1.- INTRODUCCIN AL CICLO DEL NITRGENO El nitrgeno es un gas que forma el 78 % del aire atmosfrico.

El nitrgeno atmosfrico no puede ser utilizado en forma normal por los seres vivos, sino que tiene que ser transformado en compuestos absorbibles por las plantas.

El ciclo del nitrgeno es un conjunto de procesos biogeoqumicos por los cuales el nitrgeno pasa por reacciones qumicas, cambia de forma y se mueve por diferentes embalses en la Tierra, incluyendo los seres vivos. El ciclo del nitrgeno, al igual que los dems ciclo biogeoqumicos, tiene una trayectoria definida pero quizs an ms complicada que el resto de los ciclos, dado que tiene que seguir una serie de procesos fsicos, qumicos y biolgicos. As, el nitrgeno est considerado como el elemento ms abundante en la atmsfera. Sin embargo, dada su estabilidad, es muy difcil que reaccione con otros elementos y, por tanto, se tiene un bajo aprovechamiento de l, razn por la cual su abundancia pasa a un segundo plano. A pesar de esto, gracias al proceso biolgico de algunas bacterias y cianobacterias, el nitrgeno que se encuentra en la atmsfera puede ser asimilable al romper la unin de sus enlaces por mtodos enzimticos, y as poder producir compuestos nitrogenados, que pueden ser aprovechados por la mayora de los seres vivos, en especial las plantas, que forman relaciones simbiticas con este tipo de bacterias. Ese nitrgeno fijado se transforma en aminocidos y protenas vegetales, que son aprovechadas a su vez por los herbvoros, quienes los van almacenando para finalmente pasarlos al ltimo eslabn de la cadena alimenticia, es decir, a los carnvoros.

Cabe mencionar que el nitrgeno regresa de nuevo al ciclo por medio de los desechos,en forma de amoniaco (algunos peces y organismos acuticos), o en forma de urea (el hombre y otros mamferos) o en forma de cido rico (aves y otros animales de zonas secas) que gracias a que las bacterias fijadoras los retoman, pueden finalmente ser asimilados por las plantas, cosa que de otra manera sera imposible. Sin embargo, hay prdida de nitrgeno por medio de otras bacterias que lo liberan a la atmsfera. De esta forma, se logra un equilibrio en el ciclo del nitrgeno. Se necesita de una gran cantidad de energa para desdoblarlo y combinarlo con otros elementos como el carbono y el oxgeno. Esta ruptura puede hacerse por dos mecanismos: descargas elctricas y fijacin fotoqumica, que proveen suficiente energa como para formar nitratos. 1.1 FASES DEL CICLO El ciclo del nitrgeno tiene 5 etapas, de las cuales solo la asimilacin no es realizada por bacterias. y FIJACIN. La fijacin biolgica del nitrgeno consiste en la incorporacin del nitrgeno atmosfrico a las plantas, gracias a algunos microorganismos, principalmente bacterias y cianobacterias, que se encuentran presentes en el suelo y en ambientes acuticos. Esta fijacin se da por medio de la conversin de nitrgeno gaseoso en amoniaco o nitratos. Estos microorganismos usan la enzima nitrogenasa para su descomposicin. Sin embargo, como la nitrogenasa solo funciona en ausencia de oxgeno, las bacterias deben de alguna forma aislar la enzima de su contacto. y NITRIFICACIN. Solamente existen dos formas de nitrgeno que son asimilables por las plantas: el nitrato y el amonio. El amonio es convertido en nitrato gracias a la accin de los microorganismos por medio de la nitrificacin. La modificacin de amonio a nitrato depende de la temperatura del suelo. Este proceso se ve completado entre 2-4 semanas. Esta fase es realizada en dos pasos por diferentes bacterias: y Nitrosacin. Las bacterias del suelo, Nitrosomonas y Nitrococcus convierten el amonio en nitritos. y Nitratacin. Otra bacteria del suelo, Nitrobacter, oxida el nitrito, convirtindolo en nitrato. Gracias a la nitrificacin las bacterias obtienen energa.

