Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 pgs.

23-34

INMOVILIZACIN MICROBIANA: TECNICAS Y USOS EN EL TRATAMIENTO DE RESIDUOS TXICOS.

Garzn-Jimnez, Catherine Estudiante de Microbiologa Industrial de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia. Barragn-Huerta, Blanca Estela Laboratorio de Residuos Peligrosos. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, Departamento de Ingeniera de Sistemas Ambientales, Instituto Politcnico Nacional.Av. Wilfredo Massieu S/N, Unidad Profesional Adolfo Lpez Mateos Mxico, DF. bbarraga59@yahoo.com

Resumen El uso indiscriminado de sustancias toxicas y su disposicin inadecuada ha generado graves problemas de contaminacin ambiental y daos a la salud. Diversas estrategias han sido diseadas para minimizar el impacto de estas sustancias, incluyndose los procesos fisicoqumicos, fotoqumicos y biolgicos. La gran diversidad de productos qumicos en cuanto a su aplicacin y por ende su estructura qumica ha provocado que sea imposible contar con mtodos simples de tratamiento, por lo que se ha intentado incluso la combinacin de tcnicas para alcanzar los niveles mximos permisibles en normas ambientales o simplemente para reducir la toxicidad de algunos desechos peligrosos. Los procesos biolgicos, que involucran el uso de microorganismos como bacterias, hongos o algas con capacidad para degradar y/o atrapar sustancias toxicas, han sido utilizados para la biorremediacin de sitios contaminados debido principalmente a su bajo costo. La aplicacin de la inmovilizacin en estos microorganismos presenta ciertas ventajas, como son una mayor resistencia a concentraciones altas de compuestos txicos, incremento en la actividad cataltica y la formacin de microambientes necesarios para la degradacin de compuestos recalcitrantes. Palabras clave: Inmovilizacin, desechos txicos, biorremediacin. Abstract The indiscriminate use of toxic substances and its inadequate disposal have generated serious problems of environmental pollution and damages to the health. Several strategies have been designed to reduce the impact of these substances, including the physicochemical, photochemical and biological processes, The great chemical agent diversity as far as its application and therefore its chemical structure has caused that it is impossible to have a simple methods of treatment, for this reason combination of techniques has been tried to even reach the permissible maximum levels in environmental norms or simply to reduce the toxicity of some dangerous wastes. Biological processes, that involves the use of microorganisms like bacteria, fungi or algae which displays the capacity to degrade and/or to catch toxic substances, have been used for bioremediation of polluted places because of their low cost. Application of immobilization of these microorganisms gives some advantages, as they have a greater resistance to high toxic compound concentrations, increase in their catalytic activity and promote the formation of necessary microenvironment for degrading of recalcitrant compound. Keyword: Immobilization, hazardous waste, bioremediation.

23

Inmovilizacin microbiana

Garzn y Barragn

1.

INTRODUCCIN.

2.

INMOVILIZACIN DE MICROORGANISMOS

Los vertimientos de sustancias toxicas al medio ambiente, ha sido una problemtica que desde hace algunas dcadas ha llamado la atencin de organismos gubernamentales. Numerosas tcnicas se han empleado con el fin de minimizar el impacto que estas causan a los ecosistemas. Con el fin de realizar procesos beneficiosos para el medio ambiente, se han implementado soluciones que implican el uso de microorganismos como bacterias, hongos y algas, los cuales tienen la capacidad de atrapar y/o degradar estas sustancias algunas veces hasta su mineralizacin. Algunas de las problemticas que el uso de microorganismos causa, es el crecimiento sin control de estos, o la prdida casi total de la biomasa, as como la susceptibilidad que pueden tener a factores ambientales como temperatura, pH, entre otros; de igual forma pueden tener menor resistencia a la misma sustancia que se quiera degradar (Cohen, 2001)(Korkoutas, et al. 2004). Para minimizar el impacto de estos factores en el desempeo de los sistemas biolgicos y lograr un sistema ms eficiente, se ha impulsado el uso de nuevas tcnicas, entre ellas la inmovilizacin de la biomasa activa. La inmovilizacin celular puede ser definida como la ubicacin fsica de clulas en un espacio o regin especfica, de forma natural o inducida, en la cual son capaces de mantener una actividad cataltica deseada (Karel et al., 1985). Es un evento que se da naturalmente gracias a procesos de adherencia a superficies o a otros microorganismos, debido a estructuras celulares a sustancias que estos mismos segregan. De forma artificial o inducida, puede darse por atrapamiento en los espacios o poros de fibras y geles, entre muchos. (Couto et al., 2004). Bajo muchas condiciones las clulas inmovilizadas tienen ventajas sobre las clulas libres y las enzimas inmovilizadas. El uso de clulas inmovilizadas permite la operacin de birreactores a velocidades de flujo que son independientes de la velocidad de crecimiento empleadas La estabilidad cataltica puede ser mayor para clulas inmovilizadas que para clulas libres y algunos microorganismos inmovilizados toleran concentraciones ms altas de compuestos txicos que su contraparte no inmovilizada (OReilly y Crawford, 1989).

