Defeitos no tubo neural: reviso de evidncias experimentais na terapia com clulastronco e novas opes de tratamento.

Resumo A falha no fechamento do tubo neural durante o desenvolvimento leva a malformaes chamados defeitos do tubo neural (DTN). As malformaes neurais mais comuns em humanos incluem anencefalia, encefalocele, exencefalia, espinha bfida craniorachischisis com ou sem mielomeningocele, lipomyeloschisis, lipomyelomeningocele, meningocele e myelocystocele. Estratgias preventivas atuais so baseadas principalmente na suplementao farmacolgica com cido flico. Contudo,as clulas-tronco e outras abordagens podem surgir como opes de tratamento em potencial para DTN. Este artigo fornece uma avaliao das evidncias experimentais sobre a terapia com clulas-tronco e novas opes de tratamento para DTN, que se tornaram disponveis nos ltimos anos

Introduo Defeitos no tubo neural so resultado de perturbaes no processo de neurulao. A neurulao, atravs de uma srie coordenadas de eventos, d origem placa neural, pregas neurais e ao tubo neural que eventualmente se desenvolve e diferencia no futuro crebro e medula. A maioria das NTDs surgem nos neuroporos anterior e posterior quando eles se fecham por ltimo. Os NTDs podem ser abertos ou fechados dependendo da exposio do tecido neural. NTDs abertos so resultado da neurulao primitiva e podem envolver alguma rea do sistema nervoso central. NTDs fechados so devidos neurulao secundria e esto em sua maioria restritos medula. Manifestas craniais de NTD incluem myelomeningocele (MMC) ( fig. 1 , 2 ), meningoencephalocele ( fig. 3 , 4 ), anencephaly, encephalocele (meningocele or meningomyelocele), craniorachischisis totalis, and spinal presentations incluem spina bifida aberta, myeloschisis, congenital dermal sinus, lipomatous malformations (lipomyelomeningoceles), split-cord malformations, diastematomyelia, diplomyelia and caudal agenesis.

NTDs so defeitos genticos multifatoriais complexos que envolvem tanto fatores genticos quanto ambientais. Localizao geogrfica, etnia, nutrio, doenas maternas, idade materna e paternidade, abortos anteriores, gestaes mltiplas, obesidade, status socioeconmico dos pais e sua exposio ocupacional so importantes determinantes epidemiolgicos de NTDs. A deficincia de folato tem

implicado como a maior causa de NTDs depois da teratognese. Toxinas e drogas antiepilticas como valproate and carbamazepine podem tambm induzir NTDs. NTDs so frequentemente encontradas associadas a vrias outras sndromes, disordens cromossomiais ou de genes isolados, geminao, aberraes cromossmicas bem como o CNS e malformaes no neurais. O exato mecanismo de NTDs no conhecido no momento, mas uma variedade de modelos mutantes de camundongos, especialmente o mutante de cauda enrolada que imita malformaes humanas em localizao, patologia e anormalidades associadas e o mutante de cauda loop que manifesta craniorachischisis, tem reforado grandemente nosso entedimento sobre NTDs em humanos. Algunss artigos excelentes de tempos em tempos tem trabalhado o papel de diferentes genes do processo de neurulao em geral bem como na via metablica do folato. Matriz extracelular, glicoprotenas da superfcie celular, microfilamentos de actina, fatores de crescimento e ao coordenada de vrios genes tem implicado no processo de neurulao. At 2007, 190 ocorrncias naturais ou indues experimentais de camundongos mutantes com NTDs foram descritas e com base na literatura avaliada sobre NTD que produziu perda de mutaes funcionais em camundongos, acreditou-se que 28 genes eram necessrios para uma neurulao normal. NTDs tambm podem ser produzidas cirurgicamente. Modelos baseados em NTDs mecanicamente induzidos devido a ruptura da neurulao normal atravs de uma interveno cirrgica oferecem vantagem em relao ao NTD induzido por toxina. As evolues neurolgicas demonstraram funcionamento normal na maioria dos animais e quem MMC pode ser criada mecanicamente e reparada cirurgicamente. At o momento, o consumo oral de cido flico permanece como o tratamento escolhido para prevenir NTDs. A suplementao com cido flico tem implicado no s na preveno de NTDs mas tambm de anomalias orofaciais. Uma grande parte da literatura substancia o papel do cido flico em prevenir parto prematuro, rompimento placentrio e infartos. A ingesto de multivitaminas contendo cido flico reduz o risco de DTN no incio de uma gravidez possivelmente afetada. A literatura recente sugere inositol como um possvel complemento para a teraputica do cido flico . Terapia de medicina alternativa e complementares tem sido utilizados em vrias doenas, incluindo a espinha bfida. Cordyceps, Ocimum santurio, Azadirachta indica e outras plantas medicinais e seus extratos, que so relatados como imunomoduladores,( auxiliam o corpo na defesa contra a doena e no ataca o patgeno propriamente dito), anti-cncer e possuem vrios efeitos de rejuvenescimento, podem ser investigados em camundongos mutantes DTN em combinao com clulas-tronco . No presente a nica opo para a terapia pr-natal de espinha bfida a cirurgia fetal, que continua sob julgamento na Gesto de Estudos Mielomeningocele (MOMS). Fitcher disserta acerca da reparao da espinha bfida fetal em grandes detalhes e conclui que, apesar de possveis riscos para o feto e a me, a reparao MMC intra-uterina pode revelar-se benfica nos fetos antes de 26 semanas de idade gestacional, com ventrculos pequenos na hora da cirurgia e leso

