Crioprese

UNIVERSIDAD DE MURCIA
FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Biologa Animal Ctedra de Fisiologa Animal
ESTUDIO DE DIFERENTES FACTORES QUE AFECTAN A LA CALIDAD Y CAPACIDAD FECUNDANTE DE LOS ESPERMATOZOIDES CRIOCONSERVADOS EN LA ESPECIE PORCINA
ELENA SELLS SORIANO MURCIA, DICIEMBRE DE 2.001
AGRADECIMIENTOS
A Salvador Ruiz Lpez por pemitirme trabajar en este gran equipo y por su enorme apoyo en el desarrollo de este trabajo. A Joaqun Gadea Mateos por su valiosa ayuda en la parte experimental y en el anlisis estadstico. A los dos por esa gran direccin. A Pilar Coy Fuster y Carmen Mats Parra, porque siempre han estado ah para cualquier situacin. A Rakel Romar Andrs por sus grandes consejos y buen compaerismo. Y a Empar Garca Rosell por su buena dedicacin. A Marco A. Marco Gomariz por su gran trabajo y entera disposicin. A los Alumnos Internos de este departamento, los cuales con su tarea de colaboracin han sido de gran ayuda en los numerosos anlisis que se han realizado en el laboratorio. A la empresa Lo Navarro, a la ADS Cordillera Sur y a FADESPORM por cedernos las muestras de semen y los animales que se han necesitado en las diferentes experiencias. Al matadero El Pozo por facilitarnos la obtencin de los ovarios. A ngel Poto y Begoa Peinado, por su colaboracin y ayuda. A todas las personas que me han apoyado tanto fsica como moralmente en el empeo de finalizar esta tarea.
NDICE
Pgina 1. INTRODUCCIN ........................................................................................... 2 2. REVISIN BIBLIOGRFICA ......................................................................... 7 2.1 IMPORTANCIA Y SITUACIN ACTUAL DE LA CONGELACIN SEMINAL ................................................................. 7 2.2. FACTORES QUE CONDICIONAN LA CONGELACIN ............................ 8 2.2.1. Composicin de las membranas espermticas ............................... 8 2.2.2. Fenmenos fsico-qumicos: shock trmico .................................. 10 2.2.3. Fertilidad .................................................................................... 13 2.3. FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE CONGELACIN ........... 15 2.3.1. Velocidad ptima y equilibrio ...................................................... 15 2.3.2. Diluyentes .................................................................................. 16 2.3.2.1. Diluyentes para congelacin .......................................... 16 2.3.2.2. Diluyentes para descongelacin ..................................... 17 2.3.3. Crioprotectores ........................................................................... 17 2.3.4. Aditivos ...................................................................................... 21 2.3.5. Antioxidantes ............................................................................. 22 2.3.6. Tipos de envase .......................................................................... 23 2.3.7. Protocolos de congelacin ........................................................... 25 2.3.7.1. Mtodo Beltsville (Pursel y Johnson, 1975) .................... 25 2.3.7.2. Mtodo Hlsenberg (Westendorf et al., 1975) ................. 26 2.4. MTODOS DE EVALUACIN DEL SEMEN CONGELADO .................. 26 2.4.1. Tcnicas in vitro ......................................................................... 26 2.4.1.1. Calidad seminal ............................................................ 27 2.4.1.2. Capacidad fecundante: interaccin ovocito-espermatozoide ............................................ 29 2.4.2. Tcnicas in vivo: IA y fertilidad ................................................... 31 i
3. MATERIAL Y MTODOS ........................................................................... 33 3.1. OBTENCIN SEMINAL Y PREPARACIN DE DOSIS SEMINALES .................................................... 33 3.2. EVALUACIN DE LA CALIDAD SEMINAL .......................................... 34 3.2.1. Motilidad y calidad de movimiento .............................................. 34 3.2.2. Concentracin espermtica ........................................................ 35 3.2.3. Tincin vital ............................................................................... 35 3.2.4. Morfoanomalas ......................................................................... 36 3.2.5. Acrosomas ................................................................................. 37 3.2.6. Pruebas de funcionalidad ........................................................... 38 3.3. PROCESO DE CONGELACIN-DESCONGELACIN .......................... 38 3.4. MADURACIN Y FECUNDACIN IN VITRO ....................................... 42 3.4.1. Obtencin de ovocitos ................................................................ 42 3.4.2. Maduracin in vitro (MIV) ........................................................... 43 3.4.3. Fecundacin in vitro (FIV) ........................................................... 43 3.4.4. Fijacin y tincin ........................................................................ 45 3.4.5. Valoracin microscpica de resultados ........................................ 45 3.5. FERTILIDAD IN VIVO ......................................................................... 46 3.6. DISEO EXPERIMENTAL .................................................................. 48 3.6.1. Crioprotectores ........................................................................... 48 3.6.2. Velocidad de descongelacin ....................................................... 49 3.6.3. Adicin de GSH al medio de congelacin ..................................... 49 3.6.4. Adicin de GSH al medio de descongelacin ................................ 50 3.6.5. Prueba de fertilidad in vivo .......................................................... 50 3.7. ANLISIS ESTADSTICO .................................................................... 53 4. RESULTADOS ............................................................................................ 55 4.1. EFECTO DE LA ADICIN DE CRIOPROTECTORES (GLICEROL VS. RAFINOSA) ....................................................................... 55
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4.2. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE DESCONGELACIN .............. 56

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4.3. EFECTO DE LA ADICIN DE GSH AL MEDIO DE CONGELACIN .................................................................. 58 4.4. EFECTO DE LA ADICIN DE GSH AL MEDIO DE DESCONGELACIN ........................................................... 60 4.5. EMPLEO DE SEMEN CONGELADO-DESCONGELADO EN UN SISTEMA DE FERTILIDAD IN VIVO FRENTE A UN SISTEMA DE FIV ...................................................................................... 61 5. DISCUSIN ................................................................................................ 65 5.1. ADICIN DE CRIOPROTECTORES ..................................................... 65 5.2. VELOCIDAD DE DESCONGELACIN ................................................. 67 5.3. ADICIN DE GSH A LOS MEDIOS DE CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE ESPERMATOZOIDES ......... 70 5.4. EMPLEO DE SEMEN CONGELADO-DESCONGELADO EN UN SISTEMA DE FERTILIDAD IN VIVO FRENTE A UN SISTEMA DE FIV ....................................................................................... 76 6. CONCLUSIONES ......................................................................................... 80 7. RESUMEN .................................................................................................. 82 8. SUMMARY .................................................................................................. 86 9. ABREVIATURAS ......................................................................................... 89 10. BIBLIOGRAFA ......................................................................................... 92
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Introduccin
1. INTRODUCCIN En Espaa, el sector porcino ocupa el segundo lugar en efectivos dentro del seno de la UE con un censo que supone el 172% del total de animales. El sector crnico representa el 22% del gasto total en alimentacin y la carne de porcino un 60% del total de la carne que se produce en Espaa, aportando el 28% a la produccin final ganadera y el 12% a la produccin final de la agricultura. La importancia del sector porcino como una de las principales fuentes de protenas en los pases europeos y el merecido puesto que esta industria ha alcanzado actualmente en los mercados estn estrechamente relacionados con la acertada evolucin que este sector ha sufrido y que ha dado como resultado su importancia en la economa nacional. Esto no habra sido posible sin una amplia visin de futuro por parte de los productores que han sabido adaptarse a los avances tecnolgicos y concienciarse de asimilar a tiempo las mejoras que permiten rentabilizar o mejorar las explotaciones (Pintado et al., 1994). En este sentido, es necesario seguir investigando y todo parece apuntar que, en un futuro no muy lejano, ser posible para los productores no slo disear, en funcin de las demandas del mercado, el tipo de animales ms interesantes para sus explotaciones, sino conservar en bancos de gametos, la informacin gentica de animales de alto valor. Dada la importancia del sector, las investigaciones que faciliten o mejoren las producciones en esta especie tienen gran repercusin econmica y social, tanto en nuestro pas como en el marco de la UE. En los ltimos aos se han desarrollado diferentes tcnicas reproductivas para lograr avances dentro el mbito de la produccin animal. Una de las actividades que ha hecho avanzar tecnolgicamente la produccin porcina ha sido la Inseminacin Artificial (IA). sta es
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Introduccin
