Inmunologia en las infecciones virales La respuesta inmune a cualquier agente infeccioso es una respuesta global integrada por 3 elementos

que actan al unisono Cuales son estas respuestas? 1. Respuesta inmune humoral comandada por linfocitos B y mediada por anticuerpos 2. Respuesta inmune celular comandada por linfocitos T y mediada por clulas 3. Factores que modifican la respuesta inmune y que son factores inespecficos Tipos de inmunidad y Inmunidad activa y pasiva Inmunidad Activa es aquella en que el organismo acta, es creada por el organismo, es elaborada por el organismo Natural - Artificial Inmunidad pasiva, el organismo recibe la inmunidad, alguien mas la hizo Natural - artificial *Inmunidad activa natural: El hombre la adquiere cuando sufre la infeccin naturalmente *Inmunidad activa artificial: Es cuando el individuo recibe un agente inmunizante, vacunas, aunque es la vacuna de Edward Jenner, virus de la vacuna o vaccinia *Inmunidad Pasiva natural: es cuando el individuo la recibe de la madre (inmunidad congnita) A travs de la Ig G por la placenta y a travs e la Ig A a travs el calostro y la leche materna *Inmunidad Pasiva artificial: el individuo la recibe de dos fuentes: Homologa y Heterologa *Inmunidad pasiva artificial Homologa: Cuando recibe los anticuerpos producidos por individuos de la misma especie Dos tipos de anticuerpos muy conocidos Ig antirrabica humana y la Ig contra el antigeno de la Hepatitis B *Inmunidad Pasiva artificial Heterologa es la que se produce en animales, suero antirrbico hecho en equinos En heridas se Ig antirrabica humana y tambin la vacuna pero cuando no hay la antirrabica humana se da el suero de equinos Respuesta inmune humoral comandada por linfocitos B y mediada por anticuerpos

Elementos que constituyen la respuestas 1) Linfocitos B se llama as por la bolsa de Fabricio y por Bone marrow Antigeno (ag) es proporcionado por la infeccin viral y la respuesta a ese ag son los anticuerpos (ac) Ig son proteinas por lo tanto, sin proteinas no hay Ig y no hay buena respuesta inmune Ag proporcionado por la infeccin viral (inmunidad natural) o por el agente inmunizante (inmunidad artificial) Virus de la polio es pequeo , 20 nm de diametro para que un buen inmunogeno sea un buen inmunogeno ese ag debe tener una determinada estructura Penetra mucosa digestiva, manos, agua y alimentos contaminados con heces va a la red linftica que los lleva a ganglios linfticos regionales, placas de Peyer, si no se controla la infeccin conducto torcico Viremia y rganos centrales donde se multiplica tremendamente se produce una segunda viremia En el uno por ciento llega a medula sea (astas anteriores) y produce paralisis flacida en el 1% de los casos. virus citocida = muerte celular En el 99 % restante puede ir a cualquier sitio sin producir mayores consecuencias. El 1% es tan especfico que identifica la enfermedad. Las infecciones virales dan lugar a una respuesta inmune duradera que generalmente dura toda la vida Ac: son Ig que estn constituidas por protenas por eso la infeccin por sarampin en nios e EU y Canad mientras en pases en desarrollo la infeccin es diferente. Las Ig son la A, M y G En nuestros nios hay complicaciones como encefalitis, otitis media y neumona y eso se debe a la falta de una buena nutricin ya el virus es el mismo y la cepa e es la misma La Alimentacin es un factor inespecfico que altera la respuesta inmune. Vamos a ver ahora como se comporta la respuesta inmune en infecciones generalizadas y superficiales Respuesta inmune en infecciones superficiales y generalizadas Infecciones superficiales no son las infecciones de la piel son las de mucosa y sobre todo de la mucosa respiratoria Una de las puertas de entrada son las mucosas

