Efectos de la luz en el cultivo fotomixotrfico de la pia en Biorreactores de Inmersin Temporal.

Luis A. Molina El Hage1, Maritza Escalona2, Romelio Rodrguez2, Abdulnour Jihad3; Desjardins Yves3, Justo L. Gonzlez-Olmedo2.
1

CEASE, Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. chichimolina@hotmail.com 2 Centro de Bioplantas, UNICA, Ciego de Avila, Cuba. 3 ENVIROTROM, Laval University, Quebec, Canad.

Resumen: La pia es una importante especie vegetal cultivada en muchos pases de Centro y Sur Amrica, as como de la regin Asia-Pacfico. En Bolivia, la produccin pia se concentra en la zona del Chapare, Departamento de Cochabamba y la Provincia Guarayos del Departamento Santa Cruz, donde la produccin de ste cultivo, est limitada por la falta de tecnologas que garanticen el abastecimiento de semillas de alta calidad para cubrir la demanda de las reas de produccin. Una solucin a este problema podra ser el emprendimiento de tcnicas de micropropagacin por la va de la Biotecnologa. El desarrollo de la biotecnologa de la pia, como el de cualquier otra especie, depende de la disponibilidad de mtodos eficientes para la propagacin in vitro y de un nmero de herramientas moleculares. En los ltimos aos, se ha demostrado que el empleo de los Biorreactores de Inmersin Temporal (BIT) genera mayor calidad en las plantas que los mtodos tradicionales de micropropagacin, debido al mejor manejo de los ambientes in vitro y de la nutricin. Sin embargo las condiciones en los BIT pueden ser mejoradas aun ms, esto se logra por ejemplo al favorecerse el fotomixotrofismo como un eslabn intermedio al crecimiento fotoautotrfico que caracteriza la aclimatizacin ex vitro, siendo estos los objetivos del presente trabajo. Los efectos de la luz sobre la evolucin de CO2 se evaluaron en los frascos de cultivo, mostrando una reduccin durante la etapa luminosa del fotoperiodo y un incremento en la oscuridad, cuando se compararon los segundos ciclos de inmersiones bajo dos condiciones de luz. Los brotes de pia alcanzaron valores de fotosntesis neta (Fn) superiores a 1,30 mol CO2.s-1 .10 cm-2, pero sin diferencias estadsticas entre ambas intensidades lumnicas, por lo que se presume que ellos utilizan ms los nutrientes del medio de cultivo que sus propios fotosintatos para elaborar sus reservas. La luz tambin increment la calidad de las plantas. Durante la aclimatizacin ex vitro, al inicio las plntulas redujeron la Fn, pero luego de dos semanas la incrementaron. La Fn se redujo de nuevo a los 21 das de transferidas las plantas a exteriores, quizs por insuficientes estmulos ambientales.

Palabras claves: aclimatizacin.

evolucin

de

CO2,

fotosntesis,

Effects of light on photomixotrophic culture in Temporary Immersion Bioreactores of pineapple plantlets. Abstract:
The development of pineapple biotechnology, as with any other crop, is dependent on the availability of a number of efficient methods for in vitro propagation and molecular tools. The use of Temporary Immersion Biorreactors (TIB) generates higher plant quality than the traditional micropropagation methods, due to the better in vitro environment and nutrition handling. However, even the TIB conditions can be improved, by favoring the photomixotrophism as an intermediate link of the photoautotrophic growing, which is characteristic of the ex vitro acclimatization, and these are the objectives of this research. The effects of light on the CO2 evolution in the culture flasks were evaluated, showing a reduction in the light and a rising in the dark, when it were compared the second cycles of the immersions under both conditions. Pineapple shoots recorded values of Pn higher than 1,30 mol CO2.s-1 .10 cm-2 but without statistical differences among both light intensities, then it is presumably that the pineapple shoots seem to utilize more the culture medium nutrients than their own photosynthates to elaborate the reserve substances. Also light increased the plant quality. During ex vitro acclimatization plantlets reduced Pn at the beginning, later two weeks increased it. Pn was reduced again on 21day after of transfer, perhaps for insufficient environmental stimulation.

