Centro Universitrio Fundao Santo Andr Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras

CURSO: CINCIAS BIOLGICAS

MICROBIOLOGIA Atividades Prticas

4 ANO

NOME:

N:

Profa. Dra. Mrcia Zorello Laporta 2007

Sumrio
Parte A

Normas de segurana no laboratrio de Microbiologia ...................................................................... 2 Atividade 1 Tcnica da Colorao de Gram ................................................................................... 3 Atividade 2 Colorao de Cpsula ................................................................................................ 6 Atividade 3 Colorao de Esporos ................................................................................................ 8 Atividade 4 Colorao de BAAR (Mtodo de Zielh-Neelsen) ............................................................ 10 Atividade 5 Colorao de Espiroqueta........................................................................................... 12 Atividade 6 Estudo de microrganismos ......................................................................................... 15

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas prticas no laboratrio de microbiologia tm como objetivos possibilitar ao aluno a aprendizagem das tcnicas comumente utilizadas, o desenvolvimento da capacidade de formular hipteses e interpretar resultados e possibilitar o conhecimento e a utilizao de normas de segurana exigidas neste tipo de laboratrio. Nessas aulas, so utilizadas uma grande variedade de bactrias, algumas potencialmente patognicas para o homem, principalmente quando em meios de cultura. Portanto, essencial seguir as normas de segurana estabelecidas para um laboratrio de microbiologia, a fim de se evitar contaminao dos estudantes, professores e funcionrios. 1. Use sempre avental dentro do laboratrio. No o utilize fora do laboratrio. 2. Mantenha cabelos longos sempre presos. 3. Desinfete a bancada de trabalho no incio e trmino de cada aula prtica. Para essa finalidade, utiliza-se lcool 70%. Com este procedimento, os microrganismos que poderiam contaminar a rea de trabalho so removidos. 4. Lava as mos ao entrar e sair do laboratrio e sempre que suspeitar de contaminao. 5. No coma, beba, fume, aplique cosmticos, mexa em lentes de contato ou coloque objetos (lpis, dedo etc) na boca, procedimentos eficientes de autocontaminao. 6. Tenha cuidado ao utilizar o bico de gs. Ao acender, verifique se no existem substncias inflamveis por perto. Ao trmino da aula, desligue corretamente o gs. 7. Flambe alas, agulhas e pinas antes e aps o uso. A correta flambagem dos materiais evita a formao de aerossis, um dos meios mais eficientes de contaminao. 8. No utilize pipeta sem a devida proteo de algodo. Isso evita que voc seja contaminado se estiver pipetando uma cultura bacteriana em meio lquido. 9. No coloque materiais contaminados (pipetas, lminas etc.) sobre a bancada. Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que sero dispostos em cada bancada. 10. Siga as normas de uso dos aparelhos. O microscpio um instrumento de trabalho valioso e deve ser manipulado cuidadosamente. 11. Avise ao professor, imediatamente, caso ocorra qualquer tipo de contaminao ou outro tipo de acidente. 12. Lembre-se que voc responsvel pelo material que receber.

ATIVIDADE 1 TCNICA DA COLORAO DE GRAM INTRODUO A colorao de Gram uma das principais tcnicas utilizadas para a visualizao microscpica da forma e dos arranjos dos diferentes tipos de bactrias. Considerado um mtodo diferencial, permite classificar as bactrias em Gram positivas ou Gram negativas, de acordo com as propriedades tintoriais da clula bacteriana. OBJETIVOS Aprender a realizar a colorao de Gram e compreender porque determinadas bactrias se comportam como Gram positivas ou Gram negativas. MATERIAL material retirado da boca iogurte fermento Fleischmann (fermento biolgico) ou fungo Saccharomyces culturas bacterianas em caldo e em gar nutriente lminas de vidro PROCEDIMENTO 1 Preparo dos esfregaos Para material em meio lquido (iogurte, fermento em gua, cultura bacteriana em caldo). Com auxlio da ala de inoculao previamente esterilizada, colocar 2 - 3 alquotas da amostra em uma lmina de vidro. Espalhar bem sobre a superfcie da lmina, fazendo movimentos circulares. Deixar secar ao ar. Flambar a ala na chama do bico de gs antes de recoloc-la em seu lugar. Para material em meio slido (culturas bacterianas em placa) Com auxlio da ala de inoculao, previamente esterilizada, colocar uma gota de soluo salina na superfcie de uma lmina de vidro. Flambar a ala, deixar esfriar e coletar uma alquota da cultura bacteriana. Misturar na gota de soluo salina, fazendo uma suspenso homognea. Deixar secar ao ar. Flambar a ala na chama do bico de gs antes de recoloc-la em seu lugar. Para material retirado da boca Friccionar a superfcie da mucosa oral com um cotonete estril. Fazer um esfregao com o material coletado, na superfcie de uma lmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar secar ao ar. 2 Fixao dos Esfregaos Aps a secagem, fixar os esfregaos, passando as lminas cerca de 3 vezes sobre a chama do bico de gs. Deixar esfriar e corar. 3 Colorao de Gram ala de inoculao cotonetes reagentes para a colorao de Gram (violeta de genciana, lugol, lcool 95, fucsina ou safranina) recipiente para a colorao de Gram