nos nveis abaixo de L2. No entanto, as chances de sucesso da cirurgia fetal so provavelmente muito limitadas e continuar a ser uma opo muito agressiva, sendo susceptvel a ser mal aceita pela maioria dos pacientes.

Terapia com clulas tronco. Clulas tronco tem emergido como uma modalidade teraputica em potencial para vrias doenas devido sua funo reparadora. Elas so clulas no especializadas que virtualmente podem crescer em muitos ou todos os diferentes tipos de clula no corpo. Em anos recentes, seu papel teraputico vem sendo investigado no tratamento de uma srie de doenas neurodegenerativas, incluindo derrames, paralisia cerebral, ferimento na medula espinhal, sndrome ps-plio, transtornos musculoesquelticos e m formaes congnitas. Sim et al. [14] investigou as mudanas cronolgicas da capacidade de religamento em ONTDs(defeitos do tubo neural aberto) espinhais induzidas em embries de pinto. As mudanas cronolgicas na capacidade de religamento em ONTDs tornaram-se paralelas atividade proliferativa do tubo neural, sugerindo que manipulao da dinmica celular poderia aumentar o processo de religamento no tecido embrionrio da medula espinhal. Estendendo esses estudos, Lee et al. [15] reportou aumento da capacidade de religamento pela injeo intra-amnitica de clulas tronco embrionrias humanas(hESCs) em ONTDs espinhais cirurgicamente induzidas em embries de pintos. Esse estudo revela a possibilidade do uso de hESCs na gesto pr-natal de NTDs humanas. O experimento incluiu abertura longitudinal de tubos neurais de embries de pinto, ao nvel dos brotos das asas por um comprimento de seis somitos. hESCs foram injetada na cavidade amnitica com a ajuda de um veculo . A inciso no tubo neural foi seguida da rpida injeo de 2 microlitros de veculo ou soluo de hESC. Os tamanhos das NTDs na reincubao ps operatria no dia 3,5 e 7 foram comparadas entre grupos de controle(sem injeo) e veculo(injeo de glicose em PBS(?) e hESC injeo de hESCs em veculo ). Os comprimentos no dia ps operao(POD) foram significantemente menores no hESC grupo de clulas do que nos grupos de controle e veculo do POD 3 ao POD 7, demonstrando claramente aumento do religamento nos ONTDs com clulas tronco embrionrias. O aumento da capacidade de religamento nesse estudo pode ser devido ao efeito ponte requerido para encher o local da leso e proteger o tecido lesado para promover regenerao, a qual, por sua vez, pode ter levado ao reparo de estruturas e recuperao de funo. Para simular a situao clnica de NTDs humanas, Lee et al. [24] depois investigou o religamento de cirurgicamente induzidas ONTDs espinhais pela injeo intra-amnitica de hESCs em embries de pinto 24h depois da induo de ONTD aumentar a habilidade de religamento. Gupta et al. [16] conduziu um estudo com clulas tronco autlogas em anomalias congnita em 17 pacientes com meningomielocele. Clulas tronco foram administradas quer durante a cirurgia definitiva ou ps operatrio. CD34+ clulas mononucleares separadas pela medula ssea foram injetadas na medula espinha e espao caudal para meningomielocele. A condio dos pacientes antes da cirurgia serviu como a condio controle para aquele paciente. Grficos de temperatura e