una tcnica que sustituye al apareamiento natural entre el macho y la hembra y por el cual se deposita de forma instrumental el semen de un macho de calidad probada en el aparato genital de las hembras en celo, interviniendo el hombre en cada una de las etapas, con la obtencin de unos resultados de fertilidad y prolificidad similares a los alcanzados en la monta natural. Adems, la IA permite el desarrollo de programas como: 1. La utilizacin intensiva de machos reproductores de alto valor gentico que da como resultado una mejora gentica, con el consiguiente aumento de la capacidad reproductora de los verracos. 2. La reduccin del nmero de verracos en las granjas lo que conlleva a una rentabilizacin mxima de los reproductores. 3. Un mayor control de enfermedades de transmisin sexual. La IA con semen refrigerado se ha desarrollado gracias a la creacin de diluyentes comerciales que permiten la conservacin del semen con excelentes resultados. Pero su principal limitacin radica en la vida til del semen que vara entre 2-5 das. Actualmente, se consigue una conservacin del semen refrigerado a 15C de hasta 7 das con diluyentes como MRA, BTS, Androhep, etc. (Johnson et al., 2000). Por otro lado, el estudio de la crioconservacin espermtica ha venido evolucionando en los ltimos aos debido a las ventajas que puede aportar a esta tcnica. En este sentido la congelacin de semen permite nuevas aplicaciones como son: 1) el intercambio de material gentico a largas distancias, 2) un control sanitario, gentico o productivo de los animales antes de su uso como reproductores, 3) el
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autoabastecimiento de dosis seminales en la propia granja sin necesidad de tener que disponer de verracos para recogida diaria de semen y 4) la creacin de bancos genticos para razas en peligro de extincin o para individuos de alto valor, y que adems, se encontraran disponibles en circunstancias desfavorables, como por ejemplo, una posible prohibicin en la movilidad de animales a causa de un brote infeccioso (Peste porcina clsica, fiebre aftosa, etc.). Desgraciadamente, en la actualidad, la crioconservacin de espermatozoides presenta an una baja eficacia en la especie porcina, a diferencia de lo que sucede con otras especies. Debido a las limitaciones que todava tiene esta tcnica, su uso an no se ha generalizado. El empleo de semen congelado en IA en comparacin con el semen fresco ofrece unos resultados inferiores en cuanto a fertilidad y prolificidad; de esta forma, los menores ndices de concepcin, el menor tamao de camada y el bajo nmero de dosis que se obtienen de cada eyaculado limitan actualmente sus posibilidades. Esa baja capacidad fecundante puede estar relacionada con el gran dao que se produce en las membranas espermticas durante el proceso de crioconservacin. Las principales causas de estas alteraciones son los cambios estructurales y funcionales que sufren los espermatozoides durante el enfriamiento, congelacin y descongelacin. Estos cambios estn relacionados con la elevada proporcin de cidos grasos insaturados que presentan las membranas espermticas lo que promueve procesos de peroxidacin lipdica durante la congelacin. En este sentido, sera de inters el disponer de un eficiente sistema antioxidante para evitar las alteraciones asociadas a esta reaccin. Esta problemtica nos obliga a profundizar en el estudio de tcnicas que permitan avances en la crioconservacin de semen
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Introduccin
desarrollando investigaciones en la mejora de los sistemas de congelacin y descongelacin y tambin en los sistemas de evaluacin de la calidad del semen congelado-descongelado. Un factor muy importante es la evaluacin de la calidad del semen congelado-descongelado mediante diferentes mtodos de anlisis seminal, entre los que caben destacar las tcnicas destinadas al estudio de la interaccin entre gametos, como sera el uso de la fecundacin in vitro (FIV). Finalmente, se hace necesaria una evaluacin de la fertilidad de los espermatozoides congelados mediante IA. Los objetivos de este trabajo se han orientado a la evaluacin de diferentes factores (crioprotectores, velocidad de descongelacin y adicin de antioxidantes) que pueden resultar beneficiosos en la mejora de la calidad del semen crioconservado. Para ello, se han realizado las siguientes experiencias: 1. Valoracin de la adicin de diferentes crioprotectores (glicerol y rafinosa) al medio de congelacin. 2. Estudio de diferentes velocidades durante la descongelacin. 3. Ensayo de la adicin de glutatin como antioxidante al medio de congelacin y al medio de descongelacin. 4. Evaluacin de la capacidad fecundante de los espermatozoides crioconservados mediante IA.
Material y Mtodos
3. MATERIAL Y MTODOS Para llevar a cabo este trabajo se emplearon diferentes reactivos, la mayora de ellos pertenecientes a Sigma Chemical (Madrid, Espaa), salvo que se especifique lo contrario. 3.1. OBTENCIN SEMINAL Y PREPARACIN DE DOSIS SEMINALES Se emplearon eyaculados procedentes de 4 verracos de raza Pietrain y 1 verraco de raza Blanco Belga, con edades comprendidas entre 12 y 24 meses. Los machos reproductores pertenecan a los centros de IA ADS Cordillera y Lo Navarro de Murcia S.A. y estaban sujetos a un programa higio-sanitario y a una alimentacin habitual y comn en este tipo de animales. El ritmo de recogida de los verracos era de 1-2 saltos semanales. La recogida de semen se practic con el mtodo manual, donde el operario seleccion la fraccin rica del eyaculado. Esta fraccin se hizo pasar a un termo a 37C a travs de una gasa estril que filtraba los grnulos derivados de la glndula de Cowper y las partculas que pudieran ser contaminantes. En el laboratorio del centro de IA se realiz una segunda filtracin para eliminar totalmente los grnulos o partculas que podan haber quedado en suspensin. Una vez filtrado se deposit en una probeta graduada situada en el interior de un bao termostatizado a 37C donde se valor el volumen y el color como primer anlisis macroscpico. Tambin se observ la motilidad y calidad de movimiento
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Revisin Bibliogrfica
2. REVISIN BIBLIOGRFICA 2.1. IMPORTANCIA Y SITUACIN ACTUAL DE LA CONGELACIN SEMINAL Si se consiguiera establecer una tcnica de congelacin de semen que ofreciera resultados de fertilidad y prolificidad semejantes a los que se consiguen actualmente con semen refrigerado, las empresas dedicadas a la produccin porcina contaran con un utilsimo instrumento que mejorara sustancialmente explotaciones. En Espaa, la demanda del mercado y la necesidad de incrementar la produccin del sector porcino han provocado el abandono e incluso la desaparicin y sustitucin de algunas de las razas autctonas porcinas. Entre las medidas aportadas para la conservacin y recuperacin destaca la creacin de bancos de germoplasma apoyados por las administraciones central y autonmica. El punto de arranque en el desarrollo de las tcnicas de crioconservacin espermtica se inicia en 1949, cuando Polge et al. descubren la accin protectora del glicerol. Entre los aos 40 y 50 se perfecciona la tcnica de congelacin seminal y se obtienen algunos datos de fertilidad. En la actualidad, la tcnica de crioconservacin espermtica en la especie porcina sigue estando en constante estudio, siendo numerosos los equipos de investigacin que trabajan en este campo (Eriksson et al.,
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el
rendimiento
econmico
productivo
de
sus
2000; Johnson et al., 2000; Crdova et al., 2001) Sin embargo, los resultados de fertilidad y prolificidad conseguidos no son todava comparables a los obtenidos con semen fresco o refrigerado, a pesar de que investigadores como Pursel y Jonhson (1971) y actualmente Thilman (1998) y Eriksson et al. (2000) han logrado resultados de fertilidad aceptables (60-70%). La importancia de la crioconservacin de semen se centra en su uso comercial, principalmente entre distintos pases o dentro de un mismo pas con grandes distancias entre los centros de inseminacin y las granjas. En pases como Alemania, Holanda, Dinamarca y Espaa, grandes productores de porcino y donde la IA est totalmente instaurada, el uso del semen crioconservado se reduce slo a ensayos experimentales. Efectivamente, hasta ahora las dosis de semen porcino criopreservado se han utilizado con fines comerciales slo cuando se ha tratado de algn programa de mejora gentica (Didion y Schoenbeck, 1995), pero no de forma rutinaria entre distintas explotaciones. En la actualidad, la IA con semen congelado supone menos del 1% del total de inseminaciones (Wagner y Thibier, 2000). En este sentido, an falta desarrollar en las granjas una infraestructura que acondicione a stas para hacer posible su uso de forma rutinaria. 2.2. FACTORES QUE CONDICIONAN LA CONGELACIN 2.2.1. Composicin de las membranas espermticas Losley y Bogart (1944) ya describieron una pronunciada sensibilidad de los espermatozoides de verraco al fro. Una de las principales causas de
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la baja fertilidad y prolificidad obtenidas con el empleo del semen criopreservado porcino es el dao que sufren los espermatozoides durante el proceso de congelacin debido en gran medida a la especial composicin de las membranas espermticas (Nishimura y Morii, 1993). stas sufren una serie de modificaciones fsico-quimicas durante los procesos de enfriamiento, congelacin y descongelacin, que originan cambios estructurales y funcionales en los espermatozoides lo que conlleva a un envejecimiento celular prematuro (Watson, 1996). La membrana espermtica tiene una composicin de doble
membrana lipdica de estructura fluida, compuesta por fosfolpidos, glicolpidos, esteroles y colesterol. El colesterol juega un importante papel sobre la regulacin de la fluidez de las membranas, al impedir que los cidos grasos adquieran una estructura rgida cuando se alcanzan bajas temperaturas y al aumentar la flexibilidad y estabilidad de la bicapa lipdica (Pettitt et al., 1998). La membrana espermtica tambin est compuesta por cadenas laterales de cidos grasos y protenas. La existencia de un mayor ratio de cidos grasos insaturados/saturados en los fosfolpidos de las membranas de los espermatozoides es lo que provoca una mayor susceptibilidad al fro (White, 1993). Este alto contenido en cidos grasos poliinsaturados hace que los espermatozoides sean sensibles a la peroxidacin lipdica en presencia de O2. Los efectos txicos de la peroxidacin producen una inhibicin del metabolismo oxidativo y gliclisis, unido a una inactivacin enzimtica de la membrana y desnaturalizacin de ADN (White, 1993).
