Clenbuterol y formoterol disminuir la produccin de fuerza en aislados intactos de ratn haces de fibras muscularesesquelticas a travs de un mecanismo de b2adrenrgicos independiente

Clenbuterol y disminucin de la produccin de fuerza en el formoterol aislados intactos de ratn haces de fibras musculares esquelticas a travs de una?2-adrenoceptorindependent mecanismo. J Appl Physiol 109: 17161727, 2010; DOI:?10.1152/japplphysiol.00592.2010.-Although las acciones agudas de accin corta2-adrenrgicos en la produccin de fuerza en fibras aisladas de msculo esqueltico de mamfero han sido objeto de una serie de estudios previos, los de accin prolongada? 2-adrenrgicos nunca han sido investigados. Adems, se sabe poco acerca de los eventos de transduccin de seales celulares que median sus acciones. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue investigar los efectos agudos de tratamiento de rpida y lenta contraccin del ratn haces de fibras musculares con el clenbuterol, el formoterol y salbutamol. Tanto el clenbuterol y el salbutamol increment los niveles de cAMP en ambos tipos de fibra, y este efecto fue revertido por ICI118551. Por otro lado, el clenbuterol y formoterol redujo la produccin de fuerza en ambos tipos de fibras. Tambin aument la fosforilacin de fosfolamban y? 2adrenrgicos en los haces de fibras de contraccin lenta, y sus efectos fueron insensibles al propranolol, ICI-118551, y amida 14-22. En contraste, el salbutamol aument la produccin de fuerza en ambos tipos de fibras. Tambin aument el fosforilacin de la? 2-adrenoceptores en las fibras de contraccin lenta solamente, perono tuvo efecto sobre la fosforilacin de fosfolamban en cualquier tipo de fibra. Estos efectos fueron contrarrestados por el propranolol y el ICI-118551, pero no por 14-22amida. En su lugar, 14-22 amida ms potenciado los efectos del salbutamol en la fuerza.En resumen, a largo y corto de accin? 2adrenrgicos tienen efectos opuestos sobre la produccin de fuerza en los aislados intactos de ratn haces de fibras muscularesesquelticas. A partir de estos resultados, se sugiere que las acciones agudas de corta duracin? 2adrenrgicos en la produccin de fuerza en los msculos esquelticos de mamferos estn mediadas a travs de la? 2-adrenrgicos, mientras que los delongactin? 2-adrenrgicos no lo son. cAMP 2-adrenrgicos son los broncodilatadores de gran alcance que se prescriben para el aliviode los sntomas de asma y enfermedad pulmonar obstructiva crnica. Adems de susefectos broncodilatadores, 2-adrenrgicos tambin se han mostrado tener efectos anablicos (27, 37), especialmente cuando se administra sistmicamente durante varias semanas, y los efectos

positivos inotrophic (3, 43, 44), cuando se aplica a los msculos de forma aguda. Los ltimos efectos estn influenciados por muchos factores, incluyendo el modo de administracin de frmacos (2, 5, 6, 11, 12, 38, 43), as como la composicin del tipo de fibra y el grado de activacin de los msculos (2, 3, 11 , 15, 38, 41). As, cuando2-adrenrgicos se administra sistmicamente, afectan submximo contracciones (2, 3, 11, 15, 41), y sus efectos en los msculos de contraccin lenta son muy inconsistentes (2, 3, 11, 15, 38, 41). Por el contrario, si los medicamentos son entregados directamente en el msculo, que afectan tanto a las contracciones submximas y mximas (5, 6, 12), y sus acciones en rpidas y lentas msculos son similares (4, 5). Sin embargo, todos estos estudios se realizaron utilizando la epinefrina (un symphathomimetic) o terbutalina (un shortacting? 2-adrenrgico), y ningn estudio ha investigado los efectos agudos de larga duracin? 2-adrenrgicos, como el clenbuterol y el formoterol . Adems de sus efectos ionotrophic,? 2-adrenrgicos son tambin potentes promotores de crecimiento, especialmente cuando se administra sistmicamente durante perodos prolongados (27, 28, 33, 35). Debido a sus propiedades que promueven el crecimiento, se ha sugerido que podran ser prescrito para el tratamiento de la sarcopenia y la caquexia asociada con enfermedades tales como cncer, virus de la inmunodeficiencia humana, la insuficiencia renal crnica, y enfermedad pulmonar obstructiva crnica (25, 26) . Sin embargo, su uso clnico se ve obstaculizada por la falta de conocimiento sobre cmo funcionan, sobre todo en el msculo esqueltico (26, 45). Por lo tanto, los principales objetivos de este estudio fue investigar 1) los efectos agudos de dos de accin prolongada? 2-adrenrgicos (clenbuterol y formoterol) y una ampliamente prescritos de accin corta? 