http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot http://es.wikipedia.

org/wiki/ELISA

1infeccion IgM >IgG 2 infeccin IgG > IgM Detectar igG para evitar posteriores abortos por una segunda infeccion? Preguntas para clase: (no estn pensadas, puede que no tengan ni siquiera sentido) -crees que estos son los unicos controles posibles? Razona -LPS como ag a detectar (por qu no la bacteria entera? Pensar y hacer una pregunta con esto) -compara elisa con aglutinacion (tecnica usada comunmente para la deteccion de la salmonella abortusovis)? -Controles: (meterlo aqu o en cada experimento?) Negativo (no llamarlo asi en el trabajo) Suero obtenido de ovejas cuyo rebao no tena antecedentes de abortos en los ltimos aos. Fueron estudiados/testados para detectar anticuerpos contra otras cepas bacterianas relacionadas como Brucella melitensis y Chlamydophila abortus con resultados negativos. Estos controles tienen el fallo/problema/deficiencia de que pudieron haber estado en contacto con otros patgenos, adems de que la informacin de la ausencia de abortos en el rebao era dada por el dueo de dicho rebao, por lo que sera posible que existieran errores. Positivos: El suero de ovejas que sufrieron abortos por abortusovis fueron analizadas mediante inmunoblot, y una selecion de ellos fue utilizado como control de las tecnicas posteriores Se utiliz suero de ovejas que sufrieron aborto por S. Abortusovis que dieron positivo en el estudio con inmunoblot.

-qu se quiere detectar? Presencia de anticuerpos anti S. Abortusovis en el suero de las ovejas que sufrieron aborto. -qu antigeno se usa para detectarlas? Se extrajo Lipopolisacaridos de cultivos de Salmonella abortusovis para utilizarlos como antgenos.

-Tecnicas:

Inmunoblot: El inmunoblot. Se trata de una tcnica analtica usada para detectar protenas (u otros compuestos, como ocurre en el estudio analizado) en una muestra determinada de una forma especfica. Para ello se separan mediante electroforesis en gel. Tras esto, se transpasan a una membrana adsorbente. Para detectar la protena de inters se utilizan anticuerpos especifcos contra la misma. A su vez, la tcnica requiere de marcaje para detectar la unin antigeno anticuerpo, pudiendo ser de distintos tipos, tales como fluorescencia, uso de istopos o enzimtico. En funcin de dicho marcaje el revelado ser distinto, pero todos ellos son capaces de indicar la presencia antignica, llegando incluso a permitir la cuantificacin.

a)

b)

c)

Fig.1: Esquema de la tcnica inmunoblot. a) antgeno en membrana b) adicin del anticuerpo especfico del antgeno que se quiere detectar c) adicin del anticuerpo secundario, el cual reconoce especficamente el anticuerpo primario y posee marcaje.

En este estudio en concreto, el motivo de utilizar esta tcnica ha sido el de detectar la presenca de anticuerpos anti salmonella en el suero de las distintas ovejas escogidas para el estudio para utilizarlas posteriormente en ELISA y aglutinacin (as como los controles???). Para detectar dichos anticuerpos mediante inmunoblot se corrieron en un gel de poliacrilamida los extractos de antigenos bacterianos (LPS) y se pasaron a una membrana de polifluoruro de vinilideno o PVDF (http://es.wikipedia.org/wiki/Polifluoruro_de_vinilideno ) con el objetivo de aplicar el suero sobre ellos. Los anticuerpos anti LPS de Salmonella abortusovis existentes en el suero se unirn a los antigenos de la membrana y quedaran por tanto anclados a la membrana. La incubacin de la membrana con los sueros se realiz con buffer con leche para evitar uniones inespecificas de los anticuerpos a la membrana. En el caso de que se dieran tales uniones inespecificas nos daran falsos positivos, lo cual nos llevara a detectar erroneamente la presencia de un antgeno cuando de hecho no existe en la muestra. Es por tanto un hecho a evitar a toda costa, por las repercusiones que puede llegar a tener en un tratamiento/estudio Para la deteccin del complejo antgeno-anticuerpo en membrana se utilizaron anticuerpos monoclonales anti oveja marcados con fosfatasa alcalina el cual es un marcaje de tipo enzimtico. A pesar de la posibilidad de cuantificacin, el objetivo del inmunoblot era tan slo detectar la presencia/ausencia de los anticuerpos Para la visualizacion se utiliz NBT y BCIP tal y como recomendaba el proveedor.

COMO CONTROLES Como toda tcnica, es imprescindible realizar controles para evitar la presencia de falsos positivos asi como de falsos negativos. En este estudio en concreto, los

controles utilizados han sido vacas de un REBAO el cual no ha tenido antecedentes de aborto en los ltimos aos (aqu estn las pegas? ). Estos controles tienen el fallo/problema/deficiencia de que pudieron haber estado en contacto con otros patgenos, adems de que la informacin de la ausencia de abortos en el rebao era dada por el dueo de dicho rebao, por lo que sera posible que existieran errores. Elisa (indirecto) La tcnica de ELISA (cuyo nombre proviene del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay) es una tcnica en la que se utilizan nuevamente anticuerpos y consiste en la deteccin de un antgeno inmovilizado en un pocillo mediante la adicin de un anticuerpo especfico para el antgeno de inters, frmandose un complejo antgeno anticuerpo fijado a la superficie del pocillo fcilmente detectable mediante marcadores.

ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que stos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antgeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediante centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad. Tambin, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacin, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.

El elisa indirecto es. Una placa microtituladora, placa de microtitulacin, o microplaca (la clasica placa del elisa)

El objetivo principal del estudio era el de modificar y validar un ELISA para que fuera capaz de detectar IgG contra S.Abortusovis (La tcnica de aglutacion se aplicaba para detectar IgM)

Elisa indirecto, fue ligeramente modificado para detectar anticuerpos especificos anti S. abortusovis. Se usaron 4 tipos de microplacas distintas: Polysorp Maxisorp medisorp y multisorp Se aadi a los pocillos los lipopolisacridos en dilucin desde 1:5 a 1:20. Tras la incubacin, los lavados y posterior secado, se procedi a aadir los sueros. Se utiliz tanto suero carente de anticuerpos contra S. Abortusovis como sueros positivos para el inmunoblot, diferenciando entre positivos debiles y medios. Dichos sueros fueron diluidos tambien de 1:100 a 1:800. Tal y como se realiz en el inmunoblot, como anticuerpo secundario se utiliz un monoclonal anti-oveja marcado esta vez por peroxidasa

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.(posible comparacin con inmunoblot? es wikipedia)