y ASIMILACIN. La asimilacin ocurre cuando las plantas absorben a travs de sus races nitrato o amoniaco, formados en la nitrificacin. Estas molculas son incorporadas tanto a las protenas como a los cidos nucleicos de las plantas. Cuando los animales consumen los tejidos vegetales, tambin asimilan nitrgeno y lo convierten en compuestos animales. y AMONIFICACIN. Cuando los organismos producen desechos que contienen nitrgeno, como la orina, los desechos de las aves, as como los organismos muertos en estado de putrefaccin, son descompuestos por bacterias presentes en el suelo y en el agua, liberando nitrgeno al medio bajo la forma de amonio. En este nuevo proceso de integracin del nitrgeno al ciclo, las bacterias fijadoras llevan a cabo la digestin enzimtica, por lo que el amonio se degrada a compuestos aminados dando lugar finalmente a aminocidos. Es por esta razn que el proceso se llama aminificacin o aminizacin. y DESNITRIFICACIN. La reduccin de los nitratos a nitrgeno gaseoso y amonio o amoniaco se llama desnitrificacin, y es llevado a cabo por las bacterias desnitrificantes, como las del gnero Pseudomonas, que revierten la accin de las fijadoras de nitrgeno, regresando el nitrgeno a la atmsfera en forma gaseosa, en forma no asimilable. Este proceso ocasiona una prdida de nitrgeno para el ecosistema. Ocurre donde existe un exceso de materia orgnica, y las condiciones son anaerobias, adems de que hay poca disponibilidad de agua y un alto pH, unido a la presencia de los fertilizantes del suelo. El fenmeno de la desnitrificacin se debe a que en condiciones de mucha humedad en el suelo, la falta de oxgeno obliga a ciertos microorganismos a emplear nitratos en vez de oxgeno en su respiracin. Conclusin: El nitrgeno es un elemento increblemente verstil que existe en forma inorgnica y orgnica, en muchos y diferentes estados de oxidacin. El movimiento del nitrgeno entre la atmosfera, la biosfera y la geosfera en sus diferentes formas, est descrito en el ciclo del nitrgeno, por ello este es uno de los ciclos biogeoqumicos ms importantes.

2.- MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRGENO 2.1 Generalidades

La fijacin biolgica es un proceso exclusivamente procariota: aparece nicamente en bacterias, algas cianofceas y actinomicetos, pues son los nicos que tienen la capacidad de utilizar el nitrgeno atmosfrico. Entre los ms de 60 gneros conocidos se encuentran formas aerobias facultativas, anaerobias, auttrofas y hetertrofas, con hbitats muy diversos y con requerimientos ambientales de temperatura, humedad, pH, etc. muy heterogneos. Los organismos responsables de la fijacin de nitrgeno contienen la enzima NITROGENASA y se llaman DIAZOTROFOS y en ellos se incluyen bacterias organotrficas, bacterias sulfurosas fototrficas y cianobacterias.

2.2 MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRGENO.

Existen microorganismos capaces de fijar nitrgeno atmosfrico en la mayora de los hbitats: en el suelo, en el mar, en las masas de agua dulce e incluso en las fuentes termales. Sin embargo, la cantidad de nitrgeno fijado por los microorganismos libres es muy inferior a la obtenida por las simbiosis entre plantas y microorganismos. As, se puede decir que las bacterias del suelo fijadoras de nitrgeno de forma libre contribuyen de forma muy limitada a su fertilizacin, ya que por ejemplo Azotobacter o Clostridium slo son capaces de fijar 1 kg. de nitrgeno por hectrea y ao. Esta menor efectividad se debe al consumo de poder reductor que hay que emplear en la proteccin respiratoria (en microorganismos aerobios) y a la baja eficiencia energtica del metabolismo anaerobio. Mayor rendimiento podemos encontrar en cianobacterias libres, que pueden alcanzar hasta 80 kg. por hectrea y ao. Son precisamente estas cianobacterias las responsables de la incorporacin del nitrgeno en zonas rticas y subrticas, as como en zonas volcnicas. Las cianobacterias fijan el nitrgeno en unas clulas especiales denominadas heterocistes, las cuales pasan luego el nitrgeno fijado a las dems clulas, mientras que reciben de estas los fotoasimilados. En estas clulas la nitrogenasa se halla protegida del oxgeno.