cerevisiae

 Colocar a lmina no recipiente para a colorao de Gram. Cobrir o esfregao com soluo de violeta de genciana. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante no recipiente. Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto, e desprezar o corante no recipiente. Inclinar a lmina, gotejar lcool etlico a 95% at que no haja desprendimento de corante. Lavar a lmina rapidamente em gua corrente. Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lmina. Secar com papel toalha sem esfregar a lmina. Observar ao microscpio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de leo mineral na lmina e focalizar com objetiva de imerso. Desenhar as bactrias observadas considerando o tipo de colorao (Gram + ou -), a forma e o arranjo das clulas. Aps o uso, a objetiva de imerso deve ser limpa com papel absorvente. RESULTADOS Desenhe o que voc observou

iogurte

fermento

cultura bacteriana em caldo

cultura bacteriana em placa Complete o quadro a seguir. Material iogurte fermento cultura em caldo cultura em placa material da boca

material retirado da boca

Morfologia

Arranjo

Gram

DISCUSSO 1. Complete o quadro a seguir, descrevendo o que ocorre na colorao de Gram. Bact ria Soluo cristal violeta lugol lcool fucsina Gram + Gram -

2. Como voc explica o comportamento das bactrias G + e G - na colorao de Gram?

3. As bactrias do gnero Mycobacterium no se coram pelo mtodo de Gram. Qual seria uma explicao para esse fato?

4. Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixao do material, as bactrias G+ passam a se comportar como G-. Qual seria uma explicao para esse fato?

5. Em geral, os corantes bsicos como violeta de genciana, safranina e fucsina, no penetram em clulas vivas. Qual a relao entre esta informao e as etapas que voc seguiu para realizar a colorao de Gram?

6. Sabe-se que quando em culturas velhas, bactrias G+ podem se comportar como G . Voc acha que bactrias G na mesma situao poderiam se comportar como G+? Justifique.

ATIVIDADE 2 COLORAO DE CPSULA INTRODUO Certas bactrias Gram + e Gram - produzem cpsula, camada viscosa, externa parede celular. Essa estrutura no constitui carter morfolgico permanente, aparecendo somente sob certas condies de cultura. A cpsula constitui um dos antgenos de superfcie das bactrias e geralmente formada por polissacardeos e mais raramente por protenas. A cpsula pode ser visualizada por colorao negativa onde estruturas que no so coradas, so visualizadas contra um fundo escuro. OBJETIVOS Aprender a realizar a colorao para cpsula e compreender o princpio dessa tcnica. MATERIAL culturas recentes de bactrias vermelho congo 25 mg/mL cido hidroclordrico 0,15 mol/L-1 fucsina de Ziehl-Neelsen lminas de vidro ala de inoculao

PROCEDIMENTO (Mtodo de White modificado) Colocar 1 a 2 gotas de vermelho congo na extremidade de uma lmina de vidro. Coletar uma alada da cultura bacteriana e misturar no vermelho congo. Com auxlio de outra lmina de vidro, espalhar a mistura por toda a lmina, formando uma pelcula fina. Aquecer chama fracamente para secar. Cobrir o material com cido hidroclordrico. Retirar o excesso do cido, e aquecer rapidamente, passando a lmina sobre a chama. Cobrir o material com fucsina de Ziehl-Neelsen por 10 a 15 segundos. Retirar o excesso de corante e secar delicadamente com papel toalha. Observar ao microscpio. RESULTADO Desenhe o observado e coloque legendas.

Cultura A

Cultura B

DISCUSSO 1. Por que a tcnica denominada colorao negativa?

