Antioxidantes fenlicos frente a Staphylococcus aureus de leche y carne

Marta Gutirrez-Larrinzara, Cristina de Castroa, Pilar del Vallea, Dolores de Arriagaa, M Rosario Garca-Armestob y Javier Raa

Dpto. Biologa Molecular. b Dpto. Higiene y Tecnologa de los Alimentos

Facultad de Veterinaria. Universidad de Len. Campus de Vegazana. 24007. Len. Espaa E-mail: javier.rua@unileon.es

Palabras clave: Fenoles, S. aureus, origen alimentario.

Resumen
La alteracin de alimentos por microorganismos es un problema que an no ha sido solucionado, a pesar del amplio rango de tcnicas de conservacin disponibles. Adems de su actividad antioxidante y de otros efectos beneficiosos (anticarcinognicos, antiinflamatorios, etc.), los compuestos fenlicos poseen actividad antimicrobiana frente a un gran nmero de microorganismos, como bacterias, levaduras y mohos. Las bacterias Gram positivas son unas de las ms sensibles a los compuestos fenlicos. Staphylococcus aureus pertenece a este grupo, es considerado el principal agente de contaminacin estafiloccica alimentaria y puede desarrollar fcilmente resistencia a los antibiticos. Por ello en este trabajo nos propusimos la inhibicin del crecimiento de diecinueve cepas de S aureus aisladas de distintas fuentes: leche de oveja, carne de conejo y de origen humano o clnico. Como inhibidores empleamos seis fenoles (hidroquinona, timol, carvacrol, BHA, galato y galato de octilo), cuya efectividad fue seleccionada a partir de un estudio previo realizado sobre diecinueve compuestos con actividad antioxidante. Para calcular la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y la concentracin mnima bactericida (CMB) se emple un mtodo miniaturizado (ICMSF, 1981). Como control se utiliz el antibitico penicilina G. Los 1

resultados fueron analizados estadsticamente por el mtodo de anlisis de varianza (ANOVA), a fin de establecer diferencias entre cepas segn su origen. Galato de octilo e hidroquinona fueron los fenoles ms efectivos, mientras que timol y carvacrol fueron los menos efectivos. Los valores de CMI oscilaron entre los 6-40 g/ml del octilgalato hasta los 1600 g/ml de timol y galato. Todos los compuestos fenlicos se mostraron bactericidas frente a las cepas de S. aureus, ya que los valores de CMB fueron el doble o menos de los valores de CMI. Las bacterias ms sensibles fueron las de origen lcteo, mientras que las de origen crnico fueron las ms resistentes. Este estudio prueba que los compuestos fenlicos empleados en cantidades adecuadas pueden servir para inhibir el crecimiento de S. aureus, sobre todo en leche de oveja.

Introduccin
Un compuesto fenlico o polifenlico puede ser definido como una sustancia que posee un anillo aromtico y que porta uno o ms sustituyentes hidroxlicos, adems de otros grupos funcionales (cidos, steres, glicsidos, etc.) (Shahidi y Ho, 2005). Estn ampliamente distribuidos en plantas y pueden ser encontrados en una amplia variedad de sistemas alimentarios (Lpez-Malo Vigil y otros, 2005). Estos compuestos pueden ser clasificados en los siguientes grupos: fenoles simples, cidos hidroxibenzoicos, derivados cidos hidroxicinmicos, flavonoides, estilbenos, lignanos y taninos (Shahidi y Ho, 2005). Adems de su actividad antioxidante, anticarcinognica, antiinflamatoria, etc. (Garrote y otros, 2004), los fenoles tambin pueden inhibir el crecimiento de bacterias, levaduras, mohos, virus y protozoos (Buffo y Holley, 2006; Davidson y Taylor, 2007). Entre las bacterias, las del grupo Gram positivas son ms sensibles (Lpez-Malo Vigil y otros, 2005). Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva causante de contaminacin estafiloccica alimentaria (Seo y Bohach, 2007). A pesar de ser una de las principales causas de gastroenteritis a nivel mundial, pocas investigaciones se han llevado a cabo para comparar el efecto de varios compuestos fenlicos, tanto sintticos como naturales, frente a S. aureus de distintos orgenes (lcteo, crnico, clnico, etc.) y con diferentes efectos virulentos (enterotoxignicos y no enterotoxignicos). Estudios recientes han indicado que el tipo de crecimiento y las caractersticas de inactivacin pueden variar significativamente dentro de una especie y que es necesario para la