2-adrenrgicos agonistas (salbutamol) en la produccin de fuerza en el aisladas de mamferos intactos los paquetes de fibras musculares esquelticas y 2) los eventos de transduccin de seales celulares que median las acciones de estos compuestos en el msculo esqueltico. Nuestros resultados muestran que, aunque ambas clases de? 2adrenrgicos aumento de la concentracin de cAMP en todos los haces de fibras y que estos efectos fueron contrarrestados por la? 2-adrenrgicos-inhibidor especfico de ICI-118551, que tiene efectos opuestos en la fuerza. Por lo tanto, el clenbuterol y el formoterol redujo la produccin de fuerza, mientras que el salbutamol se increment. Tambin muestran que los efectos de clenbuterol y formoterol en la fuerza fueron insensibles al propranolol, ICI-118551, y amida 1422, mientras que aquellos de salbutamol se invierte por tanto propranolol e ICI118551, pero no por 14-22 amida. A partir de estos resultados, se sugiere que los

efectos del salbutamol en ionotrophic aisladas de mamferos intactos los paquetes de fibras musculares estn mediadas a travs de la? 2-adrenrgicos, mientras que los de clenbuterol y formoterol no lo son. MATERIALES Y MTODOS Preparacin de paquetes intactos los msculos esquelticos de fibras. Para asegurar una distribucin uniforme en toda la preparacin de todos los compuestos usados y laperfusin adecuada de todas las fibras en una preparacin, los pequeos paquetes de fibras musculares esquelticas aisladas, ya sea del msculo extensor largo de los dedos (EDL) del msculo (sobre todo una contraccin rpida del msculo) o sleo muscular (un msculo predominantemente de contraccin lenta) de los adultos mayores de 56 ratones CD1 4 das (rango: 46 bis "80 das, n 41) se utilizaron en este estudio. Los ratones fueron asesinados por el cuello del tero desarticulacin de conformidad con legislacin del Reino Unido [para un resumen de los reglamentos, ver ref. 7)], y todos los experimentos se ajustaban a las directrices locales Comit de Bienestar Animal. EDL ymsculos sleos se aislaron entonces, y pequeos paquetes que contienen 10 "15fibras (media en seccin transversal de dimetro: 320 16,3 m, n 51) fueron disecados. Se tuvo cuidado para asegurar que todas las fibras en un paquete eran elctricamenteexcitables, y slo aquellos paquetes que mostraban una disminucin de la fuerza de 5% al final del experimento (s) fueron incluidos en el anlisis final. Determinacin de los efectos de 2-adrenrgicos en vigor. El procedimiento utilizado en este experimento fue bsicamente similar a la descrita anteriormente en la referencia. 13.En pocas palabras, haces de fibras fueron montadas horizontalmente entre los dos ganchos de acero inoxidable, con una conectada a un transductor de fuerza (modelo400A, Aurora Cientfico, Ottawa, ON, Canad) y el otro a un servo-motor (modelo 322C, Aurora Scientific) en un msculo cmara con un fondo de vidrio. Ellos fueron perfundidosentonces a una velocidad de 1 ml / min con solucin de Ringer o solucin de Ringerestndar estndar ms diversas concentraciones de clorhidrato de clenbuterol [4-amino--(t-butylaminomethyl) -3,5-diclorobencil clorhidrato de alcohol] disuelto directamente en elsolucin de Ringer, fumarato de formoterol dihidratado {(R *, R *)-N-[2-hidroxi-5-(1 -ydroxy-2-{[2 - (4-metoxifenil) - 1-metiletil] amino} etil) fenil ] formamida fumarato} disuelto en DMSO, o salbutamol {albuterol; - [(terc-butilamino) metil] - 4-hidroxi-mxileno-,-diol =} disolvi en metanol (todos adquiridos a Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido).Solucin de Ringer estndar contena (en mM) 109 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, CaCl2 4, 24NaHCO3, 1 NaHPO4, y 10 piruvato de

sodio con 200 mg / l bovina de suero de ternera, y su pH se mantuvo a 7,4? 0,2 burbujeando continuamente con O2 95% y CO2 5%. La temperatura dentro de la cmara de msculo se monitoriz continuamente utilizando untermopar colocado cerca del extremo transductor de fuerza del haz de fibras del msculo y se mantuvo a 20? 