2. Qual a forma das bactrias em A? E em B?

3. Se eu fizer colorao para cpsula o que posso dizer sobre o Gram da bactria?

ATIVIDADE 3 COLORAO DE ESPOROS (COLORAO DE SCHAEFFER-FULTON) INTRODUO O esporo ou endsporo bacteriano uma clula de parede espessa formada no interior de algumas bactrias. muito resistente ao calor, dessecao e outros agentes qumicos e fsicos, sendo capaz de permanecer em estado latente por longos perodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova clula vegetativa. O esporo formado por vrios envoltrios. O primeiro, mais externo, fino, formado por protenas, denominado exosprio. Abaixo do exosprio fica a capa do esporo, formada por vrias camadas de protenas ricas em ligaes de dissulfetos, resposveis pela resistncia do esporo a agentes qumicos e fsicos. Mais internamente fica o crtex do esporo, formado por camadas de peptidioglicano. Abaixo do crtex localiza-se o protoplasto ou ncleo do esporo formado pela parede celular, citoplasma, material gentico etc, provenientes da clula vegetativa. Os esporos so difceis de serem corados pois os corantes geralmente no atravessam a parede do esporo a no ser que seja utilizado o calor, como na colorao de Schaeffer-Fulton. OBJETIVOS Aprender a realizar a colorao de esporos e compreender o princpio dessa tcnica. MATERIAL cultura bacteriana em meio slido cultura de solo em meio lquido e slido verde malaquita safranina lminas de vidro ala de inoculao

PROCEDIMENTO (mtodo de Wirtz-Conklin) Preparar esfregaos em lmina das culturas bacterianas. Secar ao ar e fixar pelo calor. Corar a quente, com soluo aquosa de verde malaquita, aquecendo at a emisso de vapores, durante 6 minutos. Lavar suavemente em gua corrente. Corar com safranina, por 30 segundos. Lavar suavemente em gua corrente. Secar ao ar e observar ao microscpio. RESULTADO Desenhe o observado com legendas.

Cultura bacteriana em meio slido

Cultura de solo

DISCUSSO 1. Em qual cor visto o esporo? E a clula vegetativa? Explique como isso ocorre.

2. Por que essa colorao feita a quente?

3. A clula vegetativa retm o verde malaquita aps a 1 lavagem com gua? E o esporo?

4. Qual a funo da safranina?

5. Qual a razo de utilizarmos cultura de solo?

6. Qual a diferena bsica entre uma clula vegetativa e um endsporo?

ATIVIDADE 4 COLORAO DE BACTRIAS LCOOL CIDO RESISTENTES (MTODO DE ZIEHLNEELSEN) INTRODUO Esta colorao permite a visualizao de um grupo restrito de bactrias que possuem uma parede celular constituda de lipdeos complexos (cidos graxos cidos miclicos - e ceras) em grande concentrao, provavelmente responsveis pela propriedade de resistncia ao lcool cido. Quando os lipdeos so removidos pelo ter, perde-se esta propriedade. Assim, durante a colorao, a fucsina se fixa firmemente a esses lipdeos, no sendo removida durante a lavagem com lcool cido. OBJETIVOS Aprender a realizar a colorao de esporos e compreender o princpio dessa tcnica MATERIAL BCG (bacilo de Calmette e Guerin) Mycobacterium bovis material retirado da boca fucsina de Ziehl-Neelsen lcool-cido clordrico azul de metileno lminas de vidro ala de inoculao cotonete estril

PROCEDIMENTO Preparar esfregaos dos materiais em lmina de vidro, secar ao ar e fixar pelo calor. Cobrir o esfregao com fucsina de Ziehl-Neelsen e aquecer em chama at a emisso de vapores. O aquecimento no deve ser muito drstico, a ponto de ferver o corante, mas apenas at ligeira emisso de vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos. Lavar a lmina em gua, suavemente. Cobrir com lcool-cido clordrico, por um minuto. Lavar a lmina com gua. Cobrir o esfregao com azul-de-metileno, durante um minuto. Lavar a lmina com gua, secar e observar ao microscpio com a objetiva de imerso.

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RESULTADO Desenhe o observado e coloque legendas.

BCG DISCUSSO 1. Complete os espaos no quadro a seguir.