Entre los microrganismos fijadores de nitrgeno de vida libre encontramos: y Microorganismos libres aerobios:  Azotobacter, Beijerinckia, etc. (quimiorganotrofos).  Algunas Cianobacterias (quimiolitotrofos).  Thiobacillus (fottrofo). y Microorganismos libres anaerobios:  Clostridium, Desulfovibrio, etc. (quimiorganotrofos).  Methanobacterium (quimiolitotrofo).  Heliobacterium (fottrofo). En cuanto a la fijacin del nitrgeno a travs de relaciones simbiticas distinguimos la simbiosis con plantas no leguminosas y por otro lado la simbiosis con leguminosas. Entre los microorganismos fijadores simbiontes distinguimos: y Con no leguminosas:  Frankia (alnus), Anabaena (helecho azolla) entre otras y algunas cianobacterias. y Con leguminosas:  Rhizobium (guisante), Bradyrhizobium (soja), etc.

Simbiosis con no leguminosas:

Frankia es un gnero de Streptomicetaceas que fijan nitrgeno en simbiosis con las plantas actinorrizas. La capacidad colonizadora de las plantas actinorrizas, sobre todo en suelos pobres en nitrgeno o en condiciones de estrs ambiental (deforestaciones, incendios, volcanes, retrotraimientos de glaciares, etc. las hacen idneas para la reforestacin de los suelos. En esta simbiosis, los ndulos estn formados por agrupaciones de races cortas laterales que conforman una estructura lobular, con elementos vasculares centrales rodeados de clulas corticales infectadas de bacterias, que pasan el nitrgeno fijado a la planta en forma de amonio. Estos ndulos son mucho ms simples que los de las leguminosas. Las bacterias del gnero Frankia protegen a la nitrogenasa del oxgeno en el interior de unas vesculas esfricas multicelulares rodeadas de una cpsula, con lo que consiguen resistir hasta una concentracin de oxgeno del 80%. Las cianobacterias pueden fijar nitrgeno de manera libre o bien forman simbiosis con diversos tipos de plantas, desde hongos hasta angiospermas. La simbiosis entre una cianofcea y un hongo es un liquen, incorporando 15 kg de nitrgeno por hectrea y ao por lquenes del gnero Lobaria. Las simbiosis de cianobacterias del gnero Nostoc con algunas hepticas (Brifitos) muestran una cierta dependencia del fotoasimilado suministrado por la planta. Entre las simbiosis con Pteridfitos, la ms importantes es la que se da entre el helecho acutico Azolla y Anabaena; que llega a fijar mas de 600 kg. de nitrgeno por hectrea y ao, siendo muy aprovechada en agricultura en los campos de arroz.

Simbiosis con leguminosas:

Una de las relaciones simbiticas ms importantes se da entre las leguminosas y las bacterias fijadoras de N2. Esta gran familia incluye especies de gran importancia en la industria agroalimentaria como la soja, las judas, las lentejas, los guisante, etc. En consecuencia la capacidad de las leguminosas para crecer sin fertilizacin nitrogenada supone un ahorro de millones de euros al ao en fertilizantes a los granjeros, gracias a esta simbiosis.

Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizibium y Photorhizobium son algunos de los gneros de bacterias que crecen en el suelo o pueden infectar a plantas leguminosas estableciendo esa relacin simbitica, en conjunto este tipo de bacterias reciben el nombre colectivo de rizobios. La infeccin de las races de una leguminosa con estas bacterias conduce a la formacin de ndulos radicales que fijan nitrgeno. Esta fijacin de nitrgeno en los ndulos radicales tiene gran importancia agrcola pues conduce a un aumento del nitrgeno combinado en el suelo. As en los suelos sin fertilizar, normalmente deficitarios de nitrgeno, las leguminosas con ndulos crecen bien donde otras plantas creceran mal. En ausencia de la bacteria adecuada la leguminosa no puede fijar nitrgeno. Por su parte los rizobios tampoco pueden fijar nitrgeno por s solos cuando se cultivan en condiciones microaerfilas. Estos necesitan algo de O2 para generar la energa necesaria para la fijacin del nitrgeno, sin embargo sus nitrogenasas se inactivan con el O2. Para salvar este problema los ndulos controlan la cantidad precisa de O2 mediante la protena de unin al mismo leghemoglobina, la cual se induce por la interaccin del hospedador vegetal y el simbionte bacteriano, acta como un tampn de oxgeno para mantener baja la concentracin del mismo. De manera que en el interior del ndulo la proporcin entre el O2 unido a la leghemoglobina y el O2 libre es del orden 10.000:1. Existe una gran especificidad a la hora de establecer la simbiosis entre las especies de leguminosa y de rizobio, de modo que cada especie de rizobio es capaz de infectar determinadas especies de leguminosas pero no otras. La diferencia entre la fijacin libre y la simbitica es significativa, determina que las leguminosas no requieran demasiada fertilizacin nitrogenada y contribuyan, adems, al enriquecimiento del suelo en este nutriente favoreciendo el cultivo siguiente, que se pone en evidencia en la prctica que se conoce como rotacin de cultivos. El proceso de formacin de los ndulos radicales comprende 6 etapas: 1. Reconocimiento del socio adecuado por ambas partes y adhesin de la bacteria a los pelos radicales.

