Primavera

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Traduccin de the involvement of RNA in ribosome function

DanielArturoZavalaOrtiz
Elpresenteesunatraduccindelarticuloarribanombrado,descubrimientoscomoestos debenestardisponiblesenEspaolClasedeBioqumicaIIProfesora:ZaidaOrta Flores.Todoslosderechosaquienescorrespondan.

VeracruzInstituteofTechnology.

La participacin del RNA en la funcin ribosomal.

PeterB.Moore+&ThomasA.Steitz+
*DepartamentodeBiofsicamolecularybioqumica,&departamentodequmica,UniversidaddeYale,POBox20817,NewHeaven, Connecticut065208107,USA(correoelectrnico:peter.moore@yale.edu) InstitutomedicoHowardHughes,NewHeaven,Connectcut065208114,USA

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El ribosoma es una partcula hecha de RNA y protena que se encuentra abundantemente en clulas que son productoras activasdeprotena.EstacatalizanelRNAmensajerodirigidoalasntesisdeprotenas.Trabajosrecientessobreestructuras han demostrado una profunda participacin de los componentes del RNA ribosomal en todos los aspectos de su funcin, apoyandolahiptesisdequelasprotenasfueronaadidasalribosomatardamenteensuevolucin.
Eldescubrimientodelribosomaylaelucidacindesupapel en la expresin gnica fue uno de los grandes logros de la biologa molecular entre los aos 1950 y 1960. Investigaciones anteriores revelaron que los ribosomas consisteninvariablementeenunasubunidadgrandeyuna pequea, el grande contiene aproximadamente el doble de masa molecular que el pequeo, y ambas subunidades tienen una masa correspondiente de 60% de RNA. La subunidad pequea media las interacciones entre el RNA mensajero (RNAm) y el RNA de transferencia (RNAt) que determina la secuencia de protenas que hace el ribosoma. La subunidad grande cataliza la formacin del enlace peptidico1. El hecho de que los ribosomas protenas no sorprendi a nadieenlosaos1950,especialmentecuandosehizoclaro queestoscatalizanlasntesisproteica.Erasabidoportodos que las enzimas son protenas. La sorpresa fue que los ribosomas contenan RNA. En ese momento tres hiptesis podanadmitirsesobrelacontribucinquehaceelRNAen lafuncinribosomal:(1)Eslasubstanciaquedeterminala secuenciadeprotenasquesintetizanlosribosomas;(2)Es el molde estructural (inerte) en el que el activo cataltico, partes proteicas del aparato de sntesis proteica son ensambladas, (3) Contribuye directamente en el proceso cataltico de sntesis proteica. El descubrimiento del RNAm alrededordelosaos1960pusofinalaprimerahiptesis, la segunda hiptesis era poco atractiva debido a que no tenia sentido en la evolucin. 2,3. Ahora, si la protena realiza las funciones claves del ribosoma, probablemente aslohizocuandoelribosomaprimeroevoluciono,ysieso esverdad,PorquelribosomacontieneRNA?Adems,si lasprimerasprotenasfueronsintetizadasporprotenasen el ribosoma, Cmo se formaron primero las protenas ribosmicas?,latercerahiptesisfueproblemticadebidoa que refuto el pensamiento de que las enzimas son protenas. Con el paso del tiempo, la tercera hiptesis ha venido ganando fuerza. La idea de que los RNAs ribosomales (rRNAs) pueden participar directamente en la sntesis de protenassehizototalmentecrebleaprincipiosdelosaos 1980, siguiendo el descubrimiento de que los RNAs en efecto pueden catalizar reacciones quimicas4,5. Adems, la evidenciagenticaybioqumicalentamenteacumuladaque implico al RNAr en la funcin ribosomal68. Sin embargo, una completa apreciacin de la importancia funcional del RNAr en el ribosoma ha salido a la luz solo recientemente. Laspocomasdedosdocenasdeestructurascristalizadasde ribosomas y sus complejos ligndoos disponibles hoy en dia, documenta la participacin del RNA en la actividad ribosomal a un nivel que incluso los mas fervientes defensores de la importancia funcional del RNAr pudieron difcilmente haber anticipado. Son las protenas en el ribosomalasquerealizanlargasfuncionesestructurales,no elRNA. Sitiosactivosribosomales La importancia funcional del RNA en el ribosoma, relacionado a las protenas, puede ser mejor evaluado examinando su prominencia en la fraccin pequea de la masatotaldelribosomaencontradaensussitiosactivos,en vezdemedirloquecontribuyealapartculacomountodo. Este hecho, es casi enteramente verdadero que toda la abundancia de RNA en los ribosomas actuales reflejan una historia evolutiva que empez con todas las partculas de RNA. Probablemente, este protoribosoma original tuvo sitios de decodificacion y sntesis que fueron similares a aquellos que vemos hoy en dia, y las protenas fueron aadidas despus para mejorar su funcin. Pero antes de que estos cuestiones pudieran ser aprovechadas inteligentemente, es importante considerar que se ha aprendidodelosestudiosbioqumicosacercade