La inmovilizacin de microorganismos ha sido estudiada durantes las ltimas dcadas como la solucin y el mejoramiento de sistemas de tratamiento de aguas, suelos y aires contaminados. Algunos de los aspectos ms importantes considerados en esta tcnica son expuestos a continuacin, as como algunas aplicaciones ambientales. 2.1 Pre-requisitos para lograr una inmovilizacin. Korkoutas y colaboradores (2004) indican que para lograr una inmovilizacin que sea eficaz para el proceso a realizar, se deben tener en cuenta que los espacios que se usarn como soporte de inmovilizacin cumplan con ciertos parmetros tales como la presencia de una superficie de adherencia amplia, que sea de fcil operacin y regeneracin; debe tener buena porosidad con el fin de permitir un intercambio constante de sustratos, productos, gases, etc.; debe tener una buena estabilidad qumica, biolgica, mecnica y trmica, as como resistente a enzimas, solventes cambios de presin. En cuanto a las clulas a inmovilizar, afirman que estas deben ser viables y deben mantener un metabolismo activo por periodos largos, as como su metabolismo no debe verse afectado por los procesos de inmovilizacin. 2.2 Ventajas de la inmovilizacin de clulas. La inmovilizacin de diferentes microorganismos en diversos soportes que van desde los biodegradables como residuos orgnicos o agroindustriales, hasta aquellos de difcil o nula degradacin como plsticos y fibras de vidrio han permitido el inters y el desarrollo de nuevas tecnologas debido a algunas ventajas que presentan como son: Concentracin de biomasa. Actividad metablica Resistencia a la toxicidad 2.2. 1. Concentracin de biomasa. Algunos estudios han demostrado que en ecosistemas acuticos, la concentracin de biomasa inmovilizada es superior a la encontrada en un sistema donde la biomasa se encuentra libre. (Cohen, Y., 2001) Esto posiblemente se deba a que en los sistemas de agua, la biomasa puede ser arrastrada impidiendo que se mantenga o que aumente su concentracin. Sin embargo, Kourkoutas y colaboradores (2004) reportan que en la inmovilizacin de levaduras en perlas de alginato de calcio, la concentracin de

Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 pgs. 23-34

biomasa adicionada no disminuye, pero tampoco aumenta, debido a que las clulas se encuentran atrapadas impidiendo su crecimiento y reproduccin. En la inmovilizacin de microalgas en perlas de alginato, la concentracin de biomasa tambin se ve controlada, esto debido a que el espacio dentro de la perla no permite un aumento en la densidad celular; tambin explican como en este caso, la cantidad de luz que sea capaz de pasar a travs de la perla ser un factor indispensable para el incremento de la biomasa, as como la cantidad de nutrientes disponibles para las micro-algas (Moreno, I., 2008). 2.2.2. Actividad metablica

tenan mayor resistencia que aquellos que no la formaban. Este fenmeno, es atribuido a diferentes razones entre las cuales se encuentran las diferencias fisiolgicas entre los microorganismos inmovilizados y los de crecimiento libre; tambin es atribuido a la concentracin de nutrientes alrededor de la matriz, lo cual permite que los microorganismos sobrevivan a las altas concentraciones de compuestos txicos. Por ltimo, la matriz de exopolisacridos formada por los mismos microorganismos, reduce la difusin de las sustancias txicas hacia el interior de la biopelcula, gracias a la carga neutra o polianinica que puede tener el tipo de exopolisacrido que sea, protegiendo as a los microorganismos que la componen. (Lazarova y Manem 1995) (Naza, J., 2007) 3. TCNICAS DE INMOVILIZACIN DE MICROORGANISMOS. Dependiendo de la forma en que se induce la inmovilizacin, esta se clasifica en: inmovilizacin pasiva e inmovilizacin activa (Moreno, I., 2008) 3.1 Inmovilizacin pasiva Algunos microorganismos de forma natural tienden a formar aglomerados o unirse a superficies y crecer en ellas. Esta interaccin con superficies puede darse por la presencia de estructuras celulares como la cpsula y las fimbrias en el caso de las bacterias, y en el caso de los hongos sus propias hifas. Durante la inmovilizacin pasiva puede darse un proceso de formacin de biofilms el cual tan solo de un 15 25% corresponde a clulas vivas. El porcentaje restante esta compuesto por agua en su mayora, exopolisacridos (EPS), protenas y cidos nucleicos; estos 3 ltimos compuestos son conocidos como sustancias polimricas extracelulares (SPE). Son complejas estructuras, con sistemas de canales de agua y aireacin, los cuales permiten el transporte de nutrientes, desechos, oxgeno, y agua, entre otros. Gracias a estos canales se generan diferentes gradientes de tensin de pH y oxgeno, lo cual permite que se desarrollen micronichos y diversos grupos bacterianos (Korkoutas et al., 2004) La formacin de la biopelcula se da en 4 pasos principalmente (Fig. 1). Durante el primer paso, las clulas perciben una superficie de adherencia y forman una unin activa reversible por medio de fimbrias, apndices, pilis, o protenas de superficie. Durante la segunda fase se produce un incremento de la biomasa celular, formando microcolonias alrededor del rea de adherencia, as como la for25

Varios estudios han demostrado que el metabolismo de las clulas inmovilizadas es mucho mayor en comparacin al presentado por clulas libres (Polprasert et al., 1989) (Angelova et al., 2000) (Navarro y Durand, 1977). El incremento en la actividad metablica, puede deberse a diferentes factores; Madigan y colaboradores (1997), afirman que gracias al incremento de la biomasa en el soporte, as como la concentracin de nutrientes alrededor del soporte, permitirn que se presente este incremento. De igual forma debido a que tanto el soporte como la misma biopelcula que algunos de estos microorganismos forman, atrapan gran parte de los nutrientes y sustancias presentes en el medio, estos estarn ms disponibles para las clulas inmovilizadas, que si estuvieran libres. (Cohen, Y., 2001). Senthilnathan y Ganczarczyk (1990), Lazarova y Manem, (1995) y Cohen (2001) han sugerido que al estar inmovilizados algunos microorganismos pueden encender genes especficos que permiten un incremento en el metabolismo de estos. Se ha reportado que la disminucin del pH al interior de las perlas de alginato de calcio, permite un aumento en el metabolismo celular. La disminucin del pH se debe a que la membrana citoplasmtica incrementa la permeabilidad a protones, permitiendo que se de un consumo superior de ATP, lo cual se ve reflejado en el incremento del metabolismo (Galazzo y Bailey, 1990). 2.2.3. Resistencia a la toxicidad En un estudio reportado por Marrie y Costerton, (1981), en el cual realizaron pruebas con diferentes concentraciones de antispticos, encontraron que aquellos microorganismos que eran capaces de formar algn tipo de aglomeracin o biopelcula,