2. Excrecin de los factores nod por las bacterias causando el rizado del pelo radical. 3. Invasin bacteriana del pelo radical y formacin del tubo de infeccin por el cual se desplazan las bacterias. 4. Desplazamiento de las bacterias hacia la raz principal por el tubo de infeccin. 5. Formacin de clulas bacterianas modificadas, bacteroides, dentro de las clulas de la planta y desarrollo del estado fijador del nitrgeno. 6. Divisin continua de las clulas vegetales y bacterianas para formar el ndulo radical maduro, tumor. En la etapa 1 una vez reconocidos entre si los dos organismos que establecern simbiosis, en la superficie de los rizobios se encuentra una protena especfica de adhesin, la ricadhesina, que favorece la unin de ambos elementos. Tambin destacan las lectinas (glicoprotenas) y receptores especficos de la membrana citoplasmtica de la planta en el establecimiento de la unin. Por otro lado en la etapa 5 los rizobios se multiplican rpidamente en el interior de las clulas de la planta transformndose en bacteroides, definidos como clulas deformes, hinchadas y ramificadas que estn rodeados por porciones de membrana de la clula vegetal constituyendo una estructura denominada simbiosoma, la cual es fundamental para que se inicie la fijacin del nitrgeno, pues sin l el proceso no comienza.

Cuando la planta muere los ndulos se deterioran liberando al suelo las bacterias, de modo que los bacteroides son incapaces de dividirse, pero en el ndulo siempre quedan un determinado nmero de clulas bacterianas latentes del rizobio que en este momento proliferan usando como fuente de nutrientes los productos del ndulo en degradacin. Se ha sugerido que la fijacin y la divisin celular son procesos incompatibles. De hecho, cuando se inicia el proceso de fijacin cesa la divisin celular; el crecimiento del ndulo contina por el agrandamiento de sus clulas. El complejo enzimtico (nitrogenasa) que opera la fijacin de nitrgeno no funciona en presencia de oxgeno, como hemos dicho anteriormente, para que ocurra la fijacin la planta debe producir Leg-hemoglobina (en el interior del ndulo), molcula que absorbe el oxgeno presente para prevenir que interfiera con el proceso de fijacin. Como la Leg-hemoglobina es roja, el interior de un ndulo en fijacin activa tiene color rosado.

Los beneficios de las asociaciones simbiticas son: y Los cultivos agrcolas necesitan menor adicin de fertilizantes ya que se aprovechan mejor los nutrientes del suelo; en promedio se reduce la adicin de fertilizante en 25% y de fsforo en 50%. y La reduccin del uso del fungicida y bactericidas es tambin importante, considerando que la planta es menos susceptible a infecciones. y Aumenta la calidad y cantidad de flores o frutos ya que la planta ha tenido una induccin en su crecimiento. En la formacin de los ndulos radicales intervienen los genes, protenas y factores nod, as los genes bacterianos que dirigen las etapas de la nodulacin en leguminosas, son genes nod. Estos codifican protenas que producen oligosacridos denominados factores nod, los cuales inducen el rizo del pelo radical e inician la proliferacin o divisin de las clulas vegetales, en cuyo interior se encuentran los bacteroides, para generar el ndulo. Los factores nod son esqueletos de N-acetilglucosamina al que se unen los distintos sustituyentes, de modo que la especificidad en la simbiosis est determinada por la estructura del factor nod sintetizada por una especie de rizobio concreta.

Entre este tipo de genes, los genes nodABC son universales y codifican para el esqueleto de los factores nod, por su parte cada conjunto de genes nod de los distintos tipos de rizobios codifican las protenas que modifican dicho esqueleto para constituir un factor nod especfico de una especie.