Figura1ArreglodelossitiosdeunindelRNAenlasubunidadribosomal grande. La superficie de la subunidad grande de H. Marismortui que interaccionaconlasubunidadpequeaesmostradaenlacuallasparticiones de RNA se muestranen azul, y las regiones proteicas en prpura. Los sRNAt sonmostradosenunionesformatocintaalsitioE,PyA.Lasposicionesque ellos ocupan son deducidas de la estructura 70S de Noller y colegas 39. (Reproducidoconpermisodereferencia.14)

sitios activos del ribosoma de eubacteria. Los ribosomas de arqueobacteriasyeucariotastrabajanmuysimilarmente. LosaminoacilestRNAssonlossubstratosquelosribosomasconsumen durantelasntesisdeprotenas,Cadaclulacontieneunapoblacinde tRNAs que difiere en secuencia, pero tienen relativamente una masa molecularsimilar(aprox.2500),estructurassecundariassimilares,y lamismaestructuraterciariaenconfiguracinL.Enelfinaldistante del brazo mas largo de la configuracin L hay una tribase, una secuenciadeanticodnencadaRNAtqueescomplementarioaunadel tripletedebasesdelRNAmquecodificaaunaminocidoespecifico.En el extremo del brazo corto de la L de cada RNAt hay una secuencia CCAterminal3paraelcualcadaaminocidoespecificoseradjunto9. Durante la sntesis proteica, los anticodones terminales de tRNAs interaccionanconlaunindelRNAmconlasubunidadpequeaysus secuenciasCCAaminoaciladasinteraccionanconlasubunidadgrande. Los aminocidos son unidos al tRNAs por enzimas llamadas tRNA aminoacil sintetasas, de las cuales existe una por cada tipo de aminocido. Estas catalizan la formacin de las uniones Ester entre losgruposCarboxilodelosaminocidosylosgruposhidroxilosen posicin 3 2 del residuo terminal de adenina 3 del tRNAs . La sntesistraduceelcdigogenticocongranespecificidadmediantela unindeuntipodeaminocidoatodoslos tRNAsconelsoportede losapropiadosanticodones.Existeporlomenosuntipodemolcula detRNAporcadaaminocidousadoenlasntesisdeprotena. Los ribosomas ensamblan protenas de aminocido en aminocido, empezando con el residuo Nterminal10. La reaccin que resulta en una polimerizacin de aminocidos es el ataque nucleofilico de un grupoaminodeunaminocidoesterificadoauntRNAenelcarbono carbonilo del ester uniendo el petido (o aminocido) a una segunda molculade tRNA.Elpropsitodeestedelintermediariotetradrico resultante deacila el tRNA que es el donador del grupo carbonilo, y abandona el tRNA que provo el grupo amino esterificado a un pptidoquehasidoampliadoporunaminocido.Estareaccinocurre en el centro de la peptidil transferasa de la subunidad ribosomal grande,lacualincluyeunsubsitioparaelcuallamitadCCApeptidica de las uniones peptidicas de tRNA (en el sitio P), y un subsitio que interacciona con el aminocido que lleva el CCA terminal del aminoaciltRNA(enelsitioA). Antes de que otro aminocido pueda ser aadido a una cadena peptdico en crecimiento, el tRNA deacilado en el sitio P debe remplazarse por la peptidil tRNA residente en el sitio A, un nuevo

aminoacil tRNA debe colocarse en el sitio A. El intercambio de tRNA del sitio P requiere resultar de una transformacin conformacional poco entendida aun llamada translocacin, la cual implica ambas subunidades(Verabajo).EsmediadoporlaprotenaGllamadafactor de elongacin G (EFG) en procariotas, y es acompaada de una rupturadeGuanosinatrifosfato(GTT). La entrega del correcto aminoaciltRNA al ribosoma es el paso que determina la secuencia de la sntesis de protenas. Si el polipptido que se esta sintetizando por un ribosoma contiene la secuencia requerida por el RNAm unido a el, solo uno de los diferentes aminoacilestRNAspresentesenlaclulapodrseraceptadodurante cada ciclo de elongacin de la cadena polipeptidica. La seleccin requeridaescompletadaporelcentrodecodificadordelasubunidad pequea.LosaminoaciltRNAlleganalauninribosomalaunsegundo factor de protena G, factor de elongacin Tu (EFTu) y GTP. Estos supuestoscomplejosternariosseunendbilmentealribosomasolosi las secuencias del anticodn componente de su tRNA son complementarios a los del codn de mRNA presentado en el centro decodificadordelsitioA.Sielencuentroessatisfactorio,laaceptacin tomalugar,unprocesoqueimplicalarupturadeGTP,seguidodela liberacin de EFTu+GDP del ribosoma, un cambio importante en la orientacindeltRNAenelribosoma. ElcentrodedecodificacioncontieneademsunsubsitioP.Elcodnen elsitioPdelasubunidadpequeainteraccionaconelanticodndela peptidil tRNAenelsitioPdelasubunidadlargaalmismotiempoque laformacinenlacepeptdicoocurre.Durantelatranslocacin,elfinal delanticodnterminaldel tRNAenelsitioAsemuevehaciaelsitioP del de la subunidad pequea, desplazando al tRNA deacetilado ya unidoall(sihubounin),ylaligaduradel mRNAhacialasubunidad pequeaavanzaensimpataconladireccin5delostresnucletidos. EstoresultaenlapresentacindeunnuevocodnenelsitioAparael siguiente ciclo de seleccin de aminoaciltRNA, y la formacin de la uninpeptdicoylatranslocacinpuedanocurrir. Aparte de la peptidil transferasa y los centros de decodificacion, el ribosoma incluye un centro con factor enlazante. Este es parte de la subunidadgrande,ytodoslosfactoresdeprotenaGimplicadosenla sntesisdeprotenasinteraccionanconestecentrodefactorenlazante durante por lo menos parte de sus ciclos cometidos. En algunas vas poco entendidas, esta desencadena las actividades de la GTPasa de estasprotenas,ymedialoscambiosconformacionalesquetodosellos facilitan.Este

