e na varivel dependente so minimizados simultaneamente. Esta calibrao deve ser aplicada quando tanto os valores medidos y quanto os valores analticos x (concentraes) forem afetados por erros. O modelo dado pela Eq. (46) no pode ser determinado diretamente. preciso determin-lo por aproximaes. Por exemplo, o coeficiente angular A pode ser estimado pela mdia geomtrica (MG) das retas dadas pelas Eq.(44) e (45)13, usando-se:

para p pontos de calibrao (ndice i), e o critrio de minimizao da Eq. (16) torna-se:

A = tan[1 / 2(tan -1 Ax + tan -1 Ay )]

(47)

2 w yi d yi

= min

(40)

onde Ax dado pela Eq.(19) e Ay = Q xy / Q yy . A estimativa de B obtida a partir da Eq. (46) por analogia com a Eq. (20). Outro procedimento para estimar A foi proposto por Wald22:

Os coeficientes da calibrao so calculados por analogia com as Eqs (19) e (20), introduzindo-se os pesos wi = wyi:

Ax,w =

m wi xi yi - wi xi wi y i m wi xi - ( wi xi ) 2
2

A=
(41)

yi - y j
i =1 g

xi - x j
i =1 j =h

j =h m

(48)

B x ,w = ( wi y i - Ax ,w wi xi ) / m A estimativa do desvio padro residual

(42)

onde m o nmero de medidas de calibrao, g = m/2 = h 1 quando m par, e g = (m + 1)/2 = h quando m mpar. Deve-se mencionar tambm que a primeira componente principal, p1 , obtida em uma anlise de componentes principais (ACP)23-25 uma boa aproximao da linha de calibrao ortogonal.

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A ref. 28 apresenta uma comparao de vrios modelos aproximados para a calibrao ortogonal. Outros estudos tambm tratam do mesmo problema 29-31. TESTES ESTATSTICOS Para se aplicar o modelo de calibrao adequado, importante testar se as condies dadas na seo Modelo linear de calibrao so satisfeitas. Inicialmente, pode-se usar um programa computacional para examinar visualmente os erros residuais de um dado modelo de calibrao, obtendo-se assim uma informao preliminar sobre as caractersticas destes erros. Grficos tpicos, como os mostrados na Figura 5, tambm indicam quais os testes que devem ser realizados, tais como os de aleatoriedade, de normalidade, de linearidade, de homoscedasticidade, etc. Linearidade Pode-se avaliar se o modelo linear adequado examinando-se a distribuio dos resduos ao longo dos valores de x. Na Figura 5a os erros distribuem-se aleatoriamente em torno da linha zero, indicando que o modelo linear adequado. Na Figura 5b pode-se notar que os erros apresentam desvios sistemticos e, mesmo no caso dado onde os desvios alternam de maneira real, isto uma indicao de que o modelo linear inadequado e que deve-se escolher um modelo no-linear. A hiptese de linearidade pode ser testada de duas maneiras. (a) a priori (sem levar em considerao nenhum modelo no-linear), comparando-se o desvio padro residual, sy,x, obtido a partir da Eq. 24 com o desvio padro dos valores yij em relao a suas mdias i, y que dado por sy:
2 s y,x

c dy

x
Figura 5. Grficos tpicos dos desvios residuais

F=

s2 y

mi ( yi - yi )
i =1 p mi

/( p - 2)
(49)

( yij - yi ) 2 /(m - p)
i =1 j = h

(mi o nmero de medidas repetidas nos p pontos de calibrao;

mi = m ; normalmente m1 = m2 =...= mp, e p.mi = m). O teste feito

i =1

Homoscedasticidade Pode-se verificar se a varincia no constante atravs de grficos de resduos como o da Figura 5c. Nestes grficos, dy freqentemente uma funo de x com aparncia afunilada, como aparece na figura 5c. Nesses casos, a homoscedasticidade pode ser avaliada de maneira simples com o teste de Hartley33 (para valores de mi iguais nos p pontos de calibrao):
2 2 F = smax / smin

comparando-se o quociente da Eq. (49) com Fa,gl1=p2,gl2=mp. (b) a posteriori (em relao a um dado modelo no-linear), comparando-se o desvio padro residual do modelo linear com o desvio padro residual do modelo no linear:

(52)

F=

s 2, x,lin y s 2, x,nlin y

( yi - yi ) 2 /(m - 2)
i =1 m

Em situaes mais obscuras que a representada na Figura 5c, preciso aplicar o teste de Bartlett para homogeneidade de varincias34:

(50)
2

? 2 = 2,303 / c( gl log s 2 - gli log si2 )

i =1

(53)

( y i - yi )
i =1

/gl nlin

O nmero de graus de liberdade para os modelos lineares gllin = m 2 se forem estimados dois parmetros (Eq. (8)), ou m 1 se for estimado apenas um (Eq. (9)). No caso no-linear, o nmero de graus de liberdade depende do modelo escolhido. Por exemplo, para uma equao quadrtica y = a + bx + cx2, glnlin = m 3. De acordo com Mandel32, pode-se fazer um teste apropriado para a Eq. (50) comparando-se
2 2 s y , x ,lin - s y , x ,nlin

onde gl = m - p = gli o nmero total de graus de liberdade (mais uma vez, p o nmero de pontos de calibrao, em cada um dos quais so realizadas mi medidas repetidas), s 2 = ( gli si2 gl ) a varincia ponderada, si2 a varincia do i-simo grupo de pontos, com gli graus de liberdade, e c uma constante de correo calculada a partir de c = { (1 / gli - 1 / gl )[3(m - 1)] + 1} quando o nmero de graus de liberdade pequeno. 2 ? 2 deve ser comparado com o valor crtico da distribuio ?= ;gl 2 2 ? = ; gl , a hiptese nula s1 = s2 =...= sp deve ser rejeitada. e se ? Teste dos parmetros de calibrao Em alguns casos, pode ser til comparar os valores dos parmetros A e B obtidos experimentalmente com valores a e b teoricamente esperados. A comparao realizada com um teste t de Student:

F=

s 2, x ,nlin y
^

(51)

com Fa,gl1=1,gl2-fnlin. Se F Fa;gl1;gl2, o modelo linear no pode ser aplicado.

t = A -= / sA

(54)

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Recomendaes para Calibrao em Qumica Analtica

863

t = B - > / sB

(55)

Em relao validao, as hipteses nulas a = 1 e b = 0 so as de maior interesse. Se t t= ; gl , a hiptese nula correspondente deve ser rejeitada. VALIDAO DA CALIBRAO Como regra geral, a exatido dos resultados analticos garantida por experimentos de validao. A validao de um procedimento de calibrao baseada na funo de validao (funo de recuperao) xestim = f (xverdad) (veja Eq.(iv), da nota 3). Para se avaliar a exatido dos resultados analticos, duas maneiras prticas so usadas: Anlise de material de referncia certificado (MRC) com teores verdadeiros. A funo de validao estimada por regresso MQ normal: E(xestim) = b + axverdad (56)

medianas. Todos os coeficientes angulares entre dois pontos de y j - yi , para calibrao quaisquer so calculados atravs de Aij = x j - xi

( (

) )

j > i. Os valores Aij so colocados em ordem crescente, e sua mediana tomada como estimativa do coeficiente angular mdio:

A = med{ Aij }
A estimativa da interseo dada por

(58)

B = med{ y i - A xi }

(59)

A forma de se calcular as estimativas das varincias e dos intervalos de confiana na calibrao robusta pode ser encontrada na literatura35,36.
Nota 6: Na maioria dos casos, a calibrao robusta se torna necessria por causa da presena de pontos de calibrao anmalos (pontos influentes). aconselhvel, por isso, verificar se a relao pode ser considerada linear e se os resduos podem ser considerados aleatrios.

onde a e b so os coeficientes de validao, significando, analiticamente, uma tendncia i constante (b) e uma tendncia proporcional (a). As estimativas de a e de b podem ser obtidas das Eqs (19) e (20). A ausncia de tendncias nos resultados analticos pode ser verificada usando-se as Eqs (54) e (55) para testar as hipteses nulas a = 1 e b = 0. Desvios sistemticos tambm so detectados se os intervalos de confiana dos coeficientes de validao no contiverem os valores 0 (para b) ou 1 (para a). Isto : (i) uma tendncia aditiva se b + Db < 0 ou b - Db > 0 ( b > Db )

A relao entre os modelos de calibrao mais importantes e as condies em que eles devem ser aplicados est representada no esquema da Figura 6. Como j foi ressaltado acima, o ajuste por mnimos quadrados ordinrios s deve ser aplicado quando os valores medidos forem independentes, distribudos normalmente, isentos de anomalias ou pontos influentes, e caracterizados por erros homoscedsticos. Alm disto, os valores da grandeza analtica (concentrao) devem ser praticamente isentos de erros.