En las Infecciones generalizadas la respuesta inmune es intensa, moderada, progresiva, duradera y se produce con un despliegue de todas las Ig G,M y A 1) El virus se multiplica en la puertas de entrada y hace su recorrido, primera virema los lleva a los rganos centrales donde se multiplica tremendamente dando lugar a la produccion de una tremenda masa inmunogena, luego se da la segunda virema que lleva el virus a los rganos de choque 2) el virus entra en contacto temprano con las clulas del sistema inmune en los mismos sitios donde se multiplica que son hgado, bazo y medula sea 3) Son infecciones por virus que no cambian su estructura antignica en el curso el tiempo , son virus monotipicos Si el virus entra por mucosa en ese lugar adems de la Ig A en la sangre se produce Ig A extra secretoria que se produce a nivel de la mucosa, solo en virus que entran por mucosa se produce tan pronto como el virus entra y dura 5 anos Ig M, los reactivos comerciales no la detectan antes de los cinco das llegando a un titulo moderado a las dos semanas, donde comienza a descender y puede durar algo mas de dos meses y se detectan hasta el mes IgG en el momento en que desciende la IgM es posible detectar la IgG, esto es hacia las dos semanas Hacia los ocho dias la IgG puede ser detectada y a partir de la segunda semana alcanza un titulo bueno y al mes o a los dos meses tiene un mejor titulo. La IgA dura cinco anos en mucosa y y y Respuesta inmune a la primoinfeccin Respuesta inmune de tipo secundaria Respuesta inmediata, intensa y duradera Virus del sarampin. La infeccion repetida por el mismo virus da lugar a la respuesta inmune de tipo secundario que se produce La Ig A M y G tienen papel relevante pero solo los anticuerpos ligados a Ig G confieren proteccin ya que es la Ig de memoria El sarampin ingresa por mucosa respiratoria al ano ya sea por infeccin natural o por inmunizacin y la Ig se eleva y si a los seis anos se expone a la infeccin eleva nuevamente.

Con cada enfrentamiento se produce un reconocimiento donde se produce una respuesta inmune no primaria sino secundaria, la respuesta inmune secundaria es inmediata, duradera e intensa y es solo Ig G La primaria es lenta progresiva y duradera y constituida por el despliegue de las tres Ig Infecciones superficiales, son generalmente producidas por virus respiratorios, virus que tienen variantes antignicas, es decir son virus no monotpicos, dan lugar a una respuesta inmune de tipo primario La misma figura se produce pero difcilmente los virus respiratorios llegan a sangre entonces no se multiplican en rganos centrales y la respuesta inmune es pobre y a lugar la produccin de Ig A srica y una Ig A local secretoria que sirve solo si la variante antignica es la misma La IgM tiene una elevacin pobre, se producen las tres inmunoglobulinas. Existe por tanto una primoinfeccin Cmo se produce la respuesta inmune en virus que tienen variantes antignicas? TEORIA DEL PECADO ORIGINAL ANTIGENICO En virus que tienen variantes antigenicas como influenza. En virus que estn antigenicamente relacionados entre s como el Dengue Aquellos virus con variantes antigenicas tienen dos caractersticas:  La respuesta inmune a las infecciones seriadas del mismo virus o con cepas antigenicamente relacionadas entre si, se ve influenciada por dos procesos que parecen operar por competencia Existe una amplificacin en la especificidad contacto por primera vez Virus de influenza Con cada reinfeccion se produce una respuesta inmune e tipo primario Cada cepa esta antigenicamente relacionada, al mismo tiempo que se produce una amplificacion en la especificiad de los anticuerpos producidos. de los anticuerpos producidos pero

simultneamente se estimula la memoria inmunolgica del virus con el cual el individuo entro en

Cada cepa que entra estimula la memoria inmunologica de la cepa con el que individuo entro en contacto pro primera vez por lo tanto escurece, opaca la respuesta inmune de tipo primario. Se produce una respuesta inmune para un virus inexistente.

La teora del pecado original antignico da dos problemas 1) interpretacin e resultados 2) vacunacin 1988 Dengue 1 por PRIMERA VEZ 1990 se introdujo el Dengue 2 la cepa americana 1993 Dengue 4 otra vez 2000 Dengue 3 genotipo 3 de Sri Lanka Y EL GENOTIPO ASIATICO DEL DENGUE 2 (Produccin de anticuerpos no neutralizantes) DENGUE HEMORRAGICO NO HEMORAGIAS (Dengue Grave) Respuesta inmune inusual en la cual los ac no son neutralizantes , son ac no neutralizantes que circulan en todo el organismo depositndose en articulaciones, encfalo, corazn, En el Dengue se depositan a nivel vascular , clulas endoteliales de vasos sanguneos, el complemento al fijarse en ac no neutralizantes hace que la pared vascular produzca la extravasacin sangunea y se deposita en clulas endoteliales de los vasos y se fija el complemento en esos inmunocomplejos que alteran los factores de coagulacin y producen trombocitopenia. Ya no se habla el Dengue hemorrgico sino de Dengue grave Extravasacin, hemoconcentracin, plaquetas por debajo de 100000 Mosquito Aedes aegypti Aedes albopictus Papel de los Anticuerpos El papel es de dos tipos: 1) neutralizar la capacidad infectiva viral 2) Dan lugar a la lisis celular provocada por el complemento Neutralizar la capacidad infectiva viral Anticuerpos ligados a igG El virus promueve la formacin e anticuerpos para todas las estructuras antigenicas virales (proteinas). Solo aquellas contra la estructura externa viral