Figura 2 Interacciones de las terminaciones CCA del tRNA enlazante del ribosomaconlasubunidadgrandedelribosoma.aVistadecortedelaunidad ribosomalgrandeconunintRNAs.LostRNAssonposicionadosenlasubunidad grandecomosedefineenlalegendadelaFig.1,ylasubunidadsedeslizaenla mitaddesulongitudalmismonivelaproximadamenteperpendicularalaFig1 almismonivelpararevelarlalocalizacindelaceptordelostallosdelenlazante ribosoma tRNAs en el tnel de salida de pptidos en la subunidad grande. El rRNAesmostradoenblanco,ylaprotenaribosomalenamarillo.Los tRNAsse encuentranencdigodecolor:SitioE:Caf;sitioP:prpura;ysitioA:verde.b, interaccionesdelassecuenciasenlazanteenelsitioPyelsitioAconrRNA23S. LauninmolecularenelsitioPeselanlogoCCA(prpura)deldeaciladotRNA.

La unin molecular en el sitio A es el anlogo peptidiltRNA de la CCA puromicinfenilalaninaac. caproico biotina (verde)15. Las bases azules son componentes de los bucles P29; las bases cafs pertenecen al bucle A30. Los nucletidos en color cian y rojo son otroscomponentesdelcentrodelapeptidiltransferasa.Lasbases estnnumeradasacordealasecuenciadeH.marismortui23S rRNA. Los dos bases de rRNA 23S cercanas a la recin formada unin peptdico son A2486 y U2620, las cuales corresponden a A2451 y U2585 en E. Coli, respectivamente. (Reproducido con permiso de referencia15.)

hecho es importante percatarse que estos factores actan cataliticamente para mejorar las propiedades que el sistema ribosomalyaposee.ElribosomaprogramadoconRNAmseleccionara aminoaciltRNAs correctamente en ausencia de EFTu. Adems, la reaccion de la peptidil transferasa ocurre espontneamente sobre cualquier ribosoma que contenga los substratos adecuados unidos a el.IncluisvelatranslocacinpuedeocurrirenlaausenciadeEFG.De hecholosribosomasprogramadoscon mRNAs deapropiadasecuencia sintetizara lentamente oligopeptidos en ausencia de los factores11, aunqueenlapresenciadelosfactoreslasntesisdeprotenaocurrea unavelocidadmayoracomoloharadeotraforma,ylaprecisincon quecadamRNAstraducidoseincrementa. A pesar de que la lgica qumica de la sntesis de protena pareciera requerirlaexistenciadenomasquedossitiosdeuninconel mRNA en el ribosoma, existe un tercero, el sitio E. Durante la translocacin lasunionesde mRNAs deaciladosalsitioPsemuevenhaciaelsitioE12. La liberacin del mRNAs desde el sitio E hacia la solucin es acompaada por la aceptacin del siguiente aminoacilmRNA en el sitio A, no el paso de translocacin del siguiente ciclo de elongacin. As como los sitios A y P, el sitio E tiene componentes en ambas subunidadesqueseenmarcanelcentrodecodificadoryelcentrodela peptidiltransferasa13.