La especificidad de husped est determinada por lo menos en dos pasos con el intercambio mutuo de seales entre las plantas y microsimbiontes. En primer lugar, los genes de las bacterias causantes de la nodulacin (genes nod) se activan en respuesta a las molculas de seal que secreta la planta, como los flavonoides, lo que resulta en la biosntesis y secrecin de factores Nod por bacterias del gnero Rhizobium. En el segundo paso, los factores Nod provocar la formacin de ndulos en las races de la planta hospedera y desencadenar el proceso de infeccin.

3. MECANISMO DE NITROFIJACIN.
La reduccin de nitrgeno a amoniaco est catalizada por la enzima nitrogenasa. Aunque an se desconocen los intermediarios unidos a la enzima durante este proceso, se cree que el nitrgeno es reducido mediante adiciones de dos electrones.

La reduccin de nitrgeno molecular a amoniaco es muy exergnica, pero la reaccin tiene una elevada energa de activacin porque el nitrgeno molecular es un gas inerte con un enlace triple entre los dos tomos de nitrgeno. Por ello la reduccin de nitrgeno es costosa y requiere un gasto considerable de ATP. Se necesitan al menos 8 electrones y 16 molculas de ATP (4 ATP por cada par de electrones): N2+8H++8e- + 16 ATP 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi Los electrones proceden de la ferredoxina, que puede haber sido reducida mediante fotosntesis (en cianobacterias), procesos respiratorios (en bacterias aerobias) o fermentaciones (en bacterias anaerobias). Por ejemplo, Clostridium pasteurianum (bacteria anaerobia) reduce la ferredoxina durante la oxidacin del piruvato, mientras que la bacteria aerobia Azotobacter usa electrones del NADPH para reducir la ferredoxina.

La nitrogenasa es un sistema complejo compuesto por dos componentes protenicos principales: una protena MoFe unida a una o dos protenas Fe. La protena MoFe contiene 2 tomos de molibdeno y 28-30 tomos de hierro; la protena Fe tiene 4 tomos de hierro.

En primer lugar, la protena Fe es reducida por la ferredoxina, y a continuacin se une al ATP. La unin del ATP cambia la conformacin de la protena Fe y disminuye su potencial de reduccin, permitiendo reducir la protena MoFe. El ATP es hidrolizado cuando se produce esta transferencia de electrones. Finalmente, la protena MoFe reducida dona electrones al nitrgeno atmico reducindolo. La nitrogenasa es muy sensible al O2 y debe ser protegida de la inactivacin de O2 en la clula. En muchas cianobacterias, esta proteccin frente al oxgeno es proporcionada por una estructura especial llamada heterocisto.

La reduccin de N2 a NH3 ocurre en tres pasos, cada uno de los cuales requiere un par de electrones, por tanto se produce la transferencia de 6 electrones, y esto requiere un total de 12 ATP por cada N2 reducido. En realidad, el proceso total requiere al menos 8 electrones y 16 ATP, porque la nitrogenasa tambin reduce protones a H2. El H2 reacciona con diimina (HN=NH) para formar N2 y H2. En condiciones favorables, este ciclo intil produce algo de N2, y hace an ms costosa la fijacin de nitrgeno. Las bacterias simbiticas fijadoras de nitrgeno pueden consumir casi el 20 % del ATP producido por la planta husped. Una vez que el nitrgeno molecular ha sido reducido a amoniaco, ste puede ser incorporado a compuestos orgnicos.

Factores que afectan a la nitrofijacin:

Existen una serie de factores que afectan a la cantidad de nitrgeno fijado, la mayora de los cuales afectan tanto a la fijacin por microorganismos libres como en simbiosis. Estos factores son: nmero de microorganismos fijadores, la luz, la temperatura, la humedad, la concentracin de oxgeno, compuestos de nitrgeno, otros nutrientes minerales y reguladores de la nitrogenasa.

Nmero de microorganismos fijadores: La relacin parece resultar obvia, una mayor cantidad de microorganismos fijadores en el medio se corresponder con una mayor fijacin de nitrgeno. La distribucin de las bacterias fijadoras en los distintos hbitats es muy variable. As, Azotobacter es muy abundante en el Delta del Nilo y prcticamente inexistente en suelos de las islas Britnicas (alrededor de 1 bacteria por gramo de suelo). La luz: Este es un factor aplicable a microorganismos fotosintticos fijadores de nitrgeno. La fijacin requiere del poder reductor generado en la fotosntesis, aunque la reaccin de la nitrogenasa por s misma es independiente de la luz. Muchas algas verdeazuladas pueden crecer y fijar nitrgeno en completa oscuridad si disponen de suficientes substratos orgnicos. Un alga verdeazulada expuesta a la luz puede luego fijar nitrgeno en la oscuridad durante un cierto periodo de tiempo aprovechando para ello los substratos producidos en la fase luminosa, el ATP y el poder reductor generado. La actividad de la nitrogenasa se incrementa linealmente en microorganismos fotosintticos con el incremento de la intensidad de la luz. La actividad de la nitrogenasa (reduccin del acetileno) (l) y tasa de fotosntesis (produccin de oxgeno) (n) referidas a la intensidad de luz.