Inmovilizacin microbiana

Garzn y Barragn

macin de EPS permitiendo que sea una unin irreversible. La composicin del exopolisacrido puede variar segn el tipo de microorganismo o las condiciones ambientales, los principales componentes son alginato, N-acetil-glucosa-mina, glucosa, y galactosa. Durante el tercer paso, la biopelcula crece y madura, permitiendo la adhesin de nuevas colonias bacterianas. Luego de la maduracin, se da el ltimo paso, en el cual clulas individuales o conglomerados se desprenden de la biopelcula por erosin, abrasin o separacin para formar nuevos conglomerados. (Nazar, J., 2007)

niana, Porphyridium cruentrum, Penicillium cyclopium, Funalia trogii, entre muchos, en la remocin de diversas sustancias txicas como metales, colorantes, sustancias cloradas, entre otras. (Mazmanci y nyayar, 2005) Mazamanci y colaboradores (2005) reportan que al inmovilizar Funalia trogii en estropajo, y adicionarla una vez inmovilizada a una solucin con el colorante Negro Reactivo 5, este fue degradado hasta un 99% luego de 4 das, sin necesidad de adicionarle ninguna fuente de carbono o nitrgeno adicional. Igualmente estudios realizados por Pattanasupong y colaboradores (2004), reportan el uso de este mismo soporte, as como el uso de fibras de coco para la inmovilizacin de un consorcio bacteriano, el cual fue utilizado para la degradacin de el fungicida Carbendazim (metil-2-benzimidazol carbamato; MBC). En este estudio se encontr que despus de 4 das de cultivo se logr obtener una degradacin del 95 y 80% del MBC, en cada uno de los soportes respectivamente; un porcentaje de degradacin muy superior al obtenido por el consorcio bacteriano en crecimiento libre, el cual fue de tan solo un 12%.

Fig. 1 Formacin de biopelculas. Modificado de http://prometheus.mse.uiuc.edu/glossary/biofilms/ Gracias al mecanismo de quorum-sensing, se da una sealizacin al interior de biopelcula, permitiendo que se mantengan las condiciones dentro de la misma. Esta sealizacin se da mediante oligopptidos y acil-homoserina-lactonas. (Nazar, J., 2007) Este tipo de inmovilizacin ha sido usada en muchos ensayos en diferentes tipos de matrices tanto naturales como sintticas. Germeiner y colaboradores (1994), demostraron que los matrices orgnicos tienen mayor adsorcin de la que pueden brindar las matrices sintticas. Esto se debe a que los materiales orgnicos tienen mayor cantidad de grupos radicales como amino, carboxil, entre otros; as como una mayor cantidad de nutrientes, lo cual permite una adherencia y crecimiento ms eficaz. (Cohen, Y., 2001) El estropajo, es una fibra vegetal proveniente del fruto de la Luffa, esta fibra es obtenida una vez se ha secado el fruto y se ha retirado el pericarpio del fruto (Fig. 2). El no ser txico, ni reactivo, as como su bajo costo, permite que sea usado ampliamente en la inmovilizacin de microorganismos como Chlorella soroki-

Fig. 2 Esponja vegetal o estropajo (Luffa cilndrica). http://cgi.ebay.it/LUFFA-CILINDRICA Castillo y Gonzlez (2007), reportan que al inmovilizar la biomasa de Trametes versicolor en este mismo soporte, luego de cuatro das de exposicin a una solucin del colorante Negro Reactivo 5, se logr una decoloracin del 92% y genera una remocin de 69.27% luego de tres ciclos repetitivos durante 12 das. Akhtar y colaboradores, (2004) reportan el uso de el estropajo como soporte de inmovilizacin para Chlorella sorokiniana, en la remocin del Niquel (II) de soluciones acuosas, demostrando una efecti-

Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 pgs. 23-34

vidad superior a la mostrada por las clulas libres en un 25%, luego de 20 minutos de exposicin. Asimismo, se ha utilizado la fibra de Agave tequilana Weber en la inmovilizacin de hongos y bacterias (Garzn , 2008) para la degradacin de colorantes textiles de diferentes clases qumicas (Fig. 3).

Zn(II) de una solucin acuosa, donde luego de una hora removi 66.17mg/g del metal, un 41.93% mas que lo removido por el hongo en crecimiento libre; luego de un proceso de desercin se pudo recuperar un 99%, lo cual permiti la reutilizacin del soporte y el microorganismo inmovilizado. Otra aplicacin que puede darse para la biomasa inmovilizada en fibras naturales, es en la utilizacin de esta en reactores de lecho empacado, en donde las matrices con biomasa inmovilizada es usada para la degradacin de sustancias txicas como clorofenoles. En investigaciones realizadas, se reporta el uso de cubos de madera para la inmovilizacin de hongos de podredumbre blanca como Phanerochaete chrysosporium, donde el 4-clorofenol, fue degradado en un rango de 71.1 83 % en condiciones de ausencia de fuente de Carbono y Nitrgeno adicional. (Jin, et al., 1998) En cuanto a materiales sintticos diversos estudios han demostrado el uso efectivo de diversos materiales (Fig. 5) como vidrio o cermicas porosas en algunos casos es adicionado Fe+3 , o ser tratados con policationes, quitosan u otros qumicos con el fin de facilitar la colonizacin del soporte (Cohen, Y., 2001).

Fig. 3 Microscopa de barrido electrnico para la inmovilizacin de Klebsiella sp sobre fibra de Agave tequilana Weber. A 2000x. En la degradacin de pesticidas como el DDT, Barragn y colaboradores (2007) reportan el uso de granos de caf como matriz de inmovilizacin de diferentes grupos bacterianos, los cuales crean micronichos microaeroflicos y anaerobios dentro de los poros del caf, permitiendo as la degradacin total del DDT al no producirse intermediarios como el DDD y el DDE (Fig. 4).

5m

Fig. 5 Materiales diversos utilizados en la inmovilizacin de biomasa. Daz y colaboradores (2002), luego de realizar un estudio sobre la degradacin de petrleo por un consorcio de bacterias halotolerantes inmovilizadas en fibras de polipropileno, reportaron que el consorcio fue ms efectivo estando inmovilizado, debido a la estabilidad brindada por el soporte y a que sus propiedades fsicas permitieron un mayor aprovechamiento del petrleo. Tambin reportan como la estabilidad del soporte o del consorcio no se vio afectada pese a las condiciones de salinidad a las que fueron sometidos.

