Biologia Celular e Molecular

Tcnicas de Anlise de Protenas

Trabalho elaborado por: Ctia Monteiro Cludia Rosado Cristiana Pinho Sara Martins Turma 5

Tcnicas de Anlise de Protenas

Introduo
O nosso trabalho baseia-se nas tcnicas de anlise de protenas e, como tal, temos como objectivo principal referenciar algumas delas (nomeadamente a Cromatografia, a Electroforese, o Western Blotting, etc). Contudo, tambm fizemos uma breve abordagem estrutura e funo das protenas e ao estudo protemico.

Protenas
As protenas so biopolmeros compostos por resduos de aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Este tipo de ligao estabelece-se entre os resduos de aminocidos com consequente perda de uma molcula de gua. Cada alfa-aminocido constitudo por um grupo amino, um grupo carboxlico, um tomo de hidrognio e uma cadeia lateral (que difere de aminocido para aminocido), ligados a um carbono (carbono alfa). So vinte os aminocidos que combinados em nmero e sequncia diferentes do origem a todas as protenas existentes, conferindo-lhes a estrutura e capacidade funcional. A extremidade amino (grupo -amino) considerada como sendo o incio da cadeia e a extremidade carboxlica (grupo -carboxlico) o fim. Uma cadeia peptdica constituda por uma parte que se repete regularmente (cadeia principal) e uma parte varivel (cadeias laterais), possuindo tambm polaridade. O corpo humano produz milhares de protenas diferentes que no organismo possuem funes tambm diferentes, como por exemplo, estruturais, catalticas, contrcteis, transportadoras, de defesa imunolgica, etc, estando o formato de cada protena directamente relacionado com a sua funo. Existem quatro nveis de organizao nas protenas: estruturas primrias, secundria, terciria e quaternria. A estrutura primria caracterizada pela sequncia de aminocidos e ligaes peptdicas da molcula; o nvel estrutural mais simples e mais importante j que dele deriva todo o arranjo espacial da molcula.
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A estrutura secundria caracterizada pelo estabelecimento de ligaes de hidrognio entre aminocidos de uma cadeia proteica; os elementos deste tipo de estrutura mais comuns em protenas so a hlice- e a folha- ou pregueada. A estrutura terciria a organizao global de uma nica cadeia polipeptdica; o principal factor que determina a estrutura terciria numa protena globular o efeito hidrofbico, ou seja, as cadeias laterais dos aminocidos no polares ficam como que escondidas dentro da estrutura e as cadeias laterais dos resduos polares ficam expostos superfcie. As ligaes de hidrognio so fundamentais na estabilizao da estrutura terciria. A estrutura quaternria caracterizada pela associao de duas ou mais cadeias polipeptdicas numa estrutura com vrias subunidades, resultando numa unidade activa. Este tipo de estrutura estabilizada por ligaes de hidrognio, foras de Van der Walls ou ligaes inicas.

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Cromatografia

A coluna de Cromatografia um dos mtodos Esta mais comuns consiste de na purificao de protenas. tcnica passagem da protena atravs de uma coluna (fase estacionria) que desenhada para reter ou diminuir a velocidade da passagem da fase mvel onde esto as macromolculas (protenas) e a tcnica baseia-se numa propriedade particular, como o tamanho, carga ou afinidade qumica. A soluo a analisar deve conter a protena concentrada e o mtodo deve ser rpido para evitar a degradao da mesma, devendo no entanto, utilizar-se inibidores de proteases.