La concentracin de oxgeno: Cuando aumenta la concentracin de oxgeno se observa una disminucin de la fijacin del nitrgeno. Esto es as porque el proceso de fijacin exige condiciones reductoras. Ante la presencia de oxgeno (presencia que ser obligada en los microorganismos aerobios) se produce un gasto considerable de poder reductor para proteger a la nitrogenasa del oxgeno.

Entre los mecanismos para proteger el complejo de la nitrogenasa: Proteccin respiratoria: el microorganismo intensifica la respiracin cuando hay demasiado oxgeno. Requiere un gasto grande de compuestos carbonados (no es vlido en poblaciones con limitacin de carbono). Proteccin conformacional: Paso de la forma activa del enzima (que es sensible al oxgeno) a la forma inactiva (que no lo es). Entonces no se fija nitrgeno.

La temperatura: Los microorganismos fotosintticos son comunes en las zonas templadas, abundantes en los trpicos y llegan a estar presentes en ambientes extremos (polos y zonas calientes (como ya hemos comentado anteriormente). La actividad de la nitrogenasa aumenta con la temperatura, aunque al llegar a un mximo (normalmente entre 25-30 C) comienza a decrecer, aunque en los microorganismos de zonas muy clidas sigue aumentando (fig. 5).

Los compuestos de nitrgeno: La sntesis de la nitrogenasa es inhibida por la presencia en el medio de concentraciones de compuestos de nitrgeno, tales como amonio o nitratos. Adems, interfieren en la competicin entre fijadores de nitrgeno y no fijadores.

Otros nutrientes minerales: Necesitan molibdeno por estar contenido en el componente Mo-Fe de la nitrogenasa. Segn esto, resulta obvio que tambin se necesita hierro.

Efecto de la concentracin de molibdeno en la actividad de la nitrogenasa (reduccin de acetileno) Reguladores de la actividad de la nitrogenasa: El ADP es un potente inhibidor de la nitrogenasa. Cuando la relacin ATP/ADP es igual o inferior a 0.5, la nitrogenasa queda totalmente inhibida. Inhibidores competitivos son el acetileno y el CO, por los que la nitrogenasa presenta mayor afinidad que por el nitrgeno. La actividad de la nitrogenasa se ve incrementada con: y Un pH cercano a la neutralidad. y Un nivel alto de humedad y baja tensin de oxgeno. y Abundante cantidad de compuestos carbonados y compuestos energticos (ATP). y Baja concentracin de compuestos de nitrgeno.