2.2.2. Fenmenos fsico-quimicos: shock trmico Durante la refrigeracin, los distintos lpidos que forman parte de la composicin de las membranas espermticas van a tener diferentes temperaturas de fase de transicin. Algunos lpidos pasan a estado de gel y otros permanecen en estado lquido-cristalino. Las protenas de la membrana estn excludas de ese estado de gel y acaban encontrndose en un ambiente lipdico no fisiolgico lo que origina un cambio en su funcionalidad que conlleva a una alteracin en la integridad estructural o en el metabolismo inico (Gadella et al., 1994; Woelders 1997). Durante la congelacin, el agua pasa de estado lquido a slido. La compactacin o nucleacin ocurre cuando la solucin es superenfriada a una temperatura entre 5C y 15C. Los pequeos cristales derivados de la cristalizacin del agua tienen una gran tensin superficial, que los hace ms inestables. Luego la unin de los cristales se produce en todas direcciones y la fusin de stos produce una liberacin de calor que permanece un tiempo hasta que el agua no congelada alcanza la temperatura de congelacin (Mazur 1997). El dao que ocasionan los cristales tambin est relacionado con la cantidad y el tamao de stos, habiendo sido demostrado que si el nmero de cristales es pequeo no afecta en gran modo a la viabilidad de los espermatozoides despus de su descongelacin (Watson, 1990). Bwanga (1991) comprob que la refrigeracin superrpida forma microcristales reduciendo el dao y que la refrigeracin a 5C antes de la congelacin aumenta la supervivencia espermtica.
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Dentro de la pajuela de semen, la fraccin no congelada est formada por clulas y solutos que forman parte de la solucin provocando como consecuencia un aumento de la presin osmtica y una disminucin de su volumen. El cambio osmtico provoca la salida de agua del interior de la clula produciendo un aumento de la presin osmtica hasta que llega un momento en que se iguala con la presin osmtica del exterior (Gilmore et al., 1998). El aumento de la concentracin de solutos en el interior celular es txico para las membranas celulares y para los componentes intracelulares. Por otro lado, el aumento de la concentracin de solutos extracelular tambin provoca que puedan entrar en el interior celular y alterar la composicin de la misma. Como consecuencia de todos estos cambios se produce: Deshidratacin de membranas y de sus componentes intracelulares. Prdida de estabilidad de la membrana lipdica y desnaturalizacin de protenas. Dao en las membranas celulares por la brusca salida del agua. Deformacin de la estructura celular por la prdida de volumen. Dao traumtico debido a que los espermatozoides quedan confinados en estrechos canales de solucin no congelada. La descongelacin es otro de los procesos que producen cambios en las membranas. Los efectos de la descongelacin estn ntimamente relacionados con los ocasionados durante la congelacin. Hay que adecuar una velocidad de descongelacin a la velocidad de congelacin, por lo que si sta es lenta y la velocidad de descongelacin es rpida se producir un
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shock osmtico. Por otra parte, si la velocidad de congelacin es rpida y la velocidad de descongelacin es lenta se producen lesiones traumticas debido a que se descongela lentamente el hielo intracelular. El rpido calentamiento del semen desde 5C hasta 37C causa daos visibles en los acrosomas de toro y conejo. El grado de dao vara con las especies, los espermatozoides de toro parecen ser los ms resistentes (Bamba y Cran, 1988). El efecto del rpido calentamiento es especfico para los acrosomas, mientras que la motilidad se ve poco afectada (Bamba y Cran, 1985). La presencia de cambios acrosomales en muestras descongeladas hace pensar en la importancia del proceso de descongelacin empleado. La posicin de los cristales determina el grado de dao celular y la viabilidad espermtica al descongelar (Bwanga et al., 1991a). La eliminacin del plasma seminal por centrifugacin es crtica para asegurar la mxima viabilidad posdescongelacin en la mayora de los protocolos de crioconservacin seminal. Sin embargo, en ciertas especies como el cerdo, la incubacin a temperatura ambiente de espermatozoides en su propio plasma seminal es capaz de aumentar la resistencia de stos al choque de fro, proceso que ocurre cuando los espermatozoides recientemente eyaculados son enfriados (Pursel et al., 1973; Tamuli y Watson, 1994). La sensibilidad de los espermatozoides al fro disminuye cuando la fraccin rica del eyaculado se incuba un tiempo a 20-23C antes del proceso de enfriamiento, aunque el tiempo de incubacin parece ser ms importante que la propia temperatura de incubacin (Weitze et al., 1999). El plasma seminal contiene protenas especficas que se asocian
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perifricamente a la membrana del espermatozoide y que son capaces de inhibir la desestabilizacin prematura de la membrana fluida del espermatozoide, que acontece en la crioconservacin, a consecuencia de la eliminacin de parte del plasma seminal (Maxwell y Johnson, 1999). 2.2.3. Fertilidad Desde hace ms de 30 aos se est investigando sobre la congelacin de semen de verraco, y los resultados de fertilidad an no son satisfactorios ya que son significativamente ms bajos en comparacin con el uso de semen fresco o refrigerado (Watson, 2000). Como ya se indic en la 1 y 2 Conferencia Internacional sobre crioconservacin de semen de verraco (Uppsala, 1985; Beltsville, 1990), los resultados medios de fertilidad son inferiores al 70% y la prolificidad se sita en niveles de 10 lechones por parto. La mayora de pruebas de IA an siguen siendo experimentales, ofrecindose tan slo dosis de semen criopreservado en programas de mejora gentica (Hofmo y Grevle, 1999). Otro factor importante en la problemtica del semen criopreservado es la variabilidad que existe entre razas. Almlid y Hofmo (1996) obtuvieron mayores resultados de viabilidad en la raza Landrace cuando la compararon con la raza Duroc. Adems, tambin existe variabilidad individual entre verracos dentro de la misma raza como describieron Hammit y Martin (1989), Woelders et al. (1995) y Holt (1997). Tambin cabe destacar que un verraco puede tener buena viabilidad posdescongelacin pero poca capacidad para fecundar. As, el semen de
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verraco que sobrevive a la congelacin puede ser mvil aunque no sea necesariamente frtil, de forma que no se corresponde la fertilidad del semen congelado-descongelado, con respecto al fresco o refrigerado, con su calidad posdescongelacin (Polge, 1956; Johnson et al., 1995). La causa puede estar en la desestabilizacin prematura que ocurre en las membranas espermticas, equivalente a la que se produce en los procesos de capacitacin y reaccin acrosmica (Watson, 2000). Estos cambios son causados por factores que acontecen durante la congelacin como son: eliminacin del plasma seminal, cambios de temperatura, estrs osmtico y txico por la exposicin a los crioprotectores, y procesos de deshidratacin e hidratacin que ocurren durante los cambios de fase en el agua del medio que rodea a los espermatozoides. De forma general se puede decir que entre el 40 y 50% de los espermatozoides que se crioconservan no sobreviven a estos procesos, y aquellos que lo hacen y mantienen la motilidad posdescongelacin, y que presumiblemente son viables, son modificados de forma que se dificulta su capacidad para interactuar con el ovocito durante la fertilizacin (Watson, 2000). Se puede concluir diciendo que las causas de la baja fertilidad con el semen congelado-descongelado son: Una disminucin en la calidad y en la capacidad fecundante que conlleva a una disminucin en la tasa de fecundacin. Cambios estructurales y funcionales que producen un retraso en el desarrollo embrionario debido al envejecimiento prematuro de los espermatozoides.