seguridad alimentaria, la consideracin de estos comportamientos (Whiting y Buchanan, 2007). En este estudio, usamos seis compuestos fenlicos (naturales y sintticos), seleccionados de diecinueve antimicrobianos empleados en un trabajo anterior frente a S. aureus, empleando la tcnica de difusin en disco (Fernndez-lvarez, 2008). Comparamos la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y la concentracin mnima bactericida (CMB) de estos compuestos, algunos de ellos (timol y carvacrol) componentes principales de aceites esenciales y otros (hidroxianisol butilado BHA- y galato de octilo) antioxidantes sintticos usados como aditivos alimentarios. La estimacin de CMI es de inters, ya que hay una demanda creciente del conocimiento preciso de las CMI de aceites esenciales y compuestos simples para establecer un balance entre la aceptabilidad sensorial y el ensayo antimicrobiano.

Material y mtodos
Microorganismos y cultivos.- En este estudio se emplearon nueve cepas de coleccin de S. aureus, disponibles en el Departamento de Higiene y Tecnologa de los Alimentos de la Universidad de Len y diez aisladas de leche de oveja o de carne de conejo (Tabla I). Las cepas se reactivaron a partir de muestras almacenadas a congelacin (-40C) en crioteca o eppendorf con glicerol al 30% (v/v). A partir de colonias aisladas se sembraron las cepas en slants de BHIA y se guardaron, tras su incubacin, a temperatura de refrigeracin, hasta su utilizacin como cultivo de partida para los trabajos de investigacin. En todos los casos, la incubacin de los medios de cultivo se realiz a 35C. Preparacin de las disoluciones iniciales de fenoles.- Las disoluciones stock de hidroquinona, BHA y galato de octilo (3,2 mg/ml), as como de timol, carvacrol y cido glico (6,4 mg/ml) se prepararon en una parte de etanol (95% v/v) y diez partes de agua estril. El antibitico control penicilina G se disolvi en agua estril. Todas las disoluciones se prepararon inmediatamente antes de su uso. Pruebas de MIC y MBC.- Se emple el mtodo de dilucin en medio lquido miniaturizado (Barry, 1976), empleando placas de microttulo con 96 pocillos, provistos de medio Mueller-Hinton y una concentracin de microorganismo de 5 x 105 ufc/ml. Cada compuesto inhibidor se dispens en la primera fila de la placa a la concentracin 3

stock indicada anteriormente, y a partir de ella se realizaron diluciones seriadas 1:2 en las siguientes filas de la placa. Las placas se taparon con pelculas microporosas estriles y se incubaron a 35C durante 16-18 h. Tras ello, los crecimientos fueron examinados por deteccin de la turbidez a 620 nm en un lector de microplacas (Bio Kinetics Reader, 640 Microplate, Bio-Tek Instruments Cultek). Como valores de CMI se consideraron las menores concentraciones de compuesto fenlico o penicilina que inhibieron cada cepa ensayada de S. aureus. La determinacin de CMB se realiz a partir de las microplacas usadas para determinar las CMI, sembrando en placas de Petri con un medio no selectivo (BHIA + 1% YE) alcuotas de los pocillos donde se determinaron las CMI y de tres filas con diluciones ms bajas. La CMB se define como la concentracin ms pequea del compuesto antimicrobiano que produce una reduccin igual o superior al 99,9% en el nmero de clulas viables, en comparacin con la que exista en el inculo inicial. Anlisis estadstico.- Los datos se expresaron como medias desviaciones estndar de, al menos, cuatro medidas. Anlisis de varianza (ANOVA) se realizaron para establecer diferencias entre cepas individuales, incluidas en cada uno de los grupos, segn su origen. Se emple el programa de anlisis estadstico SPSS 15.0 para Windows, disponible en la Universidad de Len.

Resultados
Los valores de CMI para los compuestos ensayados se muestran en la Tabla II. En general, los compuestos fenlicos fueron menos efectivos que el antibitico penicilina G, para todas las cepas probadas. Entre los fenoles, galato de octilo fue el ms efectivo (valores de CMI de 6 a 40 g/ml), seguido por hidroquinona y BHA. Por grupos de cepas, slo se observ variabilidad entre cepas en los grupos de origen lcteo y crnico para hidroquinona y en origen crnico para galato de octilo. Dos tipos de cepas, sensibles y resistentes, fueron observadas en el grupo de origen crnico frente a galato y frente timol en el grupo de orgenes diversos. Diferencias significativas fueron encontradas entre cepas, dentro de cada grupo de origen, para la penicilina G, encontrando una mayor variabilidad en el grupo de origen lcteo (cuatro subgrupos). Adems, en general, las cepas de origen crnico fueron ms resistentes al antibitico, que las de orgenes diversos.