Material retirado da boca

Solues em ordem de aplicao 1 Fucsina de Ziehl 2 lcool - cido clordrico

Reao e aspectos da bactria BAAR BNAAR Bactrias coradas em _______ A fucsina ______________ nos componentes da parede celular e o lcoolcido____________________ A clula fica_______________ Bactrias coradas em _______ A fucsina ______________ nos componentes da parede celular e o lcoolcido____________________ A clula fica_______________ A clula visualizada em_________porque______

3 Azul de metileno

A clula visualizada em__________porque______

2. As coloraes podem ser classificadas em: a) Simples, qundo ocorre a aplicao de um nico corante que cora a clula inteira; b) Diferencial, quando utiliza uma combinao de corantes, o que permite observar diferenas qumicas entre as bactrias; c) Estrutural, quando cora apenas uma parte da clula, o que possibilita diferenci-la das demais. Como voc classificaria a colorao de Ziehl-Neelsen de acordo com as informaes acima? Justifique.

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ATIVIDADE 5 OBSERVAO DE ESPIROQUETAS INTRODUO As espiroquetas so bactrias espiraladas, delgadas e flexveis. Amplamente distribudas na natureza, muitas so encontradas na cavidade oral humana e algumas podem causar doenas como a sfilis, a leptospirose e a doena de Lyme. Esses microrganismos podem ser observados ao microscpio em preparaes a fresco ou pela tcnica de Fontana-Tribondeaux, em que sais de prata impregnam a superfcie da bactria tornando-a mais espessa. Espirilos e espiroquetas tem pouca afinidade pelos corantes comumente empregados e coram-se fracamente. Quando tratados com sais de prata, as espiroquetas podem ser visualizadas em marrom-escuro ou negro contra um fundo castanho-amarelado. MATERIAL material retirado da boca material retirado do aqurio cultura em gar semi-slido (Proteus sp.) soluo fixadora lcool absoluto mordente (soluo de tanino) soluo de nitrato de prata amoniacal gua destilada lminas de vidro cotonete estril ala de inoculao

PROCEDIMENTO 1. Colorao pela tcnica de Fontana-Tribondeaux Fazer um esfregao com material retirado da mucosa bucal em uma lmina e secar ao ar (no fixar pelo calor ). Com auxlio da ala de inoculao, preparar um esfregao da cultura bacteriana em meio semi-slido. Cobrir o material com soluo fixadora, durante 30 seguntos. Desprezar, cobrir novamente com a soluo fixadora, durante 30 segundos. Cobrir o material com lcool absoluto, desprezar o excesso e deixar evaporar. Cobrir o material com soluo de tanino (mordente) e aquecer a lmina at a emisso de vapores, durante 30 segundos. Lavar em gua destilada. Cobrir o material com soluo de nitrato de prata amoniacal, durante 10 a 15 segundos. A seguir, aquecer ligeiramente a lmina, at o desprendimento de vapores, por 30 segundos (a preparao deve adquire a cor marrom). Lavar em gua destilada. Secar delicadamente com papel-filtro. Observar com objetiva de imerso.

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2. Preparao a fresco Colocar 1 a 2 gotas de gua de aqurio em uma lmina e cubrir com lamnula. Observar com objetiva de imerso.

RESULTADO Desenhar o observado com legendas.

Material da boca

Material retirado de aqurio

Cultura bacteriana em meio semi-slido

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DISCUSSO 1. Qual o princpio da colorao para espiroquetas?

2. Qual o objetivo da preparao fresco de espirilos?

3. Aps ter realizado as atividades de colorao das bactrias, monte uma tabela com os seguintes dados: - nome da colorao; - microorganismo utilizado; - corantes utilizados; - tipo de colorao (considere as informaes da atividade 4).

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ATIVIDADE 6 ESTUDO DOS MICRORGANISMOS INTRODUO Microrganismos podem ser encontrados no solo, gua, no interior e nas superfcies dos seres vivos. Nesta atividade, voc dever elaborar um procedimento que permita pesquisar microrganismos presentes em diversos hbitats microbianos. OBJETIVO Possibilitar ao aluno a oprtunidade de elaborar um procedimento que permita estudar microrganismos presentes em diversos materiais. MATERIAL 4 placas com gar nutriente 1 frasco com 100mL de soluo salina 30g de terra de jardim 1 cotonete estril

PROCEDIMENTO (Considere o material disponvel e o que foi abordado nas aulas anteriores para detalhar o procedimento a ser seguido nessa aula)

RESULTADOS Anote os resultados obtidos e explique-os.

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