Licence 3 SV -Biotech

GAAW

Par des techniques dextraction, sparation, isolation et recombinaison dADN, nous voulons raliser le clonage dune petite squence nuclotidique (que lon appelle pour plus de facilit Gne dIntrt) et qui code pour lARN de la petite sous unit ribosomale Cryptospridium parvum, qui est un parasite intestinal. Lintrt du clonage est de permettre laccs facilit au gne en question mais aussi au produit de son expression en vue dtudes postrieures Pour ce faire on commence par extraire le gne dintrt de tissus de mammifres infects par le parasite. On purifie puis amplifie ce gne. Puis on lintgre dans un plasmide et le plasmide est transform dans une bactrie qui va permettre de cloner notre gne dintrt.

Extraction & Purification de lADN partir de tissus bovins

PCR

=> Permet de slectionner le gne voulu et de lamplifier afin den avoir assez pour le travailler confortablement
lectrophorse sur gel dagarose

Ligation du gne dintrt sur le plasmide & Transformation

bactrienne

(Procd de vrification)
Ensemencement sur glose
nutritive et slective (Antibiotique)

=> Mise en culture permettant vue de slection Blanc Bleu

Repiquage de colonies bleues et blanches en milieu liquide

=> Clonage proprement parler

Extraction de lADN plasmidique

=> Permet de rcuprer les copies de gne clon

RFLP : digestion enzymatique et visualisation Par lectrophorse du rsultat de llectrophorse

=> (Procd de vrification) Clonage proprement parler

Extraction, et Purification de lADN.

Extraction :Il faut rcuprer lADN du parasite qui se trouve parmi les tissus de lhte. => Broyage mcanique et Protase K pour avoir un Homognat contenant lADN en solution. Purification : Il sagit ici de ne travailler que sur de lADN : il faut se dbarrasser de tout ce qui nen est pas. => Prcipitation slective des acides nucliques => filtration (Le prcipit reste sur le filtre) => Resolubilisation (Les acides nucliques traversent le filtre)
PCR et lectrophorse

PCR => Obtention rapide dun grand nombre de copies dune squence cible sur lADN de dpart laide damorces spcifiques. Amplicons du Gne DIntrt lectrophorse : Permet de contrler que nous avons bien russi isoler le gne dintrt, de vrifier sa puret.
Ligation et Transformation

Ligation : Insertion du GI dans le plasmide (dans Lac Z permet la slection blanc/ bleu => On se sert dune ADN ligase afin de sceller les rappariements dus aux bouts collants plasmide / GI Transformation : principe gnral : processus naturel chez les bactries Gram+ qui consiste en lincorporation de matriel gntique exogne. MAIS Chez les bactries Gram- , il faut les rendre comptentes pour que cela se produise. TRANSFORMATION PAR CHOC THERMIQUE
Extraction de lADN plasmidique
MISE EN CULTURE
Clonage de GI
(Colonies blanches seulement)

=> Premire slection = Mort des bactries non transforme du fait de lantibiotique => Deuxime slection= on sait quelles sont les clones bactriens qui on transform un plasmide recombinant (BLANC) et ceux qui on un non recombinant (BLEU) => simplement en lysant les bactries et en faisant sdimenter les membranes par centrifugation on rcupre lADN plasmidique (le chromosome bactrien est li la paroi) => on prcipite le surnagent dans un nouveau tube puis on le nettoie lthanol et on le resolubilise => afin dviter toute contamination ventuelle (protine par ex)

LYSE DES CELLULES

PURIFICATION

PCR - RFLP : Random fragment lenght polymorphism. Prcd dune PCR

PCR => pour amplifier la quantit dADN => pas dhybridation de sondes marques par Blotting. => Rvlation aux UV par le BET. RFLP => Mise en vidence dun polymorphisme des plasmides entre les colonies blanches et bleues au niveau du site de restriction (dans Lax Z).
Llectrophorse conscutive la RFLP met en vidence ce polymorphisme (gnotype et phnotype =>blanc / bleu) : pour les plasmides recombinants : 2 bandes donc 2 fragments = GI + plasmide Pour les plasmides non recombins : 1 seule bande donc 1 seul fragment = plasmide seul