En general, los valores de CMB (Tabla III) fueron iguales o no ms de dos veces superiores a los correspondientes CMI, para todos los compuestos fenlicos, indicando que un efecto bactericida de todos los compuestos. La mayor variabilidad para cepas dentro de cada grupo fue observada en el origen crnico, y respecto a los compuestos, el galato de octilo fue el nico que mostr una variabilidad en los tres grupos de orgenes. El mayor efecto bactericida fue observado para galato de octilo, seguido de hidroquinona, mientras que timol y carvacrol mostraron el efecto ms bajo frente a los tres grupos de cepas.

Discusin
El rango de valores de CMI de nuestro estudio (0,003 20 g/ml) para penicilina G fue superior al indicado en otros trabajos: de 0,03 a 16 g/ml para 151 cepas de S aureus aisladas de infecciones mamarias bovinas en Finlandia (Haveri y otros, 2005) y para 30 cepas aisladas de mamitis subclinica en Portugal (Nunes y otros, 2007). Nuestras cepas ms resistentes de origen lcteo fueron 100 veces ms sensibles a las encontradas por estos autores, probablemente debido a que nuestras cepas fueron aisladas de leche de tanque y no de mamitis; adems el menor uso de penicilina G en sanidad ovina (Yamaki y col., 2004) podra contribuir a menores niveles de resistencia a este antibitico. Las muestras resistentes a penicilina G (7 cepas) mostraron un comportamiento similar a las sensibles (10 cepas) para la mayora de los compuestos fenlicos ensayados en este estudio. Sin embargo, para cido glico los valores medios de CMI para las cepas resistentes a penicilina G fueron aproximadamente 10 veces mayores (1600 g/ml) que los obtenidos para cepas sensibles a este antibitico (125 g/ml). Estos resultados podran indicar alguna conexin entre el mecanismo de resistencia a penicilina G y a cido glico, que se deber investigarse en un futuro. Para timol, el valor medio de CMI en nuestro estudio fue de 573,68 g/ml. Otros autores han indicado valores entre 360 y 500 g/ml (Walsh y otros, 2003; Falcone y otros, 2007), si bien emplearon una metodologa diferente a la nuestra. Carvacrol, al igual que los otros compuestos ensayados, fue bactericida frente a S. aureus. Este resultado est de acuerdo a lo indicado por otros autores, quienes sealaron que este fenol produce alteraciones de membrana, que conducen a la prdida de ATP intracelular 5

e iones potasio, y finalmente a la muerte celular (Knowles y otros, 2005; Ultee y otros, 1999). El carcter bactericida de BHA frente a las cepas de S. aureus, observado en este estudio, fue previamente indicado por otros autores (Pierson y otros, 1980), si bien los valores de CMI varan de unos trabajos a otros, debido a una suma de factores, tales como la metodologa usada, la variabilidad inherente a un mayor nmero de cepas ensayadas en nuestro trabajo, etc. El galato de octilo, por su parte, fue veinte veces ms eficiente en la inhibicin de S. aureus que el cido glico. Otros estudios tambin mencionan estas diferencias, no slo en S. aureus, sino en otras especies Gram positivas como Bacillus subtilis (Kubo y otros, 2002; Kubo y otros, 2004). El mecanismo antibacteriano de los alquilgalatos, como el galato de octilo, se ha asociado a su estructura especfica de pirogalol y a la longitud de la cadena alquilo.

Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado a travs del proyecto AGL2005-01793/ALI de la Direccin General de Investigacin Cientfica y Tcnica del Ministerio de Ciencia y Tecnologa.