procurando evidncias de infeco ou outras complicaes foram usadas como medidas de monitoramento ps operatrio. Em meningomielocele, cobertura de antibiticos foi dada por 7-10 dias. Status clnico e grficos musculares de pacientes com meningomielocele foram evoludos por dois fisioterapeutas independentes. Mudanas em fora, sensao e status neurolgico da bexiga e intestino foram examinados. Pacientes no estudo estavam em grupos de idade 0-1 ms, 1-5 meses e 1-6 anos, em 6, 8 e 3 casos, respectivamente, e a histria de ruptura estava presente em 5 pacientes. Reparao da meningomielocele foi realizado em 4 pacientes no passado que apresentaram persistente deficincianeurolgica. Em um paciente a cirurgia foi refeita devido medula presa. Em 13 pacientes, reparao da meningomielocele e injeo de clulas tronco foram feitas, considerando que em 3 pacientes s a injeo de clulas tronco foi feita. Dois pacientes tinham meningocele. Uma boa recuperao ps operatria em todos os sentidos foi registrada sem complicaes. Os resultados iniciais foram promissores, mas os autores querem se certificar de uma evoluo a longo prazo, com testes de controle aleatrios para chegar a concluses significantes. Embora o trabalho seja de um valor significante, sendo o primeiro desse tipo da India, experts no campo acreditam que o estudo no sem falhas, porqu: 1) Um modelo de rato com paraplegia traumtica no pode ser base de experimentos sobre meningomiocele em humanos, j que neurnios so normais at o dano na paraplegia traumtica, enquanto em meningomiocele os neurnios so congenitamente disfsicos. 2) Os autores falharam em demonstrar que as clulas tronco injetadas poderiam realmente formar neurnios funcionais aps o transplante. 3) O segurana das clulas para uso humano no foi assegurada pois elas poderiam se tornar tumorgnicas e, finalmente 4) Por causa da falta de avaliao apropriada da recuperao da funo, especialmente em infantes muito pequenos. Fauza et al. [17] entrou clulas tronco neurais (NSCs) para a medula espinhal em carneiros com MMC(meningomielocele) experimental como um auxiliar para o reparo fetal de espinha bfida. O estudo incluiu fetos de carneiros divididos em trs grupos: grupo 1, animais sem reparo; grupo 2 apresentou cobertura cirrgica padro de MMC, e o grupo 3 teve cobertura de MMC mais entrega de clone murino de NSC no defeito da medula espinhal. Uma suspenso de 2ml de NSC de 10.000.000 clulas/ml foi diretamente injetada na matria cinzenta da medula espinhal em 4-6 pontos igualmente espaados. Animais no grupo 2 e 3 mostraram sobrevivncia maior que o grupo 1. Animais no grupo 1 tambm apresentaram inabilidade para andar (paraparesia maior) em uma medida maior que os grupos 2 e 3. Uma menor incidncia de paraparesia maior foi registrada no grupo 3, comparado ao grupo 2, mas os resultados no foram estatisticamente significantes. Grupo 3, compreendendo animais sem enxerto, no apresentaram indicaes de piora clnica ou prejuzo maior que animais do grupo 1 e 2. Grupo 3 apresentou maior poder de contrao muscular e funo tctil nas reas afetadas comparado com o grupo 2. Em todos os animais dos grupos 2 e 3, graus variveis de medula presa alloderm patch foi registrada. (?) Apesar da origem xenloga e falta de imunossupresso do hospedeiros, todos os animais no grupo 3 apresentaram sobrevivncia do enxerto de NSC na medula espinhal e nenhuma piora da condio existente foi observada.

Resultados mostraram densidade NSC notavelmente maior na pores mais danificadas da medula espinhal, sugerindo seleo de NSC para reas anormais. Esse efeito foi distinto na periferida da medula no nvel do defeito onde a medula foi exposta agresso qumica pelo lquido amnitico e possivelmente sofreu dano mecnico. Em hidro/siringomielia leses presentes na corda de alguns dos animais no grupo, algumas clulas de doadores foram encontrara, o que ocorre principalmente em MMC. Essa pode ser a conseqncia de injeo de clulas por agulhas nesse modelo. Haviam poucas reas no-perifricas sem evidncia morfolgica de dano com alguma clula enxertada. Os autores no acharam nenhuma relao clara entre o grau de enxerto de NSC e resultado clnico nessa srie inicial. Nenhuma evidncia de formao de tumor foi registrada nos locais enxertados em nenhum dos animais. O estudo claramente apontou algum papel de NSCs no processo regenerativo. Os autores sugeriram validao do efeito com mais experimentos antes que NSC possam ser usadas como modalidade teraputica. Sobre a ltima parte do texto: a concluso final do experimento foi que em relao aos outros grupos, o grupo que recebeu enxertos de Clulas embrionrias neurais , foi o que apresentou um melhor prognstico. (a ser dissertado na apresentao o porqu, pra no encher os slides)
Induced Pluripotent Stem Cells (Clulas Tronco Induzidas)