Se producen inmunocomplejos e ag ac neutralizantes para evitar la accin infectante el virus mediante dos mecanismos: 1) El virus queda obstaculizado por obstculo esterico y no puede buscar los sitios complementarios especficos en la clula husped 2) El anticuerpo adherido por ambos sitios a la superficie el virion puede distorsionar la configuracin de la envoltura viral lo suficiente para alterar los procesos normales e adhesin o para permitir la entrada e nucleasas Estos inmunocomplejos no son irreversibles osea una vez formados pueden ser separados por Vibracin - pH alto o bajo Fluorocarbon

A mas de Ig complejos neutralizantes se producen los NO neutralizantes que se depositan en los glomerulos renales causando enfermedaes el complejo inmune que es caracteristica e las enfermedades cronicas Lisis celular mediada por complemento. Se produce cuando el virus se multiplica en las clulas. En la superficie celular se van a exponer diferentes antigenos virales como consecuencia en la multiplicacion viral, estas son las proteinas extranas y atraen hacia ella la respuesta inmune que estimulan la respuesta inmune que se fijan con su los brazo en enlazandose a los antigenos virales La fraccion cristalizable se fija al complemento causando la lisis celular antes de que el virus se multiplique en la celula En esta forma una clula infectada puede ser destruida por citolisis inmune, antes de que la muerte celular se produzca como resultado de la multiplicacin viral porque esto significa que miles de partculas virales invaden clulas vecinas Inmunidad mediada por celulas T Es demostrable por las reacciones de hipersensibilidad que se presentan posteriormente a la inyeccin de antgenos virales en un inividudo que ha sido previamente expuesto a ellos La inmunidad mediada por celulas T es abatida en gran parte por la timectomia neonatal y el tratamiento con suero antilinfocitico Virus ectromelia poxivirus La inmunidad humoral predomina en aquellos virus en las cuales el virus se disemina por la via hematica La imunidad celular va a predominar en aquellas infeccione virales en que los virus se multiplican de clula a clula herpes citomegalovirus

Mecanismo de la respuesta inmune celular 1) los linfocitos T sensibilizados en los tejidos infectados promueven la aparicin de interterleukinas en los tejidos infectados por los virus que inducen la migracin y la activacin de los macrfagos los que con ayuda de los ac que son las opsoninas fagocitan y digieren los viriones 2) Las clulas T sensibilizadas que se encuentran con las clulas infectadas intactas se dirigen a las clulas infectadas y las matan y constituyen los linfocitos supresores falttataa 3) Interferon: el acido nucleico estimula la produccion de interferon sobre todo RNA y los de doble cadena reovirus, el interferon impie la transcripcion del rna mensajero o impidiendo la traduccion el rna mensajero en proteinas

Inmunopatologia En ciertas infecciones virales la respuesta inmune en si es el factor principal como determinante de cambios patolgicos y por tanto de enfermedad Ej: coriomeningitis linfocitica que es letal para ratones no tratados pero no es patognico en ausencia de respuesta inmune Estos ratones pueden ser protegidos por radiacin con rayos x timectomia neonatal, suero antilinfocitico o anti-O o con algn otro tratamiento inmunosupresivo En el ratn normal, la respuesta inmune mediada por clulas para la infeccin con CML elimina el virus de rganos como pulmn, hgado y bazo pero tambin es responsable de los cambios inflamatorios letales en el cerebro La transferencia adoptiva de clulas T inmunes induce lesiones en el plexo coroideo y en las meninges de los ratones infectados con virus de la CML y que fueron inmunosuprimidos con tratamientos de ciclofosfamidad Las respuestas humorales al virus de la CML pueden ser patognicas . Los ratones

infectados en etapa neonatal muestran tolerancia inmunolgica, a lo largo de su vida se forman pequenas cantidades de anticuerpos que reaccionan con los virus en la sangre y forman complejos inmunes. Se explico que los imunocomplejos pueden ser no neutralizantes vagando y depositndose en glomrulo o en articulaciones autoinmunes Ejemplo: dengue corazn ando lugar a enfermedades