Bibliografa
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Garca-Armesto, M.R. Calidad higinica y sanitaria de la leche de oveja en Castilla y Len. PhD. Thesis. Faculty of Veterinary-University of Len (Spain). ISBN: 847719-235-9. 1990. Garrote, G., Cruz, J.M., Moure, A., Domnguez, H. and Paraj, J.C. Antioxidant activity of byproducts from the hydrolytic processing of selected lignocellulosic materials. Trends Food Sci.Technol. 2004, 15, 191-200. Haveri, M.; Suominen, S.; Rantala, L.; Honkanen-Buzalski, T. and Pyrl. Comparison of phenotypic and genotypic detection of penicillin G resistance of Staphylococcus aureus isolated from bovine intramammary infection. Vet. Microbiol. 2005, 12, 204209. ICMSF, Microorganismos de los Alimentos. Tcnicas de anlisis microbiolgico. Vol. I. Ed. Acribia, Zaragoza. 1981. Knowles, R.J.; Roller, S.; Murray, D.B.; Naidu, A.S. Antimicrobial action of carvacrol at different stages of dual-species biofilm development by Staphylococcus aureus and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 797-803. Kubo, I.; Fujita, K-I.; Nihei, K-I. and Nihei, A. Antibacterial activity of alkyl gallates against Bacillus subtilis. J. Agric. Food Chem. 2004, 52; 1072-1076. Kubo, I., Fujita, K-I. and Nihei, K.I.. Anti-Salmonella activity of alkyl gallates. J. Agr. Food Chem. 2002, 50, 6692-6696. Lpez-Malo Vigil, A., Palou, E. and Alzamora, S.M. Naturally occurring compounds. Plant sources, p. 429-452. In P. M. Davidson, J. N. Sofos, and A. L. Branen (eds.), Antimicrobials in food. 3rd edn. CRC Press. Taylor and Francis Group, Boca Ratn, Florida. 2005. Nunes, S.F.; Bexiga, R.; Cavaco, L.M. and Vilela, C.L. Technical note: antimicrobial susceptibility of Portuguese isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis in subclinical bovine mastitis. J. Dairy Sci. 2007, 90, 3242-3246. Pierson, M. D.; Smoot, L. A. and Vantassell, K.R. Inhibition of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus by Butylated Hydroxyanisole and the propyl ester of p-hydroxybenzoic acid. J. Food Prot. 1980, 43, 191-194. Rodrguez-Calleja, J.M., Garca-Lpez, I., Garca-Lpez, M.L., Santos, J.A. and Otero, A. Rabbit meat as a source of bacterial foodborne pathogens. J. Food Prot. 2006, 69, 1106-1112. Seo, K. S. and Bohach, G. A. Staphylococcus aureus. In Food Microbiology: fundamentals and frontiers, 3rd edn; Doyle, M. P.; Beuchat, L. R., Eds; ASM Press, Washington, D. C., USA, 2007, pp. 493-518. Shahidi, F., and Ho, Ch-T. Phenolics in food and natural health products: an overview, p. 1-8. In F. Shahidi, F., and Ch.-T. Ho (eds.), Phenolic compounds in foods and natural health products. ACS Symposium Series 909. American Chemical Society, Washington, D.C. 2005. Ultee, A.; Kets, E. P. and Smid, E. J. Mechanisms of action of carvacrol on the foodborne pathogen Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 4606-4610.

Walsh, S.E.; Maillard, J.-Y.; Russell, A. D.; Catrenich, C.E.; Charbonneau, D.L. and Bartolo, R.G. Activity and mechanisms of action of selected biocidal agents on Gram-positive and negative bacteria. J. Appl. Microbiol. 2003, 94, 240-247. Whiting, R. C., and Buchanan, R.L. Progress in microbiological modeling and risk assessment, p. 953-969. In: M. P. Doyle, and L. R. Beuchat (eds.), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, 3rd edn. ASM Press, Washington, D.C. 2007.

Table 1. Cepas de Staphylococcus aureus usadas en este estudio, sus fuentes y otras caractersticas.
1

CECT 59 240

Cdigo Otras colecciones2 ATCC 9144 ATCC 6538

Fuente No especificada Humano: lesin tisular

Caractersticas adicionales3 Ensayo de antibiticos Comprobacin de agentes antimicrobianos, desinfectantes, bactericidas, etc. Cepa de referencia para sensiblidad de antibiticos con discos. Produce beta-hemolisina y enterotoxina A MRSA Produce enterotoxina B Produce enterotoxina C Produce enterotoxina D Produce enterotoxina E