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2.3. FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE CONGELACIN 2.3.1. Velocidad ptima y equilibrio El efecto solucin es aquel fenmeno por el que las clulas sufren una excesiva deshidratacin debido a una lenta velocidad de congelacin, lo que les provoca una exposicin a altas concentraciones de solutos que junto con el cambio de pH y la precipitacin de stos produce alteraciones celulares (Mazur, 1984). Por el contrario, si la velocidad de congelacin es rpida se formarn cristales de hielo en el interior celular. Es necesario pues, encontrar un equilibrio en la velocidad del proceso de congelacin. As, se necesita una velocidad lenta que facilite la salida de la mayor parte de agua del interior de las clulas y a la vez lo suficientemente rpida para evitar la exposicin de los espermatozoides al efecto solucin. La velocidad de descongelacin es muy importante para la viabilidad espermtica, fundamentalmente para los acrosomas. Si la velocidad de calentamiento es rpida se podrn mejorar aquellos espermatozoides que presentaban restos de hielo intracelular (Bamba y Cran, 1985). Teniendo en cuenta que el semen congelado envasado en pajuelas de 05 ml puede ser sometidos a varias temperaturas de descongelacin, diferentes autores ensayaron distintas velocidades de descongelacin. As, Baron (1986) prob con xito las siguientes: 39C/15 seg, 20C/45 seg, 70C/8 seg y 0C/120 seg. Berguer y Fischerleitner (1992) descongelaron a 38C con distintos tiempos de inmersin: 40, 20 y 10 seg. Fiser et al.,
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(1993) probaron: 0C/120 seg, 20C/60 seg, 40C/20 seg, 60C/8 seg y 80C/5 seg. Maxwell y Johnson (1997) descongelaron a 37C durante 20 seg. Kikuchi et al. (1998) utilizaron 37C/3 min (en pajuelas de 025 ml). Johnson et al. (2000) encontraron como velocidad ptima la de 1200C/min, y por ltimo Eriksson et al. (2000) descongelan a 50C/12 seg. Segn los estudios de Bwanga (1991) y Jonhson et al. (2000) la velocidad ptima de enfriamiento desde 0C hasta 5C es de 30C/min; y la de descongelacin es de 1200C/min. 2.3.2. Diluyentes Se han elaborado distintos diluyentes que pretenden mantener la viabilidad y la capacidad fecundante de los espermatozoides durante los procesos de congelacin y descongelacin. Los diluyentes ms apropiados son los de baja o media fuerza inica (Graham et al., 1978), sin olvidar tampoco la especial sensibilidad de los espermatozoides de verraco a los cambios osmticos y a los cambios de pH (Einarsson, 1971). 2.3.2.1. Diluyentes para congelacin A continuacin, se citan los diluyentes ms empleados con su correspondiente composicin cualitativa: G-Y (Polge et al.,1970): glucosa-yema de huevo.
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BF5 (Pursel y Johnson, 1975): TRIS (hidroximetil aminometano), TES (N-TRIS (hidroximetil) metil-2-aminoetano cido sulfnico) fructosa-citrato-yema. TES-GY (Larsson et al., 1977): Tes-Na-K-glucosa-yema. TRIS-EDTA (Salomon y Visser,1973): Tris-fructosa-EDTA-yema. LEY (Westendorf et al., 1975): lactosa-yema de huevo. Por su fcil preparacin y bajo coste econmico es de los ms usados hoy en da. 2.3.2.2. Diluyentes para descongelacin Los diluyentes de descongelacin son soluciones salinas, basadas en la composicin conocida del plasma seminal, ricas en nutrientes y electrolitos para favorecer la viabilidad del semen descongelado (Tabla A). La presin osmtica y pH se encuentran en niveles fisiolgicos. 2.3.3. Crioprotectores El crioprotector permite a las clulas sobrevivir a las tasas de enfriamiento lo suficientemente lentas como para permitir la salida de agua intracelular y as evitar la formacin de hielo intracelular. La fraccin de agua no cristalizada y la formacin de hielo alcanza un equilibrio cuando la fraccin de agua no congelada es muy baja y la concentracin de solutos es muy alta. De esta manera, el crioprotector hace que el punto de equilibrio se alcance antes de forma que la concentracin de solutos no llegue a ser demasiado alta.
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Revisin Bibliogrfica Tabla A. Composicin de los diluyentes usados comercialmente para conservacin de espermatozoides descongelados de verraco. Medios Ingredientes (g/l) Bicarbonato sdico Cloruro clcico Cloruro magnsico Cloruro sdico Cloruro potsico Citrato sdico Piruvato sdico Glucosa Fructosa Lactosa Cistena EDTA HEPES BSA Penicilina (UI) Aureomicina (mg) Estreptomicina (mg) Sulfanilamida (mg) Neomicina sulfato 1 1 3 1 1 1 1 1 125 35 25 25 24 9 25 37 57 5 075 6 04 45 5 26 BTS (Pursel y Johnson, 1975). 125 HLSENBERG (Westendorf et al., 1975). 12 6 87 35 12 8 OLEP (Larsson y Einarsson, 1976). 12 ANDROHEP (Weitze, 1990).
Otra accin del crioprotector es la formacin de puentes de hidrgeno con los grupos polares de la cabeza de los lpidos de membrana, pudiendo reemplazar al agua bajo condiciones de deshidratacin. Por ltimo, el crioprotector previene la cristalizacin eutctica al aumentar la viscosidad de los solutos del medio.
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Por lo tanto, tenemos dos funciones importantes del crioprotector: minimizar el efecto solucin y aumentar la viscosidad de las soluciones intra y extracelulares produciendo una salida de agua ms lenta. Existen dos tipos de crioprotectores, penetrantes y no penetrantes. Entre los crioprotectores penetrantes se conocen el glicerol, como agente ms utilizado y otros menos comunes como son el dimetilsulfxido (DMSO), eritritol, xilitol y los glicoles, utilizados en congelaciones controladas. Entre los crioprotectores no penetrantes estn los azcares que se ensayan en congelaciones ultrarpidas. El glicerol es el crioprotector de eleccin para la congelacin espermtica en la especie porcina. La concentracin de este agente debe ser justamente utilizada en los protocolos de congelacin ya que el aumento de los niveles de glicerol afecta negativamente a la integridad del acrosoma, aunque positivamente a la motilidad (Bwanga, 1991). La concentracin del crioprotector debe estar asociada a la velocidad de congelacin empleada. A mayor velocidad debe haber menor concentracin de glicerol. La combinacin de bajas concentraciones de glicerol y altas velocidades de congelacin parece ser efectiva (Polge et al., 1949, Mazur, 1985). Segn Almlid y Jonhson (1988), niveles del 3-4% de glicerol determinan una mxima motilidad posdescongelacin, mientras que un 23% de glicerol aumenta el porcentaje de acrosomas normales.
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Los espermatozoides porcinos son muy sensibles a los efectos de este crioprotector ya que altas concentraciones de glicerol son txicas para los espermatozoides (Watson, 1995). Este efecto txico acta sobre las clulas espermticas en funcin de la concentracin y del momento de su adicin. El glicerol puede reducir la fluidez de las membranas espermticas y alterar la polimerizacin y despolarizacin de microtbulos (Parks y Graham, 1992). El momento de la adicin del glicerol tambin va a depender del tipo de envase. En pajuelas, el momento de su adicin ha de ser a 5C, y en pellets ha de ser a los 30C. La exposicin del glicerol a 5C aumenta la viabilidad posdescongelacin en pajuelas (Almid, 1988). En presencia de glicerol diluyentes con glucosa (2-4%) obtienen mxima motilidad. Altos niveles de glucosa y fructosa incrementan la proporcin de espermatozoides con alta motilidad y acrosomas normales. A menudo, altos niveles de lactosa, maltosa, sucrosa, rafinosa y glicina tienen un efecto negativo sobre la motilidad pero positivo en los acrosomas. La lactosa es el azcar que produce mejor efecto protector en los acrosomas (Bwanga, 1991). Otros crioprotectores como el DMSO, eritriol, xilitol o adenitol se ha utilizado a bajas concentraciones aumentando la motilidad posdescongelacin en los espermatozoides porcinos, pero la proporcin de acrosomas intactos resulta ser ms baja (Paquignon, 1985; Bwanga, 1991).
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La rafinosa es un trisacrido compuesto de D-glucosa, D-galactosa y D-fructosa. Al contrario de lo que ocurre con el glicerol, una mayor concentracin de azcar produce una menor motilidad posdescongelacin y un mejor efecto en los acrosomas. Este tipo de azcar se ha utilizado en congelacin de espermatozoides de ratn donde se demostr que aumentaba la resistencia al shock trmico durante el enfriamiento (Tao et al., 1995). 2.3.4. Aditivos La yema de huevo forma parte de los medios de congelacin ya que acta como fuente de energa y como agente protector. La fraccin lipoproteica de la yema de huevo protege a los acrosomas durante el choque de fro y adems tambin tiene un papel como protector a nivel de membranas (Bwanga, 1991). El OEP (orvus et paste ) es un detergente sinttico que tambin forma parte de los medios de congelacin porcina desde que lo emplearon con xito Graham et al. (1971a). Este aditivo acta disminuyendo la tensin superficial de los cristales, y adems, junto a la yema de huevo, promueve la formacin de microcristales angulares que resultan menos nocivos. El OEP por sus propiedades anfipticas slo aumenta la funcin espermtica en presencia de yema de huevo, presumiblemente por dispersar los conglomerados de lpidos-yema de huevo formados despus de la dilucin del semen (Pursel et al., 1978; Strzezek et al., 1984). Tambin se ha demostrado que el OEP aumenta la supervivencia posdescongelacin del semen congelado en pellets (Pettit et al., 1998).