Cuando cierta clase de anticuerpos reaccionan con antigenos virales en la superficie de celulas infectadas, la fijacion del complemento puede conducir a la lisis celular, esta activavion del complemento puede producir la liberacion de mediadores de inflamacion y causar cambios patologicos La respuesta mediada por celulas T es responsable de la recuperacion del sarampion y del exantema debido a citolisis en las celulas infectadas con el virus en la piel, en pctes con tumores linforreticulares se produce una neumonia de celulas gigantes mortal pero no al exantema Vrs mata al nio con lesiones graves pulmonares en nios cutas madres les han transmitido inmunidad congnita, no esta protegido sino que se producen inmunocomplejos que se agolpan en el pulmon Tolerancia inmunolgica No todas las infecciones virales congnitas crean tolerancia en el individuo expuesto a ellas durante su vida embrionaria Si el virus es citocida, los tejidos embrionarios son tan susceptibles que la muerte fetal es lo mas comn Inmunodepresin por virus En individuos tuberculino positivos que tienen sarampion se hacen negativos temporalmente La inmunidad mediada por celulas es dificil de medir pero el rechazo retardado del njerto de piel ha sido descrito en ratones infectados con virus de la leucemia El mecanismo de la inmunodepresion probablemente se deba a la multiplicacion de los virus en los linfocitos y en los macrofagos Infecciones persistentes Qu mecanismo determinan la mantencin o la erradicacin viral en el organismo? El virus solo debe causar dao tisular o enfermedad leve Pueden permanecer por periodos prolongados (meses, anos o de por vida) asociados o no a manifestaciones clnicas Rubeola (cardiopatias, defectos oculares, sordera, hepatitis, neumona, lesiones cerebrales) hasta los 3 o anos Infeccin persistente asintomatica en portadores crnicos de virus de hepatitis B (30 anos, Carcinoma hepatocelular) /300000000 de portadores cronicos en el mundo/ Infecciones cronicas productivas

Infecciones latentes asociadas a episodios agudos de enfermedad (herpes, varicela zoster) Herpes permanece latente se dirige por los nervios sensitivos hasta los ganglios correspondientes. La luz solar, la tensin emocional, traumatismos Factores inespecficos *Fagocitosis *Temperatura corporal *Nutricion *Traumatismos *Edad *Interferon *Hormonas *Stresss *Infecciones concurrentes *Resitencia geneticas

Diagnostico de Laboratorio de las Infecciones Virales Fase de la enfermedad en que se encuentra el paciente Fase aguda: tres a cuatro dias, al cuarto dia comienza a formarse la respuesta inmune, Ag-Ac, solo mientras el virus este libre puede cultivarse Fase convaleciente: 15 das en adelante Diagnostico de Laboratorio de las Infecciones Virales Metodos Directos de diagnostico virologico: Detectan la presencia de virus en muestras clinicas, lo que puede detectarse de varias formas Visualizacin Deteccin del antgeno Aislamiento viral Deteccin del acido nucleico viral Visualizacin de los virus Microscopia electrnica No es un mtodo de diagnostico rutinario, no esta en los laboratorios de virologa En heces, las particulas virales de Echo, Cocsackie, polio, picornaviridae lucen iguales Es un metodo de investigacion, epidemia de SARS en 2003 Inmunoelectromicroscopia Hepatitis A, suero en fase convaleciente mas heces de pacte se formaban inmunocomplejos que se visualizan en el microscopio electrnico Los inmunocomplejos se separaron y se encontr que la partcula viral era hepatitis A Se debe pensar que virus estoy buscando y aplicar un Ac especifico que da lugar al complejo AG-AC