Centrodelapeptidiltransferasa.
Muchodeloqueseconocehoyendiaacercadelasestructurasylos mecanismos de reaccin de los centros de decodificacion y de la peptidil transferasa han sido deducidos de cristales de subunidades separadas. idealmente esta informacin hubiera sido obtenida de cristales de ribosomas 70S con sus uniones apropiadas, pero actualmente no hay cristales de ribosoma 70s que difracte a la resolucin requerida para una determinacin independiente de su estructura atmica. La razn de que los cristales de las subunidades son tiles en este contexto es que los sitios de decodificacion y de la peptidil transferasa son contenidos totalmente dentro de una sola, subunidades separadas; estas actividades que son obviamente relacionadas a esos dos centros mostrados en los ribosomas 70S pueden ser remplazados por subunidades separadas. La informacin obtenida debe ser interpretada cuidadosamente, de cualquier forma, mientrasexistapocaresolucindisponibledelosmapasdedensidad electrnicadela70Squeapuntaqueexistenpequeasdiferenciasen las estructuras de estos centros en unidades separadas y en los ribosomas70S. Lasestructurascristalinasdelasunionesdelassubunidadesgrandes conlossustratos,anlogosdesustratosyproductosmuestranqueel centrodelapeptidiltransferasaseencuentraenelfondodeunalarga hendiduraensusuperficiedesuuninconlasubunidadpequea14,15. La figura 1 muestra la cara de la subunidad grande con el tRNA colocadoenelsitioE,PyA;lostallosdesuaceptordesaparecenenla hendidura.ComorevelalaFig.2,lassecuenciasterminalesCCAdela unin del sitio A y P con el tRNA , los cueles deben interaccionar durante la formacin del enlace peptdico, reunidos en el final de un tnel de la subunidad pequea que pasa a travs de la subunidad hasta su lado posterior. (La Fig. 2 deriva de la 1, rotando la parte superior de la subunidad 90 alejado del observador, y entonces el desplazamientoverticaldelasubunidadalolargodelplanoincluyeel tallo del aceptor de la unin de tRNA y el eje del tnel; el hemisferiode la subunidad mas cercano al observador ha sido eliminado, y el tRNA abandona el sitio) Las dos secuencias CCA se renen en el sitio donde los sustratos y productos anlogos de la peptidil transferasa se unen con la subunidad (Fig. 2b). Ninguno de estos descubrimientos fue una sorpresa. La evidencia de la microscopiaelectrnicadeltnel(apropiadamentenombradotnel de salida del pptidos) emergi primero en los aos 198016,17, siguiendo la demostracin desde su elucides, las uniones ribosoma pptido primero se convirtieron accesibles al solvente en su sitio posterior del ribosoma18,19. Todas las dudas acerca de su existencia fueron resueltas mediante estudios de microscopia crioelectronica reportadosafinalesdeladcadade1990quetambindemostrque el centro de la peptidil transferasa esta localizado al final de la subunidadpequea2022. El centro de la peptidil transferasaesta formado por nucletidos de dominio V de los componentes del principal RNA la de subunidad grande; 23S, muchos de estos componen su bucle central, documentadosenestudiosbioquimicos23,24.Ademaddelaverificacin deestosresultados,estasestructurascristalinaspruebanquenohay

Fig.3Unposible mecanismodela participacindeA486(H. marismortui)/A2451(E. Coli)enlaformacindel enlacepeptdico.Unode loshidrgenos pertenecientesalgrupo aminodelauninconel aminoaciltRNAenelsitio Adelasubunidadgrande pareceinteraccionarconel N3deA2451(E.Coli) duranteelataque nucleofilicodeesegrupo aminosobreelcarbono carbonilolauninesterdel nacientepptidosaltRNA inelsitioP(parte superior).Siesa interaccinfueralo suficientementefuerte, podramejorarlatasade formacindeuniones peptdicasmediantela sustraccindeunprotn provenientedelataquedel grupoamino(enmedio yenlapartessuperiores)

protenasqueseandelcentrodelapeptidiltransferasadelribosoma. Esto es lo mas fundamental sobre las actividades ribosomales., su actividad formadora de enlaces peptdico, es catalizada completamenteporunaestructuraexclusivamentedeRNA14. Precisar el alineamiento de sustratos es importante porque proveer de poder cataltico en el centro de la peptidil transferasa14, como es requeridoentodaslasenzimas2527.Hasidopropuestoanteriormente con motivos tericos que la orientacin del sustrato puede ser importanteenelribosoma28,ymuchodeestealineamientorequerido esgarantizadoporunapareamientodebasesentrelassecuenciasCCA del sitio A con el sitio A unido al RNAt con nucletidos con el supuestamentellamadobucleP(hlice80deRNAr23S)29yelbucleA (hlice 92)30, respectivamente (Fig. 2b). Estas posiciones de interaccindelgrupoaminodeunaminoacilRNAtenelsitioAson paraqueaspuedaatacaralcarbonocarbonilodelauninesterdeun polipptidoaunenlaceRNAtenelsitioP14. Las estructuras de la subunidad ribosomail grande de la arquea halofilica Haloarcula marismortui con el sustrato y el anlogo del enlace de transicin sugieren que el centro de la peptidil transferasa obtenga fuerza cataltica de una segunda fuente. El residuo N3 de A2451(E.Coli)deRNAr23Seselhidrogenounidoalgrupoamino del aminoacilRNAt en el sitio A14. Esta interaccin no contribuye solamente en el posicionamiento de ese grupo, sino que podra posteriormente mejorar la tasa de formacin del enlace peptdico extrayendounprotndelgrupoamino(Fig.3). Datos bioqumicos obtenidos recientemente utilizando ribosomas mutilados en la posicin 2451 sugiere que el A2451 puede en efecto actuar como una base general durante la formacin del enlace peptdico. Primeramente, todas esas mutilaciones son letalmente dominantesenE.Coli,enconcordanciaconlavisindequeA2451es vital para la funcin ribosomal3133. Segundo, recientes estudios cinticos muestran que la tasa del paso qumico de formacin de enlacepeptdicoseincrementaenunfactorde100a150cuandoun grupo en el 70S del ribosoma que contiene un pKa cercano a 7.5 es desprotonado, y que este efecto no es visto en ribosomas que tienen uraciloenlaposicin2451enlugardeadenina34.Estasobservaciones