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Los efectos positivos del OEP son los de mejorar la motilidad, la integridad de la membrana plasmtica, el estado del acrosoma y la fertilidad, aunque su mecanismo de accin an no es del todo conocido. 2.3.5. Antioxidantes Los espermatozoides eyaculados se encuentran inmersos en el plasma seminal compuesto por alcuotas del fluido de la cola del epiddimo y de las secreciones de las glndulas sexuales accesorias donde se encuentran antioxidantes naturales (Mann y Lutwak-Mann, 1981). En el epiddimo existen antioxidantes como los cidos
aminosulfnicos, taurina, hipotaurina (Holmes et al., 1992) e inositol (Carpenter et al., 1986). El cido ascrbico inhibe el dao que producen los radicales libres durante el estrs oxidativo (Brooks, 1990). Tambin se encuentran protenas ligadas al Zn 2+ que protegen del efecto txico de las sustancias oxgeno reactivas (ROS) que catalizan el proceso de peroxidacin lipdica, interviniendo en la formacin y posterior destruccin del perxido de hidrgeno (Comaschi et al., 1989). La adicin de antioxidantes externos es un tema de gran relevancia ya que su presencia en los diluyentes de congelacin podran evitar algunos daos causados por la peroxidacin lipdica. Existen adems antioxidantes de distinta naturaleza. stos pueden ser hidrosolubles que actan en el medio interno, como son el EDTA y el desferal, favoreciendo la eliminacin de iones Fe 2+ (Aitken, 1995); y los de
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naturaleza liposoluble como el hidroxitolueno butilado y la vitamina E, que inhiben el estrs oxidativo en el medio externo y minimizan reacciones de peroxidacin intracelulares (Hammersted, 1993). El glutatin (GSH) es un antioxidante de naturaleza peptdica compuesto de cistena, cido glutmico y glicina. Su naturaleza le permite pasar fcilmente de forma reversible de la forma oxidada a la reducida, con lo cual desempea un importante papel como transportador de hidrgeno (Lehninger, 1982). Es un compuesto presente en las clulas de mamferos que confiere una multitud de acciones como el transporte de aminocidos, ADN y sntesis de protenas, as como la reduccin de cadenas disulfuro y capacidad antioxidante celular (Li, 1975). El GSH protege a los espermatozoides de la peroxidacin lipdica que producira prdidas irreversibles de motilidad, inhibicin de la respiracin por prdida de enzimas intracelulares y daos cromatnicos (White, 1993). Se ha experimentado con muchos antioxidantes con el fin de minimizar los efectos txicos de la peroxidacin lipdica (Comaschi et al.,1989). Por ello, se ha reconocido la necesidad de evaluar el efecto de stos despus de ser adicionados a los medios de espermatozoides para conseguir un incremento en los parmetros seminales y en la capacidad fecundante. 2.3.6. Tipos de envase Los envases nos permiten almacenar de forma sencilla el semen crioconservado en el tanque de nitrgeno, facilitndonos de la misma
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manera la identificacin de los diferentes eyaculados. Entre los distintos tipos de envases encontramos: Maxipajuelas de 5 y 25 ml (Westendorf et al., 1975). Son fciles de identificar y de almacenar, y tiene como ventaja que una pajuela puede albergar una dosis de inseminacin. El inconveniente de este tipo de envase es que se obtienen menores ndices de viabilidad y de fertilidad. Esto se debe a que a su mayor dimetro produce una congelacin menos homognea (Ekwall, 1996). Pldoras o pellets (Pursel y Johnson, 1975). Tienen varios inconvenientes ya que son dficiles de identificar, su manejo es ms complicado debido a su tamao y su reducido volumen implica una baja concentracin espermtica con la consiguiente necesidad de utilizar muchos pellets para obtener una dosis. Pajuelas de 05 ml (Fiser y Fairfull, 1990). Pueden ser de tipo francs o alemn (stas ltimas de menor longitud y mayor dimetro interior). Son de fcil identificacin, pero se necesita un nmero de 10-20 pajuelas para alcanzar una dosis de inseminacin. Su uso nos ofrece buenos resultados de viabilidad y de fertilidad. Bolsas de plstico de 5 ml (Plastic bags) (Bwanga et al., 1991b; Rodriguez-Martnez et al., 1996). Por su forma y tamao permiten una transferencia de calor durante el congelado y descongelado bastante rpida dando como resultado una mayor supervivencia espermtica y un mayor ndice de fertilidad despus de utilizarse en IA. Su tamao nos permite utilizar una sola bolsa como dosis de inseminacin.
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Flat Pack (Eriksson y Rodriguez-Martnez, 2000). Son bolsas de plstico con un grosor de 01 mm y con mejores resultados de viabilidad y fertilidad en comparacin con las Plastic bags. Las bolsas de plstico permiten aumentar los resultados de motilidad, de acrosomas normales posdescongelados y de fertilidad con respecto a las maxipajuelas (Bwanga et al., 1991c). Existen diferencias significativas de motilidad cuando se utilizan minipajuelas (Bwanga et al., 1990; Crdova et al., 2001) con respecto a la utilizacin de maxipajuelas, alcanzndose resultados de motilidad ms altos en las primeras. 2.3.7. Protocolos de congelacin Existen varios protocolos de congelacin de espermatozoides
desarollados a partir del conocimiento de la viabilidad y capacidad fecundante de los espermatozoides porcinos. A continuacin, se detallan los protocolos ms utilizados por sus resultados de viabilidad as como por su fcil metodologa y menor coste econmico. 2.3.7.1. Mtodo Beltsville (Pursel y Johnson, 1975) 1. Fraccin rica almacenada en laboratorio (20-23C, 2 horas). 2. Centrifugacin (300 g, 10 min). 3. Dilucin hasta concentracin de 12 x 109 esp/ml con medio BF5. 4. Enfriamiento a 5C durante 2 horas 5. Dilucin con medio BF5 + glicerol (1:1) (2% final de glicerol). 6. Envasado en pldoras de 02 ml. 7. Almacenamiento y conservacin en tanque de Ntrogeno lquido.
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2.3.7.2. Mtodo Hlsenberg (Westendorf et al., 1975) 1. Fraccin rica+diluyente Hlsenberg (1:2). 2. Conservacin a 15C durante 3 horas. 3. Centrifugacin (800 g, 10 min). 4. Dilucin en LEY (1:2). 5. Enfriamiento a 5C (90 min). 6. Dilucin en LEY + glicerol + OEP (2:1) (3% final de glicerol y 065% OEP). 7. Envasado en pajuelas de 5 ml o de 05 ml. 8. Vapores de Nitrgeno lquido a 5 cm por encima del nivel de nitrgeno. 9. Almacenamiento y conservacin en tanque de nitrgeno lquido. 2.4. MTODOS DE EVALUACIN DEL SEMEN CONGELADO 2.4.1. Tcnicas in vitro Es importante poder predecir la fertilidad de los eyaculados mediante pruebas in vitro, que nos ahorrarn los grandes problemas que conllevan los test in vivo debido al alto coste y tiempo invertido (Larsson y Rodrguez-Martnez, 2000; Gadea et al., 2001). Existen varias tcnicas de anlisis de semen que nos proporcionan informacin acerca de la funcionalidad espermtica, aunque sta no sea an lo suficientemente precisa, ya que no se puede asegurar que unos resultados de buena calidad seminal se correspondan con una buena
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fertilidad (Curry, 2000). De ah, la importancia de combinar diferentes pruebas in vitro con la finalidad de obtener la informacin ms completa sobre la capacidad fecundante de los espermatozoides (Crdova et al., 1997). 2.4.1.1. Calidad seminal Adems de los factores externos que influyen sobre la calidad de los espermatozoides antes de su congelacin como son la estacin, la raza, la edad o el estado sanitario, van a existir otros factores que provocarn variaciones en la calidad seminal, y estos cambios en la calidad seminal se evalan mediante pruebas in vitro. La mayora de las pruebas de anlisis seminal se encuentran dentro del espermiograma clsico y adems, se pueden combinar con pruebas de funcionalidad de membranas. Destacamos las siguientes: 1. Evaluacin de la motilidad. Algunos autores apuntan que la motilidad es uno de los parmetros que ms se corresponde con la fertilidad (Shanis et al., 1989), ya que es necesaria una buena motilidad para el transporte de los espermatozoides dentro del aparato reproductor de la hembra hasta llegar al lugar de la fecundacin. Esta prueba es una valoracin subjetiva ya que se estima el porcentaje de espermatozoides mtiles que se observan en un campo ptico bajo el microscopio (objetivos 10x y 40x), lo que puede conducir a variaciones entre diferentes operarios (Woelders, 1990). Para eliminar estas variaciones de resultados en la motilidad se han desarrollado tcnicas ms sofisticadas para su estudio como son el efecto Doppler (Finsy et al., 1980) o los analizadores de