0,1 C por medio de un controlador de termoelctrica (modelo 825A, Aurora cientfico) y un dispositivo Peltier coloca al lado de la cmara de los msculos. Al comienzo de cada Xperiment, la longitud del sarcmero de cada preparacin se fij en2,4? M utilizando un lser de He-Ne (Lneas lser, Oxon, Reino Unido). Los preparativosfueron entonces estimulados elctricamente una vez cada 90 s usando un estmulosupramxima sola para provocar las contracciones musculares de contraccin y una vez cada 5 min con trenes de estmulos (30-60 Hz en las fibras de contraccin lenta y 90-120Hz en las fibras de contraccin rpida) para generar totalmente fusionado tetani. Haces de fibras fueron perfundidos luego con solucin de Ringer o solucin de Ringer estndarestndar ms diversas concentraciones de clenbuterol, formoterol, salbutamol o para determinar la dependencia de la dosis de la fuerza. Contracciones Twitch y tetnica se registraron a continuacin, en presencia o ausencia de cada uno de los frmacos.Despus de estas determinaciones iniciales, todos los experimentos se realizaron con50? M clenbuterol, 100? M formoterol, salbutamol y 500 nm. Se utiliza a concentraciones superiores a 1 mM, DMSO puede deprimir significativamentetanto nerviosa y submximas contracciones tetnicas (34). Por lo tanto, para asegurar que los vehculos utilizados en este estudio (700 M de DMSO en el caso de formoterol y 500metanol M en el caso de salbutamol) no afect a la produccin de fuerza, algunas de lasfibras jas bollo eran tratados durante 1 h con solucin de Ringer que contiene ya sea 700 M de DMSO o 500 M de metanol. Twitches y tetani se registraron a continuacin, en el presencia o ausencia de los vehculos. A las concentraciones que se utilizan, los vehculos no tuvo ningn efecto sobre las caractersticas de ambos y contraccin contracciones tetnicas (Fig. 1). Determinacin de los eventos de transduccin de seales celulares que median los efectos agudos de clenbuterol, el formoterol, salbutamol, y en la fuerza. Para investigar los hechos de la seal de transduccin de celulares que subyacen a los efectos agudos delos? 2-adrenrgicos en la fuerza, otro grupo de pequeos haces de fibras musculares se trat con solucin de Ringer normal por lo menos durante 30 minutos. Solucin de Ringerse reemplaz luego con una que contiene los inhibidores se muestran en la Tabla 1durante 20 min. Fue entonces sustituido por uno que contiene el inhibidor ms la?2-

adrenrgico, cuyos efectos estaban siendo investigados por al menos otros 30 minutos. Finalmente, los haces de fibras fueron cambiados de nuevo en solucin de Ringer estndar. Durante cada tratamiento, espasmos y tetani fueron registrados y almacenados en un ordenador para su posterior anlisis. En otro experimento, haces de fibras aisladas de seis ratones se dividieron en dos grupos. La mitad (6 haces de fibras / tratamiento) fueron tratados con solucin de Ringer o solucin de Ringer estndarestndar ms vehculo (DMSO o metanol en los experimentos de formoterol y salbutamol,respectivamente) durante al menos 1 hora. Estos haces actuaron como controles. La otra mitad (que consta de 6 paquetes de fibras especiales, el tratamiento) fue tratado por el mismo perodo de tiempo con solucin de Ringer normal ms 50? M clenbuterol, 100? Mformoterol, salbutamol o 500 nM por lo menos durante 30 minutos. En otro experimento,haces de fibras se preincubaron en solucin de Ringer estndar ms los inhibidores de lamuestra en la Tabla 1 durante 20 min. Se incubaron luego en solucin de Ringer que contiene el inhibidor ms el? 2-adrenrgico, cuyos efectos se estn investigando durante 1 h. Al final de los experimentos, los haces de fibras musculares se procesaron para el anlisis de inmunotransferencia como se describe a continuacin. Los datos de manipulacin y anlisis. Fuerza (desde el transductor de fuerza) y temperatura (desde el termopar) se recogieron las seales a travs de una interfaz delaboratorio CED 1401 Micro mediante la seal de software 2,11 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido) y se almacena en una ordenador. Las amplitudes de las contracciones musculares de contraccin y tetnica se determinaron a continuacin, utilizando la seal 2,11 software. La amplitud de los registros de fuerza bajo cada condicin experimental se promediaron y dividido por la fuerza media registrada a partir de la misma fibra bajo las condiciones de control. Los datos (en%) se presentan como medios de control de la SE tensin. Todas las transferencias de Western se realizaron por triplicado y cada experimento se repiti al menos tres veces. La intensidad de las bandas de cada experimento seanalizaron mediante Scion imagen (NIH) y despus se normaliza a la de la actina. El anlisis estadstico de los datos se realiz con SigmaPlot 11,2 (Systat Software, Londres, Reino Unido). La comparacin de los diversos conjuntos de datos se realiz medianteANOVA de una va, y los valores de p de 0,05 fue considerado estadsticamente significativo.

