KTIA SOUZA CARVALHO

INFLUNCIA DO FORMOL UTILIZADO PARA CONSERVAO DE CADVERES NA OBTENO DE DNA NUCLEAR EM TECIDO MUSCULAR

Dissertao apresentada Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas, para obteno do Ttulo de Mestre em Biologia Bucodental, com rea de concentrao em Odontologia Legal e Deontologia. Orientadora: Prof. Dra. Darcy de Oliveira Tosello.

PIRACICABA 2009

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

Bibliotecria: Marilene Girello CRB-8a. / 6159

C253i

Carvalho, Katia Souza. Influncia do formol utilizado para conservao de cadveres na obteno de DNA nuclear em tecido muscular. / Katia Souza Carvalho. -- Piracicaba, SP: [s.n.], 2009. Orientador: Darcy de Oliveira Tosello. Dissertao (Mestrado) Universidade Estadual Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba. de

1. Gentica. I. Tosello, Darcy de Oliveira. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Ttulo. (mg/fop)

Ttulo em Ingls: Influence of formalin used for preservation of cadavers in obtaining nuclear DNA in muscle tissue Palavras-chave em Ingls (Keywords): 1. Genetics rea de Concentrao: Odontologia Legal e Deontologia Titulao: Mestre em Biologia Buco-Dental Banca Examinadora: Darcy de Oliveira Tosello, Eduardo Daruge, Clio Spadcio Data da Defesa: 17-02-2009 Programa de Ps-Graduao em Biologia Buco-Dental

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AGRADECIMENTO

Agradeo a Deus pela vida, pelas tantas graas a mim concedidas, e por tanto amor a mim dispensado. Aos meus filhos por fazerem dos seus sonhos a minha realizao. Que, atravs de minha luta, puderam me dar oportunidade de concretizar este objetivo, me incentivando a prosseguir na jornada, fossem quais fossem os obstculos, principalmente por tantas vezes abrirem mo de momentos de convvio quando o dever e o estudo me chamaram. Por isso e muito mais sou grata e quero compartilhar esta conquista com vocs! Aos meus pais, pois foi deles que recebi o dom mais precioso: a vida; pela educao, coragem, amor e determinao para lutar pelos meus ideais. As minhas irms que, apesar da distncia, tenho certeza de que esto sempre incentivando e torcendo por mim. Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, pela oportunidade de aprender e de crescer, acolhendo todos aqueles que desejam aprimorar seus conhecimentos cientficos. Aos Professores do Curso de Ps-Graduao em Odontologia Legal e Deontologia, pela dedicada ateno e apoio para a nossa formao cientfica. Ao Prof. Dr. Fausto Brzin, Coordenador do Programa de PsGraduao em Biologia Buco-Dental, que dedicou sua vida ao ensino, modelando nesse caminho muitas vocaes, incentivando o raciocnio do estudante e transformando os nossos ideais em realizaes. A minha querida orientadora Prof. Dra. Darcy de Oliveira Tosello, quero deixar registrado o meu profundo agradecimento, por acreditar e incentivar a

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prosseguir a jornada acadmica. Profissional competente e de grande saber. Exemplo de dedicao, abnegao e disponibilidade. Sempre pronta a ajudar, com seu modo amvel e de grande simpatia. Agradeo oportunidade de concretizar este objetivo. Ao Dr. Eduardo Daruge Jnior, professor Titular do Curso de Odontologia Legal e Deontologia da UNICAMP/FOP, pelo convvio, amizade e estmulo. Meu profundo agradecimento, no s pela ajuda em realizar este trabalho, mas tambm pela oportunidade de crescer. Obrigado pela dedicao e renncia pessoal, por repartir sua experincia de vida e auxlio para trilhar com sabedoria este caminho, que tantas vezes me confortou com palavras sbias, que tantas horas destinou a me ouvir, a me entender, a me aconselhar. A pessoa que me ensinou a arte de saber lidar com as situaes mais inusitadas sem perder o bomhumor, tornando mais leve e saudvel nossa passagem por essa vida. Muito obrigada por fazer parte da minha vida. Ao Prof. Dr. Eduardo Daruge, no poderia deixar de registrar os meus agradecimentos pelas lies de saber. Admiro-te pelo seu empenho em formar futuros mestres e pesquisadores, pela arte de fazer pesquisa independente de condies estruturais e materiais. Hoje me espelho em ti, buscando refletir todos os valores e aprendizados que me foram concedidos durante a convivncia contigo, baseados sempre no mais nobre dos sentimentos, a paixo de ensinar. Ao Prof. Dr. Luiz Francesquini Jnior, agradeo pelas constantes correes, com suas sugestes valiosas. Mestre da arte do ensino, voc a reunio em um nico ser humano, dos sentimentos mais nobres, como o amor ao prximo, a solidariedade, a bondade e a compaixo. Ao Prof. Dr. Lus Renato da Silveira Costa, mdico do Trabalho e Especialista em Gentica Forense e Responsvel Tcnico pelo Laboratrio de DNA Criminal da Polcia Civil do Esprito Santo , agradeo por acreditar e incentivar a prosseguir esta minha jornada, fossem quais fossem os obstculos e

ensinando-me que preciso acreditar nos ideais. Grande incentivador e responsvel direto por todas as minhas conquistas profissionais, desde o mestrado na UNICAMP, at a minha efetivao na rea acadmica. Sou grata pelo auxlio e pela condio oferecida para a realizao dos exames de DNA. Com certeza, sem a sua ajuda esse sonho jamais seria possvel. Parabns por ser um profissional competente e de grande saber, voc sempre ser para mim um exemplo de dedicao, abnegao e disponibilidade. Ao Dr. Emerson Gonalves da Rocha, delegado de Polcia Civil, Superintendente de Polcia Tcnica Cientfica do Estado do Esprito Santo, pela sua grande simpatia, carinho, eficincia de seu trabalho, sempre pronto a nos ajudar. Meu grande apreo, admirao e sinceros agradecimentos pelo apoio e colaborao deste trabalho, pela condio oferecida para a realizao da interpretao dos dados coletados, provando que um trabalho deste tipo, resulta no de um esforo individual, e sim, de um somatrio de foras e de intenes. A Clia Regina Manesco, pelo carinho, simpatia e ajuda inestimvel prestada durante o curso atravs da eficincia de seu trabalho e demonstrao ao longo desta caminhada. Aos colegas do Curso de Ps-Graduao da FOP-Unicamp, pela convivncia saudvel e feliz durante todo o curso. A minha amiga Patrcia Bitencourt da Rocha, a quem eu devo todas as minhas alegrias e conquistas vividas em Piracicaba. Sei que Deus te colocou na minha vida no momento em que mais precisei, veio como uma representante dele. Voc sempre estar presente eternamente na minha memria e no meu corao. Aprendi que o valor das coisas no est no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecveis, coisas inexplicveis e pessoas incomparveis.

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 Bibliotecria da FOP/UNICAMP Marilene Girello, pela confeco da ficha catalogrfica. A todos os funcionrios da Faculdade de Odontologia de Piracicaba UNICAMP, sem exceo, pela amabilidade e ateno com que sempre me trataram. A todos aqueles que contriburam para o xito deste trabalho, o meu profundo sentimento de gratido.

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De tudo ficaram trs coisas: a certeza de que estamos sempre comeando, a certeza de que preciso continuar e a certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar. Fazer da interrupo um caminho novo, fazer da queda um passo de dana, do medo uma escada, do sono uma ponte, da procura um encontro

Fernando Sabino

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RESUMO

Com os avanos tecnolgicos e cientficos, bem como mudanas comportamentais no meio social, tornou-se comum a utilizao de exames de DNA para fins criminais e/ou para esclarecer a paternidade, sendo que a cincia e a tecnologia trabalhando juntas possibilitaram que esses exames pudessem ser realizados tanto em pessoas vivas quanto em cadveres nos mais variados estados de conservao. A soluo de fixao para o tecido humano mais utilizado no meio cientfico e acadmico, seja para estudo e pesquisa, seja para manuteno da integridade corporal do cadver sem dvida o formaldedo. Entretanto, a ao do formol sobre o material gentico humano (DNA) gera muitas controvrsias, havendo linhas de pesquisa cientfica que defendem a no interferncia do formol sobre o DNA e as que afirmam que a fixao de cadveres com formaldedo pode causar a degradao do material gentico. A presente pesquisa props o estudo do tema na tentativa de colaborar com a comunidade cientfica e incentivar outros estudos para que, num futuro prximo, o formaldedo possa ser utilizado sem restries e/ou dvidas. A anlise de perfis genticos de DNA (cido desoxirribonuclico) afetou de forma positiva a vida de milhares de pessoas, por se constituir no substrato responsvel pela transmisso dos caracteres hereditrios e principalmente por ser nico em cada indivduo (exceto em gmeos univitelinos) possui alto grau de confiabilidade. No que tange identificao humana, o exame de DNA assume papel preponderante quando esta no possvel pelas tcnicas datiloscpicas ou antropolgicas, situao rotineiramente verificada nos Servios Mdicos Legais quando do recebimento de corpos em estado adiantado de decomposio ou que no apresentem sinais antropolgicos caractersticos e passveis de serem vlidos para uma identificao segura. A utilizao de formol, como substncia qumica fixadora, em corpos nas condies anteriormente descritas, segundo alguns autores, pode dificultar a obteno futura de material genmico (DNA). Outros pesquisadores

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acenam com a possibilidade de interferncia de pequena monta, o que no dificultaria as anlises de DNA. Raros so os estudos publicados e rarssimas as avaliaes experimentais sobre o tema. Considerando que os exames de DNA tem se tornado cada dia mais freqentes e mais acessveis s pessoas e ao poder pblico, entendemos como importante o desenvolvimento de uma pesquisa que possa estabelecer parmetros e rotinas a serem adotadas quando se busca obter DNA em tecidos formolizados previamente. Neste trabalho foi proposto analisar a ao do formaldedo nas concentraes de 5%, 10% e 20%, sobre tecido muscular humano e seus efeitos na degradao do DNA nuclear e verificar a validade de exames de perfis genticos de DNA em cadveres submetidos conservao atravs da tcnica da formalizao. O grupo de estudo foi constitudo de 40 (quarenta) cadveres no identificados. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a fixao para tecido humano mais usado universalmente na conservao de cadveres, no meio cientfico, jurdico e acadmico o formaldedo ou aldedo frmico na concentrao de 10%. No entanto, de acordo com os resultados obtidos conclumos que o fixador mais adequado o formol a 5%, devido a sua ao eficaz e por apresentar uma mnima degradao do DNA. Todas as amostras fixadas com 5% de formol foram amplificadas e a validao dos alelos foi realizada com relativa facilidade. J as amostras formolizadas 10% e 20% apresentaram a degradao do DNA em 100% (40) das amostras estudadas.

Palavras-chave: gentica, DNA, formol.

ABSTRACT With the new scientific and technological advances, as well as behavioral and social changes, it is becoming increasingly common the use of deoxyribonucleic acid (DNA) analysis in a criminal setting and paternity identification. Science and technology work together to maximize its use in dead and living human tissue in different degrees of conservation. Formaldehyde is the fixation solution most commonly used in academic and scientific settings, either for research purpose or cadaver preservation. However, some authors suggest that fixation of human tissue with formalhyde can cause disintegration of DNA and its use and effect on DNA has been the subject of much controversy. The objective of this study is to evaluate the effects of formalhyde on the DNA chain and collaborate with the scientific community to promote the unrestricted use of formalhyde in the fixation of human tissue. The analysis of DNA genetic profile had a positive impact in the lives of millions of people. DNA provides the vehicle for the transmission of hereditary characteristics unique for each individual and for this reason is a very reliable tool for human identification. DNA analysis has a particularly important role when identification is not possible by dactyloscopic and anthropologic techniques. This is a common situation encountered in Servicos Medicos Legais particularly in advanced decomposed cadavers or when reliable anthropologic characteristics are not available. The use of formalhydeide, as the fixation solution, in the above conditions, according to some authors, can interfere with future DNA analysis. Others believe that the interference of the formalhyde in the DNA analysis is minimal. There are few reports of experimental research in the literature addressing this topic. Taking in consideration that increasing use of DNA analysis and accessibility to general public as well as governmental institutions, we understand the importance of developing a research and establish guidelines for DNA analysis in tissue fixated by formalhydeide. This research propose the analysis of formalhyde in the concentrations of 5%, 10% and 20% in human muscle tissue and its effect in the degradation of nuclear DNA, verifying the validity

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of genetic analysis of DNA in cadavers submitted to conservation by techniques using formalhydeide. The study group was consisted of 40 non-identified cadavers. Based on the results we concluded despite formalhydeide 10% being universally used in academic, judicial and scientific settings, the more adequate fixation solution is the formalhydeide 5% due to its efficacy, low cost and simplicity of use. All 40 samples fixated with formalhydeide 10 and 20% present degradation of DNA (100%).

