CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Produccin de glucoamilasa por fermentacin sumergida a partir de Aspergillus spp.

En microbiologa la palabra crecimiento se define como un incremento en el nmero de clulas. El crecimiento es un componente esencial de la funcin microbiana, ya que en la naturaleza cualquier clula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la poblacin. (9) Al crecer, el microorganismo produce enzimas necesarias para las funciones celulares como la alimentacin y el crecimiento; para el caso de los hongos, tambin se da la produccin de enzimas que son secretadas la medio externo y cumplen su funcin en el mismo.
La Biotecnologa es la aplicacin controlada y deliberada de agentes biolgicos sencillos (clulas vivas o muertas, o componentes celulares), en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de productos o como operaciones de servicios.

Las enzimas son catalizadores biolgicos que permiten que las reacciones qumicas del metabolismo celular ocurran a una velocidad significativa en condiciones ambientales extremadamente suaves, compatibles con el mantenimiento de la viabilidad celular. Los microorganismos ofrecen grandes ventajas como sistemas productores de enzimas dada su alta velocidad de sntesis, alto rendimiento de conversin de sustrato en protena enzimtica, gran versatilidad y mayor simplicidad en la manipulacin ambiental y gentica de su capacidad productiva. Para el caso a trabajar, se realiza la produccin de la enzima glucoamilasa por medio de la fermentacin sumergida en medio con una fuente de carbono que es la maltosa, y utilizando el hongo Aspergillus niger.

REACTIVOS Y MATERIALES - Reactivo de DNS. (Con su curva patrn) - Kit de glucosa oxidasa. - 300 ml de Caldo de cultivo - Esptula estril. - Tubos de ensayo lisos - Papel de filtro - Micropipeta de 100 a 1000 l - Puntas de micropipeta de 100 a 1000 l - Mecheros (EQUIPOS) - Espectrofotmetro - Agitador orbital - Bomba de vaco PROCEDIMIENTO PRIMER DIA - Reactivo de Bradford (Con su curva patrn) - 10 Erlenmeyer de 250 ml. - Cmara de NeuBauer. - Tubos de ensayo tapa rosca - Agua destilada - Micropipeta de 10 a 100 l - Puntas de micropipeta de 10 a 100 l - Embudo Butchner - Plancha de calentamiento - Centrifuga - Horno

A partir de un medio de cultivo de aspergillus, se obtiene las esporas por medio de lavados con agua destilada sobre el hongo crecido. Estas esporas van a ser el inculo que se v a agregar a los medios de cultivo de la practica. Pero, es de cuidado, el establecimiento de la concentracin estndar de esporas con las que se debe iniciar el proceso de siembra, por medio de conteo de las esporas en cmara de NeuBauer y posteriormente ajustar, por medio de dilucin, a una concentracin estndar (1*105 esporas/ml) Conteo en cmara NeuBauer: La concentracin obtenida de esporas por medio del conteo de los campos y las posterior aplicacin de la ecuacin ( casillas contadas * 5) * 1x104, obteniendo de esta forma las esporas por ml de suspensin es de 133000000 esporas/ ml de suspensin.

V1=? C1=Calculado V2=50ml C2=1*105 esporas/ml 200 rpm 35 C 133*10exp4 Dilucion 1/100= 133000000 de esporas 133*10exp8= 188microlitros Al Erlenmeyer------------------------------se toman 50 microlitos Erlenmeyer, bomba de vaco, se conecta Erlenmeyer de vaco lateral. Se filtra a un embudo Butchner (filtro) Papel contendr la biomasa La diferencia entre el peso hmedo y el peso seco dar la biomasa ***La fermentacin en liquido produce menos protenas que en seco**** SEGUNDO DIA 0,5mL DNS+0,5 mL Muestra -------------------------BLANCO DE MUESTRA 0,25mL H2O+0,25mL To+0,25m L DNS------------T0 BLANCO 0,5 mLH2O+0,5 mL DNS--------------------------------BLANCO DE LECTURA y y 50microlitos de muestra+2,5 Bradford Ac perclrico 4%+Muestra

GLUCOSA T2B 10 MICROLITROS DE MUESTRA +1ML REACTIVO CONCENTRACION DE GLUCOSA= (absorbancia de muestra/absorbancia patrn)*100(mg/dl) ***Abs. Patrn Glucosa= 0.655***

Cambiar unidades a mg/mL=g/L DATOS OBTENIDOS BRADFOR T4B=0.023 GLUCOSA T2B=0,692 ANALISIS ESPECTOFOMETRICO DE CADA UNA DE LAS MUESTRAS BRADFORD GLUCOSA 0,371 0,018 0,014 0,529 0,011 0,014 0,761 0,12 0,018 0,857 0,096 0,036 0,58 0,337 0,017 0,692 0,337 0,019 0,518 0,389 0,064 0,421 0,212 0,052 0,043 0,025 0,056 0,031 0,012 0,023 TABLA 1. DATOS DE ABSORBANCIAS EN LABORATORIO peso inicial 1,0060 1,0192 1,0176 0,9944 1,0021 1,0084 0,9990 1,0080 peso final 1,1533 1,0706 1,0652 1,0988 1,1644 1,1269 1,1759 1,1300 biomasa 0,1473 0,0514 0,0476 0,1044 0,1623 0,1185 0,1769 0,1220 DNS

T0A T0B T1A T1B T2A T2B T3A T3B T4A T4B

papel 1 2 3 4 6 7 10 11

La biomasa esta en g/50ml, debe pasarse a mg/ml TABLA 2. DATOS DE BIOMASA PREGUNTAS -Cul es la utilidad de las cinticas de crecimiento, produccin y/o consumo en los procesos defermentacin? La utilidad radica a la hora de conocer la conversin microbiolgica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de inters industrial. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulacin de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operacin de las plantas industriales.

El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. (7) -Mencione otras metodologas para determinacin de biomasa microbiana. y Determinacin de cidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin. y Determinacin de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una muestra con relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl. y Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin. (4) -Cules son las ventajas y desventajas de la fermentacin sumergida? VENTAJAS y La prdida de voltiles por evaporacin se reduce al 3-5% y Se prescinde del material de relleno y por tanto de los problemas que entraa. y Se facilita la incorporacin de sistemas automticos para la carga y descarga del fermentador, control de espuma, etc. y Se consiguen temperaturas ms uniformes, eliminndose las zonas del calentamiento local. y La limpieza y el mantenimiento es ms gil y eficaz. (5) DESVENTAJAS y y y y y El tiempo Mayor costo de energa La tecnologa de control es ms sofisticada Se requiere personal ms especializado Formacin de espuma problema en produccin(6)

BIBLIOGRAFIA .

Federle,T. Doblins J. 1986. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils, ground water; 24:365-374.