RESULTADOS Efectos del tratamiento de haces de fibras con largo y shortacting? 2-adrenrgicos en force.Treatment mxima isomtrica de los haces de fibras con clenbuterol condujo a una reduccin dosis-dependiente en la fuerza isomtrica mxima (Po, igual a la tensin, la figura 2A.). Cambios similares se observaron cuando los haces de fibras fueron tratados con formoterol, otro de accin prolongada? 2adrenrgico (trazas no mostrado). En contraste, el tratamiento de los haces de fibras con el salbutamol condujo a un incremento en Po (Fig. 2B). Aunque los rastros se muestra en la fig. 2 son de haces de fibras de contraccin rpida, resultados similares fueron observados cuando de contraccin lenta haces de fibras fueron tratados con los compuestos. Los cambios en Po se observaron en todas las concentraciones investigadas. Se produjo dentro de 10-15 minutos despus de la aplicacin de los frmacos y podra ser fcilmente revertido por conmutacin de los haces de fibras de nuevo en solucin de Ringer estndar [trazas etiqueta de lavado (WO) en la figura. 2, A-C]. Resumen de los datos de 6 de contraccin rpida y 6 de contraccin lenta haces de fibras musculares por experimento se muestran en la figura. 2C. El tratamiento de los haces de fibras musculares, ya sea con el clenbuterol o formoterol condujo a una reduccin en Po, cuya magnitud depende de la concentracin de los frmacos utilizados, y no se observaron diferencias estadsticas cuando los datos de las fibras rpidas y contraccin lenta-fueron comparados ( P? 0,05). Por ejemplo, en haces de contraccin rpida fibras musculares, 5? M clenbuterol condujo a un 10,3? 4,8% (n? 8 fibras) la reduccin de Po, mientras que a los 50? M que llev a un 55,5? 4,1% (n? 8 fibras) cada de la Po. Los valores correspondientes en los paquetes de contraccin lenta las fibras musculares fueron de 13,7? 4,1% (n? 6 fibras) y 54,2? 5,4% (n? 6 fibras), espectively.Adicionalmente, el tratamiento de los haces de fibras con concentraciones de clenbuterol de? 150? M y formoterol de? 250? M completamente abolido Po (resultados no mostrados). Tambin cabe destacar que a pesar de clenbuterol y formoterol tenan efectos similares sobre el Po, el aumento de las concentraciones de este ltimo se requiere para inducir a reducciones similares en el Po como el primero. Efectos del tratamiento de los haces de fibras musculares con? 2-adrenrgicos en la tensin nerviosa. Los efectos del tratamiento de los haces de fibras con clenbuterol, el formoterol, salbutamol, y en las contracciones musculares de contraccin eran bsicamente similares a los que estos compuestos tenan en el Po. As, el tratamiento de los haces de fibras con clenbuterol y formoterol condujo a una disminucin de la fuerza de contraccin (ver fig. 3, A y B), mientras que el tratamiento con salbutamol

aumento del mismo (Fig. 3C). Al igual que Po, los cambios en la fuerza de contraccin aumenta con la dosis de los agonistas utilizados y no fueron estadsticamente diferentes entre los dos tipos de fibra (P 0,05;? Fig. 3D). As, 25? M clenbuterol condujo a un 69,8?2,1% (n? 6 haces de fibras) disminucin de la fuerza de contraccin mxima en haces de fibras musculares de contraccin rpida del msculo y un 69,4? 3,1% (n? 6 de fibra paquetes) disminucin de la fuerza de contraccin de las fibras de contraccin lenta (Fig. 3D). En contraste, 500 nM salbutamol condujo a un 20,2? 1,8% y 20,3? 2% de aumento en la fuerza de contraccin en los haces de fibras rpidas y lentas, respectivamente (Fig. 3D). A pesar de los tres compuestos afectada la amplitud de contraccin, que no tuvo ningn efecto significativo en el tiempo de subida. Sin embargo, tanto el clenbuterol y el formoterol aumenta ligeramente la tasa de contraccin de la relajacin. Por ejemplo, los tiempos de subida media de la fuerza de contraccin de las fibras de contraccin lenta fue de 21.8? 0,8 y 23,4? 0,4 ms (n? 6) en ausencia y presencia de clenbuterol, respectivamente. Por otro lado, el medio de relajacin de la fuerza de contraccin en las mismas fibras disminuy de 310,2? 6 a 500,5? 