Keywords: genetics, DNA, formaldehyde

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LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

PCR DNA RNA dNTPs FOP UNICAMP IML IMLs OMS AF RNA VNTRs

Reao em cadeia da polimerase cido desoxirribonucleico cido ribonucleico Desoxirribonucleotdeos trifosfatos Faculdade de Odontologia de Piracicaba Universidade Estadual de Campinas Instituto-mdico-legal Institutos-mdico-legais Organizao Mundial de Sade Aldedo Frmico cido Ribonucleico Variable number of tandem repeats ou nmero varivel de repeties em tandem, tambm denominados de minissatlites

STRs

Short tandem repeats ou repeties curtas em tandem,

tambm denominados de microssatlites

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SUMRIO

1. INTRODUO 2. REVISO DA LITERATURA 3. PROPOSIO 4. MATERIAL E MTODOS 5. RESULTADOS 6. DISCUSSO 7. CONCLUSO

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REFERNCIAS ANEXOS

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1. INTRODUO
Com os avanos tecnolgicos e cientficos, e tambm em razo das mudanas comportamentais vivenciadas no meio social, tornou-se freqente a utilizao dos exames de DNA (cido desoxirribonucleico), inicialmente para fins de determinao de paternidade cvel e mais recentemente como ferramenta de fundamental importncia nas investigaes criminais. Auxiliando tambm na identificao humana, em razo da

especificidade e singularidade dos perfis genticos de DNA, distintos em cada pessoa, o DNA amplia seu leque de oferta. As novas tcnicas tm permitido a obteno de perfis genticos de DNA a partir de amostras biolgicas coletadas em pessoas vivas (amostras ditas seguras por possurem quantidade de DNA capaz de permitir uma anlise ampla e adequada) e tambm a partir de amostras coletadas em cadveres nos mais variados graus de decomposio (amostras consideradas inseguras ou amostras-vestgio). Os novos conhecimentos cientficos e a tecnologia atualmente disponvel permitiram que essas anlises fossem possveis a partir de todos os tecidos orgnicos, nos mais variados estados de conservao. Um dos problemas vivenciados pelos Servios Mdico Legais em todo o Brasil em particularmente no Esprito Santo o recebimento de cadveres vtimas de morte violenta e que se encontram em adiantado estado de decomposio, o que dificulta sobremaneira a identificao a partir da comparao das impresses digitais (mtodo datiloscpico) ou pela anlise e comparao de caractersticas antropolgicas. Esses corpos so, em grande nmero, submetidos aos processos de formolizao. A soluo mais utilizada para fixao de tecidos humanos, nos meios acadmicos e cientficos, para estudo ou para pesquisa, , sem sombra de dvida, o formoldedo conhecido tambm simplesmente como formol na concentrao de

10% (dez por cento). O produto tambm usado como desinfectante de salas cirrgicas. temperatura ambiente o aldedo frmico (AF) um gs incolor e de odor forte e caracterstico. O aldedo frmico encontrado no comrcio diludo em gua (soluo aquosa). De acordo com Ben-ezra (1990) os aldedos so compostos qumicos resultantes da oxidao parcial dos lcoois. Assim, o lcool metanol, ao perder um tomo de hidrognio (a perda de hidrognio aumenta a proporo de oxignio e, por isso, fala-se em oxidao dos lcoois) d origem ao aldedo frmico e o etanol, ao aldedo actico. Segundo Mies (1998) o formol o produto mais usado universalmente para conservao de cadveres, mediante as tcnicas de formolizao e de embalsamamento, como meio de prevenir e retardar a putrefao. Koshiba em 1993 definiu a fixao em formol como um passo fundamental no processo de conservao de cadveres. Ela baseia em manter, de modo definitivo, as estruturas citolgicas e histolgicas das clulas e tecidos, ou seja, evita a degradao do material em decorrncia de fenmenos autolticos e permite a realizao de inmeras tcnicas citolgicas e histopatolgicas, assim como, o processo de conservao dos cadveres. No entanto, Gusmman em 2007 descreveu que o aldedo frmico atua como fixador interagindo com os aminocidos lisina e arginina. Tal fixador no provoca precipitao de protenas, no preserva gorduras livres, porm fixa lipdeos complexos, provoca leve precipitao de outros constituintes celulares e no o fixador de eleio para carboidratos. Cheoker (2002) afirmou que o formol tem a propriedade de degradar o DNA, no seu todo ou parcialmente, na dependncia da concentrao e do tempo

de exposio (fixao) a que um determinado tecido submetido. Seus estudos baseiam-se em reaes bioqumicas, sem a realizao de um estudo propositivo de campo ou experimental. No entanto, assegurou que se faz necessria pesquisa a respeito. Com relao ao do formol sobre o material gentico humano (DNA), a literatura especializada silente e em razo disto, o tema ainda gera muitas controvrsias, havendo pesquisadores que defendem a no interferncia do formol sobre a molcula do DNA e outros que afirmam exatamente o contrrio, no sentido de que o formol um potencial agente na degradao do DNA, conseqentemente dificultando futuras anlises de perfis genticos. Notoriamente, verifica-se que ocorrendo morte tecidual e havendo necessidade de conservao de tecidos, impe-se a adoo de um processo de fixao, geralmente obtido a partir da utilizao de substncias qumicas conhecidas como fixadores. A fixao tem por objetivo manter as estruturas celulares e teciduais em boas condies, evitando ou retardando o processo natural de degradao decorrente de fenmenos autolticos. Em vista a este fato, o presente trabalho buscou determinar a influncia do formol utilizado para conservao de cadveres na obteno de DNA nuclear em tecido muscular e comparar as diferentes concentraes desse fixador. Buscou-se ainda discutir os aspectos ticos e legais pertinentes ao tema. Este tema visa tentativa de colaborar com a comunidade cientfica mediante uma avaliao experimental, propor-se obter os esclarecimentos necessrios e suficientes para a indicao ou contra-indicao do uso desta substncia quando da preparao de corpos que podero ser demandados no futuro, com relao a exames de DNA.

2. REVISO DA LITERATURA
Benecke (1997) citou em sua obra que o avano da cincia e tecnologia a nvel forense teve seu ponto culminante em meados dos anos 80, quando as tcnicas de identificao, fundamentadas na anlise direta do cido desoxirribonuclico (DNA), tornaram-se uma das mais poderosas ferramentas para a identificao humana e investigaes criminais. Conforme Kling (1999) muito se passou desde a proposta de Bentham, em 1832, nos Estados Unidos, em empregar a tatuagem como processo de identificao civil. Em tempos mais remotos premidos pela necessidade de identificar seus semelhantes, empregavam-se os mais brbaros e desumanos processos de identificao. Ainda este autor afirmou que destitudos de quaisquer recursos cientficos, tais tratamentos consistiam na marcao com ferro em brasa em indivduos que houvessem praticado, por exemplo, um delito, ou tratando-se simplesmente de um escravo em fuga. J neste sculo, com a descoberta dos antgenos eritrocitrios, tornou-se possvel a idia de discriminar indivduos atravs de anlises sangneas, mesmo aqueles que tiveram morte violenta, como por exemplo, vtimas de acidentes areos. Segundo Duarte et al. (2001) o primeiro mtodo de utilizao da anlise do DNA para identificar indivduos foi desenvolvido em meados da dcada de 1980 por Sir Alec Jeffreys, da Universidade de Leicester e, apesar do seu enorme poder potencial, houve srias reservas quanto o seu uso real, pois no incio, havia muitas dvidas quanto reprodutibilidade e confiabilidade dos mtodos. Luftig (2001) mencionou que em agosto de 1986, na Inglaterra, um caso criminal envolvendo o estupro e homicdio de duas adolescentes foi solucionado com a determinao da autoria do delito aps toda a populao masculina de dois vilarejos do condado de Leicester ter contribudo com a doao de amostras de

sangue para confronto com vestgios de smen coletados do corpo das vtimas. Estava assim inaugurada uma nova pgina no emprego da biologia molecular e sua utilizao na identificao humana criminal. Segundo Jobim (2003), o estudo do DNA possibilitou informaes sobre a individualidade humana, iluminando a cincia da investigao e da identificao em casos criminais. Uma mudana total na tecnologia aconteceu a seguir, pois o estudo do polimorfismo do DNA substituiu, em curto espao de tempo, as anlises sorolgicas dos polimorfismos de protenas e grupos sangneos, at ento, usados exclusivamente na rea forense. Para o autor as tcnicas de amplificao do DNA pela reao em cadeia da polimerase (PCR) na ltima dcada tiveram um enorme progresso. Foram tambm desenvolvidos novos mtodos de extrao do DNA do sangue perifrico, tecidos, ossos, cabelos, manchas de sangue, material vaginal, entre outros. Citou ainda que essa exploso cientfica, de vasto potencial de aplicao, necessita de especialistas com formao em biologia molecular na anlise forense, pois somente o domnio do conjunto das tcnicas permite a perfeita avaliao do DNA em medicina legal. De acordo com Lewis (2004), o estudo do material gentico humano (DNA) uma rea interdisciplinar por excelncia, de amplas possibilidades e de profunda dimenso; como nenhuma outra disciplina cientfica, tendo se tornado de importncia fundamental para inmeros aspectos dos interesses humanos e estando presente na humanidade de diversas maneiras. De fato, as questes genticas parecem emergir diariamente em nossas vidas. Alonso et al. (2005) relataram que a coleta de amostras para o exame de DNA deve ser realizada logo aps a identificao possvel pelos mdicoslegistas, odonto-legistas e papiloscopistas, mesmo quando esta identificao for positiva, pois pode ser necessrio um futuro confronto gentico para elucidao de dvidas com relao a identidade do indivduo e troca de corpos.

Bezerra (2005) relatou que em um grau to avanado de carbonizao somente possvel identificar com o uso da anlise de DNA. Smara (2006) citou que a tecnologia moderna invadiu to rapidamente nossa vida que at esquecemos quando foi criada. J faz vinte anos que Alec Jeffreys, professor da Royal Society Wolfson na Universidade de Leicester, Inglaterra, descobriu o fingerpritning gentico, ou seja, a importncia do DNA como referncia para a identificao de indivduos. Verssimo et al. 2007 descreveram que o desenvolvimento da biologia molecular e da gentica nas ltimas dcadas permitiu o estabelecimento de um amplo corpo de tcnicas aplicadas na investigao biolgica que tiveram profunda influncia nas pesquisas mdicas. Entre esses grandes avanos tecnolgicos destaca-se a possibilidade de amplificao de DNA utilizando-se a reao em cadeia da polimerase (PCR). Mate (2007) relatou que a identificao pelo DNA afetou a vida de milhares de pessoas no planeta e tem sido utilizado rotineiramente na medicina legal e forense para desvendar crimes, revelar paternidade, identificar vtimas em desastres, catstrofes ou atentados terroristas, e comprovar a clonagem, bem como estudar as mudanas que ocorrem na seqncia do DNA. 2.1 cido desoxirribonuclico (DNA) A estrutura da molcula de DNA foi descrita conjuntamente pelo americano James Watson e pelo britnico Francis Crick em 7 de maro de 1953, e esta pesquisa lhes valeu o Prmio Nobel de Fisiologia, em 1962, juntamente com Maurice Wilkins. Watson definiu o cido desoxirribonucleico (DNA) como sendo uma molcula orgnica que contm a "informao" que coordena o desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos vivos. O DNA responsvel pela transmisso das caractersticas hereditrias de cada espcie de ser vivo.

Inwald (2001) esclareceu que no interior da clula o DNA organizado numa estrutura chamada cromossomo e o conjunto de cromossomos de uma clula forma o caritipo. Antes da diviso celular os cromossomos so duplicados atravs de um processo conhecido como Replicao. Dentro dos cromossomos, protenas as histonas compactam e organizam o DNA. Estas estruturas compactas guiam as interaes entre o DNA e outras protenas, ajudando a definir que regies do DNA devero ser transcritas. Lewis (2004) descreveu que o seu principal papel armazenar as informaes necessrias para a construo das protenas e do cido ribonucleico (RNA). Segundo ele, os segmentos de DNA que so responsveis por carregar a informao gentica so denominados genes. O restante da sequncia de DNA tem importncia estrutural ou est envolvido na regulao do uso da informao gentica.