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imgenes computerizados (Rath et al., 1987; Abaigar et al., 1999). Estos sistemas describen con detalle el tipo de movimiento de las clulas en una muestra de semen. 2. Evaluacin del estado del acrosoma. El acrosoma contiene a los enzimas con actividad hidroltica, por eso su estudio es tan importante ya que nos revelar la capacidad del espermatozoide para penetrar al ovocito. Por lo tanto, las alteraciones relacionadas con el acrosoma estarn siempre asociadas a una reduccin de la fertilidad (Hashizume et al., 1990). Los cambios que se producen en la morfologa del acrosoma son muy frecuentes en los procesos de congelacin y descongelacin de los espermatozoides (Mann y Lutwak-Mann, 1981). 3. Tincin vital. Es una de las pruebas que estudian la integridad de las membranas espermticas. Se basa en que los espermatozoides que pierden la integridad de su membrana permiten la entrada de los colorantes. Entre los colorantes vitales ms utilizados se encuentra la combinacin de eosina y nigrosina (Bamba, 1988). Es una prueba de bajo coste y rpida preparacin; sin embargo, no presenta una buena correlacin con la fertilidad (Graham et al., 1990), ya que la integridad estructural a veces no se corresponde con la funcionalidad de la membrana (Berger y Parker, 1989), factor muy importante para la capacitacin y reaccin acrosmica (Check et al., 1989). 4. Pruebas de fluorescencia para evaluar la funcionalidad
espermtica. El diacetato de carboxifluorescena (DCF) es una sustancia permeable a la membrana plasmtica del espermatozoide. La presencia de esterasas en el interior de clulas intactas transforman el DCF en una
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sustancia fluorescente que permite su visualizacin en un microscopio con fluorescencia. Slo emiten fluorescencia aquellos espermatozoides que presentan actividad esterasa en su interior (Harrison et al., 1990). Existen otro tipo de anlisis como los estudios de reaccin acrosmica y capacitacin espermtica mediante lectinas y clortetraciclina (Wang et al., 1995), estudios bioqumicos que evalan los contenidos de ATP como un ndice de actividad metablica (Tardif et al.,1999; Gadea y Mats, 2000), y estudios enzimticos como la fosfatasa cida, aspartato aminotransferasa (Strzezek et al., 1995), o acrosina (Ciereszko et al., 2000) que igualmente evalan la funcionalidad espermtica. Por ltimo, tambin se emplean el test de resistencia osmtica (ORT) (Schilling y Vengust, 1987; Garca et al., 1989) basado en la resistencia de las membranas acrosomales bajo condiciones osmticas; y el test de endosmosis o hiposmtico (HOST) (Jeyendran et al., 1984; Vzquez et al., 1998) basado en la exposicin de los espermatozoides a un medio hiposmtico. 2.4.1.2. Capacidad fecundante: interaccin ovocito-espermatozoide. Los espermatozoides que sobreviven a los procesos de congelacin, aparentemente viables, debido a las modificaciones que han sufrido en sus membranas pueden tener dificultades para interactuar con el ovocito durante la fertilizacin. Por ello, es muy interesante hacer estudios de fecundacin in vitro que detecten estos cambios y nos ofrezca informacin acerca de su capacidad fecundante. Se pueden ensayar dos tipos de tests.
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1. Test de FIV heteroespecfico. Se basa en el estudio de la capacidad del espermatozoide para penetrar un ovocito de hmster libre de zona pelcida (SPA) (Berger et al., 1996). Este tipo de estudio se ha realizado muchas veces en la especie humana (Yanagimachi, 1984), pero tambin ha sido adaptado a las dems especies animales. En la especie porcina fue introducido por Imai et al. (1977) quienes demostraron que exista una buena correlacin con la fertilidad in vivo. Tambin, Hammitt et al. (1989) utilizaron este mismo sistema con semen congelado y consiguieron una correlacin positiva con la fertilidad, concretamente con el nmero de espermatozoides unidos a la zona y el porcentaje de ovocitos penetrados, pero no consigueron una correlacin positiva con el nmero de espermatozoides por ovocito. 2. Test de FIV homoespecfico (hIVP) (Gadea et al., 1998a). Nos permite analizar todas las etapas del proceso de fecundacin, y es por tanto un mtodo muy adecuado para predecir la capacidad fecundante de los espermatozoides congelados-descongelados. Estos sistemas utilizan ovocitos inmaduros, que tambin pueden ser penetrados de igual manera que los madurados in vivo (Mattioli et al., 1990; Martnez et al., 1996; Xu et al., 1996; Xu et al., 1998; Campos et al., 2001). Los sistemas FIV de ovocitos madurados in vitro nos han demostrado que existen diferencias entre verracos en cuanto a las tasas de penetracin (Wang et al., 1995; Coy et al., 1999), de polispermia y de formacin de proncleo masculino (Foxcrot et al., 1995).
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2.4.2. Tcnicas in vivo: IA y fertilidad En los estudios de fertilidad es necesario utilizar un nmero elevado de hembras para poder eliminar la variabilidad que ejercen stas debido a factores externos que les afectan como pueden ser la estacin, la edad, el estado de nutricin y el nmero de ciclos reproductivos (Amann, 1989). La IA es un buen sistema para valorar la capacidad fecundante de los espermatozoides de verraco sometidos a un proceso de congelacindescongelacin, ofrecindonos datos como el nmero de partos y el tamao de camada. El inconveniente de estos sistemas es que se necesita tiempo para recoger datos sobre los resultados de fertilidad, adems del importante coste econmico que esto supone. Para resolver estos inconvenientes se han desarrollado otros sistemas que nos permite valorar los resultados en menor tiempo como son la recogida de embriones a los pocos das de inseminacin (Wabersky et al., 1994), el diagnstico de preez mediante ultrasonografa (Martnez et al., 1992), la tasa de no retorno al estro (Strzezek y Skaweta, 1984) y el uso de dosis heterosprmicas (Pursel et al., 1984) donde la competencia de los espermatozoides del eyaculado ms frtil reducir tambin el tiempo de estudio y el nmero de hembras reproductoras.
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bajo microscopio con objetivo 10x. Se calcul la concentracin espermtica mediante una cmara de recuento celular, determinndose as el nmero total de espermatozoides del eyaculado El semen fue diluido en una proporcin 1:1 sobre el diluyente comercial BTS (Beltsville thawing solution, Pursel y Johnson, 1975; Minitb, Tiefenbach, Alemania ). Este diluyente estaba compuesto por glucosa 02 M, Na2-EDTA.2H2O 336 mM, CO3HNa 15 mM, citratoNa3.2H2O 20 mM y ClK 5 mM, y haba sido mantenido a la misma temperatura que el semen. El semen se transport hasta la Facultad de Veterinaria de Murcia en menos de una hora desde su recogida y a una temperatura de 22C. En nuestro laboratorio se procedi a evaluar la calidad seminal con las pruebas pertinentes previas a su congelacin. 3.2. EVALUACIN DE LA CALIDAD SEMINAL 3.2.1 Motilidad y calidad de movimiento La motilidad fue la primera prueba a evaluar. Se deposit 10 l de semen sobre un portaobjetos precalentado a 39C y se observ bajo el microscopio con objetivo 10x. Se valor el porcentaje de espermatozoides mtiles. La calidad de movimiento tambin fue determinada al mismo tiempo en una escala de 0-5, basndose en el tipo de movimiento que presentaban los espermatozoides a travs del campo microscpico (Gadea y Mats, 1998). Fueron aceptables aquellos eyaculados que obtuvieron al menos un 70% de motilidad y un valor de 3 en la escala de calidad y donde la mayora de los espermatozoides tenan un movimiento progresivo.
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3.2.2. Concentracin espermtica Se emple para su determinacin una cmara de recuento celular de Newbauer. Para ello el semen fue diluido en una proporcin 1:100 en solucin salina formolada (SSF) al 03% que permiti la fijacin de los espermatozoides. La concentracin se expres como el nmero de espermatozoides por ml. 3.2.3. Tincin vital Se trata de una prueba de integridad estructural que determina el porcentaje de espermatozoides con membrana ntegra. Se utiliz la tincin vital eosina-nigrosina cuyo fundamento se basa en que los espermatozoides con membrana alterada permiten la entrada del colorante (Eliasson y Treichl, 1971). Para la preparacin de la solucin eosina-nigrosina se mezclaron 25g de eosina amarilla (Merck) y 5g de nigrosina hidrosoluble (Merck) en 100 ml de solucin citrato trisdico al 39% en agua y posteriormente se procedi a su filtracin (Bamba, 1988). Para la contrastacin de esta prueba se mezclaron 50 l de semen y 50 l de la solucin de tincin en un portaobjetos, y se procedi a realizar la extensin, la cual una vez seca se observ al microscopio con el objetivo de 40x. Los espermatozoides con membrana daada aparecen de color rojo-pardo, mientras que los que tienen la membrana ntegra no resultan teidos (Fig. 1-A).