3 ms (n? 6) en presencia y ausencia de clenbuterol, respectivamente. Como los efectos sobre la produccin de fuerza de los tres? 2-adrenrgicos examinados no fueron estadsticamente diferentes entre los dos tipos de fibra en todas las concentraciones examinados (P? 0,05), en el resto de los datos del estudio de ambos tipos de fibras se analizaron en conjunto. Adems, como sus efectos sobre la tensin de contraccin fueron similares a los que tenan en Po, slo sus efectos sobre Po fueron considerados en el resto del estudio. Efectos del propranolol e ICI 118,551, de los cambios en la fuerza inducidas por? 2-adrenrgicos. Para determinar si los cambios en la fuerza informado anteriormente fueron mediadas a travs de la? 2-adrenrgicos, algunos de los haces de fibras fueron pretratadas con 10? M propranolol (un general?Adrenrgico) o 10? M ICI-118551 (uno especfico? 2 -adrenrgico) durante 20 min. La solucin de Ringer fue cambiado a uno que contiene el propranolol o ICI118.551, ms el 2 - agonista de los receptores adrenrgicos, cuyos efectos estaban siendo investigados por otros 30 minutos. Fuerza se registr a continuacin, en presencia y en ausencia de los inhibidores y / o drogas. El tratamiento de los haces de fibras con 10? M propranolol solo condujo a un 10,3? 3,8% (n? 7 fibras) disminucin de la Po, y combinarlo con cualquiera de clenbuterol o el formoterol no suprimi sus efectos sobre la Po (Fig. 4, A y C). En contraste, el pretratamiento de haces de fibras

con propranolol invertido completamente los efectos del salbutamol sobre Po (Fig. 4, B y C). Se obtuvieron resultados similares cuando los haces de fibras fueron tratados con los frmacos ms el? 2-adrenrgicos-inhibidor especfico de ICI118551 (fig. 5). Sin embargo, a diferencia de propranolol, ICI-118551 solo no tuvo ningn efecto sobre Po (Fig. 5, A y B). Efectos de la amida 14-22 sobre los cambios en la fuerza inducida por? 2adrenrgicos.Se cree generalmente que el 2 -? Agonistas adrenrgicos ejercen sus efectos a travs de la activacin de PKA por AMPc (10, 17, 36, 42). Sin embargo, una serie de estudios (10, 39) han demostrado recientemente que el AMPc puede ejercer efectos que son independientes de la PKA. Por lo tanto, en otro experimento, se examinaron los efectos de la inhibicin de la PKA sobre los cambios en la fuerza inducidas por los tres? 2-adrenrgicos. El tratamiento de los haces de fibras con 10 nM 14-22 amida, una celda de permeabilidad PKA inhibidor especfico, no result significativamente afectan a la produccin de fuerza en ambos tipos de fibra (P? 0,05). Adems, no suprimir los efectos de los? 2-adrenrgicos (Fig. 6). En efecto, adems potenci los efectos del salbutamol sobre Po (Fig. 6, B y C). Por ejemplo, el tratamiento de los haces de fibras con salbutamol solo condujo a un 15? 2% (n? 5 fibras) el aumento de Po, y esta cifra ascendi a 21,5? 3% cuando los haces de fibras fueron tratados con ambos salbutamol y amida 14-22. ? 2-Adreceptor expresin rpida y de contraccin lenta haces de fibras musculares esquelticas. Anteriormente, un nmero de estudios de unin de radioligandos (8, 16, 20) han demostrado que la? 2-adrenrgicos es el principal?-Receptor presente en el msculo esqueltico de mamferos y que su concentracin es mayor en el msculo soleus que en el msculo EDL ( 8, 16, 20). Sin embargo, poco se sabe sobre su expresin en el nivel de protenas, as como su grado de fosforilacin despus?estimulacin agonista 2-adrenrgicos. Tambin es incierto si su fosforilacin puede dar cuenta de los cambios en la fuerza que hemos detectado en este estudio. Por lo tanto, en otro experimento, se analiz la expresin y la fosforilacin de la? 2-adrenrgicos en pequeos haces de fibras musculares aisladas de la EDL (contraccin rpida) y sleo(contraccin lenta) los msculos de ratones adultos antes y despus del tratamiento con?2adrenrgicos agonistas. En todos los haces de fibras examinados, el receptor estaba presente con independencia de si son de rpido o lento-contraccin muscular (fig. 7). Adems, en cada tipo de fibra, las formas fosforiladas y fosforilada del receptor eran recprocos, es decir, cuando una fibraexpresado altas concentraciones de una forma, se expresaron niveles bajos de la otra.