Key words: CO2 evolution, photosynthesis, acclimatization. Introduccin: La pia es uno de los cultivos ms importantes en Centro- y Sud-Amrica as como la regin del Asia-Pacifico. A pesar de que el cultivo se remonta a la poca pre-colombina existen muy pocas variedades comerciales, y slo el cultivar Cayena lisa domina la produccin comercial. La mejora gentica de variedades es muy difcil en pia y se ha avanzado muy poco en comparacin con otras importantes especies como trigo o arroz. Esta caracterstica hace a la pia especialmente idnea para la aplicacin de ingeniera gentica que permite incorporar caractersticas especificas de otras especies sin cambiar el conjunto del genoma (Botella y Fairbairn, 2002), entre ellas mecanismos de resistencia a estrs biticos y abiticos, eficiencia metablica, que las haga competentes en programas de seguridad alimentaria. La pia es la segunda fruta tropical ms importante al nivel mundial en cuanto a volumen de produccin, en el 2000 sta

ascendi a 13,7 millones de toneladas, para ocupar el 23% del total de la comercializacin de frutas tropicales. Se reconoce que el 70% se consume en los propios pases productores y los restantes 4,1 millones de toneladas se comercializan como frutos frescos, conservas y zumos directos o concentrados (FAO, 2001, http://www.pineapleinn.com/reviews.html). Estas altas tasas de produccin y consumo justifican investigaciones que traten de mejorar el material vegetal y los sistemas de propagacin empleados. La micropropagacin de la pia incluye la secuencia de cultivos en medio lquido para la multiplicacin de meristemos y yemas axilares mediante la llamada micropropagacin convencional (Firoozabady et al., 1997; Daquinta y Benega, 1997), la cual est muy limitada para lograr la cantidad de plantas requeridas anualmente para iniciar nuevas plantaciones. El cultivo en biorreactores de inmersin temporal (BIT) supera el nmero de plantas con mayor calidad y abarata los costos de produccin (Escalona et al., 1999). Las investigaciones en el cultivo in vitro de plantas se han enfocado fundamentalmente en las respuestas fisiolgicas, bioqumicas y moleculares debidas a la composicin del medio de cultivo. En los ltimos aos un significativo nmero de trabajos se realizan sobre los efectos ambientales sobre el crecimiento de las plntulas (Nguyen y Kozai, 1998; Gonzlez-Olmedo et al., 2001). En pia Gonzlez-Olmedo et al. (2002) informaron incrementos en la calidad de los brotes por manejos de los BIT con aire enriquecido con CO2, dos concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo y dos niveles de flujo de fotones fotosintticos (FFF). La luz es un determinante componente del sistema de propagacin. El crecimiento de las plntulas in vitro se estimul en muchas especies por incremento en la fotosntesis, debida a mayor nmero de intercambios gaseosos (Kozai y Sekimoto, 1988), aire enriquecido con CO2 (Desjardins et al., 1988; Kirdmanee et al., 1995 a,b), reduccin de sacarosa en el medio de cultivo (Hdider y Desjardins, 1995) y manejo de la luz (Hayashi et al., 1993). Kitaya et al. (1995) tambin destacan el papel de la luz y su calidad en la propagacin in vitro de plntulas de papa. De igual modo en este trabajo se evalan los efectos de dos niveles de FFF sobre los brotes de pia cultivados en BIT enriquecidos con CO2. Materiales y Mtodos: Propagacin del material vegetal: Los brotes de pia (Ananas comosus L. Merr) del cultivar Cayena lisa se cultivaron en Biorreactores de Inmersin Temporal (BIT) segn describen Escalona et al.,1999, con las modificaciones impuestas por los tratamientos: luz (FFF= 80 y 275 mol m-2s-1), y aire enriquecido con CO2 (2000 mol.mol-1). Cada tratamiento const de tres repeticiones.