4.- IMPORTANCIA Y APLICACIONES BIOTECNOLGICAS

DEL PROCESO.
De la cantidad total de nitrgeno molecular fijada cada ao (unos 200 millones de Tm), el 695 % corresponde a la fijacin biolgica y un 15 % es fijado por el hombre para convertirlo en abonos. Para fijar los 40 millones de Tm de fertilizantes que cada ao son arrojados a los campos se requiere un empleo masivo de combustibles fsiles (el equivalente a unos 300 millones de barriles de petrleo). El encarecimiento de estos combustibles, as como la contaminacin medioambiental que produce la aplicacin masiva de los fertilizantes nitrogenados, han dirigido la investigacin agronmica a la mejora del proceso de fijacin biolgica del nitrgeno atmosfrico. Actualmente son muchos los estudios de organismos fijadores de nitrgeno que aplican la Biologa molecular para conseguir mejorar la fijacin del nitrgeno atmosfrico. Las perspectivas a corto plazo incluyen la expansin del uso de las simbiosis existentes, el estudio de las mal conocidas y la bsqueda de nuevas; a medio plazo, le mejora de la eficacia de los sistemas simbiticos conocidos y a largo plazo, el desarrollo de nuevos sistemas fijadores.. Actualmente se realizan numerosos estudios sobre la fisiologa de la fijacin simbitica y la influencia ambiental, tratando de encontrar la combinacin bacteria-leguminosa ms adaptada a una situacin ambiental concreta, as como el manejo ptimo del cultivo, poniendo nfasis en la resistencia a temperaturas extremas, sequa, salinidad y en la influencia de la fertilizacin nitrogenada y aplicacin de productos fitosanitarios. Pero sin duda, lo que ha despertado mayores expectativas es la utilizacin de la ms moderna y sofisticada tcnica: la ingeniera gentica. Los mtodos genticos han sido utilizados desde los primeros tiempos en agricultura, con el fin de obtener variedades ms productivas, pero es en los aos 70 con la aparicin de las tcnicas de ingeniera gentica, como la del ADN recombinante, cuando se abren posibilidades espectaculares. La propia naturaleza del material gentico, permite, mediante su manipulacin, el desarrollo de proyectos con unos objetivos de gran inters aplicado, como son la alteracin de los genes de una forma especfica y predeterminada o la transferencia de genes de inters de unos organismos a otros, adicionndolos o sustituyendo parte de su dotacin gentica. De este modo puede lograrse un incremento de la eficacia de fijacin de nitrgeno.

La manipulacin y transferencia de genes ligados a la fijacin del nitrgeno y de otros estrechamente relacionados con ella, permitir conseguir nuevas o mejores cepas de microbios fijadores, crear nuevos sistemas, e incluso obtener plantas capaces de utilizar nitrgeno atmosfrico en ausencia de un microbio diaztrofo asociado. Respecto a esto es importante destacar la presencia de un vector natural microbiano: Agrobacterium tumefaciens, causante de la formacin de tumores en forma de cresta de gallo en plantas, que tiene la propiedad de transmitir al genoma de la planta dicho carcter tumorgeno, con lo cual el tumor puede proliferar en ausencia de aquel tumor que lo inici. As se pretende introducir en la planta el carcter deseado incorporndolo previamente en el genoma de Agrobacterium. Por otro lado la alteracin de los genes que regulan la fotosntesis y de otros relacionados con el metabolismo y fisiologa de las plantas, permitir un incremento de la fotosntesis neta y de la capacidad de utilizacin de los nutrientes, una mejor tolerancia a las condiciones naturales extremas y una cierta independencia de las caractersticas fsicas y qumicas de los suelos, la obtencin de plantas resistentes a plagas y pesticidas y la mejora de su calidad nutritiva. Por otro lado la actividad fijadora de nitrgeno atmosfrico est codificada por los llamados genes nif, que han podido transferirse por manipulacin gentica bajo forma de plsmidos desde microorganismos fijadores a otros que no lo son. Las investigaciones actuales sobre estos genes se centran en los siguientes aspectos: y Caracterizacin y manipulacin del grupo nif con objeto de producir plsmidos estables y de alta velocidad de replicacin. y Transformacin de los microorganismos que habitualmente colonizan la rizosfera de las plantas. y Transferencia del grupo nif directamente a las plantas. El problema principal radica en la regulacin de la expresin de los genes nif, es decir, si se consigue transferir estos genes a una clula vegetal y se mantienen estables podran llegar a expresarse? Por lo tanto, la introduccin del grupo nif en los organismos superiores, como los cereales, no basta, sino que es necesaria tambin la introduccin de genes auxiliares para hacer posible su expresin, lo que significa una modificacin del metabolismo y estructuras vegetales, para lo cual, los avances tcnicos actuales an no estn dispuestos. Estos genes auxiliares son los genes de la fotosntesis, los de utilizacin de celulosa (den) y los genes de desnitrificacin (cut).