Por lo tanto, las fibras de contraccin rpida expresa principalmente la isoformafosforilada, mientras que las fibras de contraccin lenta expresa de forma predominantela forma fosforilada, del receptor (Fig. 7, A y B). Por otra parte, el tratamiento de los bultoscon cualquiera de los 2 - agonistas de los receptores adrenrgicos aumento de la fosforilacin del receptor en los paquetes de contraccin lenta las fibras musculares (ver Fig. 7C).. Efectos del tratamiento de los haces de fibras musculares con? 2adrenrgicos en la fosforilacin de la PLB. En general se cree que el efecto de lusitrophic?-Adrenrgicosestimulacin de los msculos cardacos surge de la fosforilacin de PLB, un retculosarcoplsmico pequeo Ca2ATPasa protena pumpassociated, por PKA (18, 22). Sin embargo, si los cambios similares en la fosforilacin de PLB ocurrir en esqueltico las fibras musculares despus? 2-adrenrgicos tratamiento con agonistas es incierto.Tambin es incierto si los cambios en su fosforilacin contribuido a los cambios en la fuerza reportados en otras partes en este informe. Por lo tanto, en otro experimento, se examinaron los efectos del tratamiento de pequeos haces de fibras musculares con el clenbuterol, el formoterol,salbutamol, y en la fosforilacin de la PLB. El tratamiento de los haces de fibras con el clenbuterol aument la fosforilacin de PLB en haces de fibras de contraccin lenta pero disminuy en haces de fibras de contraccin rpida (fig. 8, A y B). Se obtuvieron resultados similares cuando los haces de fibras fueron tratados con formoterol (resultados no mostrados). En contraste, el tratamiento de los haces de fibras con el salbutamol no tuvo efecto sobre la fosforilacin de PLB en haces de fibras de contraccin lenta. Sin embargo, se suprimi completamente la fosforilacinde PLB en haces de contraccin rpida fibras musculares (Fig. 8, C y D). Efectos de la? 2-adrenrgicos sobre las concentraciones de AMPc en haces de fibras.En la mayora de los tejidos,? 2-adrenrgicos estimulacin activa la adenilato ciclasa, lo que lleva a un aumento en los niveles de cAMP intracelulares (10, 17, 36, 42), y el tratamiento de las fibras del msculo esqueltico de rata con dibutiril-AMPc tiene efectos similares sobre la fuerza como la terbutalina (6, 12). Por lo tanto, en otro experimento, se investig los efectos del tratamiento de los haces de fibras musculares con 50? Mclenbuterol salbutamol o 500 nM en las concentraciones de cAMP. Ambos agonistasllevado a una de dos a tres veces en aumentar la concentracin de cAMP en todos los lotes examinados con independencia de si eran de msculos rpidos-

o contraccin lenta-(Fig. 9). Adems, el pretratamiento de los haces de fibras con 10? M ICI-118551 invertido completamente el incremento de cAMP inducida por los agonistas en ambos tipos de fibras (fig. 9, A y B). Por ejemplo, el tratamiento de los haces de fibras de contraccin rpida con clenbuterol aumento de los niveles de cAMP de 556? 10 a 1.371? 57 pmol / gmsculo (n? 3 fibras), y el tratamiento previo de los paquetes con ICI-118551 invertido esta a 157? 12 pmol / g msculo. DISCUSIN Aunque los efectos agudos de terbutalina (5, 12) y el salbutamol (43) sobre la produccin de fuerza en mamferos haces de fibras del msculo esqueltico previamente han sido investigados, esta es la primera vez que los de una accin prolongada? 2-adrenrgico han sido examinados. Los resultados aqu presentados muestran que los efectos del tratamiento de pequeas intactas mamferos haces de fibras del msculo esqueltico con? 2adrenrgicos en la produccin de fuerza depender de las CLAS del agonista y no en la composicin del tipo de fibra del msculo, como ya se sugiri (2, 4, 11, 15, 38, 41). Por lo tanto, el tratamiento de los haces de fibras con la corta duracin? 2adrenrgico salbutamol aument la produccin de fuerza en los dos haces de fibras rpidas y Slowtwitch, mientras que el tratamiento con los de accin prolongada? 2-adrenrgicos clenbuterol y el formoterol tuvo el efecto opuesto en fuerza (ver Figs. 2 y 3). Tambin es digno de mencin que los efectos del salbutamol reportedin el presente estudio y las que se presentan en otra parte (5, 12, 43) son similares (por ejemplo, comparar los resultados que se muestran en las Figs. 2 y 3 del presente estudio con los que se muestran en las Figs. 3 y 4 de ref. 5). As, el tratamiento de los haces de fibras, ya sea con salbutamol o terbutalina condujo a un aumento de 14-20% tanto en contraccin y fuerza tetnica. Adems, el aumento de la fuerza se produjo en ambos tipos de fibras con independencia de si los haces eran de ratones (presente estudio y ref. 4) o ratas (refs. 5 y 12). Por lo tanto, es probable que un aumento de la fuerza es un general propiedad de todos los de accin corta? 2-adrenrgicos en pacientes adultos msculos esquelticos de mamferos, independientemente de su composicin tipo de fibra, y las diferencias en la fuerza observadas en algunos estudios previos (2, 3, 15) probablemente reflejan los preparados que se utilizan o se utilizan las tcnicas de estimulacin . Uno de los efectos adversos de la? 2-adrenrgicos, particularmente despus de la administracin oral o por inhalacin a dosis elevadas, es temblores del msculo