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3.2.4. Morfoanomalas En esta prueba se evalu el nmero de espermatozoides que son morfolgicamente anormales (Fig 1-B). Hay un listado amplio de anormalidades espermticas, de entre todas ellas y de acuerdo con Howard y Pace (1988) y Bonet et al. (2000), podemos destacar: Gotas citoplasmticas: su presencia se ha tomado como una forma de valorar la madurez espermtica. En el epiddimo la presencia de gotas citoplasmticas representa un 90%, pero a lo largo del trayecto epididimario (desde la cabeza hasta la cola) estas gotas van disminuyendo hasta alcanzar unos niveles en el eyaculado inferiores al 15%. Se han clasificado segn su localizacin en: - proximales: la gota se encuentra situada entre la cabeza y el cuello del espermatozoide. - distales: la gota se encuentra situada en la mitad de la porcin intermedia. Anormalidades en la cola: este tipo de alteracin implica un impedimento para el movimiento de los espermatozoides. Las clasificamos en: - colas en ltigo: el flagelo se encuentra plegado. - colas en ovillo: el flagelo est totalmente enrollado sobre s mismo. Alteraciones de la cabeza: son el resultado de una alteracin de la espermatognesis. La presencia en el eyaculado de este tipo de alteraciones es de menor importancia, ya que representan un porcentaje muy pequeo en el espermiograma. Entre stas podemos destacar: macrocefalia, microcefalia, cabezas sueltas, cabezas piriformes, cabezas dobles, etc.
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Otras alteraciones: implantaciones anormales de la cola, colas dobles, etc. Para hacer el anlisis de morfoanomalas se fijaron los
espermatozoides en SSF. Se valor en un microscopio de contraste de fases con objetivo de 40x (Leica). Se admitieron un mximo de 25% de formas anormales totales. 3.2.5. Acrosomas Para determinar el porcentaje de espermatozoides con acrosoma normal se diluy el semen en SSF, se deposit una gota sobre el portaobjetos y se evalu a 1000 aumentos en contraste de fases (100x). El acrosoma normal se observ en el borde apical de la cabeza del espermatozoide, a modo de semiluna negra, perfectamente definida. Cualquier irregularidad del borde apical correspondera a espermatozoides con el acrosoma daado. Los espermatozoides que estaban perdiendo el acrosoma presentaban una especie de velo acrosomal. Los espermatozoides que no presentaban en su borde apical la estructura de semiluna negra habran perdido el acrosoma (Pursel y Jonhson, 1973) (Fig. 1-C). Segn grado (Pursel las et consideraciones al., 1973), anteriores se el dividieron porcentaje los de
espermatozoides en dos grupos, normales y alterados en cualquier contabilizndose espermatozoides con acrosoma normal (NAR).
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3.2.6. Pruebas de funcionalidad Su fundamento se basa en que la membrana plasmtica puede estar estructuralmente intacta pero alterada desde el punto de vista funcional. solucin Para de ello se de utiliz la prueba del diacetato se de carboxifluorescena (Harrison et al., 1990). Para la preparacin de la diacetato carboxifluorescena (DCF) realiz primeramente una dilucin de 046 mg/ml de DCF en dimetilsulfxido (DMSO) y una dilucin de 500 g/ml de ioduro de propidio (IP) en solucin salina. Estas soluciones se conservaron en congelacin (-20C). En el momento de su utilizacin se hizo la siguiente mezcla: 20 l solucin DCF + 20 l solucin IP + 10l SSF + 1 ml solucin espermtica. Se ajust la concentracin espermtica a 3 x 107 esp/ml. Inmediatamente, se incubaron los espermatozoides durante 10 min a 38C. Pasados otros 10 min, se depositaron 5 l sobre un portaobjetos y se valor en un microscopio de fluorescencia (Nikon) a 400 aumentos (40x), con filtro B2 y 495 nm de excitacin. Bajo el microscopio se podan distinguir espermatozoides que emitan fluorescencia verde (funcionales) y espermatozoides que no emitan fluorescencia y aparecan teidos de rojo por el IP (membrana daada) (Fig. 1-D). Se contaron al menos 200 espermatozoides para determinar el porcentaje de espermatozoides funcionales. 3.3. PROCESO DE CONGELACIN-DESCONGELACIN Para proceder a la congelacin de las muestras de semen se evalu en primer lugar la calidad seminal de las mismas.
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Figura 1.
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El semen fue procesado segn el procedimiento descrito por Westendorf et al. (1975) con pequeas modificaciones. Partiendo de la fraccin rica del eyaculado en una dilucin 1:1 con el diluyente BTS (Pursel y Johnson, 1975) se conserv a una temperatura de unos 2022C, 90-120 min. Pasado este tiempo se llevaron las muestras a una temperatura resultante de 15C, durante con el 150 min. Posteriormente, lactosa-yema se centrifugaron a 800 x g 10 min para eliminar el sobrenadante. El pellet se resuspendi diluyente (LEY; Westendorf et al., 1975) compuesto por 80 ml de lactosa al 11% y 20 ml de yema de huevo, hasta una concentracin de 15 x 109 esp/ml. Esta supensin se mantuvo a 5C durante 90 min. Pasado este tiempo se rediluy hasta una concentracin de 1x109 esp/ml con el medio LEY + 9% glicerol + 15% del detergente orvus es paste (Equex-Paste, Minitb, Tiefenbach, Alemania ) quedando una concentracin final del 3% de glicerol y 05% de OEP (Fig. 2). Posteriormente, se procedi al llenado de las pajuelas de 05 ml mediante un sistema de aspiracin manual y a su sellado con alcohol de polivinilo. Las pajuelas se depositaron sobre los vapores de nitrgeno lquido a unos 4 cm aproximadamente sobre el nivel del nitrgeno durante 20 min y posteriormente se depositaron en el tanque de nitrgeno lquido para su almacenamiento. El proceso de descongelacin se llev a cabo de forma rutinaria mediante la inmersin de la pajuela en un bao a 50C durante 10-12 seg, a menos que se refiera lo contrario segn el diseo experimental; despus se resuspendi el semen en el diluyente de descongelacin BTS mantenido a una temperatura de 37C.
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Figura 2
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3.4. MADURACIN Y FECUNDACIN IN VITRO En este apartado describiremos las tcnicas de maduracin y fecundacin de ovocitos porcinos empleados en este trabajo, as como la valoracin de resultados. 3.4.1. Obtencin de ovocitos Los medios empleados para el transporte y lavado de ovarios, as como para la manipulacin de ovocitos fueron: Solucin salina (SS): 09% de NaCl con 100 mg/l de sulfato de kanamicina, que se conserv a temperatura ambiente hasta su uso. Solucin de cetrimida (Cetab): bromuro de hexadecil-
trimetilamonio al 004%, que tambin fue conservado a temperatura ambiente hasta su uso. Tampn fosfato salino de Dulbecco modificado (PBSDm)
suplementado con 1 mg/ml de alcohol polivinlico y 0005 mg/ml de rojo fenol. El pH se ajust a 74 y el medio fue esterilizado a travs de un filtro de membrana con un dimetro de poro de 022 m (Millex GP) en una cabina de flujo laminar horizontal (Telstar). El medio fue preparado con agua ultrapura (Milli-Q) y fue conservado en frascos estriles a 4C hasta su utilizacin. Los ovarios pertenecan a cerdas prepberes sacrificadas en el matadero El Pozo que fueron transportados al laboratorio en un termo con SS a 35C aproximadamente en menos de una hora.
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Material y Mtodos
Ya en el laboratorio los ovarios se lavaron en dos pases en Cetab y luego en dos pases de lavado en SS, ambos medios atemperados a 39C. Sobre placa calefactora a 39C se seccionaron los ovarios con un bistur seleccionando los folculos entre 3-6 mm de dimetro y se recogi el contenido folicular en PBSDm sobre placas de Petri. Los ovocitos se visualizaron bajo estereomicroscopio (Nikon), sobre una placa termostatizada a 39C en cabina de flujo laminar, donde se procedi a lavarlos en dos pases de PBSDm. Finalmente, los ovocitos que presentaban un citoplasma homogneo y estaban rodeados por varias capas de clulas del cumulus oophorus se recogieron a travs de una pipeta Pasteur adelgazada, con el extremo romo y conectada a una cnula de silicona para posteriormente agruparlos en placas de Petri de 35 mm de dimetro. 3.4.2. Maduracin in vitro (MIV) El medio de cultivo empleado para la maduracin fue el medio Waymouth (MB 752/1) con L-glutamina, 22 mg/ml de bicarbonato sdico (Merck) y 100 g/ml de sulfato de kanamicina que fue filtrado (022 m) y conservado en frascos estriles a 4C hasta su utilizacin. El pH fue ajustado a 74. En el momento de la MIV el medio fue suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10% de fluido folicular porcino, 10 UI/ml de PMSG, 10 UI de HCG y 1 g/ml de estradiol-17, tal como lo describen Yoshida et al. (1992).