contradicen las conclusiones publicadas previamente que fueron adems basadas en las mediciones de la dependencia de la tasa de formacindelenlacepeptdicoconelelpH,perobajolascondiciones utilizadasenestosexperimentosprevios,latasadelpasoqumicode lareaccinparecenohabertenidounlimite32,35. Lasimpleinterpretacindeestasobservacionespuedeserlacorrecta; elA2451puedeserelgrupocuyatitilacinafectalatasadeformacin delenlacepeptdico,ypuedequehagaestodebidoaquepuedefungir comounabasegeneraldurantelaformacindelenlacepeptdico.Sin embargo,seriaprematuroconcluirquelasituacinestaconclusa.No ha habido pruebas de que hay una titilacin de A2451 que afecte la tasadeformacindeenlacepeptdico,solosielnucletidoenposicin 2451estituladoseveefectoalguno.ElpKadelN3deA2451hubiera sido 7.5 para ambos casos: tanto para funcionar como una base general bajo las condiciones fisiolgicas como se ha propuesto14 as comoparaexplicarlainformacindetitulacin.PeroelpKadelN3de una adenosina es solo cercano a 1.0. A medida que la hiptesis del A2451 fue avanzando, existi informacin qumica que pareca mostrarquelapKadelA2451erainusualmentealta31,perohoyendia esclaroqueesosdatoseranirrelevantesalaspropiedadesdelA2451 de los componentes ribosomales en la formacin del enlace peptdico33,36,37. Finalmente, el postulado de que la mutacin de una de las bases era crucial para perturbar el pKa del A2451 (ref. 14) resultofalsapuestoquenoafectolaviabilidad,yesademsreportado que no afecta en la tasa de formacin del enlace peptidico32,33. Por todas estas razones, sigue siendo posible que un cambio conformacional que dependiente del pH y que de alguna manera dependedelaidentidaddelnucletidoenposicin2451,afectelatasa desntesisdeenlacespeptdico.

Elcentrodecodificador

Unanotablecantidaddeinformacinacercadelcentrodecodificador ha sido generada a partir de estructuras cristalinas de la subunidad pequea, y en parte tambin como resultado de un accidente fortuito38.LasubunidadribosomalpequeadeThermusthermophilus tiene una estructura de tallo en bucle saliente, llamada el espoln, cuyaconformacinseasemejaaladelanticodnquehayeneltalloen formadebucledelRNAr.Adems,elextremofinal3delRNAr16Sse repliega hacia el sitio P, donde se une se cree haya un residuo de RNAm.Unadelasinteraccionesmolecularesqueestabilizaloscristales deestassubunidadesimplicalainsercindelespolndeunadelas subunidades hacia el sitio P de la otra. La interaccin resultante es similaraaquelladondeelRNAtseunealsitioPdelosribosomas70S con su subunidad componente pequea39,40, y mucho de esto (acerca delainteraccindelRNAtconelsitioP)puedeaprendersedecristales desubunidadespequeasquenocontienenRNAtRNAm. A diferencia del centro de la peptidil transferasa, el centro decodificador contiene protena. La ranura pequea del tallo del anticodndeRNAtunidoalsitioPcontactanosolamentenucletidos pertenecientes al mayor dominio 3 y el dominio central del componentedeRNAdelasubunidadpequea,RNA16S,sinotambin a los aminocidos pertenecientes a las protenas ribosomales S13 & S9. El anticodn de RNA unido al sitio P interacciona con el codn expuestodeRNAmarribaaligualquelahlicepenltima(hlice44). ElsitioAesademsunaestructurahibrida38,41.Estaincluyeresiduos de protena ribosomal 16S, y un bucle de S12 que colinda con el codn de RNAm expuesto all. Los elementos del RNAr 16S representados en el sitio A incluyen el bucle 530, la hlice 44 y el mayor dominio 3. Pero a pesar de estas interacciones entre las protenas y el RNAt , el centro decodificador, como el centro de la peptidiltransferasa,esbsicamenteunamaquinadeRNA.Unotienela impresin de que si las protenas en el sitio decodificador pudieran ser removidas de alguna manera sin alterar su estructura, este seguirafuncionandopropiamente. Elcentrodecodificadorestalocalizadoenlaregindondelacabezade lasubunidadpequeaseencuentraconsucuerpo,yestaincluyelas partesmasimportantesdelsitioqueinteraccionaconelRNAm.Partes de este sitio han sido localizadas en cristales de subunidades pequeas que tienen uniones anlogas de RNAm41, y el resto ha sido observado a una menor resolucin en cristales 70S, llevando pequeas, y naturales secuencias de RNAm42. Formas de doble hlice entre las secuencias de ShineDalgarno de mRNAs adecuadamente