esqueltico (21, 23). Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a los tembloresson an poco conocidos, algunos investigadores creen que se derivan de la accin de losagonistas en la periferia? 2-adrenrgicos (29). Sin embargo, como los resultados reportados en los estudios de este y los anteriores (5,6, 12, 43) demuestran claramente, el tratamiento de pequeos haces de fibras del msculo esqueltico con diferentes concentraciones de clenbuterol (5-100? M),formoterol (5-150? M ), el salbutamol (0,001 hasta 1,0? M) (presente estudio y ref. 43) yterbutalina (0.1-10? M) (refs. 5 y 6) no indujo contracturas en cualquiera de las preparaciones. Por lo tanto, no creo que los temblores surgen de las acciones directas de estos compuestos en? 2-adrenoceptores en msculos esquelticos de mamferos. En su lugar, especular thatthey surgir ya sea desde la accin de estos compuestos en el sistema nervioso autnomo o de la hipopotasemia que inducen en vivo (9). En general, se cree que a corto y de larga duracin? 2-adrenrgicos ejercen sus efectospositivos en inotrophic msculos esquelticos de mamferos a travs de la? 2-adrenrgicos (5, 12). Por lo tanto, sus efectos deberan ser fcilmente revertidos porcualquiera de propranolol (un general?-Bloqueante) o ICI 118,551 (un? 2-adrenrgicosespecficos bloqueador). Sin embargo, como los resultados reportados en el presente estudio muestran, esto no es siempre el caso (vanse las Figs. 4 y 5). As, ambos inhibidores totalmente suprimido el aumento de lafuerza inducida por salbutamol, e ICI-118551 tambin invierte el aumento de cAMPinducida por tanto el clenbuterol y el salbutamol (ver fig. 9). En contraste, ambos inhibidores no tuvo efecto sobre la disminucin de la fuerza inducida por tanto el clenbuterol y formoterol. Nuestra interpretacin de estas observaciones es que en los mamferos haces de fibras del msculo esqueltico, de corta duracin? 2-adrenrgicos modulan la fuerza, principalmente a travs de las? 2-adrenrgicos, mientras que los de accin prolongada? 2-adrenrgicos no. Esta sugerencia se ve reforzada por las observaciones que ICI-118551 (12) y propanolol (5) tambin aboli los efectos de la terbutalina sobre la produccin de fuerza en aislados de rata haces de fibras musculares esquelticas, mientras que ICI-118551 y octavos de final de la? 2-adrenrgicos no tuvo ningn efecto sobre el aumento de la captacin de glucosa inducida por clenbuterol en el ratn haces de fibras musculares esquelticas (32). Del mismo modo, la retirada mecnica del sarcolema en la rata rpido y fibras de contraccin lenta del msculo esqueltico no aboli los efectos del clenbuterol en el retculo sarcoplsmico carga de Ca2 (1). En conjunto, todas estas observaciones sugieren que el clenbuterol tiene

efectos sobre la produccin de la fuerza y la captacin de glucosa en los mamferos las fibras musculares esquelticas que no estn mediadas a travs de la? 2-adrenrgicos. En esqueltico de rata haces de fibras musculares, el aumento de la fuerza inducida por la accin corta? 2-adrenrgicos es acompaado por un aumento de AMPc (43) y la concentracin de Ca2 intracelular (4, 6, 12). Tambin puede ser imitado por dibutyrylcAMP (5, 12). Por lo tanto, se ha sugerido que el aumento de la fuerza surge de la mayor liberacin de Ca2 del retculo sarcoplsmico, y, para que esto ocurra, la fosforilacin de rianodina / dihidropiridina receptores por PKA es necesario (6, 12). Aunque en el presente estudio, tanto el clenbuterol y el salbutamol aument los niveles de AMPc en todos los haces de fibras investigados, y aunque esto se invierte por completo por el pretratamiento de los haces de fibras con ICI-118551, el pretratamiento de los haces de fibras con 14-22 amida, un PKAspecific inhibidor, no tuvo efecto sobre la disminucin de la fuerza inducida por el clenbuterol y formoterol. Adems, el pretratamiento de los haces de fibras con 14-22 amida no aboli el aumento de la fuerza inducida por salbutamol. En su lugar, adems potenci los efectos del salbutamol en la fuerza. Algunas de estas observaciones dan mayor credibilidad a la idea de que los de accin prolongada? 