Primeiramente descrito por Takahashi e Yamanaka (18), essas clulas so basicamente clulas somticas reprogramadas que eventualmente se tornam pluripotentes pela introduo e expresso ectpica de alguns fatores especficos de transcrio - Oct4, Sox2, Klf4 e Myc se tornando mais prominente. Clulas tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) dividem muitas similaridades com hESCs (clulas humanas embrionrias) e podem se diferenciar em todas os tipos celulares representando os trs folhetos embrionrios. Esse avano tecnolgico, por um lado, contornou o uso de embries e ocitos para pesquisa; por outro, o uso de animais pode ser poupado significativamente pela descoberta de drogas e testes de toxidade. Gerao de iPSCs especfico para cada paciente pode ignorar o problema de rejeio de enxerto, assim, provando ser uma ideal escolha para estudo de transplantes. Em adio, iPSCs so capazes de restaurar funes orgnicas como tambm de reconstruir todo tecido em evento de ferimento ou doena. A descoberta de iPSCs tem iniciado uma agitao de pesquisa em descobrir tratamentos para uma variedade de doenas do SNC (sistema nervoso central). Recentemente, tornou-se possvel gerar tipos especficos de iPSCs que podem se diferenciar nos mais relevantes tipos celulares. Alguns recentes exemplos incluem gerao de neurnios da espinha motora e glia da pessoa que sofre de esclerose amiotrpica lateral, neurnio dopamina derivado do iPSCs derivado de pessoas com Mal de Parkinson, neurnio motor derivado de iPSCs derivado de criana de 3 anos com atrofia espinhal muscular e derivao de iPSCs de pessoas com disautonomia familiar - uma rara doena gentica afetando, principalmente, o sistema nervoso

perifrico. Devido a uma funo direta de clulas da crista neural no fechamento do tubo neural, bastante razovel supor que provavelmente clulas da crista neural podem ser reprogramadas para derivar especficos NTD iPSCs que, se transplantadas, podem possivelmente ajudar de forma adequada no fechamento do tubo neural em crianas. Por cautela, tais estudos devem ser primeiro demonstrados em modelos animais. Para modelar a doena em vitro, as clulas tronco das cristas neurais podem ser isoladas do palato do adulto. Para um rpido e eficiente reabastecimento dos tecidos doentes com clulas saudveis, o potencial migratrio de tais iPSCs cristas neurais precisa ser acessado e sua dependncia em molculas da matriz extracelular, tais como trombopondina para migrao, examinada. Outro tipo de clula candidato para terapia iPSCs em NTD pode ser clulas do fgado, pois essas clulas so uma natural fonte de cido flico. Esse fato pode ser usado para ajudar mulheres com um histrico familiar de defeitos no nascimento ou com filho anterior com defeito no nascimento ou mltiplos abortos no primeiro trimestre. Clulas do fgado isoladas de tais mulheres podem ser reprogramadas para endogenamente secretar cido flico e administradas imaediatamente antes do incio da gestao como medida profiltica para possivelmente prevenir NTD em neonatos. Mas de novo, essa ideia puramente especulativa e precisa de adequada validao experimental, especialmente para aquelas responsveis pela sntese de cido flico, absoro e transporte bem como pela toxicidade do folato (em um evento de excesso de sntese de cido flico). iPSCs so nicas no senso que clulas especficas de cada paciente podem se diferenciar em especficas linhagens celulares, assim providenciando uma potencial ferramenta in vitro para estudar a complexidade da doena. A nica preocupao com iPSCs, no presente, sua segurana para o uso humano como misprogrammed (?) e indiferenciada iPSCs pode levar a tumores.

Novas terapias

O casamento entre a biologia qumica e a gentica molecular tem levado ao surgimento de uma nova disciplina genmica qumica que visa descobrir pequenas molculas teraputicas. Uma variedade de molculas, incluindo oligonucleotdeos antisense, peptdeos, pequenas interferncia (SI) RNAs e microRNAs, CNS, dopaminrgicos e produtos naturais baseados em candidatos da droga. Zhou et al testou peptidrgicos agonistas de atividade-dependente de fatores neurotrficos em pr-natal com lcool DTN induzido e causaram perda de B6 em neuronios de serotonina em grvidas B6 and serotonin neuron loss in time pregnant B6 dams. Os autores induziram experimentalmente a deficincia nos neurnios 5-HT fetais da rafe