Propriedades fsicas e qumicas

Figura 1: Estrutura qumica do DNA.

Para este autor o DNA um longo polmero formado por unidades repetidas chamadas nucleotdeos. A cadeia de DNA tem 2,2 a 2,4 nanometros de largura, e um nucleotdeo possui aproximandamente 0,33 nanometros de comprimento. Embora os monmeros (nucleotdeos) que constituem o DNA sejam muito pequenos, polmeros de DNA pode ser molculas enormes com milhes de nucleotdeos. Por exemplo, o maior cromossomo humano (cromossomo 1), possui 220 milhes de pares de bases de comprimento. DeSalle (2004) citou que em organismos vivos, o DNA no existe como uma molcula nica (fita simples), mas sim como um par de molculas firmemente associadas. As duas longas fitas de DNA enrolam-se como uma trepadeira formando uma dupla hlice. Descreveu tambm que os nucleotdeos esto presentes em ambas as fitas da dupla hlice, unidos com nucletidos da mesma fita por ligaes fosfodister e fita complementar atravs de pontes de hidrognio formadas pelas suas bases. Em geral, uma base ligada a um acar chamada nucleosdeo e uma base ligada a um acar e um ou mais fosfatos chamada nucleotdeo. Portanto, o DNA pode ser referido como um polinucleotdeo. Watson (2007) mencionou que em 1978, Alec pela primeira vez usou a genmica, cincia ainda emergente na poca, para pesquisar as alteraes no DNA humano e descobrir abundantes variaes em determinadas regies do DNA. A origem das variaes na seqncia do genoma humano assim comeou a ser revelada. Ainda citou que as alteraes podem chegar a aproximadamente a 10 milhes em nosso DNA. Estas possuem a propriedade de serem repetidas com alteraes resultantes das diferenas individuais. Esta descoberta em 1984 levou ao desenvolvimento, quase acidental, do fingerprinting de DNA e mostrou que em uma anlise gentica poderia identificar cada pessoa individualmente no planeta (com exceo de gmeos idnticos).

Este autor descreveu que as alteraes genticas so provenientes de dois processos: mutao e recombinao (crossover). A primeira pode induzir mudanas hereditrias no DNA e a segunda pode produzir cpias maternal e paternal de uma determinada regio de DNA pelo pareamento e mudar de local estas informaes durante a formao dos espermatozides e dos vulos. Gusmman (2007) relatou que algumas vezes a recombinao pode gerar mudanas no DNA que levam a doenas genticas. Estes dois processos de alteraes no DNA so fundamentais para a evoluo humana. Entretanto, para Watson (2007) ambos so difceis de serem estudados nos seres humanos. Tradicionalmente comparam-se as crianas com seus pais procurando por mutaes e locais de recombinao. Segundo Matte (2007) para este tipo de experimento, cerca de dez mil crianas teriam que ser utilizadas para detectar com segurana uma mutao ou uma recombinao em um gene. Na poca, Alec Jeffreys, resolveu este problema desenvolvendo processos alternativos para detectar estas alteraes, no em crianas, mas pelo exame de milhes de espermatozide. Utilizando-se desta estratgia, revelou o modo complexo pelo quais os minissatlites sofrem mutao. Conforme Remualdo (2007) agora os pesquisadores esto

caracterizando as regras bsicas que controlam a recombinao que ocorre no DNA humano e afetam a diversidade gentica na populao humana. Assim, esclareceu a dinmica da evoluo do DNA humano e os fatores que influenciam a integridade de nosso DNA bem como o modo que eles so transmitidos aos nossos descendentes.

2.1.2 Vida Lewis (2004) citou que cada ser vivo que habita a Terra possui uma codificao diferente de instrues escritas na mesma linguagem no seu DNA. Estas diferenas geram as diferenas orgnicas entre os organismos vivos.

Figura 2:Diferentes nveis de condensao do DNA. (1) Cadeia simples de DNA . (2) Filamento de cromatina (DNA com histonas). (3) Cromatina condensada em intrfase com centrmeros. (4) Cromatina condensada em prfase. (Existem agora duas cpias da molcula de DNA) (5) Cromossoma em metfase.

Segundo este autor a dupla cadeia polinucleotdica constitui a molcula de DNA, cuja seqncia de nucleotdeos codifica as instrues hereditrias, organizadas em genes, que codificam as inmeras protenas existentes nas mais variadas clulas. As molculas de DNA contm portanto a informao gentica necessria para a codificao das caractersticas de um indivduo, como a cor do cabelo em humanos, o formato da folha em Angiospermas e a sua morfologia. Alonso (2005) relatou que o DNA de todas as clulas do corpo humano seria equivalente, se fosse visvel a olho nu, em comprimento, a oito mil vezes a distncia da Terra Lua.

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2.1.3 Funo biolgica do DNA De acordo com Tokuda (2000) o DNA normalmente possui forma linear e est presente nos cromossomos de eucariotos ou circulares em cromossomos de procariotos. Inwald (2001) descreveu que o DNA carrega a informao gentica na seqncia de suas bases, logo a utilizao ou duplicao da informao depende do pareamento de novas bases. Conforme Smarra (2006) quando a clula usa a informao nos genes, a seqncia de DNA copiada em uma seqncia complementar de RNA. Normalmente, o RNA produzido nesse processo codifica protena (RNAm), mas este pode ser estrutural (ex.: RNAr). A traduo ocorre no caso do RNAm, que tambm depende da interao dos nucleotdeos de RNA, essa interao ocorre no ribossomo e entre o RNAm e RNAt para formar a seqncia linear de uma protena.

2.1.4 Estrutura do genoma Greer (1991) citou que o DNA genmico est localizado no ncleo celular dos eucariotos, mas uma pequena quantia esta presente nas mitocndrias e cloroplastos. J em procarioto, o DNA est mantido dentro de um corpo irregular no citoplasma chamado de nucleoide. E a informao gentica em um genoma mantida dentro dos genes. Sugiyama (2000) descreveu que um gene uma regio do DNA que influncia numa caracterstica particular em um organismo. Os genes contm uma matriz de leitura aberta que pode ser transcrito, conjunto de seqncias reguladoras como promotors e reguladores que controlam a expresso dos genes.

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Figura 3: Fluxo da informao gentica Legrand et al (2002) relataram que em muitas espcies, s uma pequena quantia do genoma total codifica protenas. Por exemplo, apenas aproximadamente 1.5% do genoma humano consistem de exons codificantes de protenas e mais de 50% do genoma humano consiste de seqncias repetidas no codificantes. Para estes autores a razo para a presena de tanto DNA no codificante nos genomas de eucariotos e a extraordinria diferena no tamanho do genoma ou valor-C entre as espcies representa um velho quebra-cabea denominado enigma do valor-C. Porm, a seqncia de DNA que no codifica protena pode codificar molculas funcionais de RNA no-codificante o qual est envolvido na regulao da expresso gnica. DeSalle (2004) apontou que algumas seqncias de DNA no codificante mostra papel estrutural nos cromossomos. Conforme este autor, os telmeros e centrmeros contm poucos genes, mas so importantes para o funcionamento e estabilidade do cromossomo. Uma forma abundante de DNA no codificante em humanos so os pseudogenes, que nada mais so do que copias de genes que sofreram desativao por

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mutaes. Na luz do evolucionismo essa seqncia, denominas fosseis moleculares, podem ser a matria-prima do processo evolutivo.

2.1.5 Evoluo Jobim (2006) afirmou que o planeta Terra era um Jardim do den

molecular, h cerca de quatro bilhes de anos. As molculas se reproduziam de

forma ineficiente, produzindo-se cpias grosseiras. Neste tipo de cenrio ocorreram as primeiras replicaes, mutaes, e extines de forma selectiva e aleatria. Ainda relatou este autor que as variedades menos eficientes foram sendo eliminadas, enquanto aquelas que conseguam sobreviver se tornaram cada vez mais eficientes a cada gerao - evoluo. Gusmman (2007) mencionou que com o avano no tempo, as molculas orgnicas foram adquirindo mais e mais funes especializadas, foram se juntando aos poucos e de forma casual. Tambm descreveu que a princpio, pode-se dizer que estas colectividades moleculares formaram algo parecido com o primeiro ser vivo composto a partir de algum momento por um DNA funcional.

2.2.6 Dados Histricos relacionados Hereditariedade

1865 - Gregor Mendel publica trabalho sobre experimentos com ervilhas em

que prope as leis da hereditariedade e supe que as caractersticas hereditrias so transmitidas em unidades.

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1869 - O suo Friedrich Miescher isola, a partir do pus humano e do esperma

do salmo, uma substncia com alto teor de fsforo que chama de "nuclena", posteriormente denominada "cido desoxirribonuclico" (DNA).

1882 - O alemo Walter Flemming descobre corpos com formato de basto

dentro do ncleo das clulas, que denomina "cromossomas".

1900 - O holands Hugo de Vries, o alemo Carl Correns e o austraco Erich

Tschermak von Seysenegg chegam de forma independente aos resultados de Mendel sobre as leis da hereditariedade.

1902 - O norte-americano Walter Sutton e o alemo Theodor Boveri do incio

teoria cromossmica da hereditariedade.

1909 - O dinamarqus Wilhelm Johannsen introduz o termo "gene" para

descrever a unidade mendeliana da hereditariedade. Utiliza os termos "gentipo" e "fentipo" para diferenciar as caractersticas genticas de um indivduo de sua aparncia externa.

1915 - O norte-americano Thomas Hunt Morgan e outros publicam o livro "O e mostram que os genes esto linearmente dispostos nos

Mecanismo da Hereditariedade Mendeliana", no qual relatam experimentos com drosfilas cromossomos.

1949 - O austraco Erwin Chargaff descobre, nos EUA, uma relao

quantitativa entre as bases do DNA: a proporo entre adenina e timina sempre igual, e o mesmo ocorre entre guanina e citosina.

1950 - Os norte-americanos Linus Pauling e Robert Corey identificam a

estrutura molecular bsica de protenas. Eles propem uma estrutura para o DNA com trs cadeias helicoidais entrelaadas (o modelo da tripla hlice).

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1952 - A britnica Rosalind Franklin obtm imagens de DNA , por difraco de

raios X.

1953 - O norte-americano James Watson e o britnico Francis Crick decifram,

em 7 de Maro, a estrutura de dupla hlice para o DNA e a publicam na revista "Nature" de 25 de Abril. Em 30 de maio, tambm na "Nature", Watson e Crick analisam as implicaes genticas de seu modelo e sugerem um mecanismo para a replicao do DNA.

1958 - Os norte-americanos Matthew Meselson e Franklin Stahl confirmam a

hiptese feita por Watson e Crick de que o DNA replica-se de maneira semiconservativa.

1972 - O norte-americano Paul Berg obtm molculas de DNA recombinante,

unindo DNA de diferentes espcies e inserindo esse DNA hbrido em uma clula hospedeira.

1975 - Grupos de pesquisa desenvolvem mtodos de seqenciamento de

DNA.

1976 - Criada a primeira companhia de engenharia gentica, a Genentech. 1980 - A Suprema Corte dos EUA decide que formas de vida alteradas podem

ser patenteadas.

1982 - O primeiro animal (camundongo) transgnico obtido nos EUA. 1983 - Companhias nos EUA conseguem obter patentes para plantas

geneticamente modificadas. mapeado nos EUA o primeiro gene relacionado a uma doena.

1985 - Alec Jeffreys (ingls) descreve tcnica de identificao que ficou

conhecida como "impresso digital" por DNA.

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Os NIH dos EUA aprovam directrizes gerais para a realizao de experimentos com terapia gentica em seres humanos.

1986 - Plantas de tabaco geneticamente modificadas para se tornarem

resistentes a herbicida so testadas em campo pela primeira vez, nos EUA e na Frana.

1988 - Nos EUA, Philip Leder e Timothy Stewart obtm primeira patente para

um animal geneticamente modificado, um camundongo.

1989 - Criao nos EUA do Instituto Nacional para Pesquisa do Genoma

Humano (NHGRI), chefiado por James Watson, para determinar toda a sequncia do DNA que compe os cromossomas humanos.