Deteccion del Ag viral IFD:La Inmunofluorescencia Directa es una tcnica de inmunomarcacin que hace uso de anticuerpos unidos qumicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molcula Hace uso de un nico anticuerpo que se encuentra qumicamente unido a un fluorforo. El anticuerpo reconoce la molcula diana y se une a ella directamente Rabia: se busca el Ag rbico En pacientes vivos se hace un frotis de cornea Ac conjugados con fluoresceina se unen al Ag del frotis y se visualiza en microscopio de fluorescencia / /Color verde brillante manzana // ELISA: (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) Es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. Pocillos de ELISA El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingls Radioimmunoassay) es tipo de inmunoensayo o mtodo radioinmunomtrico que se basa en la formacin especfica de los complejos Antgeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los mtodos radiolgicos. La tcnica ha sido prcticamente reemplazada por el mtodo ELISA el cual mide la unin AgAc mediante colorimetras en lugar de radiometras Sustancias Radioactivas Iodo 125. Contador Ganma Inmunoperoxidasa (ELISA casero) Corresponde a un grupo de tcnicas de inmunotincin que permiten demostrar una variedad de antgenos presentes en las clulas o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible slo si el anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin. En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. P

Las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo primario Aislamiento viral Cultivos celulares Animales de Laboratorio Huevos embrionados Huevos embrionados (embrion de pollo en desarrollo) Goopasture 1931 Membrana corioalantoidea (viruela, vaccinia, Herpes.) Cavidad alantoidea (clara) Cavidad amniotica (Influenza, Sarampiom y Parotiditis) Los huevos se inoculan 5 a 15 das postfertilizacion Embrin de pollo Animales de Laboratorio Modelo mas antiguo para aislar y conservar virus Se produce enfermedad con lesiones tipicas y/o muerte Raton lactante 1930 Primates (hepatitis) Hamsters (virus oncogenicos) Conejos (vacunas) Crecimiento viral de manera indirecta 1. Efecto citopatogenico (ECP) 2. Hemadsorcion 3. Interferencia 4. Hemaglutinacin: liquido amniotico, fluidos alantoideos 5. Lesiones pustulosas: membrana corioalantoidea 6. Signos y sntomas de enfermedad Efecto Citopatogenico (ECP) Dao que el virus causa a la clula. La mayora de los virus, pero NO TODOS matan a la clula en que se multiplican. Ej: Enterovirus, Herpes simple y Viruela

Primer grado: 25% de afectacin del sistema Segundo grado: 50% de afectacin del sistema Tercer grado: 75% de afectacin del sistema Cuarto grado: afecta todo el cultivo MATAN A LA CELULA : Rubeola, citomegalovirus *Dao lento y tardo *Retrasan el crecimiento celular *Alteraciones en recin nacido

Hemadsorcion (fenmeno celular) Adosamiento de los glbulos rojos a la membrana citoplasmica Las clulas cultivadas infectadas con Ortomixovirus, Paramixovirus, Togavirus, incorporan a la membrana plasmatica de la celula invadida protenas virales que tienen afinidad por los glbulos rojos. Ej: Influenza Tubo control: bailan los glbulos rojos Tubo problema: No se mueven porque estn unidos a la M. plasmatica Interferencia En algunos virus la replicacin ocurre sin produccin de ECP, pero esta replicacin es capaz de inhibir la multiplicacin de otro virus que penetra posteriormente La multiplicacin de un virus, inhibe la multiplicacin de otro que se agrega despus Tubo problema (virus de la rubeola) Tubo control = = no crece el echovirus crece el echovirus

Hemaglutinacin (fenmeno viral) Los virus contienen en su envoltura externa protenas capaces de unirse a los eritrocitos (receptores), estos virus forman puentes entre los glbulos rojos y forman una red 1941 Hirst, Influenza, hemaglutininas, glicoproteinas que se proyectan en la envoltura viral (peplomeros). Neuraminidasa destruye los receptores y se pierde la red Virus de la Influenza = Hemaglutinacin Lesiones pustulosas En embrin de pollo viruela Membrana corioalantoidea vaccinia herpes Lesiones localizadas pustulas caracteristicas de cada virus

Signos y Sintomas de enfermedad Ratn lactante 1930 48 horas de nacido inoculacin intracerebral Encefalitis Rabia Arbovirus 24 horas de nacido inoculacin intraperitoneal flccida Virus entricos: Coxsackie A Parlisis

Deteccion del acido nucleico Hibridacin in situs Se basa en la complementariedad de bases de nucletidos. En la hibridacin in situ se usa una secuencia de nucletidos, denominada sonda, que es complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar y que est marcada con una molcula que luego pondremos de manifiesto. Southern blot, hibridacin Southern o, simplemente, Southern es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, despus, una transferencia a una membrana en la cual se efecta la hibridacin de la sonda. Northern blot es una tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamao. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efecta la hibridacin de una sonda molecular marcada radiactiva o qumicamente La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN.