Determinacin de la concentracin de CO2: Los contenidos de CO2 se midieron en un cromatgrafo gaseoso, modelo Perkin Elmer 8500, dotado con un detector de ionizacin de llama, con columna Poropak Q y un integrador modelo HP3393A. Como gas transportador se emple He con un flujo de 30 psi. Determinacin de la fotosntesis neta: Al final del experimento in vitro y cada siete y hasta 21 das durante la aclimatizacin, diez plantas completas se utilizaron para medir sus capacidades fotosintticas. La Fn fue calculada a partir de la tasa de asimilacin neta de CO2 por el rea foliar total de cada planta colocada en cmara para hojas de conferas acoplada a un analizador infrarrojo de gases (IRGA) modelo LI- 6400, porttil. El PAR de saturacin para la pia fue prximo a 600 mol m-2s-1. Variables de crecimiento: Al final del experimento in vitro se cosecharon todas las plntulas, se contaron y se determin las masas frescas por pesada en balanza analtica. Condiciones de aclimatizacin: Las plntulas de cada tratamiento fueron transferidas a casas de cultivos con las siguientes condiciones ambientales, todas medidas a las 12m: FFF= 150 mol m-2s-1; HR= 95 1%; Temperatura: 25 1C. Como sustrato se emple turba y el riego fue por nebulizadores areos bajo control automatizado para garantizar la HR antes referida. Resultados y Discusin: La luz es uno de los aspectos ms crticos en la produccin de plantas. Muchas investigaciones han evaluado los efectos de la intensidad de la luz, su espectro de distribucin y su ciclo, pero comparativamente poco se ha hecho sobre el efecto en la evolucin del CO2 en los frascos de cultivo. En la figura 1 se comparan las dinmicas de evolucin del CO2 durante el segundo ciclo de inmersiones bajo condiciones de luz y oscuridad segn el fotoperodo, para ambos tratamientos de FFF. Figura 1: En la oscuridad, la acumulacin de CO2 en el interior de los frascos de cultivo sometidos a FFF= 275 mol m-2s-1 super en ms del doble la concentracin del aire enriquecido, cuando fue de mil unidades ms que la mxima concentracin determinada en los frascos del tratamiento con menor FFF, en ambos casos al final del segundo ciclo de inmersin a la oscuridad. Por otra parte este comportamiento se invierte durante la fase iluminada del fotoperodo. Cuando las plantas estn iluminadas los contenidos de CO2 en los frascos de cultivo de los BIT decrecieron durante el segundo ciclo de inmersin. La reduccin fue ms intensa en el tratamiento con mayor intensidad lumnica, particularmente en la primera hora siguiente a la inmersin. Un significativo consumo de CO2 tiene lugar tan pronto como las plntulas son iluminadas, cuando crecen bajo

condiciones caracterizadas por microambientes enriquecidos con CO2 y mayores FFF. Esta intensa tasa de asimilacin puede agotar el CO2 disponible en el interior de los frascos debido al crecimiento vigoroso de los brotes (Kitaya et al., 1996). En correspondencia con esta valoracin se aprecian los efectos de ambos tratamientos sobre las variables de crecimiento en la tabla 1. Figura 1. Diferencias en la evolucin del CO2 durante el segundo ciclo de inmersiones en el cultivo de pia en BIT bajo dos intensidades de luz.
Concentracin de CO 2
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 HORA 0 HORA 1 HORA 2

Significacin

Ns

ANOVA, test de rangos mltiples de DUNACAN para P 0,05 %. N=15 y 3 para mf y nmero de brotes respectivamente