1994 - Liberao de tomate, primeiro alimento geneticamente modificado cuja

venda aprovada pela FDA.

1995 - obtida a primeira sequncia completa de DNA de um organismo de

vida livre, a bactria Hemophilus influenzae.

1997 - Nascimento da ovelha Dolly, primeiro mamfero clonado a partir de uma

clula de um animal adulto pelo Instituto Roslin (Esccia). Mapa gentico completo do camundongo.

2000 - Pesquisadores do consrcio pblico Projeto Genoma Humano e da

empresa privada norte-americana Celera anunciam o rascunho do genoma humano. No Brasil, pesquisadores paulistas anunciam o seqenciamento do genoma da bactria Xylella fastidiosa, a causadora da doena do amarelinho em ctricos. O artigo foi destacado na capa da revista "Nature".

12 de Fevereiro de 2001 - anunciada a publicao da anlise da sequncia

do genoma humano.

2003 - Concluso parcial da anlise da sequncia do genoma humano (PGH).

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2.3 Marcadores moleculares para a identificao humana Em 2005 Pena descreveu que nos testes de determinao de identidade gentica so estudadas regies genmicas em que h variao entre pessoas normais. Ainda este autor essas regies so chamadas de polimorfismos de DNA ou marcadores de DNA. Miething et al (2006) relataram que nos ltimos anos foram desenvolvidas diversas tcnicas para estudo de diferentes tipos de polimorfismos de DNA, formando assim um verdadeiro cardpio, no qual os cientistas e laboratrios podem escolher o mtodo mais adequado para solucionar o problema em mos. Citaram ainda que o mtodo mais usado hoje em dia o estudo de regies repetitivas de DNA, chamadas de minissatlites (VNTRs) e microssatlites (STRs). Segundo Evonne (2006) a chave da diversidade nessas regies que o nmero de repeties varia entre indivduos e pode ser estudada com sondas de DNA, ou atravs de PCR, como vem sendo feito em maior escala atualmente. Gusmman (2007) definiu o nmero varivel de repeties em tandem, tambm denominados de minissatlites, ou VNTRs (do ingls variable number of

tandem repeats), sendo polimorfismos de DNA que consistem numa srie de

comprimento de repeties de fragmentos de DNA. Para este autor uma regio VNTR tpica consiste de 500 a 1000 pb, compreendendo principalmente unidades repetidas em seqncia, cada qual com cerca de 15 a 35 pb de comprimento.

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Para Watson (2007) os locos VNTR so particularmente convenientes como marcadores para a identificao humana, pois possuem um nmero muito grande de alelos diferentes e, sendo assim, provvel que no existam dois indivduos no aparentados que compartilhem o mesmo gentipo . Ainda este autor definiu o short tandem repeats ou repeties curtas em tandem (STRs ou ainda microssatlites) sendo polimorfismos muito similares aos VNTRs, mas diferindo em seu tamanho (em geral no ultrapassam 200pb) e no comprimento das unidades de repetio em tandem, que variam de 2 a 7 nucleotdeos. Verssimo (2007) citou que estes locos so muito abundante no genoma humano, e cada um deles possui um grande nmero de diferentes alelos, inclusive maior do que o encontrado em VNTRs, o que os torna ainda mais til para identificao humana.

2.3.1 Marcadores bi-allicos Pena (2005) relatou que alm dos minissatlites e microssatlites h dois grandes grupos de polimorfismos no genoma humano - os polimorfismos de substituio de nucleotdeos nicos (single nucleotide polymorphisms, ou SNPs) e os polimorfismos de insero ou deleo de um ou mais nucleotdeos (polimorfismos de insero - deleo; ins/del). Para este autor ambos polimorfismos apresentam a grande vantagem de que podem ser estudados em produtos de amplificao muito curtos (50 pb ou menos) e, assim, apresentam distintas vantagens sobre os microssatlites no estudo de DNA extremamente degradado.

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Jobim (2006) afirmou que os mais abundantes e os melhor estudados desse grupo so os SNPs. Cerca de 5,3 milhes deles foram encontrados no genoma humano, o que corresponde a um SNP a cada 600pb. Para Xio J, et al (2006) a possibilidade de que SNPs marcadores ins/del possam vir a substituir os STRs na identifcao de criminosos. Porm, embora estes marcadores possam oferecer algumas vantagens, os bancos de dados j foram montados com microssatlites e, portanto, a facilidade de comparaes entre um dado biolgico e uma seqncia armazenada muito maior para marcadores STRs. Ainda estes autores descreveram que a tipagem dos SNPs relativamente complexa mas por outro lado, os ins/del so muito mais fceis de serem tipados porque seus alelos diferem somente em tamanho. Miething (2006) citou que na rea de identificao humana, estes marcadores apresentam a desvantagem de possurem somente dois alelos, o que torna muito maior a possibilidade de dois indivduos compartilharem o mesmo gentipo, mesmo sem serem aparentados ou relacionadas cena do crime. Para o autor uma maneira de superar esta desvantagem seria a tipagem de um nmero maior de marcadores ins/del, de maneira que fosse possvel uma identificao precisa. De acordo com Verssimo (2007), por muito tempo, estes polimorfismos foram detectados por tcnicas que possuam como base a eletroforese, cujos fundamentos permitiram o desenvolvimento de mtodos automatizados. Tambm relatou que, com o advento da reao em cadeia da polimerase (PCR), todos os tipos de marcadores moleculares passaram a ser detectados a partir de quantidades menores de amostras, com um tempo menor e, assim, uma ateno especial ser dada para esta tcnica.

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2.4 Procedimentos de anlise Um procedimento para analisar um DNA compe as seguintes fases: a) (1 FASE) - Extrao; b) (2 FASE) - Amplificao; c) (3 FASE) Eletroforese e leitura de fragmentos 2.4.1 FASE - EXTRAO Em 2001, Luftig descreveu em sua pesquisa que antes, as impresses digitais e outras pistas eram usadas para desvendar crimes; hoje, so inmeros os espcimes biolgicos dos quais o DNA pode ser extrado. No trabalho supracitado o autor afirmou que podemos encontrar o material gentico (DNA) em pequenas amostras de sangue, ossos, smen, cabelo, dentes, unhas, saliva, urina, entre outros fluidos. Benecke (2002) citou que a anlise cuidadosa desse material ajuda a identificar criminosos. As aplicaes da Biologia Molecular no laboratrio criminal centralizam-se, em grande parte, na capacidade da anlise do DNA em identificar um indivduo a partir de cabelos, manchas de sangue e fluidos corporais, entre outros itens recuperados no local do crime. Jobim (2006) relatou que para analisar o DNA, em primeiro lugar, devemos extrair o material gentico da clula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestgios de crimes) sem danific-lo. Segundo este autor, normalmente o material extrado o DNA, mas pode-se trabalhar com o RNA em uma RT-PCR que um desdobramento da PCR e possui outras aplicaes. Ou seja, para a extrao de DNA existem vrios protocolos de acordo com o tipo de amostra.

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2.4.2 FASE - AMPLIFICAO Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR uma das tcnicas mais comuns utilizadas em laboratrios de pesquisas mdicas e biolgicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnstico de doenas hereditrias, identificao de fingerprint gentico (usado em testes de paterninade e na medicina forense), deteco de dianstico de doenas infecciosas e criao de organismos transgnicos. Eglinton (1991) descreveu este tcnica sendo um mtodo in vitro rpido e verstil para a amplificao de seqncias-alvo de DNA definidas, presentes em uma preparao de DNA. Citou ainda que geralmente, o mtodo programado para permitir a amplificao seletiva de uma seqncia-alvo de DNA especfica a partir de DNA total previamente extrado. Hamazaki et al (1993) relataram que para permitir tal amplificao seletiva, alguma informao prvia, a respeito das seqncias-alvo, necessria. Essa informao utilizada para desenhar dois oligonucleotdeos iniciadores, denominados primers, os quais so especficos para a seqncia-alvo e apresentam cerca de 15 a 25 nucleotdeos de extenso. Referenciaram ainda que aps os primers terem sido adicionados ao DNA-molde desnaturado, eles se ligam especificamente s seqncias de DNA complementares ao seu stio-alvo, flanqueando e delimitando a regio a ser analisada. Em 1994, Karlsen et al, afirmaram que na presena de uma DNApolimerase termoestvel apropriada e dos quatro desoxirribonucleosdeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), iniciada a sntese de novas fitas de DNA, que so complementares a cada uma das fitas de DNA do segmento-alvo de

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DNA, formando, desta maneira, um fragmento de DNA com seqncia idntica do DNA a ser analisado, e previamente selecionado pelo par de primers . Benecke (2002) citou que este ciclo de duplicao molecular repetido vrias vezes, e que a PCR uma reao em cadeia porque as fitas de DNA, recentemente sintetizadas, iro atuar como moldes para mais uma sntese de DNA nos ciclos subseqentes. Referenciou ainda que aps cerca de 25 ciclos de sntese de DNA, os produtos da PCR iro incluir, alm do DNA que iniciou a reao, cerca de 105 cpias da seqncia-alvo especfica, uma quantidade que facilmente visualizada como uma banda distinta de tamanho especfico quando submetida eletroforese. Jobim (2007) descreveu que este processo relativamente simples e fcil de realizar em laboratrio. Os resultados podem ser obtidos em um espao curto de tempo, freqentemente menos do que 24 horas, em contraste com uma anlise do genoma total com Southern, que exige at mesmo semanas.

I-) Procedimentos A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) um mtodo muito sensvel de anlise e por isso realizado com muito cuidado para evitar contaminaes que possam inviabilizar ou tornar errneo o resultado.

II-) Principais vantagens da tcnica de PCR e suas aplicaes Duarte (2001) relatou que a clonagem de DNA por PCR pode ser realizada em poucas horas usando-se um equipamento relativamente simples, cuja funo fundamental a variao de temperatura em cada passo da tcnica.

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Este autor ainda citou que uma reao de PCR consiste de 30 ciclos contendo as etapas de desnaturao, sntese e pareamento, com cada ciclo individual levando em geral 3 a 5 minutos em um termociclador automatizado, o que totaliza menos de trs horas para todo o processo. Evidentemente, algum tempo tambm necessrio para a construo e a sntese dos oligonucleotdeos que serviro como primers, mas isso foi simplificado pela disponibilidade de programas de computador para projetar primers e pela sntese comercial rpida dos oligonucleotdeos desejados. Para eles o PCR encontra sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de DNA disponvel reduzida. Em teoria, possvel amplificar qualquer DNA. Cheoker (2002) afirmou que uma das principais aplicaes do PCR na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaos de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaos de plo ou at mesmo a minscula quantidade de DNA deixada em uma impresso digital) so amplificadas para serem analisadas pelo mtodo de fingerprinting. Ainda referenciou que o PCR tambm rotineiramente utilizado em procedimentos cientficos de Biologia Molecular como amplificao para gerar mutagnese, deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem (insero em plasmdeo, por exemplo) como tambm pode ser utilizado para identificao de patgenos que esto presentes em amostras como por a exemplo identificao de agentes como Cndida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vrus do papiloma humano e seus gentipos, HBV Vrus da Hepatite B. Etc Segundo Miller em 2001, a PCR capaz de amplificar seqncias a partir de quantidades nfimas do DNA-alvo e, at mesmo, do DNA de uma nica clula. Esta vantagem torna a tcnica particularmente til na anlise forense, quando, em muitos casos, a quantidade de material biolgico, e portanto, de DNA

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extrado de algumas amostras, muito pequena, como em fios de cabelo ou traos de saliva em tocos de cigarro. Strachan et al., 2002 relatou em seu estudo que desta maneira a tcnica possibilita a tipagem do DNA em amostras de prova que no poderiam ser analisadas atravs de outras tcnicas, como por exemplo, o Southern, uma vez que esta tcnica necessita de uma grande quantidade de DNA total. Alm disso, a pequena quantidade de DNA, necessria para a PCR, torna mais fcil guardar pores de amostras para repetir os testes no mesmo ou em outro laboratrio. Outros pesquisadores, Strachan et al., em 2002, citaram que tal sensibilidade excelente tem fornecido novos mtodos para o estudo da origem molecular de doenas e tem encontrado numerosas aplicaes na cincia forense, no diagnstico, na anlise de ligaes genticas, utilizando a classificao de um nico tipo de esperma, e nos estudos paleontolgicos em que as amostras podem conter um nmero insignificante de clulas. No entanto, a sensibilidade extrema do mtodo implica que enormes cuidados devem ser tomados para evitar a contaminao da amostra com DNA de outras fontes. Gino et al. (2004) salientaram que a PCR pode permitir a amplificao de seqncias especficas a partir de material no qual o DNA est gravemente degradado ou embebido em um meio onde o isolamento de DNA problemtico. Como o Southern utiliza DNA genmico total, necessrio que este DNA esteja em bom estado, ou seja, que as molculas estejam intactas. De acordo com Viera (2006) em gentica forense, nem sempre as amostras biolgicas so novas e se encontram em um bom estado de conservao, o que compromete a integridade do genoma da clula a ser analisada. Uma vez que somente um fragmento do DNA isolado e amplificado pela PCR, uma enorme vantagem desta tcnica permitir a utilizao, com sucesso, de amostras que contenham DNA degradado.