Fig 4 Interacciones de revisin de fiabilidad en el sitio A de la subunidad ribosomal pequea. Esta figura muestra las interacciones entre residuos ribosomalesylosparesdebasequeformancuandounanticodndetalloen forma de bucle con un anticodn GAA interacciona en el sitio a con un complementarioUUU.aTipo1:unapequeainteraccindeAentreA1493y el par AU que se forma entre el U en la posicin uno del codn y la A3 del anticodn. b Tipo 2: Pequea interaccin que se forma entre el AU con el segundoUenelcodndeRNAmyA1492.,ylainteraccinsimilarconelpar AU involucrando G530, el cual tiene tambin uniones de hidrogeno con A1492.C.Lainteraccindelribosomaconelpardebasellamadadebalanceo, en la cual involucra el U 3 del condn de RNAm. Obsrvese que este estas interacciones monitorean solamente el desplazamiento de la base de RNAm, noellugardelanticodnconlaqueestaapareado.(Reproducidoconpermiso, ref.41)

posicionadosysusecuenciacomplementariaeneltermino3delRNAr 16S,comoseesperaba43,44.LahliceShineDalgarnoesencontradaen estareginentrelacabezadelasubunidadylaplataforma,cercanaal sitioE. La porcin del sitio P sujeto al mRNAs es difcil de visualizarse en diferentes mapas debiendo a la tendencia de la 3 y de rRNA 16s a ocuparestareginenribosomasvacos.Sinembargo,estaesclarotal estoesunafiladodoblesenlascolumnasdelosmRNAsentrecodones enelsitioPyelcodndeelsitioA.sobreelladodela3deelsitioAla molculapasaatravsdeuntnelformadoporprotenasS3,S4,yS5 que puede funcionar como un helicaza para remover la estructura secundariadesdemRNAcomoestaentraalaregindecodificadora. El primer paso en el mecanismo por que el ribosoma pequeo subunido correctamente decodificado mRNA parece estar acomplejado completamente por un rRNA 16S y la conformacin del complejo entre el mR_NA y el tRNAs en el sitio A depende de la interaccindecodnyanticodnescognado.CuandoentrauntRNAs cognadoalsitioAlasbasesdeA1992y1993cambianposicionesde formas tipo II y tipo I interacciones amino respectivamente con el menorlaranuraenlaprimerasegundabasepartedelresultadocodn y anticodn, estas interacciones no son posibles en la segunda y tercera posicin del anticodn y del tRNAs en el sitio A que no son formadosporWatsonyCrickbasesparesdeunaydosbasesdemRNA codnestospresentados. G530 son menos sensibles a pares de bases geomtricas que Estas interacciones tomadas con el primer segundo par. As estas interaccionesnosoloexplicanporqueelcdigoesdegeneradoenla tercera posicin pero tambin por que los ribosomas son capaces de discriminar as como lo hace este entre cognado de tRNAs y tRNAs cognadoscercanos.ellossontambinimportantesparalacapacidad delosribosomasamejorarlascorreccindepruebasfielmente.

 Los datos de microscopia electrnica muestra que la orientacin de los aminoaciltRNAs sobre el ribosoma cambia dramticamente entre elmomentodelquesonliberadosalribosomaporelfactorEFTuyel momentocuandoocurreelenlacepeptdico. 13,46,47Almomentodela liberacin, cuando el tRNAs es inicialmente seleccionado, los anticodones del tRNAs se encuentran en el sitio A del centro decodificador, pero sus secuencias CCA aminoaciladas no se encuentran cerca del centro peptidil transferasa. El acomodo ( la reorientacinquecolocaelfinalCCAdel tRNAs enelsitioAdelcentro peptidiltransferasa)noocurreamenosqueel tRNAs recibidoseaafin ocasiafnalasecuenciade mRNAenelsitioA.Lasestructurasdelas subunidades pequeas con uniones finales en forma de bucle y los ribosomas70Sconuniones tRNAs correspondenalestadoposterioral acomodamiento, y no esta claro aun como la geometra de la interaccin con el sitio A con los codones de tRNA en el estado posterior al acomodo varia con el estado previo al acomodo, cuyas interaccionesdeterminaninicialmentesieltRNAseraceptadoono. Sin embargo, cuando ocurre una interacciona fin en el sitio A, mediante un mecanismo aun desconocido, una seal es transmitida desde el sitio A al dominio G del factor EFTu, el cruel esta unido al centro del factor uniente en la subunidad grande. Esa seal, la cual puedeinvolucraruncambioconformacionalqueocurreenelsitioA delasubunidadpequeacuandoocurreunainteraccindeuncodn con su anticodn. Los desencadenantes de la hidrlisis de ATP, un factor de liberacin del ribosoma, y de otros pasos de acomodacin. Estas interacciones entre las subunidades no sern comprendidas hastaqueestructurascristalinasdealtaresolucinseanobtenidosde complejos de ribosomas con factores y tRNAs en sus estados anterioresyposterioresasuacomodo.