435 976 4013 4459 4465 4466 5192

ATCC 25923 ATCC 13565 CCM 6188 CCTM La 2812 ATCC 19095 ATCC 23235 ATCC 27664

Aislamiento clnico Brote de intoxicacin alimentaria: jamn serrano. Glndula mamaria bovina No especificada Humano: absceso cutneo Ensalada de pavo Brote de intoxicacin alimentaria: pollo. Leche de oveja (tanque) Leche de oveja (tanque) Leche de oveja (tanque) Leche de oveja (tanque) Leche de oveja (tanque) Leche de oveja (tanque) Carne de conejo Carne de conejo Carne de conejo Carne de conejo

Aislamientos de laboratorio 168 172 180 181 202 361 SA 49 SA 164 SA 181 SA 182
1

Produce enterotoxina A No toxignica No toxignica Produce enterotoxin A No toxignica Produce enterotoxina C Produce enterotoxina C Produce enterotoxina C Produce enterotoxina B Produce enterotoxina B

, CECT: Coleccin Espaola de Cultivos Tipo. 2, ATCC: American Type Culture Collection; CCM: Czech Collection of Microorganisms; CCTM: Centre de Collection de Types Microbiens, Universidad de Lausanne (Switzerland). 3, En cepas comerciales, se sealan algunas aplicaciones y caractersticas especificadas por las Colecciones de Cultivo Tipo; en aislamientos de laboratorio se menciona el carcter enterotoxignico de acuerdo con Garcia-Armesto (1990) para cepas de leche de oveja y Rodrguez-Calleja y otros (2006) para las de carne de conejo; MRSA: S. aureus resistente a meticilina.

Tabla 2. CMIs (g/ml) de compuestos fenlicos y del antibitico control.

Origen Cepas Hidroquinona Timol Carvacrol
a

BHA

cido glico
a a a a a a a a a a a a a a a a a a

Galato de octilo

Penicilina G

CECT 59 CECT 240 OD CECT 435 CECT 4459 CECT 4465 CECT 4013 168 172 OL 180 181 202 361 CECT 976 CECT 4466 CECT 5192 OC SA 49 SA 164 SA 181 SA 182
1

75.00 28.90 62.50 25.00 75.00 28.90 62.50 25.00 100.00 0.00

a a a a a

1600.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00

b b

400.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00

a a a a

300.00 115.50 350.00 100.00 250.00 100.00 275.00 150.00 350.00 100.00
a

100.00 0.00

a a

10.94 9.38

a a a a a

0.014 0.004 0.031 0.000 0.031 0.000 0.010 0.004 0.031 0.000 0.003 0.001 0.014 0.004 0.125 0.000 0.234 0.193

a b b a b b a c a a a

125.00 50.00 100.00 0.00 100.00 0.00 100.00 0.00 100.00 0.00
a a a a

31.25 21.65 31.25 21.65 28.12 15.73 28.12 15.73 18.75 7.22
a a

425.00 50.00 400.00 0.00

ab b

350.00 100.00 400.00 0.00

a a

62.50 43.30ab 125.00 50.00 15.62 6.25 10.94 3.12 50.00 0.00
b b a ab

500.00 200.00 400.00 0.00 400.00 0.00

a a

350.00 100.00 400.00 0.00 400.00 0.00

a a a a a

143.75 173.66 450.00 251.67 250.00 100.00 250.00 100.00 250.00 100.00 250.00 100.00

150.00 57.73 87.50 25.00 100.00 0.00

a a

6.25 0.004 9.38 3.61 6.25 0.00

a a

500.00 200.00 300.00 115.47 600.00 231.00 600.00 231.00

ab a a

a a a a

400.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00

150.00 57.73 125.00 50.00 NT 125.50 50.00 100.00 0.00 NT

a

a a

17.19 9.38 5.47 1.40

a

0.012 0.004 0.012 0.004

a ab d

150.00 57.74 100.00 0.00

350.00 100.00 400.00 0.00

a b

212.50 143.60 250.00 100.00 212.50 143.60

23.44 19.35
a

0.75 0.29 0.38 0.14

175.00 50.00 62.50 21.65 100.00 0.00

b

400.00 0.00

26.56 17.95 9.38 10.52

b

0.019 0.008
b b b b b c

300.00 100.00 500.00 173.00

ab

a a a a

200.00 0.00

ab

350.00 100.00 500.00 200.00 400.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00
a a a