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Jobim (2007) descreveu que atravs da PCR, possvel a tipagem do DNA em amostras que de outra maneira no poderiam ser analisadas, como amostras antigas e j decompostas, restos mortais de vtimas de incndios ou acidentes e corpos em decomposio.

2.4.3 FASE ELETROFORESE E LEITURA DE FRAGMENTOS I-) Mtodos automatizados Saiki et al. em 2000 relataram o mecanismo da eletroforese capilar, descrevendo que funciona como a eletrofores normal, porm o gel e a amostra esto dentro de um capilar, e a amostra detectada automaticamente por um detector. Isso possibilita a automao do processo. Essa a eletrofores atualmente utilizada em sequenciadores de DNA. Inwald (2001) descreveu que por meio dessa tcnica possvel separar molculas em funo da sua massa (tamanho), forma e compactao. Trata-se de uma tcnica rpida, sensvel e precisa. Este autor ainda citou que a molcula do DNA, migra em suportes (gis de agarose ou acrilamida) por ao de uma corrente eltrica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamanho e forma. Cheoker (2002) afirmou quando submetido a um campo eltrico, as molculas de DNA migram para o plo positivo, pois so carregadas negativamente, e como fora oposta migrao existe o atrito com o suporte (gel). Quanto maior a molcula, maior o atrito e mais lenta a migrao. Gino et al. (2004) salientaram que o DNA pode ser visualizado na presena de compostos intercalantes, sendo que o mais utilizado o brometo de etdio. Em presena desse composto, o DNA emite fluorescncia por exposio

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luz UV e, assim, molculas de um mesmo tamanho so visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma faixa fluorescente. Constataram ainda em seu estudo que se na amostra submetida corrente eltrica existir mais de um tamanho de molcula, estas sero separadas na migrao e, ento, sero visveis bandas em diferentes localizaes do gel. De acordo com Viera (2006) basicamente, duas matrizes slidas so utilizadas atualmente para eletroforese: gis de agarose e gis de acrilamida. Para este autor a escolha do tipo de gel depende do tamanho do fragmento e da diferena de tamanho de diferentes fragmentos de DNA que se quer visualizar. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. Referenciou ainda que em qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida). Segundo Jobim (2007) para eletroforese de DNA, normalmente utilizase o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA). Quanto aplicao das amostras no gel, ressaltou que antes disso elas so misturadas a uma outra soluo (Tampo de amostra), que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Tambm citou que o tampo de amostra possui um corante que possibilita a visualizao do andamento da corrida.

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2.5 O ALDEDO FRMICO (FORMOL) Ben-ezra (1990) descreveu que os aldedos so compostos qumicos resultantes da oxidao parcial dos lcoois. Assim, o lcool metanol, ao perder um tomo de hidrognio (a perda de hidrognio aumenta a proporo de oxignio e, por isso, fala-se em oxidao dos lcoois) d origem ao aldedo frmico e o etanol, ao aldedo actico. Tokuda et al (1990) relataram que o formaldedo normalmente utilizado em soluo aquosa em concentrao de 37% e contm metanol como preservativo contra a polimerizao. Nessa forma de apresentao mostra-se como lquido incolor, possui massa molar de 30.03 g/mol, ponto de ebulio de 19,5C e ponto de fuso de -92C. incompatvel com oxidantes fortes, lcalis, cidos, fenis e uria. Tem como sinnimos: formol, formalina, xido de metileno, componente de exausto de diesel e produto da pirlise (queima) de revestimento de eletrodos de solda. Lund et al, (1991) citaram que temperatura ambiente, o aldedo frmico (AF) um gs incolor e de cheiro muito forte. O que se encontra disponvel para utilizao e venda comercialmente a soluo aquosa de AF, tambm muito consumido nas indstrias de madeira, plsticos e vernizes. Greer (1991) relatou as diversas formas de se fixar um tecido, sendo a fixao obtida atravs do uso de substncias qumicas (fixadores) a mais adequada. De acordo com seus estudos, ainda este autor, descreveu que o fixador mais utilizado o formol a 10% (aldedo frmico), devido ao seu baixo custo e simplicidade de uso. Para ele o formol extremamente voltil e provoca irritao dos olhos e vias respiratrias. E quando apresenta em soluo aquosa o formol precipita-se

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em concentraes superiores a 40%, portanto, recebendo esta soluo a denominao de "formol puro". Jackson et al (1991) descreveram que o cido frmico um dos produtos de degradao do formol, sendo que tal cido freqentemente interage com a hemoglobina produzindo um pigmento acastanhado chamado de "pigmento de formol" ou hematina. O uso de soluo tampo evita a acidificao do fixador, impedindo assim o aparecimento do pigmento de formol. Eglinton et al (1991) citaram que em conseqncia da inveno do formol em 1893, multiplicou-se o nmero de monumentos de carne para tornar viva a memria dos mortos, sendo usado para mumificar pessoas famosas como Lnin e Evita. O produto mais usado universalmente para conservao de cadveres o formol. Koshiba em 1993 definiu a fixao em formol como um passo fundamental no processo de conservao de cadveres. Ela baseia em manter, de modo definitivo, as estruturas citolgicas e histolgicas das clulas e tecidos, ou seja, evita a degradao do material em decorrncia de fenmenos autolticos e permite a realizao de inmeras tcnicas citolgicas e histopatolgicas, assim como, o processo de conservao dos cadveres. Conforme Hamazaki et al (1993) elucidaram que a fixao um passo fundamental no processo de conservao de cadveres. Este mdoto baseia em manter, de modo definitivo, as estruturas citolgicas e histolgicas das clulas e tecidos, ou seja, evita a degradao do material em decorrncia de fenmenos autolticos e permite a realizao de inmeras tcnicas citolgicas e histopatolgicas, assim como, o processo de conservao dos cadveres. Karlsen et al (1994) descreveram que a exposio ao formaldedo carreta irritao nos olhos e mucosas. Exposies de longa durao a baixas concentraes podem causar dificuldade respiratria.

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Para este autores o aldedo frmico em concentraes elevadas tem sido classificado com agente carcinognico humano e relacionado com cnceres de vias areas superiores e de pulmo, leucemia e cncer no encfalo. J Romero (1997) citou que o corao, o fgado, os pulmes e as demais vsceras eram colocadas em potes contendo uma substncia (bicarbonato de sdio) que dificultava a decomposio. Este autor descreve que o corpo ficava mergulhado no formol durante 3 (trs) dias e posteriormente era enfaixado com tiras de algodo, colocado em um sarcfago e transladado para as tumbas existentes nas pirmides. Mies em 1998 descreveu que o formol o produto mais usado universalmente para conservao de cadveres, mediante as tcnicas de formolizao e de embalsamamento, como meio de prevenir e retardar a putrefao. De acordo com Mizuno (1998) o povo do antigo Egito acreditava que havia vida aps a morte. Ento, quando uma pessoa morria, eram retirados os seus rgos. Inwald (2001) descreveu que de a forma molecular H2CO tem como principais aplicaes: produo de resinas, matria prima para diversos produtos qumicos, agente esterilizante para autoclaves, agente preservante de produtos cosmticos e de limpeza, formolizao de peas e de cadveres, embalsamamento de cadveres, etc. Cheoker (2002) afirmou que o formol tem a propriedade de degradar o DNA, no seu todo ou parcialmente, na dependncia da concentrao e do tempo de exposio (fixao) a que um determinado tecido submetido. Seus estudos baseiam-se em reaes bioqumicas, sem a realizao de um estudo propositivo de campo ou experimental. Assegura, no entanto, que se fazem necessrias pesquisas a respeito.

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Gino et al. (2004) salientaram que qualquer afirmativa com relao aos efeitos deletrios do formol na molcula do DNA depende de outros estudos experimentais, recomendando que sejam utilizadas concentraes diferenciadas e com grupo controle. DeSalle (2004) citou as diversas formas de se fixar um tecido, sendo a fixao obtida atravs do uso de substncias qumicas (fixadores) a mais adequada. Mehrdad et al (2005) relataram que o povo do antigo Egipto acreditava que havia vida aps a morte, ento, quando uma pessoa morria, eram retirados os seus orgos, como o corao, fgado, pulmes as vsceras e colocados em potes com uma substncia (bicarbonato de sdio), que dificultava a decomposio dos rgo. O corpo ficaria mergulhado na substncia durante 3 dias e posteriormente enfaixado com tiras de algodo ver mmia e colocado no sarcfago, que seria transladado para uma pirmide. De acordo com Miething (2006) a expresso cadver o nome dado a um Corpo, aps a sua morte, enquanto este ainda conserva parte de seus tecidos. Aps a decomposio de todos os orgos, msculos e tecidos, o mesmo passa a ser denominado como ossada. Legrand em 2006 descreveu que a origem da palavra cadver teria inscrio latina "Caro Data Vermibus" (carne dada aos vermes), que supostamente seria inscrita nos tmulos. Na verdade no se encontrou at hoje nenhuma inscrio romana deste gnero. Os etimologistas defendem que a palavra deriva da raiz latina "cado", que significa "cado". A favor desta teoria est o facto de Santo Isidoro de Sevilha referir que o corpo deixa de ser cadver a partir do momento em que sepultado. Gusmman (2007) citou que o aldedo frmico atua como fixador interagindo com os aminocidos lisina e arginina. Tal fixador no provoca

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precipitao de protenas, no preserva gorduras livres, porm fixa lipdeos complexos, provoca leve precipitao de outros constituintes celulares e no o fixador de eleio para carboidratos. Remualdo (2007) salientou que o embalsamento ou embalsamao uma tcnica de preservao de cadveres para prevenir a putrefrao.

2.5.1 Composto qumico - Aldedo Aldedos so compostos qumicos resultantes da oxidao parcial dos lcoois. Assim, o lcool metanol ao perder um tomo de hidrognio (a perda de hidrognio aumenta a proporo de oxignio e, por isso, fala-se em oxidao dos lcoois) d origem ao aldedo frmico e o etanol, ao actico:

HO3C-OH

(metanol)

--->

HO3C=O

(aldedo

frmico)

HO3C-HO3C-OH (etanol) ---> HO3C-HO3C=O (aldedo actico)

Na temperatura ambiente o aldedo frmico (AF) um gs incolor e de cheiro muito agressivo. O que se encontra como formol no comrcio a soluo aquosa de AF. Na Medicina usado como desinfectante de salas cirrgicas ou outras, e pelos anatomistas e patologistas para preservarem tecidos, rgos ou cadveres. O AF tambm muito consumido na indstria da madeira, de plsticos e de vernizes.

31

2.5.2 Formaldedo O formaldeido um dos mais comuns produtos qumicos de uso atual. o aldedo mais simples, de frmula molecular H2CO e nome oficial IUPAC metanal. Suas aplicaes principais so:

Produo de resinas uria-formol, fenol-formol e melamnica Matria-prima para diversos produtos qumicos Agente esterilizante. V. autoclave Agente preservante de produtos cosmticos e de limpeza Embalsamao de peas anatmicas Conservao de cadveres Laboratrios

I-) Propriedades qumicas e fsicas - formaldeido O formaldedo um gs. normalmente utilizado em soluo aquosa a cerca de 37% em massa contendo metanol como preservativo contra a polimerizao.