(ii) uma tendncia proporcional se a + Da < 1 ou a - Da > 1 ( a > Da ) Anlise por dois mtodos independentes de uma determinada srie de amostras de teste com concentraes que variam gradualmente. A exatido deve ser verificada para o mtodo I, enquanto o mtodo II tido como exato. A funo de recuperao apropriada : xI,estim = b + axII,verdad (57)

Como neste procedimento tanto xI,estim quanto xII,verdad esto sujeitos a erros, deve-se usar um ajuste por mnimos quadrados ortogonais (Eqs (47) e (48)), uma anlise de componentes principais ou um ajuste robusto. Os testes de desvios significativos das hipteses a = 1 e b = 0 so feitos como indicado acima. CALIBRAO ROBUSTA Se as condies bsicas para o uso do ajuste por mnimos quadrados no forem satisfeitas, ou se surgirem pontos de calibrao com desvios muito grandes (pontos anmalos ou, de forma mais exata, pontos influentes j), o mtodo dos mnimos quadrados ordinrios falha, isto , os parmetros estimados so tendenciosos e portanto no representativos da relao entre x e y. A normalidade dos valores medidos freqentemente pode ser obtida por meio de uma transformao adequada, mas quando existirem pontos de calibrao anmalos35 deve-se fazer uma calibrao robusta. No caso mais simples, estimativas robustas dos parmetros podem ser baseadas em

Figura 6. Relao entre diferentes modelos de calibrao e as condies estatsticas e qumicas que os dados devem satisfazer

i j

bias (N.T.) No original, outliers e leverage points, respectivamente. Alguns autores preferem traduzir outliers como valores discrepantes ou valores suspeitos (N.T.).

864

Barros Neto et al.

Quim. Nova

Do ponto de vista qumico, em casos onde aparecerem efeitos de matriz e no se dispuser de um material de referncia certificado apropriado, a calibrao pode ser realizada na prpria matriz da amostra por adies de padro. CALIBRAO POR ADIES DE PADRO Quando existirem (ou forem esperados) efeitos de matriz e no se dispuser de amostras de calibrao com uma matriz semelhantek, o mtodo de adies de padro (MAP) pode ser o mais indicado. MAP utilizado com freqncia em sistemas ambientais e bioqumicos e na anlise de ultratraos em geral. Adicionando-se solues-padro amostra, produz-se na srie de calibrao um comportamento semelhante ao da amostra, desde que o analito no padro adicionado esteja na mesma forma da amostra. O modelo de adies de padro baseado no pr-requisito de que o branco no apresenta valor estatisticamente diferente de zero ou que esse valor pode ser eliminado, Eq.(9). Se x0 a concentrao inicial do analito na amostra que est sendo investigada, ento: y0 = Axx0 (60)

x0 =

x p y0 y0 = Ax y p - y 0

(62)

com o intervalo de confiana:

cnf ( x 0 ) = x0 s y , x t= ; gl =m-2 / Ax

2 1 ( - x 0 - x p / 2) + m Q xx

(63)

onde y0 o valor medido para a amostra sem adio de padro. Quantidades conhecidas, xi, do analito so adicionadas amostra, de preferncia em teores equimolares de xi, na faixa de x1 x0, x2 = 2x1, ..., xp = px1 (normalmente com p = 3 ou 4). Para isto, alguma idia da concentrao inicial x0 necessria.

que mais largo que o intervalo da calibrao normal (Eq.35, dividida por Ax), por causa da extrapolao at xi = x0. O nmero de mep didas de calibrao, m , dado por m0 + pmi ou m0 + S mi, sendo m0 o nmero de medies de y0. Quando o branco apresentar um valor diferente de zero, deve-se estim-lo a partir de um nmero suficientemente alto de medidas de branco, e ento corrigir os valores medidos em relao a ele. Para garantir um modelo de calibrao adequado por adies de padro, deve-se realizar p 2 adies de padro. Uma nica adio (repetida mi vezes) s pode ser feita quando se tiver certeza de que o modelo linear adequado. Em geral, a linearidade pode ser testada com as Eqs (49) (51). Se a linearidade na faixa x < x0 tiver sido apenas admitida, e no verificada experimentalmente, a calibrao por adies de padro torna-se um mtodo pouco confivel. No entanto, praticamente no existe alternativa, quando se suspeita da presena de efeitos de matriz. SUMRIO Os fundamentos da calibrao em Qumica Analtica so apresentados. Os dados de calibrao podem apresentar diferentes caractersticas estatsticas, de acordo com o mtodo analtico. Dependendo da normalidade dos dados, da varivel independente (a concentrao dos padres de calibrao) ser isenta de erro e da condio de homoscedasticidade, a calibrao pode ser realizada pelo mtodo dos mnimos quadrados simples, normais ou ordinrios (MQ, MQN ou MQO), pelos mnimos quadrados ponderados (MQP), pelos mnimos quadrados ortogonais (tratamento dos erros em ambas as variveis) ou por calibrao robusta, como mostra o fluxograma da Figura 6. Na maioria dos casos prticos, pode-se usar a calibrao por mnimos quadrados ordinrios. Quando dois mtodos so comparados para fins de validao, os erros em ambas as variveis devem ser considerados e, portanto, deve-se aplicar o ajuste por mnimos quadrados ortogonais.