2-adrenrgicos tienen efectos directos sobre la fuerza. Tambin sugieren que, en las fibras musculares esquelticas de mamferos, los pasos intermedios de la PKA puede tener efectos negativos en la produccin de fuerza. De hecho, en los msculos cardacos, la activacin de PKA conduce a la fosforilacin de la troponina I y miosina de unin de la protena C, y esto se ha demostrado que disminuye la sensibilidad miofibrilar Ca2. Tambin aumenta la tasa de ciclos de puentes cruzados, y la red efecto de todas estas acciones es la reduccin de la tensin nerviosa (15, 19, 30).Adems, como los efectos del clenbuterol y el formoterol fueron insensibles a 14-22 amida, le sugerimos que no estn mediadas a travs de cualquiera de PKA. Otra consecuencia de la activacin de PKA en los msculos esquelticos estriados es la fosforilacin de la PLB. PLB es una protena 22-kDa oligimeric que acta como un modulador de sarco (endo) plasmtico Ca2-ATPasa del retculo (SERCA) en las fibras musculares cardacas y dos de contraccin lentaesquelticos (18). Normalmente, se inhibe De la recaptacin de Ca2 por SERCA, pero una vez que se fosforilados en Ser16 y Thr17 por la PKA, sus efectos inhibitorios son abolidas, y esto aumenta la actividad de la SERCA, resultando en un aumento de la tasa de Ca2 recaptacin y, por lo tanto, la relajacin de tensin

(40).Adems de sus efectos sobre la fuerza, la terbutalina tambin aumenta la tasa de relajacin de tensin en las fibras musculares de rata de contraccin lenta (12), pero no en ratones de contraccin rpida haces de fibras musculares (4). Por lo tanto, estas observaciones se han tomado como un indicio de que la terbutalina aumenta la fosforilacin de PLB en mamferos fibras del msculo esqueltico (6, 12). Sin embargo, como los resultados mostrados en la figura. 8 demuestran, el salbutamol no aument la fosforilacin de PLB en cualquiera de los haces de fibras, lo que sugiere que los de accin corta? 2-adrenrgicos puede tener ningn efecto sobre la fosforilacin de PLB. En efecto, dibutiril-AMPc se ha demostrado que no tienen ningn efecto sobre la descomposicin de Ca2 transitorios registrados a partir de los msculos sleos de ambos ratones transgnicos y de tipo salvaje (24). En conjunto, estos hallazgos sugieren que un aumento en la fosforilacin de la PLB no puede ser una caracterstica constante de tratamiento de mamferos haces de fibras del msculo esqueltico con accin corta? 2-adrenrgicos agonistas. En contraste, el tratamiento de ambos rpidas y lentas haces de fibras musculares con clenbuterol y el formoterol siempre conduce a una disminucin de la fuerza en ambos tipos de fibra (Figuras 2 y 3) y un aumento de la fosforilacin de PLB en las fibras de contraccin lenta solamente (Fig. 8). Adems, en estas fibras, los cambios en la fuerza fueron siempre acompaada por un marcado incremento en la tasa de relajacin de tensin. De hecho, todos los haces de fibras tratadas con? 50? M clenbuterol y 100? M formoterol fueron incapaces de mantener el ttanos, y sus contracciones tetnicas en la presencia de las drogas siempre pareca contracciones musculares de contraccin. A partir de estas observaciones, se sugiere que la fosforilacin de PLB por tanto el clenbuterol y el formoterol puede jugar un papel importante en la disminucin de la fuerza inducida por estos compuestos. Sin embargo, como PLB se encuentra principalmente en las fibras de contraccin lenta, esto no puede ser el nico mecanismo que subyace a la reduccin de la fuerza inducida por estos compuestos en las fibras musculares esquelticas de mamferos. Por lo tanto, otra posibilidad es que estos compuestos actan directamente para desacoplar ciclismo puentes cruzados. De hecho, es bien sabido que?Estimulacin de los adrenoceptores puede mejorar ciclos de puentes cruzados en los miocitos ventriculares (14), y esto puede explicar por qu las acciones de clenbuterol y el formoterol fueron insensibles al propranolol e ICI 118,551. Sin embargo, ms estudios para confirmar esto se justifica. En resumen, los resultados que presentamos aqu muestran que el salbutamol, terbutalina, como, aumenta la produccin de fuerza en las fibras intactas aisladas de mamferos del msculo esqueltico, mientras que el clenbuterol y el formoterol tiene los efectos

opuestos sobre la fuerza. Tambin muestran que los efectos del salbutamol estn mediadas a travs de la 2 -? Drenoceptor, mientras que los de clenbuterol y formoterol no lo son. A partir de estos resultados, se sugiere que los efectos del clenbuterol y formoterol en la produccin de fuerza en zonas aisladas, intactas de mamferos haces de fibras musculares esquelticas puedan derivarse de sus acciones directas sobre puentes cruzados.