Fig 4. Microfotografia mostrando la colonizacin bacteriana en los poros del grano verde de caf. En el estudio realizado por Iqbal y Saeed (2006), Phanerochaete chrysosporium fue inmovilizado en fibra de madera de papaya, con el fin de remover

27

Inmovilizacin microbiana

Garzn y Barragn

compuestos luego de cuatro das de contacto de la solucin contaminada con la biomasa inmovilizada. Wang y Li, (2007) reportaba el uso de carbn activado y de una membrana de un polmeto con el fin de inmovilizar una cepa aislada de suelo contaminado, Pseudomonas putida. Se utiliz en un reactor, en el cual se puso en contacto con el medio y contaminado con fenol. Luego de 24 horas el fenol fue removido y se demostr que dicho proceso se haba dado en cuatro pasos. Adsorcin por el soporte, remocin por biodegradacin y por absorcin de las membranas celulares, biodegradacin por parte de las clulas inmovilizadas y las clulas en suspensin, y por ltimo la bio-regeneracin, donde la concentracin de biomasa en el reactor aument. La degradacin de fenoles fue superior al adicionar el carbn activado granular, esto debido a que el carbn activado aumento la capacidad de sorcin de el fenol, as como facilito el transporte de este hacia las clulas. Mileva y colaboradores, (2008) reportan el uso de carbn activado para la inmovilizacin de Klebsiella oxytoca 8391, en la biodegradacin de 1,2dicloroetano. Se reporta como la inmovilizacin de K. oxytoca 8391 en carbon activado, aumenta notablemente la biodegradacin del compuesto txico, as como brinda una mayor proteccin a el microorganismo frente a las concentraciones txicas de este mismo compuesto. Igualmente gracias al modelo matemtico creado y probado en este estudio, demuestran que la liberacin de clulas inmovilizadas es mnima y stas no realizan biodegradacin del 1,2-dicloroetano. El carbn activado tambin ha sido usado en biodegradacin de fenoles a concentraciones de 0.2, 0.4, y 0.6 g/L en aguas residuales. La degradacin mxima fue realizada por Pseudomonas pictorum, quin produjo un porcentaje de degradacin de 95.2%, a un pH de 7.6, una concentracin de carbn de 1.12g/L, y una concentracin de fenol de 0.229 g/L; este resultado se mantuvo constante, demostrando que P. pictorum inmovilizada es capaz de mantener un alto nivel de degradacin durante un largo tiempo de colonizacin. (Annadurai, et al., 2000) Al realizar tratamiento de residuos en plantas de tratamiento industriales, uno de los mtodos ms implementado es el uso de digestores anaerobios; sin embargo para que sea un proceso realmente efectivo, es necesario mantener constante una alta concentracin de biomasa. Dadas estas circunstancias, Garca y colaboradores (1997), realizaron un estudio donde se evalu la efectividad de las perlas de vidrio poroso (SIRAN) en un reactor de lecho fijo, usado a condiciones termoflicas, para la degradacin de las vinazas del vino. Luego del estu-

Fig. 6 Microscopa de barrido electrnico para la inmovilizacin pasiva de T. versicolor en espuma de poliuretano a 200x. (Castillo & Gonzlez, 2007) Fava y colaboradores (1996), informan los resultados obtenidos al inmovilizar un consorcio bacteriano identificado como ECO3, en tres diferentes soportes de inmovilizacin, los cuales fueron perlas de vidrio, perlas de slice, y cubos de poliuretano, con el fin de observar la declorinacin de bifenilos poco clorados. Terminado el estudio demostraron que la declorinacin y degradacion de PCB increment al inmovilizar el consorcio ECO3. De igual forma se demostr que la biomasa inmovilizada en perlas de slice tiene mayor capacidad de declorinacin que la inmovilizada en vidrio y poliuretano; as como tienen mayor capacidad de reduccin del PCB que el poliuretano pero la misma capacidad que las perlas de vidrio. Sin embargo la mayor concentracin de biomasa fue inmovilizada por las perlas de vidrio, seguida por las perlas de slice y los cubos de poliuretano, respectivamente; indicando que la cantidad de biomasa inmovilizada no tena una relacin directa con la degradacin y declorinacin del PCB. El poliuretano al igual que el polivinil, son materiales ampliamente usados en la inmovilizacin de microorganismos gracias a su resistencia a condiciones ambientales diferentes (Fig. 6). Se ha reportado el uso de estas sustancias en la inmovilizacin de Scenedesmus obliquus para la remocin de metales en agua (Urrutia, et al., 1995). Yamaguchi y colaboradores (1999) igualmente reportan el uso de espuma de poliuretano en la inmovilizacin de Prototheca zopfii, en la degradacin de hidrocarburos. La espuma de polivinil fue usada por Doronina y colaboradores, (2006) en la inmovilizacin de Pseudomonas esterophilus, para la biodegradacin de 510 ppm de etilacetato y 520 ppm de metilacetato, logrando una degradacin del 100% de los dos

Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 pgs. 23-34

dio llegaron a la conclusin de que gracias a las caractersticas del soporte como los diferentes tamaos de poro que presenta, as como su amplia superficie favorecen la adhesin del microorganismo al soporte. Observaron que durante la colonizacin de este soporte, sin importar el microorganismo, se diferencia claramente tres pasos: una fase de latencia, una de formacin de la biopelcula, y una final de estabilizacin de la biopelcula. Sin embargo al presentarse un sistema de alimentacin por cargas la fase de latencia inicial se ve reducida a unas pocas horas y facilita la estabilizacin de la poblacin bacteriana, logrando que la biomasa llegue a una concentracin del 93% de los slidos voltiles al finalizar el proceso; este valor supera la inmovilizacin lograda en procesos de inmovilizacin en (GAC) carbn activado granular reportados por Fox (1990). Adicionalmente afirman que la colonizacin del soporte se dar de las partes ms internas como grietas y poros, hacia la superficie; este proceso puede darse gracias a que estas irregularidades de la superficie proporcionan proteccin a los microorganismos facilitando la adhesin inicial de estos al soporte. Reportes similares sobre la forma de colonizacin de los soportes, fueron dados por Barragn y colaboradores (2007a) donde indica, como la colonizacin sobre GAC se dio desde la parte interna hacia la externa facilitando la creacin de microambientes anaerbicos (que facilitaron la degradacin de colorantes textiles hasta su mineralizacin, al darse ambientes aerobios y anaerobios en el mismo soporte.