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Dependendo da escolha da coluna, as protenas podem ser separadas de acordo com a sua carga (IEX cromatografia de troca inica), sua hidrofobicidade (HIC cromatografia de interaco hidrofbica), seu tamanho (GF filtrao em gel) ou pela sua capacidade de se ligar a grupos qumicos particulares. IEX Cromatografia de troca Inica Baseia-se na carga da protena que estamos a tentar isolar. Se esta possuir carga positiva, a soluo deve passar por uma coluna com carga negativa (impedindo a passagem das protenas com carga positiva). Depois de fazer passar a soluo pela coluna recorre-se ao procedimento salting out para separar a protena, com carga positiva, da coluna com carga negativa (este tipo de coluna denominado coluna de troca de caties e possui ies de sulfato, imobilizados na fase estacionrio). Para impedir a passagem de uma protena com carga negativa utiliza-se uma coluna de carga positiva designada por coluna de troca de anies que, geralmente, possui ies de amnio. Salting out Esta tcnica usa uma soluo de elevada concentrao de sal que compete com a protena na ligao coluna. Como esta tem maior afinidade para a carga dos sais do que para a das protenas, estas acabam por ser libertadas, mantendo-se os sais ligados coluna. As protenas com fracas interaces inicas sero libertadas com uma concentrao baixa de sal. A adio de sal dever ser feita de uma forma gradual e, no final, para ter a certeza que todas as protenas foram libertadas da coluna, deve ser colocado nesta uma soluo de concentrao de sal de 2-3mol/L. Para remover os sais da soluo de protenas deve ser feita uma dilise contra tampo. As mudanas no pH alteram a carga das protenas, por isso necessrio conhecer o seu ponto isoeltrico (pH a que a carga da protena 0) e certificar-se de que o pH do sistema est convenientemente ajustado e tamponado.

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HIC Cromatografia de Interaco hidrofbica O HIC baseia-se nas propriedades hidrofbicas de algumas protenas. As protenas devem ser colocadas na presena de elevada concentrao de sulfato de amnio, o qual aumenta a entropia da gua, aumentando, assim, as interaces hidrofbicas. Este tambm estabiliza as protenas. As pores hidrofbicas da coluna so colocadas com uma matriz de agarose de fenil. Na presena de elevadas concentraes de sal, os grupos de fenil da matriz impedem a passagem de pores das protenas hidrofbicas. Pode-se controlar a separao de diferentes ligaes coluna das protenas, reduzindo a concentrao do sal ou adicionando solventes. GF Cromatografia de filtrao em gel A cromatografia de filtrao em gel separa as protenas com base no seu tamanho. A coluna constituda por uma matriz de pequenas esferas porosas empacotadas. Ao fazer passar a soluo de protenas pela matriz da coluna, as molculas pequenas entram nos poros das esferas demorando a atravess-los, enquanto que as grandes passam entre as esferas sendo separadas primeiro. Outro tipo de coluna o AC (Cromatografia de Afinidade), que um procedimento mais eficiente que os outros, acima citados. AC Cromatografia de Afinidade A cromatografia de afinidade baseia-se nas funes biolgicas da protena que se liga coluna. O tipo mais comum envolve um ligando (pequena biomolcula especfica por exemplo anticorpo), que imobilizado e ligado a uma matriz da coluna, como a celulose ou poliacrilamida.

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A protena a analisar passa depois atravs da coluna e liga-se a ela pelo seu ligando, enquanto que outras protenas sero libertadas. A separao da protena alvo normalmente feita, passando atravs da coluna uma soluo que contenha uma elevada concentrao de ligando livre. Isto um mtodo muito eficiente de purificao, uma vez que se baseia numa especificidade biolgica da protena que se pretende analisar, tal como a afinidade de uma enzima a um substrato ou a ligao entre antignio e anticorpo. Contudo, apesar das inmeras vantagens que a cromatografia convencional oferece, esta est limitada pela no homogeneidade nas matrizes (como celulose), que causa uma desigual fluidez do solvente atravs da coluna. Com o objectivo de colmatar esta falha foi desenvolvida uma nova cromatografia, o HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Para alm disso tambm permite que as protenas sejam separadas mais rapidamente do que pelos mtodos convencionais e separar molculas com estruturas e tamanhos muito semelhantes.

Electroforese
A electroforese uma tcnica de separao de molculas que consiste na migrao de molculas com carga, numa soluo, em funo da aplicao de um campo elctrico. A velocidade da migrao depende da fora do campo aplicado, da carga, do tamanho e da forma das molculas e tambm da fora inica, viscosidade e temperatura do meio, onde estas se movem. De um modo geral, no transporte electrofortico, fora do campo ope-se a resistncia do meio, produzindo, quando se igualam, uma velocidade constante das partculas. uma tcnica que pode ser usada para anlise de protenas. As protenas so molculas anfotricas, cuja carga determinada pelo pH do meio onde esto suspensas. Numa soluo com pH acima do ponto isoelctrico, a protena negativamente carregada migra para o nodo do campo elctrico. Abaixo do ponto isoelctrico, a protena

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positivamente carregada e migra para o ctodo. H diversos tipos de electroforese como: Electroforese livre (frente mvel) Electroforese de zona Electroforese em papel Electroforese em acetato de celulose Electroforese em gel (SDS-PAGE) Focagem isoelctrica Electroforese bidimensional