Lquido incolor (soluo) ou gs com odor penetrante e irritante Massa molar: 30.03 g/mol Ponto de ebulio: -19,5C Ponto de fuso: -92C

32

Incompatibilidades: oxidantes forte, lcalis, cidos, fenis e uria

Sinnimos: formol, formalina, xido de metileno, componente de exausto

de diesel e produto da pirlise (queima) de revestimento de eletrodos de solda. II-) Limites de tolerncia

OSHA: TWA = 0,75 ppm, STEL = 2 ppm, Nvel de ao = 0,5 ppm ACGIH: Valor Teto (Ceiling) = 0,3 ppm, A2 = Suspeito de Carcinognico NIOSH: TWA = 0,016 ppm, Valor Teto = 0,1 ppm, Carcinognico Potencial NR-15: TWA = 1,6 ppm IDLH: 20 ppm

Humano

2.6 ASPECTOS TICOS E LEGAIS

Os aspectos ticos e legais relacionados com o estabelecimento laboratorial para a prtica do exame de DNA, est previsto nas seguintes leis: ANVISA De acordo com a Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) os procedimentos tcnicos em laboratrios analticos deveram seguir as devidas normas: todas as etapas da cadeia de custdia das amostras biolgicas devem ser documentadas de modo apropriado, a fim de evitar contaminaes e a adequao das condies de trabalho ISO/IEC 17.025. Em adio, Os procedimentos para estabelecer padres de qualidade, como a calibrao de equipamentos e a presena de um segundo analista devem ser implementados no pas para que as anlises se equivalham em termos de segurana e credibilidade quelas realizadas em laboratrios de referncia no exterior.

33

De acordo com a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Resoluo RDC n 306, de 07 de dezembro de 2004

III - Gerenciamento dos resduos de servios de sade

O gerenciamento dos RSS (resduos de servios de sade) constitui-se em um conjunto de procedimentos de gesto, planejados e implementados a partir de bases cientficas e tcnicas, normativas e legais, com o objetivo de minimizar a produo de resduos e proporcionar aos resduos gerados, um encaminhamento seguro, de forma eficiente, visando proteo dos trabalhadores, a preservao da sade pblica, dos recursos naturais e do meio ambiente. O programa a ser elaborado deve ser compatvel com as normas locais relativas coleta, transporte e disposio final dos resduos gerados nos servios de sade, estabelecidas pelos rgos locais responsveis por estas etapas. 1 - MANEJO: O manejo dos RSS entendido como a ao de gerenciar os resduos em seus aspectos intra e extra estabelecimento, desde a gerao at a disposio final, incluindo as seguintes etapas: 1.1 - SEGREGAO - Consiste na separao dos resduos no momento e local de sua gerao, de acordo com as caractersticas fsicas, qumicas, biolgicas, o seu estado fsico e os riscos envolvidos. 1.2 - ACONDICIONAMENTO - Consiste no ato de embalar os resduos segregados, em sacos ou recipientes que evitem vazamentos e resistam s aes de punctura e ruptura.

VI - 5.4.6 - As sobras de amostras de laboratrio contendo sangue ou lquidos corpreos, podem ser descartadas diretamente no sistema de coleta de esgotos, desde que atendam respectivamente as diretrizes estabelecidas pelos rgos ambientais, gestores de recursos hdricos e de saneamento competentes.

34

A ANVISA classificou em grupo de risco, para exames de DNA segue a seguinte nomenclatura:

GRUPO A1 - Culturas e estoques de microrganismos; resduos de fabricao de produtos biolgicos, exceto os hemoderivados; descarte de vacinas de microrganismos vivos ou atenuados; meios de cultura e instrumentais utilizados para transferncia, inoculao ou mistura de culturas; resduos de laboratrios de manipulao gentica.

VII - 19 - Todos os profissionais que trabalham no servio, mesmo os que atuam temporariamente ou no estejam diretamente envolvidos nas atividades de gerenciamento de resduos, devem conhecer o sistema adotado para o gerenciamento de RSS, a prtica de segregao de resduos, reconhecer os smbolos, expresses, padres de cores adotados, conhecer a localizao dos abrigos de resduos, entre outros fatores indispensveis completa integrao ao PGRSS
Em adio, por fazerem uso de tcnicas de engenharia gentica, as tipagens genticas devem obedecer s normas estabelecidas na Biossegurana N 8.974/95. Lei de

CDIGO DE PROCESSO PENAL LEI N 8.974/95 A confiabilidade e a segurana dos testes de identificao por DNA, quando da utilizao da Engenharia Gentica, podem ser equacionados pela Lei de Biossegurana (N 8.974/95):

"Art. 1 - Esta lei estabelece normas de segurana e mecanismos de fiscalizao no uso das tcnicas de engenharia gentica na construo, cultivo, manipulao, circulao, comercializao, consumo, liberao e descarte de

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Organismo Geneticamente Modificado (OGM), visando proteger a vida e a sade do Homem, dos animais e das plantas, bem como o meio ambiente."
O decreto de regulamentao (N 1.752/95), normatiza as atividades da Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana - CTNBio:

"Regulamenta a Lei n 8.974, de 05 de janeiro de 1995, dispe sobre a vinculao, competncia e composio da Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana - CTNBio, e d outras providncias."
Aspecto relevante desta legislao que a mesma protege a sade dos Homens, animais, vegetais e do meio ambiente sem hierarquizar a proteo. Em suma, a Lei de Biossegurana regulamenta todos os procedimentos laboratoriais que envolvam qualquer tipo de DNA, seja humano, animal, vegetal, transgnico e at mesmo quimeroplstico. Qualquer instituio domiciliada no Pas e que utilize tcnicas de Engenharia Gentica deve possuir o Certificado de Qualidade em Biossegurana CQB por fora da lei N 8.974/95:

"Art. 2 3 - As organizaes pblicas e privadas, nacionais, estrangeiras ou internacionais, financiadoras ou patrocinadoras de atividades ou de projetos referidos neste artigo, devero certificar-se da idoneidade tcnicocientfica e da plena adeso dos entes financiados, patrocinados, conveniados ou contratados s normas e mecanismos de salvaguarda previstos nesta Lei, para o que devero exigir a apresentao do Certificado de Qualidade em Biossegurana de que trata o art.6 inciso XIX, sob pena de se tornarem co-responsveis pelos , eventuais efeitos advindos de seu descumprimento."
O decreto de regulamentao N 1.752/95 tambm d competncia CTNBio para estabelecer o Cdigo de tica de Manipulao Gentica: "Art. 2 Compete CTNBio:

36

IV - propor o Cdigo de tica de Manipulaes Genticas;"

No bastasse o referido decreto, a sociedade ainda dispe da Resoluo N 196/96, do Conselho Nacional de Sade, ligado ao Ministrio da Sade, que estabelece os procedimentos ticos das pesquisas envolvendo seres humanos, e o faz de maneira participativa, pois prev a criao de Comisses de tica em Pesquisa, com participao de leigos e de membros no pertencentes instituio proponente da pesquisa.

"VII - Comit de tica em Pesquisa CEP

Toda pesquisa envolvendo seres humanos dever ser submetida apreciao de um Comit de tica em Pesquisa.

Do Exame de Corpo de Delito e das Percias em Geral do Cdigo de Processo Penal

II, Art. 166 - Havendo dvida sobre a identidade do cadver exumado, proceder-se- ao reconhecimento pelo Instituto de Identificao. Art. 170 - Nas percias de laboratrio, os peritos guardaro material suficiente para a eventualidade de nova percia. Sempre que conveniente, os laudos sero ilustrados com provas fotogrficas, ou microfotogrficas, desenhos ou esquemas. Art. 173 - No caso de incndio, os peritos verificaro a causa e o lugar em que houver comeado, o perigo que dele tiver resultado para a vida ou para o patrimnio alheio, a extenso do dano e o seu valor e as demais circunstncias que interessarem elucidao do fato.

37

3. PROPOSIO

Assim sendo, a pesquisa teve como objetivos: a) Analisar a ao do formaldedo nas concentraes de 5%, 10% e 20%, sobre tecido muscular humano e seus efeitos na degradao do DNA nuclear; b) Avaliar o grau de degradao do DNA em tecido muscular humano nos quais foi aplicado formol, comparando os resultados com os obtidos em tecido muscular no formolizado, ou seja, in natura; c) Analisar a confiabilidade dos exames de perfis genticos de DNA realizados em amostras biolgicas conservadas em diferentes concentraes de formaldedo e indicar a concentrao de maior confiabilidade, ou seja, a que menos degrada o DNA; d) Avaliar a validade de exames de perfis genticos de DNA em cadveres submetidos conservao atravs da tcnica da formalizao. e) Discutir os aspectos ticos e legais pertinentes ao tema.

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4. MATERIAL E MTODOS
O material utilizado na pesquisa (fragmento de tecido muscular) foi coletado no Departamento Mdico Legal de Vitria ES, em cadveres no identificados que deram entrada no perodo de setembro a outubro de 2008, obtendo um total de 40 (quarenta) cadveres. Foram includos na pesquisa os cadveres no identificados e que estiveram selecionados para serem sepultados pelo Departamento, em cumprimento rotina administrativa que estabelece que, decorridos 30 (trinta) dias aps a data de entrada, compete ao Estado o sepultamento dos corpos, aps tomadas as medidas preventivas legais, ou seja, elaborao do laudo de exame cadavrico ps necrpsia, fotografias, coleta de impresses digitais quando possvel, registro de dados antropolgicos e coleta de amostra biolgica (sangue ou tecidos) para futuro exame de perfil gentico de DNA, se necessrio. Foram coletadas trs fragmentos musculares intercostais de

aproximadamente 1cm3, acondicionado em coletor plstico contendo 30ml de formol a 5%, 10% e 20%. Armazenados durante perodo de 6 (seis) dias. Aps esse perodo, processou-se a anlise gnica. Foram processadas 120 (cento e vinte) amostras-questionadas assim sub-divididas: 40 (quarenta) amostras de fragmentos de tecido fixados em

formol na concentrao de 5%; 40 (quarenta) amostras de fragmentos de tecido fixados a 10%; 40 (quarenta) amostras de fragmentos de tecido fixados a 20%.

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Cumpre-nos informar que a coleta de amostra de tecido muscular faz parte da rotina adotada pelo Departamento Mdico Legal de Vitria ES, quando do sepultamento de corpos no identificados e tem por objetivo a anlise de perfis genticos de DNA. Uma amostra foi submetida ao exame de DNA in natura. Esta amostra comps o grupo-controle. Para assegurar a qualidade, integridade e segurana nos exames envolvendo a utilizao de DNA estabeleceram-se um padro de procedimentos de coletas e das anlises, atravs de um manual, que ser descrito logo abaixo. As etapas envolvem vrias fases que podem ser assim enumeradas: a. Coleta dos materiais; b. Extrao do DNA; c. Quantificao do DNA; d. Amplificao do DNA; e. Anlise comparativa do DNA das amostras; f. Clculos Estatsticos;

g. Elaborao do Relatrio das anlises realizadas. Todas as amostras coletadas foram acondicionadas em recipiente plstico com a devida identificao e encaminhadas para armazenamento em cmara fria do Laboratrio de DNA Criminal da Polcia Civil ES, onde permaneceram at o processamento que compreendeu as etapas de extrao, amplificao e leitura de fragmentos. No processo de extrao foram utilizados os protocolos normalmente seguidos pelo Laboratrio de DNA Criminal da Polcia Civil - ES, recomendados

40

para tecido muscular. A amplificao foi realizada para marcadores genticos em sistema

multiloci , atravs da tcnica da PCR (reao em cadeia da polimerase).

Posteriormente ser feita a leitura dos fragmentos amplificados em seqenciador gentico com eletroforese capilar. A degradao do DNA foi avaliada tomando-se por base o nmero de marcadores amplificados. Em um procedimento normal de anlise espera-se amplificar 15 (quinze) marcadores, correspondentes a 15 (quinze) regies cromossomiais, e o marcador que determina a presena na amostra dos cromossomos X e Y (amelogenina), fato tal obtido nesta pesquisa. A degradao do material gentico (DNA) avaliada comparando-se os resultados encontrados, o nmero de marcadores amplificados e a intensidade de fluorescncia dos picos obtidos. Os alelos encontrados em todas as amostras (uma amostra controle, e trs amostras fixadas em solues com concentraes distintas de formol) foram validados de acordo com normas recomendadas pelos fabricantes dos reagentes utilizados. Considerando os volumes das amostras de tecido muscular a serem utilizados na pesquisa temos que quase no houve tecido remanescente, posto que as amostras foram processadas integralmente. Em casos isolados de algum tecido remanescente este foi descartado, de acordo com as normas estabelecidas e em cumprimento no Laboratrio de DNA Criminal da Polcia Civil. Os perfis genticos de DNA das amostras obtidas foram incorporados ao Banco de Dados do Laboratrio visando possvel necessidade de comparaes futuras com amostras-referncia de familiares dos corpos no identificados. Os dados encontrados foram submetidos s anlises matemticas e
1

Kit comercial multiplex para identificao humana, 16 regies, Identifiler, Applied Biosystems.