ros naturales o sintticos, y el uso de agentes floculantes. (Moreno-Garrido, 2008). Los agentes floculantes se usaron inicialmente con el fin de sedimentar partculas suspendidas, evitando as el uso de tcnicas como la centrifugacin. Actualmente pueden usarse con el fin de permitir que clulas que por su naturaleza propia no tienden a aglomerarse, lo hagan, permitiendo as el atrapamiento de otras sustancias suspendidas en el medio (Kourkoutas, et al., 2004). En cuanto a agentes floculantes, el quitosano ha sido, por excelencia, el compuesto ms usado (Moreno-Garrido, 2008). El quitosano (Fig 8), es un polisacrido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de -(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas) y N-acetil-D-glucosamina\ (unidad acetilada), el cual es extrado de la quitina. Posee una carga positiva, y es soluble e medios cidos. (Kean, et al., 2005)

Fig. 8 Estructura qumica de la Quitina y del Quitosano. http://www.tecsup.edu.pe/webuds/web/publicacion/ publicacion7/index.htm Presenta grupos aminos cargados positivamente, los cuales le permiten tener una alta afinidad por partculas cargadas negativamente. Es un medio comnmente usado en bio-remediacin de aguas residuales con altos contenidos de metales a travs de la inmovilizacin de algas (Moreno-Garrido, 2008). Este tipo de inmovilizacin es muy variable, factores como composicin de la pared celular, pH, oxgeno disuelto y la composicin del medio, puede hacer que la cantidad de clulas cambie. Fig 7. Crecimiento de Pseudomonas sp dentro de los poros de carbn activado a 10, 000x (Barragn, 2004). 3.2 Inmovilizacin activa Dentro de las tcnicas de inmovilizacin activa, o inmovilizacin artificial pueden distinguirse el ataque qumico, atrapamiento en geles de polmeEl atrapamiento en una matriz porosa, es uno de los procesos ms utilizados. Este puede darse en polmeros sintticos (resinas, acrillamidas, poliuretanos), protenas (gelatina, colgeno, albmina de huevo), o polisacridos naturales (agares, carragrenanos o alginatos) (Moreno-Garrido, 2008). Consiste en la inmovilizacin de clulas dentro de una matriz, la cual impide la difusin de las clulas en 29

Inmovilizacin microbiana

Garzn y Barragn

el medio, pero permite el paso de metabolitos y nutrientes (Kourkoutas, et al., 2004). El procedimiento general para el atrapamiento de las molculas en gotas de polmeros, consiste es suspender el microorganismo a inmovilizar en una solucin lquida que contiene los monmeros de la macromolcula. Para la gelificacin de esta mezcla se usan diferentes mtodos de acuerdo a la naturaleza del polmero a usar. Entre los mtodos a usar se encuentran la disminucin o aumento de temperatura, la gelificacin ionotrpica de macro-molculas con cationes multivalentes, y otros mtodos qumicos como la adicin de las gotas a un buffer enfriado en hielo o en diferentes soluciones qumicas (Cohen, Y., 2001). Este tipo de inmovilizacin, puede tener como problema que las clulas libres del medio se ubiquen sobre la superficie de la esfera y degraden esta permitiendo la liberacin de la biomasa inmovilizada. Para solucionar este problema, se ha implementado el uso de esferas de gel con un ncleo interno que contiene las clulas inmovilizadas (Fig. 9) y una capa externa protectora que impide su liberacin. (Ramon-Portugal et al., 2003) (Kourkoutas, et al., 2004). Algunas de las ventajas que ofrece este tipo de inmovilizacin, es que permite la inmovilizacin de una alta concentracin de biomasa, ofrece una alta resistencia a sustancias txicas presentes en el medio, permite la inmovilizacin de diferentes especies de microorganismos, separados fsicamente unos de otros, entre muchos (Cohen, Y., 2001). La inmovilizacin de clulas en este tipo de matrices ha sido ampliamente aplicada en biorremediacin (Tabla 1).

lizacin de una cepa de Pseudomonas putida MTCC1194, para la biodegradacin de fenol. Chitiva y colaboradores (2003), tambin reportan el uso de Pseudomonas spp., en la biodegradacin del fenol. Como matrices de inmovilizacin se usaron polmeros de poliuretano (inmovilizacin pasiva), alginato y una mezcla con alginato y alcohol polivinlico (inmovilizacin activa); estos se compararon entre s y contra un cultivo de clulas libres. Gracias a la adicin de un polmero con grupos OH- en el gel de alginato, y a su interaccin con los grupos amino de la pared celular del microorganismo, se permiti una mayor concentracin celular e esta matriz, pero la degradacin de fenol no se vio aumentada lo cual indica que la concentracin de biomasa, no es proporcional a la biodegradacin la cual fue de 100% para todos los matrices. Las perlas de alginato han sido reportadas en la inmovilizacin de Pseudomonas sp., para la degradacin de p-Cresol (Oreilly, et al. 1989), de etilbenceno (Parameswarappa, et al., 2008). La inmovilizacin de Pseudomonas luteola fue estudiada por Chang y colaboradores (2001), en la degradacin del colorante Rojo reactivo 22. P. luteola, fue inmovilizada en tres diferentes matrices, Alginato de calcio (CA), -carragenano (CGN) y poliacrilamida (PAA). En comparacin con las clulas libres, las clulas de P.luteola inmovilizadas tienen mayor resistencia a las variaciones de pH y oxgeno disuelto presentando adems una mayor estabilidad al ser usadas durante varios ciclos de decoloracin. Pese a que se presenta una buena decoloracin en el tratamiento realizado con clulas inmovilizadas en alginato de calcio y -carragenano, la inmovilizacin en poliacrilamida, es mejor que en clulas libres, alginato de calcio y -carragenano. Pseudomonas putida, inmovilizada en alginato de calcio, carragenano y agar; fue usada en la biodegradacin de cianidas, cianatos y tiocianatos de amonio y dixido de carbono, producidas en la minera y extraccin de metales. El mejor ndice de biodegradacin, fue reportado por las clulas de P.putida inmovilizadas en alginato de calcio, mineralizndose los compuestos hasta NH3 y CO2. (Chapatwala, et al., 1998).