La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molcula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia Mtodos Indirectos de Diagnostico Virologico Son aquellos que investigan la respuesta de anticuerpos especficos antivirales en el suero del paciente Inmunodifusion Fijacion del complemento Neutralizacion Inhibicion de la hemaglutinacion IFI ELISA RIA Western -Blot

*Inmunodifusion El antgeno en suspensin se mezcla con agar-agar en estado lquido y luego ste se vierte sobre una placa (generalmente un portaobjetos de microscopa). Una vez solidificado, con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) que contendrn la muestra de suero. Se deja incubar de modo que el suero con anticuerpos se difunde por la placa de agar y reacciona con el antgeno embebido en la placa.

Al cabo de 24 horas se ha creado un precipitado fruto de la reaccin entre antgeno y anticuerpo que se muestra en la placa como una lnea blanca rodeando al pocillo (en ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar su visionado). El dimetro de este crculo es un reflejo de la concentracin de anticuerpos que tenamos en la muestra de suero, de modo que a mayor dimetro, mayor concentracin de anticuerpo

*Fijacin del Complemento El complemento es un reactante inespecfico del sistema de defensa humoral del organismo El Sistema necesita ser activado mediante la presencia de inmunocomplejos Se mezcla el suero del paciente con un Ag especifico, si hay Ac se formaran inmunocomplejos EL complemento aadido es activado por estos inmunocomplejos consumiendose Si despus se aaden eritrocitos sensibilizados se producir la lisis de los mismos siempre que haya suficiente complemento (osea que no se hayan formado inmunocomplejos) Si se ha consumido el complemento, los eritrocitos permaneceran intactos, formando se un boton (inhibicion de la hemolisis) en el fondo de la placa *Neutralizacin Ciertos anticuerpos interactan con los viriones y neutralizan su infectividad El suero se inactiva por calentamiento a 56 grados para destruir los inhibidores inespecficos de la infectividad viral Las diluciones del suero se mezclan con dosis constantes de virus, se dejan reaccionar por 60 minutos. Se investiga su infectividad residual mediante la inoculacin en cultivos celulares, huevos embrionados o animales de laboratorio El limite de titulacin se toma como la mas alta dilucin del suero que inhibe el desarrollo del ECP en cultivos celulares o lamultiplicacion del virus en el animal empleado

*Inhibicin de la Hemaglutinacin Los anticuerpos pueden inhibir la hemaglutinacin mediada por virus bloqueando en la superficie del virion, a los antgenos responsables de este fenmeno. El suero del paciente se trata para eliminar los inhibidores no especficos de la HA

Se hacen diluciones seriadas en una placa. A cada dilucin se aade el virus a probar y tambin eritrocitos animales La placa se incuba hasta que sedimenten los eritrocitos El titulo de IH se toma como la mas alta dilucin que inhibe la hemaglutinacin

*Inmunofluorescencia indirecta (IFI) La inmunofluorescencia primaria, o directa, tambin conocida por sus siglas IFD (inmunofluorescencia directa), hace uso de un nico anticuerpo que se encuentra qumicamente unido a un fluorforo. El anticuerpo reconoce la molcula diana y se une a ella directamente. La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta (tambin conocida por sus siglas IFI) hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se une a al molcula diana, mientras que el secundario que es el que se encuentra marcado con el fluorforo, reconoce al primario y se une a l. Esta tcnica es un poco mas compleja que la IFD, requiere mas pasos y es ms posible que sufra interferencias, pero en contrapartida es mucho mas flexible que una tcnica directa y debido a que es posible que un anticuerpo primario una a mas de anticuerpo secundario, implica un efecto de amplificacin que tambin aumenta la sensibilidad de la tcnica

*Western blot El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular estructura, hidrofobicidad, Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella.[