a a

187.50 154.80 350.00 100.00 350.00 100.00 300.00 115.47 137.50 75.00
a

31.25 12.50
b b b

ab a

0.75 0.29 0.75 0.29 4.00 2.83 4.50 2.52

300.00 115.47 150.00 50.00 200.00 0.00

a

600.00 200.00 600.00 200.00 400.00 0.00

a a

1600.00 0.00

37.50 14.43 25.00 0.00 25.00 0.00 15.62 6.25

ab

1400.00 400.00 1200.00 462.00 1600.00 0.00

b

ab ab ab

137.75 75.00

ab

400.00 0.00

20.00 8.00

; OD: Origen diverso, OL: origen lcteo, OC: origen crnico. Los valores representan la media SD de al menos dos ensayos realizados por duplicado. Los datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre ellos (p < 0.05) para un origen y un compuesto antimicrobiano. BHA: Hidroxianisol butilado. ND: No determinado.

10

Tabla 3. CMBs (g/ml) de compuestos fenlicos y del antibitico control

Origen Cepas Hidroquinona Timol Carvacrol
a

BHA
a

cido glico
a a a a a

Galato de octilo
a a

Penicilina G

CECT 59 CECT 240 OD CECT 435 CECT 4459 CECT 4465 CECT 4013 168 172 OL 180 181 202 361 CECT 976 CECT 4466 CECT 5192 OC SA 49 SA 164 SA 181 SA 182
1

150.00 57.73 75.00 28.87 87.50 25.00

a a

1600.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00

b b

400.00 0.00 > 400 400.00 0.00

b

400.00 0.00 400.00 0.00

100.00 0.00

12.50 0.00 50.00 0.00 50.00 0.00

a
b

> 0.063 > 0.125 > 0.125

b

125.00 50.00 100.00 0.00 100.00 0.00 100.00 0.00 100.00 0.00
a a a a a

a a

350.00 100.00 325.00 150.00 350.00 100.00

a

125.00 86.60 75.00 84.16b 200.00 0.00

b b a c a a b

a a

500.00 200.00 400.00 0.00

b

350.00 100.00 > 400

a a a a a a a ab a

43.75 12.50 > 50 50.00 0.00

a a a a

0.031 0.000 0.062 0.000 0.02 0.01 0.06 0.00

a a b b a a

250.00 173.20

500.00 200.00 400.00 0.00

a

400.00 0.00 400.00 0.00

400.00 0.00

600.00 231.00 400.00 0.00 400.00 0.00

a a

150.00 58.00 150.00 58.00 150.00 58.00

> 25 50.00 0.00 > 25 34.38 18.75 12.50 0.00

b ab ab a

31.25 21.65 12.50 0.00

600.00 231.00 400.00 0.00 400.00 0.00

a a

400.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00

a

0.38 0.14 0.38 0.14

75.00 28.87 200.00 0.00 400.00 0.00

300.00 115.00 400.00 0.00

a

200.00 0.00 100.00 0.00

a a

0.016 0.000 0.016 0.000 1.00 0.0

c

1000.00 692.00 700.00 200.00 400.00 0.00

c ab a a a a a a

400.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00 200.00 0.00

312.00 175.00 400.00 0.00

ab ab ab

ND 150.00 58.00 100.00 0.00 ND > 800 > 800 100.00 0.00
a a

31.25 12.50 > 50 25.00 0.00

a

400.00 0.00

0.062 0.000 1.00 0.00

a b b b b c

125.00 86.60 400.00 0.00

a

300.00 115.00 500.00 200.00 600.00 231.00

ab

212.50 143.60 212.50 143.60 600.00 231.00 400.00 0.00 400.00 0.00 400.00 0.00
ab a a

b b a

300.00 115.74 300.00 115.74 150.00 57.73 75.00 28.87

a a

400.00 100.00 600.00 231.00 400.00 0.00 400.00 0.00 > 400
ab a

31.25 12.50 75.00 29.00 50.00 0.00 12.50 0.00 50.00 0.00
a
b

1.00 0.00 1.00 0.00

600.00 231.00 1600.00 0.00 400.00 0.00

b a

ab

16.00 0.00 > 0.063 > 0.125

125.00 50.00

; OD: Origen diverso, OL: origen lcteo, OC: origen crnico. Los valores representan la media SD de al menos dos ensayos realizados por duplicado. Los datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre ellos (p < 0.05) para un origen y un compuesto antimicrobiano. BHA: Hidroxianisol butilado. ND: No determinado.

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