Fig. 9 Modelo de inmovilizacin en matriz porosa. Blanco y colaboradores (1999), describen el uso de un polmetro sinttico, el polisulfano, y una resina epxica, para la inmovilizacin de clulas de Phormidium laminosum, una cianobacteria con la capacidad de absorber metales pesados como Cu (II), Ni (II) y Zn (II). Bandhyopadhyay y colaboradores (1999), reportan el uso de gotas de alginato de calcio, en la inmovi-

Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 pgs. 23-34

Tabla 1. Comparacin entre polmeros naturales (Carrageno y alginato) y polmeros sintticos (PVA, polietilen glicol (PEG) y policarbomil sulfato (PCS)) usados en la inmovilizacin microbiana, aplicado en el tratamiento de aguas residuales domsticas. ( Modificado de Llenen, et al., 1996)
Polmetros naturales Carragenano Alto Posible Bajo Muy bueno Bueno Simple Ca -alginato Alto Posible Bajo Muy bueno Bueno Simple PVA Bajo/nulo Bajo Alto Bueno Moderado Laborioso Polmeros sintticos PCS Bajo/nulo Bajo Alto Moderado Moderado Laborioso PEG Bajo/nulo Bajo Medio -Bueno Laborioso

Caractersticas Solubilidad Biodegradabilidad Estabilidad Difusibilidad Crecimiento Proceso de inmovilizacin

Las gotas de alginato de calcio, tambin pueden ser utilizadas en la inmovilizacin de cepas fngicas. Domnguez y colaboradores (2005) reportan el uso de esta matriz en la inmovilizacin de Trametes versicolor, para la decoloracin de colorantes sintticos textiles. Los resultados obtenidos indican que luego de 40 das de operacin de la biomasa inmovilizada en un reactor, las bio-partculas mantuvieron su forma y consistencia y no presentaron problemas de operacin. Igualmente reportaron altos porcentajes de decoloracin en un tan solo 24 horas, 96% para ndigo y 69% para rojo de fenol. Ramsey y colaboradores usan este mismo tratamiento en la remocin de Amaranto, Negro Reactivo 5, Azul Reactivo 19 y Negro Directo 22, donde la decoloracin de las soluciones con estos compuestos fue casi completa; sin embargo notaron que las perlas que fueron colonizadas podan fracturase fcilmente. Otro polmetro usado para la inmovilizacin de microorganismos por atrapamiento, es el agar. El agar puede ser usado en esferas o en fibras. Un consorcio de microorganismos conformado por un grupo bacteriano oxidador del fenol, Methanothrix y un microorganismo metanognico degradador de H2 fueron inmovilizados en filamentos delgados de agar, previamente tratados con CO2 y N2 para hacer anaerbica la matriz. Luego de tratar una solucin que contena una concentracin de fenol, durante un mes, este fue convertido en CH4 y CO2. La inmovilizacin protegi el consorcio de la toxicidad que altas concentraciones de fenol pueden producir; de esta forma concentraciones de 500g/mL disminuy la tasa de

degradacin de los microorganismos en crecimiento libre, pero una concentracin de 1000 g/mL logr disminuir la tasa de degradacin del fenol en microorganismos inmovilizados. Una concentracin de 2000 g/mL logr inhibir totalmente la degradacin por parte de las clulas libres, pero las clulas inmovilizadas aun a esa concentracin presentaban un alto ndice de degradacin. (Dwyer, et al., 1986). Gardin y colaboradores, (2001) reportan la coinmovilizacin muy efectiva de microorganismos aerobios y anaerobios, en perlas de gel de carragenano/gelatina (2%p/p), para la degradacin de 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP). El tratamiento se dio en un reactor USB, en anaerobiosis, donde se controlaron las condiciones de temperatura y pH, entre otros. El 2,4,6-TCP fue degradado a 2,4-DCP y 4-CP. Las concentraciones residuales de este ltimo, causaban la inhibicin de una mineralizacin completa. En otro estudio realizado por Kabaivanova y colaboradores (2008), son utilizadas perlas de agar como matriz para inmovilizar una cepa de Bacillus sp. termfila, con la cual lograron la degradacin de nitrilos, producidas por industrias petro-qumicas. Se logr una degradacin del 93% de la 4cianopirimidina, a altas temperaturas, a travs de una nitrilasa termoestable, demostrando la efectividad de este mtodo de inmovilizacin para el tratamiento de aguas residuales provenientes de las industrias petroqumicas. Otros numerosos estudios han sido realizados para la biodegradacin de sustancias txicas por mtodos de atrapamiento en geles. Por ejemplo el uso de geles de poliacrilamida, alginato y agar para la inmovilizacin de clulas de Pseudomonas sp. en la degradacin de naftaleno (Karegoudar, et al., 1998), o la biodegradacin de pireno y fenantreno, por medio de Fusarium sp. inmovilizado en polivinil y alginato (Li, et al., 2005). 31

Inmovilizacin microbiana

Garzn y Barragn

El uso de matrices de inmovilizacin se ha convertido en una solucin a problemas de toxicidad de sustancias, al proteger a los microorganismos degradadores por medio de geles, ha mejorado la tasa de degradacin al hacer esta ms rpida, incrementando el metabolismo de las clulas inmovilizadas; ha disminuido la prdida de biomasa al permitir la adhesin o atrapamiento no reversible de sta: son estas razones principalmente las que han permitido que cada da sea incrementado el uso de estas tcnicas no solo en la biorremediacin, sino tambin en diversos procesos ambientales e industriales, incentivando el estudio y trabajo de los mismos. El uso de residuos agroindustriales en este proceso ofrece ciertas ventaja sobre soportes convencionales, ya que al ser materiales de desecho son economicos, se promueve el uso sustentable del recurso y pueden servir adems como fuente de nutrientes a los microorganismos inmovilizados, incrementar en algunos casos su actividad cataltica o la produccin de enzimas especificas.