Figura 5. Conservacin en la subunidad ribosomal grande. La unidad ribosomal grande de H. Marismortui es vista desde el lado de interfase de su subunidadpequea,mirandoabajohaciasusitioactivo,dondeuninhibidor(en rojo)muestraunaunin.LostomosdeRNAsonmostradoscomoesferasque llenanespacios,ylaprotenaesmostradaenformadelistn.ElRNAcoloreado deazulespertenecientealncleodelRNAt23S/28Squesehaconservadoen todas las especies. El RNA en verde representa las secuencias exteriores del ncleoconservativo.(ReproducidoconpermisodeScience.)

ElsitioE

EnelsitioEhaymasprotenasqueenlossitiosA&P.Ademsdelos varioscontactossitioE tRNAshaceconel rRNA16Sy23S,sustallos deanticodninteraccionanintensivamenteconlaS7enlasubunidad pequea, y sus bucles y tallos T contactan a la L1 en la subunidad grande. Existe la interacciones adicionales que involucran a la L33 (ref.40),yhayunasubstancialevidenciabioqumicaindicandoqueel sitioEinteraccionaalostericamenteconelsitioA12.

Elcentrodelfactoruniente

El dominio de la GTPasa, EFTu, EFG y todas las otras protenas factores G participantes en la sntesis proteica interaccionan con el centro del factor uniente durante la sntesis proteica. Debido a la carencia de estructuras ribosomales de alta definicin con factores proteicos G unidos, nuestro entendimiento de la localizacin del centroylaformaconlaqueinteraccionaconlosfactoresestalimitado a lo que puede conjeturarse de las imgenes de microscopia electrnica de baja resolucin y de las investigaciones en biologa molecular 4558,combinadoconunmodelode construccinutilizando estructuras atomicas44. La secuencia de bucle sarcinricin (tallo en bucle 95 del RNAr 23S) es uno de los componentes crticos del centro48, sin embargo el centro tambin incluye diversas protenas (porejemplo:L7/12,I,11,L6,L14;referencias49,50),algunasdelas cuales son esenciales para su operacin. Los factores que interaccionan con el centro, sufren significativos cambios conformacionalesalhacersusfunciones,ascomorupturasdeGTP,y la geometra de los complejos que ellos forman con el ribosoma cambiaenconcordancia,ascomolohacelaconformacindelmismo ribosoma5155.

Otrossitiosribosomales.

Los factores proteicos de sntesis que no son protenas G se unen a sitios en el ribosoma afuera del centro del factor uniente. Han sido reportadas estructuras de alta resolucin para dos de esos factores queseunenalasubunidadpequea:Elfactordeiniciacin1(IF1)56, y el dominio CTerminal del factor de iniciacin 3 (IF3)57. El sitio al cual el IF1 se une incluye al sitio A del centro decodificador de la subunidad pequea, y su interaccin con ese sitio causa cambios conformacionales en la subunidad pequea que interfiere con su interaccin con la subunidad grande, asi como con los tRNAs. El dominio CTerminal del IF3 se une del lado del solvente en la

plataformaenloscristalesdelasubunidadpequeahaciaelcualhubo sidoimpregnado,peroamedidaquelassubunidadessecontactanen los cristales examinados construyen el sitio de unin del IF3 identificado por otros58.59, la relevancia de esta observacin no esta clara. Existen ahora 20 estructuras disponibles paras posibles uniones con subunidades ribosomales, y el numero crece rpidamente. Estas estructurasreafirmanlaimportanciadelRNAenlafuncinribosomal. Lamayoradelosantibiticosexaminadosestructuralmentehansido encontradosparainhibirlafuncinribosomalmediantelauninalos sitioscompuestoscompletamenteporRNA.Muchosantibiticosque tienencomoobjetivolasubunidadpequeainterfierenconlasntesis proteica inhibiendo uno o mas de los cambios conformacionales que acompaalafuncinnormaldeesasubunidad38,41,57.Porelcontrario, losantibiticosexaminadoshastaelmomentoqueinhibenlafuncin de la subunidad grande actan de una forma diferente. Sus interaccionesconelribosomaestericamentebloqueanelaccesodelos sustratos al centro de la peptidil transferasa o el pasaje de los pptidosnacienteshaciaeltneldesalida(ref.60,61yJ.L.Hansen,N. Ban,P.Nissen,P.B.M.yT.A.S.,enpreparacin). Otra regin fundamentalmente vital del ribosoma que consiste primeramente de RNA es la interfase entre las dos subunidades del ribosoma 70S . Esta incluye diversos sitios, llamados puentes, donde componentes de las dos subunidades se contactan unas con otras. Informacin acerca de estos puentes puede ser obtenida nicamente de de estructuras de ribosomas 70S, y por lo tanto la resolucin a la cual estas son entendidas es limitada. Sin embargo, es claro que la mayoradelospuentesresultandeinteraccionesdesecuencias16Sde RNArconsecuencias23S40,porestoesquesontanricosenRNA.Es tambin evidente que el movimiento de los tRNAs a travs de la brecha entre las subunidades del ribosoma 70S que es esencial en la sntesis de protenas debe estar acompaada de por la hechura y rupturadelospuentesentrelassubunidades.Estasestructurastienen unroldinmicoenlasntesisdeprotenas. Lossitiosribosomalesfinalesaconsiderarson,lareginsobreellado posteriordelasubunidadgrandequeseunealtranslocon,elcualesel aparato responsable de la secrecin proteica, y el sitio que interacciona con la partcula reconocedora de la seal, la cual es la responsable de la detencin de la translocacin que ocurre tempranamente en la sntesis de protenas secretadas para que los ribosomas puedan interactuar con el translocon antes de que la sntesisseacompletada.