Las plantas CAM entre las que como se conoce se encuentra la pia, tienen mecanismos para la separacin temporal de CO2 por fijacin y reduccin respectivamente. En la oscuridad se fija CO2 como malato y en la luz se libera para ser reducido por la Rubisco en fotosntesis. Las plantas del tipo CAM toman este CO2 atmosfrico cuando los estomas estn abiertos (Winter, 1985) al final de la fase iluminada del fotoperodo. As el comportamiento antes descrito no se corresponde con los resultados de este estudio, de modo que se supone operaron ms los mecanismos de plantas C 3, dadas por las condiciones del cultivo en los BIT. Independientemente de las rutas metablicas seguidas, en las plntulas propagadas bajo mayor FFF se mejor la calidad de ellas con ligeros incrementos en la actividad fotosinttica al final del cultivo in vitro o momento de transferencia a las casas de cultivo (figura 2). En la figura 2, se observa que los brotes de pia redujeron la actividad fotosinttica al ser transferidos a condiciones ex vitro, cualquiera hubieran sido las intensidades de luz con las que fueron propagados, aunque resultaron ms marcadas en las de mayor FFF. Son reconocidos los cambios bioqumicos y fisiolgicos que ocurren en las plntulas de la inmensa mayora de las especies durante este trnsito, con ellas se atenan los efectos estresantes impuestas por las drsticas variaciones ambientales (Van Huylenbroeck et al., 1998;Pospisilova et al., 1999). Figura 2. Comportamiento de la Fn en los primeros 21 das de la aclimatizacin de las plntulas de pia propagadas en BIT bajo dos FFF.
2
Fn (mol CO2 10

80 ? mol m-2s-1

275? mol m-2s-1

Diferencias en la evolucin del CO2 durante el segundo ciclo de inmersiones en oscuridad

2500

Concentracin de CO2

2000 1500 1000 500 0 HORA 0 HORA 1 HORA 2

80 mol m-2s-1

275 m-2s-1 mol

Diferencias en la evolucin del CO2 durante el segundo ciclo de inmersiones en luz

Tabla 1: Los suplementos de CO2 al aire que alimenta los BIT mejoraron las condiciones para el crecimiento fotomixotrfico de los brotes de pia. La mayor intensidad lumnica favoreci la fijacin del gas por las plntulas incrementando significativamente la calidad de las mismas expresada en su masa fresca. Es importante recordar que en esta fase se trata de mejorar la calidad de los brotes y no el nmero de ellos, para favorecer su aclimatizacin ex vitro. Tabla 1: Efectos de la Intensidad de Luz sobre la Cantidad y Calidad de los Brotes de Pia Propagados en BIT Enriquecidos con CO2 Tratamiento Masa fresca Nmero de brotes FFF mol (g) m-2s-1 80 15,2 21,5 275 23,1 16,5 ES x 0,38 4,24

1,5 1 0,5 0 0 Das 7 Das

80 (mol m-2s-1

14 Das
275 (mol m-2s-1

21 Das

Los mximos porcentajes de supervivencia en ambos grupos de plantas tambin demuestran que la acumulacin de sustancias de reservas se debi ms a movilizaciones desde el medio de cultivo que a partir de los propios fotosintatos. La recuperacin parece iniciarse luego de dos semanas en las casas de cultivo, con ligera tasa de incremento superior para las plantas provenientes de mayores intensidades lumnicas, tal vez mejores adaptadas para el cultivo fotoautotrfico. Sin embargo una semana despus de nuevo la Fn se redujo en ambos grupos, presumiblemente por los