caudal atravs da exposio ao lcool durante o pr-natal. Tratamento pr-natal com os peptdeos neuroprotetores SAL ou NAP pode proteger completamente contra a reduo dos Neurnios 5-HT na rafe caudal e rostral, e PNA preveniu contra o atraso no fechamento do canal rombenceflico ventral. Um estudo recente da Zwerts et al. [27] demonstrou o papel das clulas survivinas endoteliais nos defeitos embrionrios na angiognese, cardiognese, e no encerramento do tubo neural. A survivina um inibidor da protena de apoptose que um regulador da mitose e altamente expressa na proliferao celular, mas mas baixa ou ausente em repouso ou em fase terminal das clulas diferenciadas. um regulador negativo da apoptose e desempenha um papel crtico na manuteno da pr-natal integridade vascular no pr-natal. O estudo mostrou que a falta de expresso endotelial durante o desenvolvimento embrionrio resultou no fechamento atrasado do tubo neural juntamente com a letalidade uterina e com o desenvolvimento cardaco defeituoso.Filhos de mes diabticas so mais propensas as malformaes congnitas. Wentzel el al. [28] mostrou que o efeito teratognico do soro do diabtico pode ser prevenido por suplementao de superxido dismutase e N-acetilcistena em cultura de embries de ratos. Pequenas molculas, como monastrol ou ispinesib, que pode inibir kinesin KIF11 e inibidor de 4 integrina (CT301), que demonstraram ter funo neuroprotetora, podem ser investigados por seu possvel papel na preveno de DTNs. Gyuris et al. usando bromodomain contendo protena 2 (Brd2) nula de camundongos, mostrou que Brd2 necessrio para o encerramento do tubo neural para a e embriognese. Os autores demonstraram que a interrupo do gene Brd2 provoca letalidade embrionria e apresenta defeitos no fechamento do tubo neural e, mais comumente, a anencefalia do rombencfalo. O efeito da atividade do gene transgnico Brd2 pode ser testado em fechamento do tubo neural para investigar se a superexpresso de genes Brd2 poderia ser usado como um alvo teraputico. Watson et al. demonstrou que MRJ / - DTN dos embries de ratos apresentam NTDs independentes dos defeitos extraembrionrios. O estudo sugere o uso de MRJ / - embries mutantes como um excelente modelo para estudar a relao entre clulas-tronco e o fechamento do tubo neural. Clulas-tronco neurais com possibilidade de uma reprogramao MRJ para aumentar a auto-renovao, pode ser uma opo vivel para o desenvolvimento da terapia com clulas-tronco para DTN. A recente revelao de que a inibio sinrgica de sinalizao SMAD por Noggin e SB431542 pode causar neural converso eficiente de hESCs, bem como a diferenciao direta de iPSCs em dopamina mesencfalo e dos neurnios motores espinhais, ainda prev a extenso possvel do uso de pequenas molculas e as clulas-tronco para tratar DTN. Em um estudo recente, Camerer et al. [32] demonstraram que a sinalizao local da

protease contribui para o fechamento do tubo neural em embries de camundongos. Estas molculas de sinalizao podem ser aproveitados para a sua adequao teraputica como molculas-alvo no tratamento do tubo neural e associadas ao desenvolvimento de defeitos no mesmo. Alm disso, os siRNAs e microRNAs, projetados contra um gene especfico, que regula os processos de desenvolvimento, podem ser teis na compreenso da causa subjacente da DTN e no desenvolvimento de estratgias teraputicas para preveno de DTN.

Concluso DTN so evitveis, em certa medida pelo consumo adequado de cido flico. A nova modalidade de tratamento com clulas tronco demonstra alguma melhora, mas por segurana, estudos rigorosos com animais ainda so recomendados antes da sua Antes de utilizao em ensaios clnicos humanos. iniciar qualquer desses estudos, os pesquisadores devem planejar cuidadosamente o experimento, tendo em mente todas as consideraes, tais como o uso de controles adequados, uso de modelos experimentais adequados, a utilizao de procedimentos padronizados e bem estabelecidos(especialmente quando seres humanos esto envolvidos). Avaliao da migrao e integrao funcional das clulas-tronco devem ser cuidadosamente investigada em estudos envolvendo o transplante de clulas. O uso da ressonncia magntica e os procedimentos da nanotecnologia tem sido extremamente til traando o destino de clulas-tronco transplantadas [33-36].A medicina alternativa em conjunto com clulas-tronco e iPSCs pode ser til no tratamento de DTN. Terapias combinadas usando clulas-tronco com extratos vegetais, de potencial teraputico conhecido podem ser testados em modelos animais de DTN, para examinar o efeito teraputico de tais formulaes.