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estatsticas pertinentes. Considerando o ineditismo da pesquisa, a falta de referncias literrias a respeito, e ainda, a possvel inespecificidade dos resultados achamos conveniente utilizarmos trs instrumentos estatsticos. Para a anlise dos dados os seguintes testes estatsticos foram utilizados: anlise de varincia para exemplo com um experimento (one-way ANOVA), teste de Pearson, e coeficiente de correlao intra-classe (ICC). Todos os dados obtidos foram mantidos sob o mais absoluto sigilo, visando preservar a confidencialidade das informaes. Este projeto de pesquisa contou com o apoio operacional do Departamento Mdico Legal de Vitria ES e do Laboratrio de DNA Criminal da Polcia Civil - ES, instituies que dispem de rea fsica, equipamentos, tcnicos e profissionais treinados para a realizao dos procedimentos necessrios, dentro de normas ticas e de biossegurana exigidas em pesquisas que envolvem seres humanos.

Os Mtodos de extrao de DNA utilizado nesta pesquisa foram: Material: SANGUE e TECIDO MUSCULAR Mtodo: CHELEX

O Mtodo de amplificao de STRs autossmicos foi: kit comercial: IDENTIFILER

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CONSIDERAES TICAS E RELATIVAS BIOSSEGURANA Em cumprimento aos requisitos necessrios para o desenvolvimento deste projeto, o mesmo foi submetido Comisso de tica em Pesquisa da EMESCAM (Escola Superior de Cincias da Santa Casa de Misericrdia de Vitria). No foram geradas imagens de qualquer natureza dos corpos no identificados submetidos coleta de material biolgico, portanto, no houve qualquer possibilidade de exposio da identidade da vtima. Os autores assumiram o compromisso de que nenhum dado coletado ser publicado individualmente. No tocante biossegurana, o manuseio do material foi feito por pessoal habilitado e treinado para a funo. Os critrios de segurana relativos a esta pesquisa esto em conformidade com as normas atuais contidas na Resoluo 196/96 do Conselho Nacional de Sade. As amostras obtidas de cada cadver foram armazenadas em refrigerador a -20 na cmara fria do Laboratrio de DNA Criminal da Polcia C, Civil do Esprito Santo, at o termino do processamento e foram integralmente utilizadas nas pesquisas no havendo remanescentes teciduais. As amostras foram submetidas anlise de perfis genticos de DNA e foram utilizados marcadores genticos especficos para identificao humana, em regies no codificantes do DNA, no havendo, portanto, nenhuma possibilidade da identificao de possveis portadores de gens relacionados a doenas de qualquer natureza.

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5. RESULTADOS Coletou-se 40 amostras para controle (Tabela 1), verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados foram em 100% (40) das amostras coletadas. Portanto, verifica-se que extremamente possvel procederse a identificao humana por meio da anlise do exame de DNA em tecido muscular. Tabela 1: Relao dos resultados obtidos da anlise das amostras de controle Amostra
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Nmero de marcadores amplificados

15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina

Amostra
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Nmero de marcadores amplificados

15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina

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RESULTADO DA AMOSTRA CONTROLE O resultado da amplificao do marcador chamado AMELOGENINA, que determina a presena na amostra dos cromossomos X e Y, refere-se ao sexo do indivduo. Verificou-se que em 100% (40) das amostras de controle analisadas obteve-se a presena deste marcador (Grfico 1). Quantidade do marcador da Amelogenina em 40 amostras Amelogenina

100%
Grfico 1: Quantidade do marcador amelogenina presentes nas amostras controle.

Com relao ao nmero de marcadores analisados (D8S1179, HumTH01, HumvWA, D21S11, D13S317, HumTPOX, D7S820, D16S539, D18S51, CSF1PO, D2S1338, D5S818, D3S1358, D19S433 e FIBRA/FGA) em 40 amostras de controle encontrou-se a quantidade de 15 marcadores acima citado em 77,5% (31) das amostras e 14 marcadores amplificados em 22,5% (09) (Grfico 2). 77,5%

" !" " !" " !"   ! "    "  # "!   # "!   # "!    !   #  "             

22,5%

45

Verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados foram em 100% (40) das amostras coletadas, aps formolizao a 5%. Observou-se que estas amostras apresentaram mnima degradao do DNA e a validao dos alelos foram realizadas com relativa facilidade, assim como, verificou a presena da amelogenina em todas as amostras amplificadas, permitindo a confirmao do gnero (sexo) do titular da amostra (tabela 2).
Tabela 2: Relao dos resultados obtidos da anlise das amostras formolizao a 5%.

Amostra
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Nmero de marcadores amplificados

14 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 14 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina

Amostra
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Nmero de marcadores amplificados

14 e amelogenina 15 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 15 e amelogenina 15 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina 15 e amelogenina 14 e amelogenina 13 e amelogenina

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Verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados foram em 100% (40) das amostras analisadas. Observou-se que as amostras formolizadas a 10% apresentaram a degradao do DNA em 100% (40) das amostras, pois obedecendo ao protocolo internacional preconizado pelo programa CODIS do FBI, para assegurar uma identificao humana, se faz necessria uma amplificao mnima de 13 marcadores e os resultados obteve-se uma quantidade de marcadores amplificados inferior ao programa CODIS. Notou-se tambm que a amelogenina no foi amplificada em seis (15%) amostras analisadas (tabela 3). Amostra
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Nmero de marcadores amplificados

9 e amelogenina 11 e amelogenina 12 e amelogenina 12 e amelogenina 11 e amelogenina 11 e amelogenina 9 10 e amelogenina 10 e amelogenina 11 e amelogenina 11 e amelogenina 7 9 e amelogenina 10 e amelogenina 11 e amelogenina 10 e amelogenina 10 e amelogenina 11 e amelogenina 10 e amelogenina 10 e amelogenina

Amostra
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Nmero de marcadores amplificados

11 e amelogenina 10 e amelogenina 10 e amelogenina 9 9 e amelogenina 11 e amelogenina 10 e amelogenina 10 regies e amelogenina 9 10 e amelogenina 10 e amelogenina 10 e amelogenina 10 e amelogenina 9 e amelogenina 10 e amelogenina 9 9 10 e amelogenina 9 e amelogenina 10 e amelogenina

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Verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados foram em 100% (40) das amostras coletadas, aps formolizao a 20%. Tambm observou uma degradao maior que as formolizadas a 5% e 10%. Obteve-se uma quantidade de amplificao inferior ao programa CODIS em 100% (40). Portanto, cadveres formolizados 20% so descartados para uma possvel identificao humana. Com relao amelogenina, nota-se a presena desse marcador em apenas 23 (57,5%) das amostras (tabela 4). Amostra Nmero de marcadores amplificados
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Amostra

Nmero de marcadores amplificados

6 e amelogenina 8 e amelogenina 10 9 e amelogenina 8 7 9 e amelogenina 9 e amelogenina 10 9 7 e amelogenina 6 9 10 e amelogenina 6 e amelogenina 6 e amelogenina 6 e amelogenina 6 e amelogenina 5 6

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

5 6 6 e amelogenina 5 7 e amelogenina 6 e amelogenina 6 6 5 6 e amelogenina 6 e amelogenina 7 e amelogenina 5 amelogenina 6 e amelogenina 6 s e amelogenina 7 7 e amelogenina 6 e amelogenina 6 e amelogenina 6

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GRFICO COMPARATIVO DAS CONCENTRAES DE 5%, 10% E 20% Com relao ao nmero de marcadores analisados em 40 amostras nas concentraes de 5%, 10% e 20%, verificou-se que em 100% (40) das amostras coletadas, aps formolizao a 5% apresentaram mnima degradao do DNA e a validao dos alelos foram realizadas com relativa facilidade, assim como, verificou a presena da amelogenina em todas as amostras amplificadas, permitindo a confirmao do gnero (sexo) do titular da amostra. No entanto aps formolizao a 10% e 20% obteve-se uma quantidade de amplificao inferior ao programa CODIS em 100% (40). Com relao amelogenina, nota-se a presena desse marcador em apenas 25 (85%) das amostras submetidas a concentrao de 10% e 23 (57,5%) na concentrao de 20% (Grfico 03).

Grfico 03: Estudo comparativo entre as concentraes das amostras submetidas ao formol de 5%, 10% e 20%.

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6. DISCUSSO
A identificao pelo DNA afetou a vida de milhares de pessoas no planeta e tem sido utilizado rotineiramente na medicina legal e forense para desvendar crimes, identificar vtimas em desastres, catstrofes ou atentados terroristas, uma vez que o DNA o nico responsvel pela transmisso das caractersticas hereditrias de cada espcie de ser vivo. Desde 1893 com a inveno do formol, multiplicou-se o nmero de monumentos de carne para tornar viva a memria dos mortos, sendo usado para mumificar pessoas famosas como Lnin e Evita. Tratando-se de morte tecidual, fundamental o processo de fixao obtida atravs do uso de substncias qumicas (fixadores). Existem vrios tipos e concentraes para se fixar um tecido. A fixao se baseia em manter, de modo definitivo, as estruturas citolgicas e histolgicas das clulas e tecidos, ou seja, evita a degradao do material em decorrncia de fenmenos autolticos e permite a realizao de inmeras tcnicas citolgicas e histopatolgicas, assim como, o processo de conservao dos cadveres. Segundo Mies (1998) o formol o produto mais usado universalmente para conservao de cadveres, mediante as tcnicas de formolizao e de embalsamamento, como meio de prevenir e retardar a putrefao. Greer (1991) relatou as diversas formas de se fixar um tecido, sendo a fixao obtida atravs do uso de substncias qumicas (fixadores) a mais adequada. De acordo com seus estudos, o fixador mais utilizado o formol a 10% (aldedo frmico), devido ao seu baixo custo e simplicidade de uso. No entanto, muitos autores confirmam que as amostras formolizadas a 10% apresentaram a degradao do DNA. Salienta-se que obedecendo ao

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protocolo internacional preconizado pelo programa CODIS do FBI, para assegurar uma identificao humana, se faz necessria uma amplificao mnima de 13 marcadores. De acordo com os resultados obtidos, verificou-se a veracidade da afirmao acima, pois em 100% (40) das amostras formolizadas a 10% e 20% apresentaram degradao do DNA. Assim como tambm a amelogenina no foi amplificada em vrias amostras, desta forma no sendo possvel a confirmao do gnero (sexo) do titular da amostra. Gusmman (2007) citou que o aldedo frmico atua como fixador interagindo com os aminocidos lisina e arginina. Tal fixador no provoca precipitao de protenas, no preserva gorduras livres, porm fixa lipdeos complexos, provoca leve precipitao de outros constituintes celulares e no o fixador de eleio para carboidratos. Cheoker (2002) afirmou que o formol tem a propriedade de degradar o DNA, no seu todo ou parcialmente, na dependncia da concentrao e do tempo de exposio (fixao) a que um determinado tecido submetido. Seus estudos baseiam-se em reaes bioqumicas, sem a realizao de um estudo propositivo de campo ou experimental. No entanto, assegurou que se faz necessria pesquisa a respeito. Entretanto, da ao do formol sobre o material gentico humano (DNA), este tema gera muitas controvrsias, havendo linhas de pesquisa cientfica que defendem a no interferncia do formol sobre o DNA e as que afirmam que a fixao de cadveres com formaldedo pode causar a degradao do material gentico. Apesar de alguns autores defenderem a hiptese de que tecidos