Naturalmente, el hombre tambin ha ideado un sistema para fijar nitrgeno industrialmente (proceso de Haber-Bosch) con el que abonar los campos de cultivo. Aplicaciones de las bacterias fijadoras de nitrgeno y promotoras del crecimiento El reconocimiento de la fijacin biolgica del N2 puede remontarse a 300 aos antes de Cristo cuando los romanos utilizaban la rotacin de cultivos con leguminosas en sus prcticas agrcolas. En la actualidad, adems de la rotacin de cultivos, se emplean microorganismos como biofertilizantes, y se aplican mtodos de biocontrol para proteger a las plantas contra el ataque de patgenos, plagas y malezas. Biofertilizantes: A pesar de que Rhizobium es un habitante comn en los suelos agrcolas, frecuentemente su poblacin es insuficiente para alcanzar una relacin benfica con la leguminosa, o la cantidad de N2 que fijan no resulta suficiente. En estos casos, es posible inocular la semilla con microorganismos para asegurar la fijacin biolgica del N2. El proceso de inoculacin consiste en agregar a las semillas, antes de la siembra, una mezcla de bacterias fijadoras y otros ingredientes que facilitan el crecimiento de las mismas. El empleo de inoculantes de Rhizobium en las leguminosas es una de las contribuciones ms importantes de la microbiologa a la agricultura. Estos inoculantes favorecen la fijacin simbitica de nitrgeno y, en consecuencia, disminuye la dependencia a los fertilizantes nitrogenados y la contaminacin ambiental por nitrgeno asociada al empleo de estos productos. Lo ideal es seleccionar un Rhizobium altamente infectivo y efectivo para lograr una disminucin mxima del fertilizante nitrogenado sin reducir el rendimiento de la leguminosa.

Los objetivos de estas investigaciones son bsicamente: 1) Mejorar la eficiencia de fijacin de nitrgeno mediante el uso de bacterias muy competitivas. 2) Desarrollar bacterias fijadoras ms eficientes y competitivas. Tambin se investiga sobre la obtencin de cepas bacterianas con genes capaces de mejorar las limitaciones que presenta el proceso de simbiosis y de fijacin de nitrgeno. 3) Extender las ventajas de la simbiosis a otros cultivos (arroz, maz, etc.). En los cereales, por ejemplo, se intenta inducir estructuras similares a los ndulos de leguminosas. Se han realizado experimentos de transferencia de genes inductores de nodulacin a plantas de arroz y se ha observado que se expresaban en las races de las plantas transgnicas obtenidas.

Biocontrol:
Los mtodos de biocontrol buscan proteger a las plantas de los patgenos mediante el uso de agentes biolgicos, como microorganismos. Su mecanismo de accin puede ser la competencia nutricional con el patgeno, o por la induccin de resistencia restringiendo la penetracin del patgeno en la planta, optimizando su defensa, o bien por la produccin de antibiticos, cido cianhdrico, etc. efectivos contra enfermedades fngicas. Desde el punto de vista histrico, Azotobacter es el microorganismo que de una forma ms amplia ha sido utilizado en la agricultura. La aplicacin prctica de la inoculacin de este microorganismo ha sido positiva, observndose notables incrementos en los rendimientos en diferentes cultivos, principalmente en cereales. De entre las rizobacterias usadas en biocontrol, Pseudomonas fluorescens es de las ms conocidas. Tambin las bacterias Bacillus y Streptomyces han resultado muy eficaces en el control de enfermedades. Estas bacterias producen una amplia gama de metabolitos con capacidad antimicrobiana. El Bacillus thuringiensis es un agente de biocontrol que representa el 90% del mercado mundial de bioinsecticidas. En los estados de esporulacin produce unos cristales constituidos por protenas (endotoxinas) dotadas de propiedades insecticidas. Esas endotoxinas forman parte de formulaciones comerciales de bioinsecticidas. Se han obtenido plantas transgnicas (como el maz BT) que contienen el gen que codifica para endotoxinas, resistentes al ataque de los insectos. Es decir que la misma planta produce el insecticida especfico, lo que reduce la necesidad de empleo de productos qumicos insecticidas. Actualmente, cerca de 40 productos estn disponibles en el comercio para el control de organismos fitopatgenos. La mayora de estas bacterias producen antibiticos como mecanismo de control de la enfermedad, pero se sigue investigando con el fin de disear nuevos productos para el control biolgico de patgenos en la agricultura. Por lo general, las mezclas de cepas nativas, y la generacin de cepas genticamente modificadas en las que se acelera la produccin de metabolitos antimicrobianos, son las dos estrategias ms atractivas para mejorar la capacidad de las bacterias como agentes de biocontrol.

Tanto para bacterias como para plantas asociadas, la construccin de microarreglos (microarrays o chips) de ADN est permitiendo abordar estudios de interaccin planta-microorganismo que hasta hace pocos aos eran imposibles. (Un microarreglo, microarray o chip de ADN es una serie ordenada de muestras de ADN que se pueden estudiar para determinar patrones en la expresin de los genes transcriptos).