REFERENCIAS Akhtar, N., Iqbal, J., Iqbal, M., (2004), Removal and recovery of nickel (II) from aqueous solution by Loofa sponge immobilized biomass of Chlorella sorokiniana characterization studies. J. Hazard. Mater. 94: 108, 85. Angelova, M.B., Pashova, S.B., Slokoska, K.S. (2000), Comparison of antioxidant enzyme biosynthesis by free and immobilized Aspergillus niger cells. Enzyme Microbiology Technology. 26: 544549. Annadurai, G., Mathalai Balan, S., Murugesan, T. (2000). Design of experiments in the biodegradation of phenol using immobilized Pseudomonas pictorum (NICM-2077) on activated carbon. Bioprocess Engineering. 22: 101-107. Bandhyopadhyay, K., Das, D., Maiti, B. (1999). Solid matrix characterization of immobilized Pseudomonas putida MTCC 1194 used for phenol degradation. Applied Microbiology Biotechnology. 51: 891-895. Barragn-Huerta B. E. (2004). Degradacin de colorantes textiles por cultivos bacterianos. Tesis para optar por el Grado de Salamanca. Universidad de Salamanca, Salamanca, Espaa. Barragn B.E. (2006). Aportacin de los microorganismos asociados al grano verde de caf en la degradacin de plaguicidas organoclorados y su relacin con la capacidad de adsorcin del grano. Tesis doctoral. CINVESTAV. Mxico. Barragn, B.E., Costa C., Mrquez. 2007a. Biodegradation of azo dyes by bacteria inoculated on solid media. Dyes and pigments 75:7381 Barragn, B., Costa, C., Peralta, J., Barrera, J., Esperanza, F., Rodrguez, R. (2007b). Bio-

degradation of organochlorine ppesticides by bacteria grown in microniches of the porous structure of green bean coffee. International Biodeterioration & Biodegradation. 59: 239-244. Blanco, A., Sanz, B., Llama, M.J., Serra, J.L. (1999), Biosorption of heavy metals to immobilized Phormidium laminosum biomass. Journal of Biotechnology. 69: 227240. Castillo, L., Gonzlez, K. (2007), Evaluacin de tres soportes de inmovilizacin y dos condiciones nutricionales para Trametes versicolor en la remocin del colorante Negro Reactivo 5 en columna de burbujeo. Trabajo de grado para obtener el titulo de Microbilogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot-Colombia. Chang, J., Chien Ch., Shan-Yu Ch. (2001). Decolorization of azo dyes with immobilized Pseudomonas luteola. Process Biochemistry. 35: 757763. Chapatwala, K., Babu, G., Vijaya, O., Kumar, K., Wolfram, J. (1998). Biodegradation of cyanides, cyanates and thiocyanates to ammonia and carbon dioxide by immobilized cells of Pseudomonas putida. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 20: 28-33. Chitiva, L., Dussn, J. (2003). Evaluacin de matrices para la inmovilizacin de Pseudomonas spp. En biorremediacin de fenol. Revista colombiana de biotecnologa. 2: 5-10. Cohen, Y. (2001). Biofiltration - the treatment of fuids by microorganisms immobilized into the filter bedding material: a review. Bioresource Technology. 77: 257-274 Couto, S., Toca, J. (2006) Industrial and biotechnological application of laccases: A review. Biotechnology advances, 24: 500-513. Diaz, M.P., Boyd, K., Grigson, S., Burgus, J. (2002), Biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotolerant bacterial consortium MPD-M, immobilized onto polypropylene fibers. Biotechnology and Bioengineering. 79: 145-153. Domnguez, A., Couto, S., Sanromn, Ma. (2005). Dye decolorization by Trametes hirsuta immobilized into alginate vedas. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 21:405409 Doronina, N., Nazarov, N., Ezhov, V., Trotsenko, Y. (2006). Biodegradation of Methyl and Ethyl Acetates by Immobilized Pseudomonas esterophilus Cells. Applied Biochemistry and Microbiology. 42(1):45-47 Dwyer, D., Krumme, M., Boyd, S., Tiedje, J. (1986). Kinetics of phenol biodegegradation by an immobilized methanogenic consortium. Applied and environmental microbiology. 52(2): 345-351 Fava, F., Di Gioia, D., Marchetti, L., Quattroni, G. (1996), Aerobic dechlorination of low_chlorinated biphenils by bacterial biofilms in packed-bed bath bioreactors. Applied Microbiology & Biotechnology. 45: 562-568.