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conservados em formol (como por exemplo, cordo umbelical) perdem todo o seu material gentico, os resultados obtidos nesta pesquisa apontam no sentido de que o DNA realmente sofre degradao quando em contato com o formol e que uma concentrao maior de formol no tecido dificulta a amplificao do material genmico e que esta dificuldade diretamente proporcional concentrao, ou seja, a degradao maior quanto mais concentrada for a soluo de formol. Sabidamente o processo de formolizao, muitas vezes til e imprescindvel para a adequada conservao e para o transporte de corpos, no uma prtica regulamentada pelos rgos pblicos e muitas dvidas pairam sobre o assunto, particularmente sobre a quem compete tal responsabilidade. Desta forma, por no constituir-se em prtica regulamentada ou fiscalizada, de uma gama de tcnicas em sua grande maioria de fundamentos empricos, aquele que realiza o ato escolhe uma, a que mais lhe parecer conveniente. Por esta razo torna-se difcil, diante de uma amostra dita ou considerada formolizada, a elaborao de estimativas seguras quanto aplicabilidade de uma anlise de perfis genticos de DNA. Alguns laboratrios, tendo conhecimento de que os tecidos a serem analisados foram submetidos ao do formol, recusam-se a iniciar as anlises. Entendemos que esta no deva ser a rotina adotada. Os resultados do nosso trabalho mostram que tecidos embebidos em formol em altas concentraes ainda apresentam quantidade de DNA passvel de amplificao mediante utilizao dos kits comerciais atuais. Nesse sentido, o trabalho ora exposto, contribui significativamente para desmistificar alguns conceitos adotados por alguns profissionais, conceitos adotados possivelmente empiricamente, sem evidncias significativas. Questiona-se tambm, a partir dos resultados obtidos no trabalho, a

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validade da indicao de concentraes de formol a 5% para realizao de processo de formolizao, considerando que a degradao do formol mostrou-se menor nos tecidos que foram expostos s menores concentraes. A princpio este deveria ser o raciocnio e neste sentido a indicao seria vivel. Importa considerar que a literatura mundial, ao referir-se ao uso do formol, tanto para conservao de corpos quanto para preservao de amostras destinadas s anlises histopatolgicas, recomendam categoricamente formol a 10%. Questionamos se uma reduo na concentrao de formol, de 10 para 5%, permitiria um mesmo processo de conservao ou se teramos uma acelerao dos fenmenos transformativos post-mortem. A considerarmos esta ltima hiptese os objetivos primordiais da utilizao do processo de formolizao no seriam atingidos. A colocao acima exposta vlida desde que o uso de formol a 5% fosse indicado somente nos processos de formolizao de corpos para fins de transporte ou para conservar corpos por perodos mais curtos de tempo, mantendo-se a recomendao da utilizao de formol a 10% para os demais processos de anlise histolgica. Sugerimos como recomendao ou rotina a ser seguida pelos servios mdicos legais e servios de verificao de bito a coleta de amostra-referncia em todos os corpos necropsiados, antes que se proceda formolizao ou embalsamamento. Considerando que o processo de formolizao no realizado, em regra, por mdicos legistas e sim por tcnicos em preparao de corpos; considerando ainda que estes no se baseiam em normas preconizadas pelas

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instituies sanitrias, no adotando por conseguinte concentraes regulares e padronizadas, entendemos que, diante da necessidade da anlise de perfis genticos de DNA em tecidos que foram submetidos a este procedimento, mesmo diante da comprovao de que o formol um agente que degrada o DNA, Ponderamos ainda a qualidade dos kits comerciais atualmente disponveis, o exame de DNA no dever ser descartado pois um dado aparentemente negativo no processo de formalizao (falta de padronizao) pode constituir-se exatamente em um fator favorvel. A atividade pericial voltada para a elucidao de questes referentes ao Direito Penal e ao Processo Penal tem objetivos distintos daquela demandada para fins cveis (em geral de ordem patrimonial ou financeira). O objetivo precpuo da percia na esfera penal a colaborao no cumprimento e na aplicabilidade da Justia, em sentido amplo. Nesse sentido, amplia-se tambm e de forma significativa, a atuao do perito, posto que este, em determinadas situaes, se constituir em um arauto que dar aos julgadores uma palavra final. Este no pode, diante dos sagrados interesses da sociedade, negligenciar em sua rea de atuao, e a busca por respostas implica em sempre tentar, sempre questionar, sempre inovar, sempre buscar solues e alternativas, no acreditando nunca nos que divulgam e defendem a expresso: No adianta fazer pois isto no possvel e no vai dar certo. A conduta e a postura de no desistir diante das dificuldades porventura encontradas se afina perfeitamente com a gentica criminal e deve ser seguida e divulgada por todos aqueles que, de alguma forma, esto comprometidos com esta rea da cincia.

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7. CONCLUSO Com base na metodologia empregada e nos resultados obtidos, lcito concluir que: a) As amostras formolizadas : 5% apresentaram mnima degradao do DNA comparada com as amostras de controle. Todas as amostras (100%) foram amplificadas, inclusive o marcador da amelogenina, permitindo a confirmao do gnero (sexo) do titular da amostra. Salienta-se ainda que a validao dos alelos foram realizada com relativa facilidade; 10% apresentaram a degradao do DNA em 100% (40) das amostras. Confirmando, de acordo com o protocolo internacional preconizado pelo programa CODIS do FBI, esta concentrao no serviria para identificar um indivduo. Pois, para assegurar uma identificao humana, se faz necessria uma amplificao mnima de 13 marcadores, resultado este no alcanado. Notou-se tambm que a amelogenina no foi amplificada em seis (15%) amostras analisadas. 20% apresentaram degradao maior que as formolizadas a 5% e 10%, obtevimos uma quantidade de marcadores amplificados inferior ao programa CODIS em 100% (40) das amostras. Portanto, cadveres formolizados 20% so descartados para uma possvel identificao humana. b) O formol tem a propriedade de degradar o DNA, no seu todo ou parcialmente, na dependncia da concentrao de exposio (fixao) a que um determinado tecido submetido;

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c) O formol ainda o produto mais usado universalmente para conservao de cadveres, mediante as tcnicas de formolizao e de embalsamamento, como meio de prevenir e retardar a putrefao. d) De acordo com os resultados obtidos conclumos que o fixador mais adequado o formol a 5% (aldedo frmico), devido ao seu baixo custo, simplicidade de uso e principalmente pela sua ao eficaz na no degradao do tecido humano. e) A atividade pericial voltada para a elucidao de questes referentes ao Direito Penal e ao Processo Penal tem objetivos distintos daquela demandada para fins cveis. Nesse sentido, verificamos a essencial atuao do perito, posto que este, em determinadas situaes, se constituir em um arauto que dar aos julgadores uma palavra final. Este no pode, diante dos sagrados interesses da sociedade, negligenciar em sua rea de atuao, e a busca por respostas implica em sempre tentar, questionar, inovar, buscar solues e alternativas. A conduta e a postura de no desistir diante das dificuldades porventura encontradas se afina perfeitamente com a gentica criminal e deve ser seguida e divulgada por todos aqueles que, de alguma forma, esto comprometidos com esta rea da cincia. Verificamos tambm que, embora exista a Lei 8.501/92 e as "Normas Gerais de Servio previsto para as funerrias, nota-se a falta de padronizao no processo de conservao dos corpos. Sendo assim, caso haja uma necessidade de anlise de DNA, mesmo considerando o formol um agente degradante, a busca por perfis genticos NO dever ser descartada.

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ANEXO 1

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ANEXO 2 EXTRAO DE DNA POR CHELEX- SANGUE (Conforme Walsh,1991) Procedimento 1. Sangue: 3mm2 ou 3l de sangue total Cortar a mancha e coloc-la num tubo de 1,5 mL (com furo na tampa) e adicionar 1 ml de H2O autoclavada. 2. Deixar em temperatura ambiente durante 30 min (agitar ocasionalmente, se amostra fresca, no agitar) 3. Centrifugar por 3 min (10000-150000 x g). 4. Retirar o sobrenadante e elimin-lo, deixar cerca de 30l no tubo.

5. Adicionar 170l de Chelex (Chelating resin 100) a 5%

cortar a ponta da pipeta 6. Colocar os tubos em banho Maria a 56C por 30min 7. Agitar um pouco no vrtex (5 a 10s) 8. Ferver os tubos durante 8 min agulha 9. Agitar um pouco no vrtex (5 a 10s) 10. Centrifugar por 2 a 3 min (10000-15000) Observaes: 1.

no esquecer de

no esquecer de furar os tubos com uma

O chelex contm resina esfrica que precisa ser colocada na soluo das

amostras. O furo nos tubos para permitir sada de vapor, logo impedir abertura dos frascos durante fervura. 2. Aps extrao do DNA dever ser congelado. No deitar os tubos antes do congelamento total do produto extrado.

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Extrao de DNA POR CHELEX Tecido muscular

Procedimentos 1. Descreveu morfologicamente o tecido, verificando a poro que tem melhor aspecto, evitando retirar pores do bordo (podem estar contaminadas) ou com muitas fibras (mais difcil digesto). 2. Corar (fragmentar ao mximo) em condies estreis (sob superfcie estril, com bisturi e pinas estreis) o tecido muscular (ou tero e prstata) e colocar em tubo de 1,5 mL estril devidamente identificado (N da amostra,Tipo de extrao,tempo BM,data e tipo de tecido biolgico). 3. Adicionam-se 600l de Tampo de extrao de Tecido. 4. Colocar as amostras no banho a 56C por 2 horas, por overnight (24horas), ou por 48horas (o tempo melhor a usar depende das condies do material) 5. Aps retirar as amostras do banho, agitar as amostras um pouco no vrtex (5 a 10s) e centrifugar por 3 minutos a 14.000 rpm. 6. Retirar o sobrenadante e coloc-lo em novo tubo adiciona-se 400l de Clorofane a cada tubo. 7. Inverter vigorosamente cada tubo at a soluo ficar com o aspecto leitoso (manualmente ou 30 segundos no Vrtex) 8. Centrifugar 5 min a 14000 rpm. 9. Marcar novos tubos com a mesma identificao. 10. Aps centrifugao observa-se 3 fases distintas, o DNA encontra-se na fase superior. Retira-se esta parte cuidadosamente para o novo tubo respectivo, tendo

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o cuidado de no pipetar a fase protica, pois esta causa inibio da reao de PCR; o precipitado rejeitado. 11. Colocar 600l de ETOH a 100% a frio (o qual deve ser previamente colocado num copo esterilizado e no gelo) em cada amostra + controle (-). 12. Inverter suavemente e uma s vez cada tubo. 13. Colocar as amostras por 30 min a 20C para a precipitao do DNA. 14. Centrifugar inicialmente por 15 min a 14000 rpm para poder observar se h formao de pellet; (Ateno: tubos com ala voltada para o lado de fora da centrfuga para orientao do lado do tubo em que se forma o pellet). 15. Decantar cuidadosamente o etanol. 16. Secar o pellet temperatura ambiente at evaporar todo o etanol (mnimo 12h), colocar os tubos deitados, com a tampa aberta, dentro num armrio fechado e voltados para o lado posterior. 17. Ressuspender as amostras com 25l de H2O desionizada e autoclavada. 18. Agitar e dar um pulso de centrifugao. 19. Colocar no banho Maria a 56C por 30 min.

Notas: 20. No esquecer que fundamental fazer um controle negativo (o qual contm um tampo de Extrao e adicionar proteinase K e DTT-usados na extrao) 21. Na precipitao o ideal para obter DNA genmico humano centrifugar por 10 min a 13000x g 56000 rpm; 22. Aps a extrao o DNA dever ser congelado.No deitar os tubos antes do congelamento total do produto extrado.fazer alquotas da extrao quando for necessrio para evitar contaminao na sala de pr-PCR. 23. Todo o material a ser usado deve ser lavado com hipoclorito e gua MiliQ, autoclavar (esterilizao e secagem) e colocar no mnimo 12h na UV.

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AMPLIFICAO DE STRs AUTOSSMICOS Identifiler

1. Organizar a cmara de fluxo laminar colocando papel, pipetas, ponteiras, becker com saco plstico, tubos de 1,5 ml ou de 0,5 l, tubos 0,2 l marcados com identificao da amostra e gua estril. 2. Ligar a UV e deixar por 10 minutos. 3. Retirar as amostras da geladeira ou freezer (esperar descongelar). 4. Agitar e centrifugar as amostras. 5. Cinco minutos antes de terminar a esterilizao, retirar a Taq Gold e as reaes de PCR da geladeira (Reaction Mix e Primer Set). 6. Agitar. 7. Desligar a UV. 8. Distribuir 6,6 l de gua estril em cada tubo. 9. Pegar as reaes de PCR e a Taq Gold. 10. Preparar MASTER MIX: 11. 12. 13. n x 2,5 l de REACTION MIX n x 0,4 l de TAQ GOLD n x 2,5 l de PRIMER SET

Agitar no Vortex e centrifugar. Distribuir 5,4 l da MASTER MIX Adicionar 1 l da extrao de DNA (Chelex). Volume final = 13 l

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