Dentro desta variedade centraremos a nossa ateno no SDS-PAGE. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis Laemmli, 1970) O objectivo do SDS desnaturar a protena, isto , converter a protena numa estrutura linear (a sua forma nativa , geralmente, globular) e conferir-lhe densidade de carga uniforme, de forma a poderem ser separadas por electroforese, somente, em funo do tamanho (massa molecular). O SDS tem uma alta carga negativa e pH 7 e tem uma cauda hidrofbica que interactua com as cadeias das protenas (polipeptdeos). O nmero de molculas de SDS que se ligam s protenas proporcional ao nmero de aminocidos que constituem as mesmas, pois liga-se na razo de uma molcula por ligao peptdica. Se as protenas desnaturadas so postas num campo elctrico, todas elas se movero para o plo positivo, na mesma proporo, sem possibilidade de avaliar a distncia migrada. Ento, necessrio coloc-las num ambiente que permita que protenas de variados tamanhos se desloquem a velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel de poliacrilamida (polmero de monmeros de acrilamida). De seguida, aplica-se uma corrente elctrica e, como tal, as molculas movem-se ao longo do gel de poliacrilamida (a todo este processo chama-se Electroforese em Gel de Poliacrilamida), migrando mais rapidamente as de menores dimenses.

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Aps as protenas terem corrido o gel, preciso fix-las, para evitar que difundam quando se procede colorao do mesmo. O cido actico a 25% em H 2O um bom fixador, alm de que mantm as protenas desnaturadas. O gel , tipicamente, corado com azul de Coomasie (a fixao e colorao podem ser preparadas na mesma soluo, usando como solvente o metanol ou sais de prata) e depois descorado.

Focagem isoelctrica
Esta tcnica baseia-se nas diferenas dos pontos isoelctricos das protenas para as separar. As protenas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou nula dependendo do pH do meio e para cada protena existe um valor de pH do meio para o qual a carga da mesma 0 (pI, ponto isoelctrico), que geralmente se situa entre 3 12. Quando uma protena colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o gradiente de pH estabelecido pela mistura de solues tampo especiais e sujeita a um campo elctrico ir inicialmente mover-se em direco ao elctrodo com carga oposta. Durante a migrao atravs do gradiente de pH, a protena ir captar ou perder protes. Enquanto a protena migra a sua velocidade vai diminuindo at chegar ao ponto em que o valor de pH ser igual ao seu pI. Neste ponto a protena ter carga total neutra e como consequncia deixa de migrar. Se a protena se difundir para uma regio fora do seu pI, ir adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posio onde globalmente neutra. Pode ter grupos ionizados, mas globalmente neutra.

Electroforese Bidimensional
Como as bandas proteicas tendem a sobrepor-se, os mtodos unidimensionais de separao, como a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS), podem apenas separar um nmero relativamente pequeno de protenas (geralmente menos de 50), a electroforese de um gel bidimensional, ao combinar dois processos de separao distintos, pode ser usado para separar mais de 1000 protenas. Numa primeira etapa as protenas so separadas em funo da sua carga nativa. As cadeias polipeptdicas so, ento, separadas por um processo de focagem isoelctrica. Numa etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contm as protenas separadas por focagem isoelctrica sujeito, novamente, a electroforese mas
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numa direco em ngulo recto quela usada na primeira etapa. O gel original mergulhado em SDS e depois colocado numa extremidade de um slab de gel de poliacrilamida SDS, atravs do qual cada cadeia polipeptdica migra em funo do seu tamanho observando-se no resultado final como um ponto sptot. As nicas protenas que no so separadas sero aquelas que tero idntico tamanho e ponto isoelctrico, uma situao relativamente rara. At quantidades vestigiais de cada cadeia polipeptdica pode ser detectada no gel por vrios processos de colorao ou por autorradiografia se a amostra da protena tiver sido previamente marcada por um radioistopo. O poder de separao to grande que duas protenas que diferem em apenas um aminocido carregado podem ser prontamente distinguidas.