Revista Sistemas Ambientales, Vol. 2, No 1, 2008 pgs. 23-34

Fox P., Suidan M.T., Bandy J.T. (1990). A comparison of media types in acetate fed expandedbed anaerobic reactors, Water Research. 24 (7): 827-835. Galazzo, J., Bailey, J. (1990), Growing Saccharomyces cerevisiae in calcium-alginate beads induces cell alterations, which accelerate glucose conversion to ethanol. Biotechnology & Bioengineering. 36: 417426. Garca, M., Romero, L., Sales, D. (1997). Inmovilizacin de biomasa anaerobia termoflica en soportes porosos. Ingeniera del agua. 4 (3): 11-16 Gardin, H., Lebeault, J., Pauss, A. (2001) Degradation of 2,4,6-trichlorophenol (2,4,6-TCP) by co-immobilization of anaerobic and aerobic microbial communities in an upflow reactor under air-limited conditions. Applied Microbiology Biotechnology. 56: 524-530. Garzn-Jimenez R.C. 2008. Cintica de degradacin de colorantes textiles de diferentes clases qumicas por hongos y bacterias inmovilizados sobre fibra de Agave tequilana webber. Trabajo de grado para obtener el ttulo de Microbilogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia. Gemeiner, P., Rexova, L., Svec, F., Norrlow, O. (1994), Natural and synthetic carriers suitable for immobilization of viable cells, active organelles and molecules. In: Cohen, Y. (2001). Bioresource Technology. 77 : 257-274 Iqbal, M., Sabed, A. (2006). Entrapment of fungal hyphae in structural fibrous network of papaya wood to produce a unique biosorbent for the removal of heavy metals. Enzyme and Microbial Technology. 39: 996-1001. Jin, K., Peirce, J. (1998) Biodegradation kinetics of chlorophenols in immobilized-cell reactors using a white-rot fungus on wood chips. Water Environment Research. 70(2): 205-213. Kabaivanova, L., Dimitrov, P., Boyadzhieva, I., Engibarov, S., Dobreva, E., Emanuilova, E. (2008). Nitrile degradation by free and immobilized cells of the thermophile Bacillus sp. UG-5B, isolated from polluted industrial waters. World Journal of Microbiology and Biotechnology. Karegoudar, T., Manohar, S. (1998) Degradation of naphthalene by cells of Pseudomonas sp. Strain NGK 1 immobilized in alginate, agar and polyacrylamide. Applied Microbiology Biotechnology 49: 785-792 Karel, S., Libicki, S., Robertson, C. (1985). The immobilization of whole cellsengineering principles. Chemical Engineering Science. 40, 13211354. Kean T, Roth S, Thanou M (2005), Trimethylated chitosans as non-viral gene delivery vectors: cytotoxicity and transfection efficiency. Journal of Control Release 103 (3): 643-53. Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I., Marchant, R., Koutinas, A. (2004). Immobilization

technologies and support materials suitable inalcohol beverages production: a review. Food Microbiology. 21 : 377-397. Lazarova, V., Manem, J. (1995), Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment. Water Research. 29(10): 2227-2245. Li, P., Li, H., Stagnitti, F., Wang,X., Zhang,H., Gong, Z., Liu, W., Xiong, X., Li, L., Austin, C., Barry, D. (2005) Biodegradation of Pyrene and Phenanthrene in Soil Using Immobilized Fungi Fusarium sp. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 75: 443-450. Leenen, E.J.T.M, dos Santos, V.A.P., Grolle, K.C.F, Tramper, J., Wijffels, R.H. (1996). Characteristics of and selection criteria for support materials for cell immobilization in wastewater treatment. Water Research. 30: (12), 2985-2996. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (1997), Brock, Biology of Microorganisms, eighth ed. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ. Marrie, T., Costerton, J. (1981). Prolonged survival of Serratia marcescens in chlorhexidine. Applied and Environmental. Microbiology. 42:1093 .Mazmanci, M., nyayar, A. (2005), Decolourisation of reactive black 5 by Funalia trogii immobilised on Luffa cylindrical sponge. Process Biochemistry. 40 : 337-342. Mileva A., Sapundzhiev, Ts., Beschkov, V. (2008). Modeling 1,2-dichloroethane biodegradation by Klebsiella oxytocava 8391 immobilized on granulated activated carbon. Bioprocess Biosystem Engineering. 31: 75-85. Moreno, I. (2008) Microalgae immobilization: Current techniques and uses. Bioresource technology. 99:3949-3964. Navarro, J., Durand, G. (1977). Modification of yeast metabolism by immobilization on to porous glass. Journal of Applied Microbiology. 4: 243254. Nazar, J. (2007). Biofilms bacterianos. Revista de otorrinolaringologa. 67:61-72. Oreilly, K., Crawford, R. (1989). Kinetics of p-Cresol degradation by an immobilized Pseudomonas sp. Applied and Environmental Microbiology. 55(4): 866-870. Parameswarappa, S., Chandrakant, K., Nagenahalli, M. (2008) Degradation of ethylbenzene by free and immobilized Pseudomonas fluorescensCS2. Biodegradation. 19: 137-144 Pattanasupong, A., Naimogase, H., Sugimoto, E., Hori, Y., Hirata, K., Tani, K., Nasu, M., Miyamoto, K. (2004), Degradation of Carbendazim and 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid by immobilized consortium on Loofa sponge. Journal of Bioscience and Bioengineering. 98(1): 28-33. Polprasert, C., 1989. Organic Waste Recycling. Wiley, New York. In Cohen, Y. (2001) Bioresource Technology. 77: 257-274

33

Inmovilizacin microbiana

Garzn y Barragn

Ramon-Portugal, F., Silva, S., Taillandier, P., Strehaiano, P. (2003) Immobilized yeasts: actual oenologic utilizations. Wine Internet Technical Journal. (www.vinidea.net). Ramsey, J., Mok, W.H.W., Luu, Y.-S., Savage, M. (2005) Decoloration of textile dyes by Alginate-immobilized Trametes versicolor. Chemosphere, 61: 956-964. Senthilnathan, P., Ganczarczyk, J. (1990), Application of biomasa carriers in activated sludge process. In Cohen, Y. (2001) Bioresource Technology. 77: 257-274 Urrutia, I., Serra, J., Llama, M. (1995), Nitrate removal from water by Scenedesmus obliquus immobilizes in polymeric foams. Enzyme Microbiology Technology. 17: 200205. Wang, C., Li, Y. (2007). Incorporation of granular activated carbon in an immobilized membrane bioreactor for the biodegradation of phenol by Pseudomonas putida. Biotechnology letters. 29: 1353-1356. Yamaguchi, T., Ishida, M., Suzuki, T. (1999), An immobilized cell system in polyurethane foam for the lipophilic micro-alga Prototheca zopfii. Process Biochemical. 34: 167171. Paginas electrnicas consultadas: http://prometheus.mse.uiuc.edu/glossary/biofilms/ http://www.tecsup.edu.pe/webuds/web/publicacion/ publicacion7/index.htm. http://cgi.ebay.it/LUFFA-CILINDRICA