DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS

Quimbayo, P. (paulymelisa@yahoo.com); Medina, Y (yurany121@hotmail.com); . Guaza, H. (heck01@hotmail.com) Facultad de Ciencias Naturales Exactas, Departamento de Quimica Universidad del Valle Santiago de cali Septiembre 6 de 2011 Resumen Se realizaron pruebas cualitativas agregando a cada solucin de albumina, glicina prolina y aspartame NaOH, luego se someti a calentamiento con lo cual se confirm la presencia de un grupo amino libre, dando un producto azul o purpura al contrario de la prolina cuya coloracin final era amarilla. En la interaccin de protenas con osmolitos se tomaron dos tubos con albumina A y B, El tubo A con la albumina adicionando HNO3 luego NaOH, dndose la separacin de dos capas una amarilla intensa encima y una ms tenue abajo. El tubo B con la albumina adicionando (NH4)2SO4 la solucin se torn un poco lechosa y al aadirle urea tomo su color transparente, luego de calentar estas soluciones A y B, se observ turbidez en la solucin. Tambin se realiz un anlisis cuantitativo de protena por mtodo Biuret, se prepararon cinco soluciones estndar a diferentes concentraciones de albumina de clara de huevo, a las cuales se les adiciono en un volumen igual de solucin A NaOH + 25g de tartrato sdico-potsico en 500mL) y solucin B (7,5g de CuSO4.5H2O en 500mL), la reaccin de dicha protena con sulfato de cobre en solucin alcalina de una coloracin purpura o violeta la cual se cuantifica a 550nm. Finalmente se realizo un anlisis cualitativo por el mtodo Biuret a dos soluciones de glicina y aspartame las cuales dieron azul claro y oscuro respectivamente. Abstract. Qualitative tests were performed by adding to each solution of albumin, glycine, proline and aspartame NaOH, then subjected to heat thereby confirmed the presence of a free amino group, giving a blue or purple product instead of proline which was final color yellow. The interaction of proteins with osmolytes took two tubes with albumin A and B, the tube with albumin after adding NaOH/HNO3, giving the separation of two layers deep yellow above and below a more tenuous. The tube B with albumin added (NH4)2SO4, the solution becomes milky and a bit by adding urea took its transparent color, then heating the solutions A and B, was observed turbidity in the solution. also performed a quantitative analysis of protein by Biuret method, five standard solutions were prepared at different concentrations of egg albumin, to which were added in an equal volume of solution A NaOH + 25g potassium sodium tartrate in 500 mL) and solution B (7.5 g CuSO4.5H2O in 500mL), the reaction of the protein with copper sulphate in alkaline solution of a purple or violet which is measured at 550nm. Finally a qualitative analysis was performed by the Biuret method to two solutions of glycine and aspartame which gave light and dark blue respectively.

Introduccin Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas muchos de

estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV b)para la formacin de derivados quimicos o c)

la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes dichos mtodos se basan en diferentes sensibilidades. En este caso se utiliz los mtodos Biuret el cual es poco sensible y se utiliza para la cuantificacin de protenas en muestras muy concentradas. Mtodos y Experimentos En la prctica se determinaron las propiedades cualitativas de las protenas mediante la reaccin de Ninhidrina, interaccin de protenas con osmolitos y reaccin con el calor y se realiz un anlisis cuantitativo por el mtodo de Biuret se usa normalmente este mtodo colorimtrico que permite determinar la concentracin de protenas en una muestra mediante espectroscopia ultravioleta visible a una longitud de onda de 540 nm. Resultados y Discusin En esta prctica se realizo el anlisis cualitativo de aminocidos y protenas por tres mtodos los cuales fueron la reaccin de Ninhidrina, interaccin de protenas con osmolitos y efecto del calor. En este anlisis se obtuvieron los siguientes resultados para cada mtodo: Reaccin de Ninhidrina: Para este mtodo se adiciono una solucin de Ninhidrina (0,05g/25mL), junto con una solucin de NaOH al 10% a un conjunto de soluciones de aminocidos y protenas diferentes como son la albumina, la glicina, la prolina y el aspartame, para las cuales se obtuvo inicialmente un color amarillo en cada una de ellas, pero este color cambio al ser sometidas las soluciones a un calentamiento en bao mara, cuyos resultados se presentan en la siguiente tabla: Tabla 1. Coloracin obtenida para cada solucin de aminocidos y

protenas al Ninhidrina. Soluciones Albumina Glicina Prolina Aspartame

reaccionar

con

la

Coloracin Amarillo Claro Purpura Amarillo - Caf Violeta Oscuro

Este cambio de color en las soluciones de aminocidos se da debido a que poseen un grupo amino libre en su estructura lo cual le permite reaccionar con la Ninhidrina y formar dixido de carbono, amoniaco y un aldehdo que contiene un tomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reaccin da lugar a la formacin de un producto color azul o purpura. En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, la coloracin final es amarilla. La albumina no reacciona con la Ninhidrina por ser una protena. A continuacin se muestra el mecanismo general de reaccin de la Ninhidrina con los aminocidos con grupos amino libres:

Esquema 1. Mecanismo general de reaccin de la Ninhidrina y los aminocidos con grupos amino libres. (1) La Ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energtico que por una desaminacin oxidativa de los aminocidos conduce a la formacin del aldehdo correspondiente, con liberacin de amoniaco y gas carbnico y formacin de la Ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molcula de hidridantina, en presencia de otra de Ninhidrina, condensa a travs del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o purpura de Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. (1) Interaccin osmolitos: de protenas con

de un color amarillo lechoso, la cual luego de adicionar NaOH presento la formacin de dos fases: arriba una fase de color amarilla intenso y viscosa, mientras que abajo era de color amarillo claro y viscosa. Tambin se observa la formacin de un precipitado amarillo. Esta reaccin se debe a la formacin de nitroderivados aromticos por reaccin del cido ntrico sobre los grupos bencnicos que poseen algunos aminocidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptfano. (2) Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos aromticos en su molcula como por ejemplo el aminocido tirosina presente en la protena albumina de la clara de huevo; En otro (Tubo B) se aadi (NH4)2SO4 al 70% agitando suavemente y se observ que la solucin de albumina se torn un poco lechosa y al agregarle urea 6M se vuelve transparente de nuevo. La formacin de este precipitado se da por el efecto de la sal de sulfato de amonio, ya que esta es muy soluble y el ion sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas y una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos compiten por el agua y rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan, mtodo conocido tambin como Salting Out. (3) Luego se adiciona urea con el fin de reenaturalizar la protena. Efecto del Calor: Luego de someter una solucin de albumina a bao mara a una temperatura de 100C se observ turbidez en la solucin debido a la precipitacin de la protena, por la desnaturalizacin de esta por efecto del calor, haciendo la protena inestable. Las alteraciones que sufre la molcula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insolubles. Esta propiedad de las protenas se denomina coagulacin.

Para este mtodo de anlisis se adiciono albumina de clara de huevo a dos tubos de ensayo. En uno (Tubo A) se le aadi HNO3 concentrado agitando suavemente y se observ que la solucin de albumina se torn

Tambin se realiz un anlisis cuantitativo de protena por mtodo Biuret, para el cual se prepararon cinco soluciones estndar a diferentes concentraciones de albumina de clara de huevo, a las cuales se les adiciono en un volumen igual de solucin A (20g de NaOH + 25g de tartrato sdico-potsico en 500mL) y solucin B (7,5g de CuSO4.5H2O en 500mL), por lo tanto al reaccionar la protena con sulfato de cobre en solucin alcalina se produce un color caracterstico purpura o violeta, el cual se cuantifica espectrofotomtricamente a 555nm; el color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos figura 1. (5)

para la muestra problema (0,027) en la ecuacin de la recta, en donde se toma Y como el valor de la absorbancia y a X como el valor de la concentracin de protena, y teniendo en cuenta las correspondientes diluciones realizadas a la muestra problema en su preparacin. Luego este valor se comparo con un valor terico del contenido de protena en la clara de huevo 11,1%,(4) donde se obtuvo un porcentaje de error de 65,8%, el cual se debi a posibles interferencias en el anlisis como la presencia del ion amonio el cual altera el desarrollo del color por ende el valor de la absorbancia. Por ltimo se realiz un anlisis cualitativo del mtodo de Biuret para las disoluciones de Glicina y aspartame, para las cuales se obtuvo los siguientes resultados: Tabla 2. Color obtenido para cada disolucin luego de adicionar el Reactivo de Biuret. Disoluci n Color Inicial Incoloro Incoloro Color Final Azul Claro Azul Oscuro

Figura 1. Complejo cprico formado en la reaccin de Biuret. (6) Luego de de determinar espectroscpicamente la absorbancia de cada solucin patrn de albumina se obtuvo la siguiente grfica y su correspondiente ecuacin de la recta:

Glicina Asparta me

Grafica 1. Grafica de absorbancia vs concentracin de protena de las soluciones estndar. La ecuacin de la recta para esta grafica es la siguiente: y=0,245x-5,9110-3 (1) A partir de la ecuacin de la recta obtenida al graficar los datos de absorbancia y concentracin de protena de las soluciones estndar se calculo la concentracin de protena en la muestra problema (solucin de clara de huevo) la cual fue de 18,4%. Este valor se determino al reemplazar el valor de la absorbancia obtenida

El cambio a color azul de ambas disoluciones indica un resultado positivo para el mtodo de Biuret, debido a la formacin del complejo de cobre (II) que se forma, cuyo color se desarrolla por la formacin de un ion coordinado, tetracprico, con dos grupos amida adyacentes. Conclusiones La sal de sulfato de amonio es muy soluble y el ion sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas, lo cual aumenta la interaccin protena-protena, favoreciendo la precipitacin de la protena. Esta reaccin de Biuret sirve para diferenciar las protenas y pptidos de los aminocidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrlisis

proteica, la reaccin ser negativa cuando la hidrlisis sea completa. El desarrollo del color es diferente para cada protena y su intensidad se puede determinar espectroscpicamente a 555nm. La cuantificacin de la protena se lleva a cabo con una curva patrn, utilizando el principio establecido por la ley de Beer. En general las reacciones coloridas nos ayudan a saber con qu grupo funcional est formada la protena y as tambin de que aminocido est formado. La intensidad de la coloracin en la prueba de Biuret es proporcional a la cantidad de protenas de la solucin. En las reacciones donde se obtuvo precipitacin se debi a en el estado fsico de la protena, mientras que en la coagulacin se ha producido un cambio en el estado fsico y en la estructura qumica por eso es irreversible.