Figura 7. Calibrao por adies de padro

AGRADECIMENTOS Os tradutores agradecem a E. A. G. Zagatto por crticas e sugestes e ao CNPq pela bolsa de Produtividade em Pesquisa. REFERNCIAS (61)
1. Currie, L.A.; IUPAC Commission on Analytical Nomenclature; Pure Appl. Chem. 1995, 67, 1699. 2. Danzer, K.; Fresenius J. Anal. Chem. 1995, 351, 30. 3. Moseley, H.; Phil. Mag. 1913, 26, 1024. 4. Kovats, E.; Helv. Chim. Acta 1958, 41, 1915; Anal. Chem. 1964, 36, 31A. 5. Colthup, N.B.; Daly, L.H.; Wiberly, S.E.; Introduction to Infrared and Raman Spectroscopy, Academic Press: New York, London, 1975. 6. De Gregorio, P.; Savastano, G.; Spektrum des Eisens von 2206 bis 4656 mit Analysenlinien, Specola Vaticana, 1972; Peter, H.; Scheller H.; Atlas fr Gitterspekrographen 2250 bis 6500 , Carl Zeiss: Jena, 1982.

A funo de calibrao por adio de padro (AP) estimada por mnimos quadrados. O coeficiente angular dado por:

Ax

(y p - y0 ) =
xp

Este procedimento s se justifica se a sensibilidade da determinao das espcies na amostra for igual das espcies adicionadas:

Ax =

y p - y0 Dy y 0 , onde p o nmero de amostras com = = Dx x 0 xp

adies de padro. A soluo para x dada pela funo analtica AP, cuja extrapolao para y = 0 fornece:

Matrix-matched (N.T.)

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Recomendaes para Calibrao em Qumica Analtica

865

7. Harrison, G.R.; M.I.T. Wave-Length Tables of 100.000 Spectrum Lines, New York, 1939; Meggers, W.E.; Corliss, C.H.; Scribner, B.F.; Tables of Spectraline-Intensities, Nat. Bur. Standards Monograph, 1961, p. 32. 8. IUPAC, Orange Book, Compendium of Analytical Nomenclature; Freiser, H.; Nancollas, G.H., eds., 2nd ed., Blackwell Scientific Pub.: Oxford, 1987. 9. Hulanicki, A.; IUPAC Commission on General Aspects of Analytical Chemistry, Pure Appl. Chem. 1995, 67,1905. 10. Harvey, C.E.; A Method of Semi-Quantitative Spectrographic Analysis, Glendale, A.R.L., California, 1947. 11. Ramendik, G.I.; Fresenius J. Anal. Chem. 1990, 337, 772. 12. Sherman, J.; Spectrochim. Acta 1955, 7, 283; Fei He, Van Espen, P.J.; Anal. Chem. 1991, 63, 2237. 13. Danzer, K.; Fresenius J. Anal. Chem. 1990, 337, 794. 14. Currie, L.A.; Svehla, G.; IUPAC Commission on Analytical Nomenclature; Pure Appl. Chem. 1994, 66, 595. 15. Harter, H.L.; Int. Statist. Rev. 1974, 42, 147; ibid, 1975, 43, 269. 16. Currie. L.A.; Anal. Chem. 1968, 40, 596 17. Kaiser. H.; Fresenius J. Anal. Chem. 1965, 209, 10; ibid, 1966, 216, 80. 18. Currie, L.A., ed.; Detection in Analytical Chemistry: Importance, Theory, and Practice, ACS Symp. Ser. 361, Washington, 1988, ch. 1. 19. Currie, L.A.; Horwitz, W.; Analusis 1994, 22, 24M. 20. Garden, J.S.; Mitchell, D.G.; Mills, W.N.; Anal. Chem. 1980, 52, 2310. 21. Draper, N.R.; Smith, H.; Applied Regression Analysis, 2nd ed., Wiley: New York, 1981.

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