insuficientes estmulos ambientales, entre ellos la luz que nunca rebas 150 mol m-2s-1. Yanes et al. (2001) describieron las exigencias de luz para la aclimatizacin y dinmico crecimiento de las plntulas de pia propagadas en BIT, las que son muy superiores a las logradas en las casas de cultivo que se emplearon en este experimento, que pudieron limitar las posibilidades de las plantas objeto de estudio. Ellas debieron estar en este caso mejor preparadas para el cambio, en correspondencia con las conclusiones de Kadlecek et al. (2001) sobre la eficiencia de pretratamientos in vitro para la supervivencia y crecimiento de las plantas durante la aclimatizacin ex vitro. Bibliografa: Botella, J. L., Fairbairn. D. J. 2002. Present and future potential of pineapple biotechnology. Fourth Int. Pinapple Symp. Biotech. 2.0 Daquinta, M., Benegas, R. 1997. Brief Review Of Tissue Culture Of Pineapple. Pineapple News. 3: 7-9. Escalona, M., Lorenzo, J. C., Gonzalez, B., Daquinta, M., Gonzalez, J., Borroto, C., Desjardins, Y. 1999. Pineapple (Ananas Comosus L. Merr) Plant Propagation In Temporary Immersion System. Plant Cell Report 18(9): 743-748. Gonzlez-Olmedo, J. L., Escalona, M., Abdulnour, J., Desjardins, Y. 2001. Cultivo fotomixotrfico de la pia (Ananas comosus L. Merr) en biorreactores de inmersin temporal. Libro de Reportes Cortos BioVeg: 66. Gonzlez-Olmedo, J. L., Fundora, Z., Molina, L. A., Abdulnour, J., Desjardins. Y. Escalona M. 2002. New contribution to propagation of pineapple (Ananas comosus L. Merr) in temporary immersion bioreactors. Fourth Int. Pinapple Symp. Biotech. 3.08. Hayashi, M., Kozai, T., Tateno, M., Fujiwara, K., Kitaya, Y. 1993. Effects of the lighting cycle on the growth and morphology of potato plantlest in vitro under photoautotropic culture conditions. Environ. Control Biol. 31:161-166. Hdider, C., Desjardins, Y. 1995. Reduction Of Ribulose 1-5 Bisphosphate Carboxilase/Oxigenase Efficiency By The Presence Of Sucrose During The Tissue Culture Of Strawberry Plantlets . In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant 31: 165-170. Kitaya, Y., Fukuda, O., Kozai, T., Kirdmanee, C. 1995. Effect of light intensity and lighting direction on photoautotrophic growth and morphologi of potato plantlest in vitro. Scientia Horticulturae, 62:15-24. Kitaya, Y., Mohapatra, S.C., Kubota, C. Kozai, T. 1996. Advantages Of Photoautotrophic Micropropagation For Space Agriculture. In: Suge, H. (Ed.) Plants In Space Biology. Pp. 235-244.

Kirdmanee, C., Kitaya, C., Kozai, T. 1995b. Rapid Acclimatization of Eucalyptus plantlets by controlling photosynthetic photon flux density and relative humidity. Environ. Control Biol. 33(2): 123-132. Kozai, T., Sekimoto, K., 1988. Effects of number of air exchange per hour of the closed vessel and photosynthetic photon flux density on the carbon dioxide concentration in side de vessel and the growth of Strawberry plantlets in vitro. Environ. Control Biol. 26:21-29. Nguyen, Q. T., Kozai, T. 1998. Environmental Effects Of The Growth Of Plantlets In Micropropagation. Environ. Control Biol. 36(2): 59-75. Pospsilov, J., Synkova, H., Haisel, D., Catsky, J., Wilhelmova, N., Sramek, F. 1999. Effect Of Elevated CO2 Concentration On Acclimatization Of Tobacco Plantlets To Ex Vitro Conditions. Journal Of Experimental Botany. 50(330): 119-126. Van Huylenbroeck, J. M., Piqueras, A., Debergh, P. C. 1998. Photosynthesis And Carbon Metabolism In Leaves Formed Prior And During Ex Vitro Acclimatization Of Micropropagated Plants. Plan Science 134: 21-30. Yanes E., Gonzlez -Olmedo, J., Rodrguez, R. 2000. Light Management During Acclimatization Of Pineapple (Ananas Comosus (L.) Merr.) Cv. Cayena Lisa 'Serrana' Vitroplants. No. 7 Newsletter Of The Pineapple Working Group, International Society For Horticultural Science. Luis A. Molina El Hage chichimolina@hotmail.com Telef. 3561170 - 71644049 Santa Cruz -Bolivia