Western blotting
O western blotting permite detectar uma protena numa mistura de protenas dando tambm informao acerca do seu tamanho. Inicialmente as protenas so separadas por SDS-PAGE e, posteriormente, so transferidas para uma membrana de nitrocelulose (do mesmo modo que foram separadas no SDS-PAGE). O polo negativo ctodo, fica do lado do gel e o positivo - nodo no lado da membrana de nitrocelulose para conduzir as protenas carregadas negativamente em direco membrana (carregada positivamente). A razo para a transferncia das bandas de protenas para uma membrana de nitrocelulose permitir a chegada dos anticorpos s bandas com maior facilidade e eficcia, j que o gel de poliacrilamida no permite a difuso de grandes molculas. A membrana de nitrocelulose incubada com o anticorpo primrio que se liga protena que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo-protena. Seguidamente -lhe adicionado o anticorpo secundrio conjugado, anticorpo-enzima, que se vai ligar ao anticorpo primrio. A enzima (ex. fosfatse alcalina ou peroxidase) funciona como um sinalizador molecular que permite a visualizao do local da protena detectada. No entanto, para que a enzima seja visualizada necessrio coloc-la na presena de uma mistura reactiva especfica. adicionado um substrato cromognico, que ao ser degradado pela enzima conjugada com o anticorpo dar origem a um

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precipitado insolvel colocalizado com o anticorpo primrio que por sua vez se ligou protena. Podem tambm ser utilizados outros tipos de marcadores como os fluorescentes ou os radioistopos (que podem ser detectados por tcnicas de autorradiografia).

Apesar do proteoma no ser objectivo directo do trabalho, achamos importante e pertinente falar sobre este assunto que, de certa forma, est directa ou indirectamente relacionado com as tcnicas de anlise de protenas1. integrativo dos estudos de anlise de protenas

Proteoma
O proteoma reflecte o estado actual de funcionamento do sistema em condies fisiolgicas especficas, ou seja, a expresso do genoma funcional. Esta caracterstica faz com que o estudo do proteoma se torne um grande desafio. O proteoma da clula bastante dinmico dependendo do seu estado de desenvolvimento, da presena de activadores ou inibidores e tambm das condies especficas do meio ambiente. Embora a identificao de todas as protenas codificadas no genoma de um organismo parea uma tarefa bastante difcil de concretizar, mesmo em organismos muito simples, so cada vez mais as informaes completas, atravs de estudos protemicos, sobre vias de sinalizao celular, conjuntos de protenas reguladoras, modificaes ps-traduo, bem como outras informaes cruciais sobre os estados fisiolgicos e fisiopatolgicos de clulas e organismos. O estudo em questo pode levar a trs vertentes bsicas com implicaes directas em vrios campos da biologia e da biotecnologia. Primeiro, o estudo do proteoma permite a descoberta de vias metablicas nas diversas etapas celulares, gerando um conhecimento sem precedentes na biologia
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Os mtodos experimentais utilizados no estudo do proteoma dividem-se, fundamentalmente, em duas etapas: isolamento e separao das protenas a partir do material biolgico (fraccionamento cromatogrfico - filtrao em gel, afinidade, imunoafinidade, etc - mtodos electroforticos - SDSPAGE, focagem isoelctrica, etc); e sequenciao dos aminocidos de cada protena. Tcnicas de Anlise de Protenas 10

celular e na bioqumica. Tal conhecimento torna possvel a identificao de novos alvos farmacolgicos especficos. Segundo, esse mesmo estudo permite viabilizar a identificao de novas molculas bioactivas em extractos biolgicos naturais, levando ao desenvolvimento de novos medicamentos. Terceiro, permite tambm a identificao e caracterizao de marcadores biolgicos, ou seja, molculas endgenas ou exgenas especficas de um determinado estado patolgico. A capacidade de identificar essas molculas extremamente til no diagnstico precoce de doenas e no acompanhamento da evoluo do tratamento. O estudo do proteoma tambm tem largas aplicaes na medicina, principalmente na caracterizao de cancros e em doenas neurolgicas (como a doena de Alzheimer), infecciosas ou cardacas.

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Bibliografia
ALBERTS, Bruce; JOHNSON, Alexander; LEWIS, Julian; RAFF, Martin; ROBERTS; Keith; WALTER, Peter, Molecular biology of the cell, 4 edio Garland Science, New York 2002 http://www.mcb.uct.ac.za/western.html http://www.biology.arizona.edu/immunolo/activities/western_blot/west3html http://ntri.tamuk.edu/if/if.html http://.accessexcellence.org/LC/SS/chromatography_background.html http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/chrom/chrom1.htm

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