En la actualidad se plantean diversas estrategias de estabilizacin proteica, siendo la ms comn sencilla y eficaz. La aplicacin de aditivos que modifican favorablemente el entorno de las protenas. Las diversas observaciones respecto al uso de ciertos osmolitos como estabilizantes. Han llevado a la conclusin de que estos compuestos previenen la perdida de la actividad enzimtica, inhiben la agregacin irreversible y aumentan la temperatura de transicin trmica de diversas macromolculas. Por tanto se probaron que estos osmolitos sorbitol, manitol y glicina, en la estabilizacin trmica de soluciones de inmunoglobulinas. 3. Qu mtodos se utilizan para determinar el peso molecular de una protena? Cromatografa de tamizado molecular, Electroforesis en geles de poliacrilamidas SDS. 4. Qu otros anlisis de cuantificacin de protenas existen? Seale otras en adicin al mtodo Bradford? Mtodo Kjeldhal, Lowry Espectrofotomtrico. Y

Preguntas 1. Dibuje la estructura del edulcorante de bajo aporte calrico conocido como aspartame Qu tipo de compuesto biolgico es?

5. Qu propiedades presentan 2.
Que es un osmolitos? Cmo se usan para la purificacin de protenas? Osmolito, compuesto que protege a las clulas de la desecacin al mantener una alta osmolaridad intracelular (concentracin osmtica). las albuminas? Qu funcin tiene la albumina de suero sanguneo? Son substancias solubles en agua y coagulables por el calor y se dividen en naturales y de transformacin, sus disoluciones no precipitan ni por los cidos orgnicos o minerales debilitados, ni por la sal marina y sulfato de

magnesia saturado, pero si por el sulfato amnico en exceso. En el suero sanguneo Posee propiedades de anti-oxidante y anti radicales libres, adems se une fcilmente a los lpidos, frmacos sustancias toxicas, etc.

amonio interfieren en la reaccin Puede ocurrir opalescencia en la solucin final si estn presentes altas concentraciones de lpidos o carbohidratos Debe estandarizarse el color mediante cantidades de protena conocidas

6. Cmo se realiza un perfil de

aminocidos? La determinacin del perfil de aminocidos consiste en romper la cadena proteica para obtener los aminocidos individuales (hidrlisis). Debido a la inestabilidad de algunos de ellos en las condiciones de reaccin, esto requiere tres tratamientos separados, hidrlisis acida, hidrlisis con lcalis y previa oxidacin de los aminocidos azufrados. 7. Compare la tcnica de cuantificacin de protena por Biuret con otro mtodo de los que hallo en la pregunta 4, en trminos de sensibilidad Ventajas determinacin protenas mtodo Biuret: de

Referencias (1) Garrido, A; Teijn, J. M. Fundamentos de Bioqumica Estructural, 2 ed.; Tbar, S. L., Madrid, 2006; pp 67-68 (2) Vejar, E. Practicas de Bioqumica Descriptiva; UniSon, Mxico; pp 168 (3) Precipitacin de protenas. http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench4 85/lab6a.htm. Revisado 01/09/2011. (4) http://proteinas.org.es/alimentosricos-proteinas. Revisado 01/09/2011 (5) Battaner, E., Biomolculas, 1ed.; Universidad de Salamanca, Espaa, 2000; pp 264 (6) http://www.uam.es/personal_pdi/cienci as/bolarios/BiologiaCCAA/Guiones/Prac tica1.htm. Revisado 01/09/2011 Revisado 01/09/2011 Anexos Clculos: A partir de la siguiente ecuacin se realizaron los respectivos clculos para determinar la concentracin de protena en la clara de huevo:

Menos caro que el mtodo Kjeldhal. Rpido (se puede completar en menos de 3 minutos). Mtodo ms simple de anlisis de protenas. No es frecuente encontrar derivaciones de color. Pocas sustancias no proteicas interfieren con la reaccin de Biuret Biuret

y=0,245x-5,9110-3 (1)
Si tomamos Y e igual a 0,027 y despejamos X se obtiene que:

x=0,134mg/mL Proteina
Teniendo en cuenta las correspondientes diluciones (4mL de albumina en 25mL de solucin) al preparar la muestra problema de clara de huevo a partir de una concentracin de 0,4552g/100mL:

Desventajas mtodo comparado con Lowry Las altas

concentraciones de sales de

0,134mgmL*25mL4mL*100mL0,45 52g*1g1000mg*100= =18,4% Proteina

Y al comparar el valor con el valor terico presente en la clara de es de 11.1%, se obtiene de error del experimental de protena huevo el cual un porcentaje

%E=Valorexp -ValortericoValorterico*100% (2) %E=18,4%11,1%11,1%*100%=65.8%