 La estructura de los ribosomas eucariotas produciendo polipptidos nacientes unidos a la Sec61 (el complejo proteico que forma la interfaseentrelosribosomassecretoresyelrestodeltranslocon)ha sidoinvestigadaampliamentepormicroscopiaelectronica62.Sec61es mas o menos una protena toroidal ensamblada que se une con su poro concntrico con el final del polipptido del tnel de salida. Los contactosformadosinvolucranaamboselementos23S/28StRNAylas protenasquerodeanelfinaldeltneldesalida,L19,L23,L24&L29 (Ref.62).

Evolucindelossitiosactivosribosomales.

Es frecuentemente enfatizado que ninguna enzima pudo haber sido sintetizada sin que los ribosomas modernos hubieran emergido del caldo primario en un nico paso. Los primeros ribosomas estaban formados enteramente de RNA. La evidencia para esta hiptesis es que el centro funcional de los modernos ribosomas, el centro decodificadoryelcentropeptidiltransferasaconsisteprimariamente deRNAyelbonchedefactoreshansidoencontradosenlasuperficie, muyremovidosdeloscentrosfuncionales(Fig.5).Elprimerribosoma fuemeramentemaspequeo,desimpleestructuracomparadoconsus descendientesmodernos,yteniaunafuncinmaslimitada.Elproto ribosoma pudo haber sido de una sola subunidad que catalizaba el enlacepeptdicodeunaformaaleatoria,sinsentidoprogresivo,yesto hizo pequeos oligopeptidos de secuencia aleatoria que no eran protenasenunestrictosentidomoderno,ypudohabertenidootros propositos63. Este protoribosoma pudo haber ganado su funcin decodificador, y su subunidad pequea con la que esta asociada, despus,paralelamenteconlaevolucindelgenomayelRNAt.Debido aquelasprotenasfactoresquefacilitanlafuncinribosomalnoson aun absolutamente esenciales, resulta lgico pensar se aadieron despus. Adems, el sitio E parece ser una adicin evolucionara tarda; uno puede fcilmente imaginar que el ribosoma primitivo descargaba los tRNAS descargados directamente del sitio P al citoplasmaposterioralaformacindelenlacepeptdico. Las composiciones qumicas de los centros funcionales ribosomales muestra una cruda correlacin con su edad evolucionara en esta escena el centro mas reciente es el centro que contiene mas protenas.Elcentropeptidiltransferasa,elmasantiguodetodosellos, notieneprotenasenelcentrodesufuncin.Elcentrodecodificador, el segundo en ser aadido a la partcula, es predominante en RNA, pero las protenas realizan una modesta contribucin a su funcin. Ninguna estructura cristalina de resolucin atmica ha sido establecida aun para el complejo ribosoma/factor en el proceso de elongacin, pero tanto datos bioqumicas como estudios de estructuras de baja resolucin indican que no solamente el sitio de factor uniente contiene diversas protenas, sino que tambin estas tienen funciones criticas para la funcin de este centro. Consistentemente con este patrn, el sitio E, el cual es el ultimo en aadirsealribosomaesmuyricoenprotena.

Conclusin

La importancia del RNA en la funcin ribosmal ha sido probada mas all de las preguntas pasadas, mediante estructuras cristalinas publicadasenlosdosaospasados.Peroalelucidarcomosonestas estructuras, estas proveen nicamente una estimacin acerca de cmolosnucletidosenloscentrosactivosribosomalesrealizansus funciones.Unafrtilreacarentederespuestashasidoabiertayque debera cambiar a los bioqumicas y biologistas moleculares en los aosporvenir. Un completo entendimiento de la funcin ribosomal no parece emerger sin ayuda extra de la comunidad de biologa estructural. Grandescambiosconformacionalesocurrenenelribosomadurantela sntesis proteica, y en la ausencia de estructuras de alta definicin para el ribosoma 70S en muchos mas estados que han sido caracterizadosantes,seriadifcilentenderloqueestoscambiossony porque ocurren. Aunque no es fcil la preparacin de cristales, los beneficioscerteramentesernenormes.