43
Material y Mtodos
El sistema de MIV consisti en la utilizacin de microgotas de 100l de medio cubiertas con aceite de parafina. Se dispusieron 20 ovocitos rodeados por sus clulas del cmulus por microgota, a 385C y un 5% de CO2 en aire saturado de humedad. Despus de 20-22 h en el medio de maduracin los ovocitos fueron transferidos posteriormente al mismo medio de maduracin sin suplemento hormonal donde fueron lavados dos veces y cultivados 20-22 h (Funahashi et al., 1997) (Fig. 3A). 3.4.3. Fecundacin in vitro (FIV) Para la FIV se utiliz el medio TCM-199 (199 fiv) con L-glutamina y sales de Earle con 22 mg/ml de bicarbonato sdico y 75 g/ml de sulfato de kanamicina (199 stock) y suplementado con 12% de suero fetal bovino, 09 mM de piruvato sdico, 875 mM de lactato clcico, 305 mM de glucosa, 0068 mM de estreptomicina, 068 mM de penicilina y 36 mM de cafena, que fue filtrado y equilibrado a un pH de 74. Cada placa de FIV contena 2 ml de este medio, previamente preincubado, con 20 ovocitos procedentes de MIV, al que se le aadieron aproximadamente una hora ms tarde 100 l de la solucin espermtica. Las muestras de semen descongeladas, posteriormente diluidas en BTS, fueron centrifugadas a 50 g 3 min y el sobrenadante recuperado fue de nuevo centrifugado a 1200 g otros 3 min. El pellet resultante fue resuspendido hasta alcanzar la concentracin final deseada con medio 199 suplementado con 12% de suero fetal bovino inactivado, 091 mM piruvato sdico, 305 mM D-glucosa, 292 mM lactato clcico, 0168 mM de penicilina y 0068 mM de estreptomicina, a un pH de 78 y a 39C.
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Material y Mtodos
Se
calcul
la
concentracin
espermtica
en
cmara
hemocitomtrica para ajustar la concentracin espermtica final de espermatozoides. sta vari a lo largo de las distintas experiencias. Un volumen de 100 l finales de la solucin espermtica fue introducido en las placas de Petri que contenan a los ovocitos. Los ovocitos y los espermatozoides se coincubaron durante 16-18 horas en condiciones de 385C de temperatura y a 5% de CO2 en aire saturado de humedad (Fig. 3-B). 3.4.4. Fijacin y tincin Despus de 16-18 horas de coincubacin se lavaron los ovocitos en PBSDm atemperado eliminando mecnicamente con una pipeta automtica los espermatozoides adheridos a la superficie del ovocito y las clulas del cmulus, quedando as denudados. Los ovocitos fueron fijados y permanecieron en la solucin fijadora a base de cido actico:etanol (1:3, v/v) a temperatura ambiente durante 24 horas (Coy et al., 1992), tras las cuales se tieron con colorante Lacmoid al 1% (Chang, 1952). 3.4.5. Valoracin microscpica de resultados Los ovocitos fueron examinados bajo microscopio (Leica) de contraste de fases (40x), donde se valoraron los siguientes detalles: Los ovocitos en estado nuclear de vescula germinal se
consideraron inmaduros y fueron descartados del estudio.

45
Material y Mtodos
Los ovocitos en estado de metafase II con corpsculo polar se consideraron maduros. Se consider un ovocito degenerado cuando su citoplasma ofreca un aspecto granuloso y no se poda visualizar material cromosmico en su interior. stos fueron descartados del estudio. Se consideraron ovocitos penetrados aquellos que presentaban espermatozoides en el interior del citoplasma, ya sea con la cabeza en forma compacta, descondensada o en forma de proncleo masculino. Nmero de espermatozoides por ovocito: tenindose en cuenta los proncleos masculinos al igual que las cabezas espermticas en descondensacin y compactas. Ovocitos monosprmicos: aquellos que slo haban sido penetrados por un nico espermatozoide, apareciendo ste de forma compacta, descondensada o como proncleo. (Fig. 3 C-D). 3.5. FERTILIDAD IN VIVO Se utilizaron 24 cerdas reproductoras multparas pertenecientes a varias granjas comerciales. Se llev a cabo una doble inseminacin a las 12 y 24 horas despus de la deteccin del celo. Las hembras fueron inseminadas con semen descongelado a 50C/12 seg y posteriormente diluido en BTS atemperado a 37C. La concentracin de las dosis para la inseminacin fue aproximadamente de 5 x 109 esp en 100 ml de BTS.
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Material y Mtodos
Figura 3.
47
Material y Mtodos
El diagnstico de gestacin se realiz a los 23-25 das despus de la IA mediante ultrasonografa. Finalmente, se determin el porcentaje de fertilidad y el tamao de camada (nmero de lechones nacidos totales) 3.6. DISEO EXPERIMENTAL El trabajo se llev a cabo en 5 experiencias (Figs. 4, 5 y 6). 3.6.1. Crioprotectores Se utilizaron dos eyaculados procedentes de dos verracos sometidos a dos diferentes medios de congelacin. Las dos muestras se procesaron segn el mtodo anteriormente descrito con la adicin del medio de congelacin LEY (lactosa+yema) y posteriormente enfriados a 5C. A los 90 min se le aadi a una de las muestras 9% de glicerol y 15% de orvus et paste , quedando una concentracin final de 3% de glicerol y 05% de OEP. A la otra muestra se le aadi 13% de rafinosa y 15% de orvus et paste, quedando como concentracin final 43% de rafinosa y 05% de OEP. Se envasaron en pajuelas de 05 ml y se enfriaron con vapores de nitrgeno lquido para despus depositarlas en el tanque de nitrgeno. Las muestras se descongelaron de igual manera a 50C/12 seg y se diluyeron en BTS atemperado a 37C. Despus de un tiempo de incubacin de aproximadamente 30 min se analizaron los parmetros seminales y las muestras se prepararon para ser empleadas en el sistema de FIV. La concentracin espermtica utilizada en FIV fue de 10 x 106 esp/ml. Esta prueba experimental se realiz por triplicado.
48
Material y Mtodos
3.6.2. Velocidad de descongelacin Para evaluar el efecto de la velocidad de descongelacin se utilizaron 3 eyaculados procedentes de un mismo verraco los cuales fueron congelados y posteriormente sometidos a las siguientes velocidades de descongelacin: 1. Inmersin en agua a 37C durante 30 seg (350C/min) (Maxwell y Johnson, 1997). 2. Inmersin en agua a 50C durante 12 seg (800C/min) (Bwanga, 1991; Eriksson et al., 2000). Despus de un tiempo de incubacin de aproximadamente 30 min se analizaron los parmetros seminales y las muestras se prepararon para ser empleadas en el sistema de FIV. La concentracin espermtica utilizada en FIV fue de 1x106 esp/ml. Esta prueba experimental se realiz por triplicado. 3.6.3. Adicin de GSH al medio de congelacin Eyaculados de cuatro diferentes verracos fueron procesados segn el protocolo de congelacin de Westendorf et al. (1975), aadiendo 5 mM de GSH al medio de congelacin LEY, comparndose a la vez con un control. Las muestras fueron descongeladas a 50C durante 12 seg. Despus de un tiempo de incubacin de aproximadamente 30 min se analizaron los parmetros seminales y las muestras se prepararon para ser empleadas en el sistema de FIV. La concentracin espermtica utilizada en FIV fue de 10 x 106 esp/ml. Esta prueba experimental se realiz por triplicado.
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Material y Mtodos
3.6.4. Adicin de GSH al medio de descongelacin Se utilizaron eyaculados de dos verracos diferentes, que fueron congelados utilizando el medio de congelacin LEY (lactosa+yema) siguiendo el protocolo normal de congelacin y posteriormente sometidos a de descongelacin a 50C/12 seg y diluidos en el medio BTS mantenido a 37C y a diferentes concentraciones de glutatin: 0, 1 y 5 mM. Despus de un tiempo de incubacin de aproximadamente 30 min se analizaron los parmetros seminales y las muestras se prepararon para ser empleadas en el sistema de FIV. La concentracin espermtica utilizada en FIV fue de 10 x 106 esp/ml. Esta prueba experimental se realiz por triplicado. 3.6.5. Prueba de fertilidad in vivo Se descongelaron en la granja las dosis de semen
correspondientes a 3 machos en un bao termostatizado a 50C/12 seg. Se evalu la calidad del semen congelado-descongelado de estas muestras mediante contrastacin seminal para posteriormente pasar a la prueba de fertilidad in vivo mediante IA de las hembras a una concentracin de 5 x 109 espermatozoides por dosis. Estas muestras de semen fueron tambin probadas en un sistema de FIV en nuestro laboratorio a una concentracin de 5 x 106 esp/ml. Se contabiliz el porcentaje de cerdas gestantes, determinando la tasa de fertilidad y el nmero de lechones vivos y muertos al nacimiento.
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Material y Mtodos
Figura 4.
51
Material y Mtodos
Figuras 5 y 6
52
Material y Mtodos
3.7. ANLISIS ESTADSTICO Los valores de calidad seminal, el nmero de espermatozoides por ovocito penetrado y los porcentajes de penetracin, de monospermia y de formacin de proncleo masculino fueron analizados mediante un ANOVA de dos vas, considerando los experimentos 1 (crioprotectoreyaculado), 2 (velocidad descongelacin-eyaculado), 3 (tratamientomacho) y 4 (tratamiento-macho). El experimento 5 (macho) fue analizado con un ANOVA de una va y tambin con un estudio de correccin de Pearson entre los parmetros seminales in vivo e in vitro y los resultados de fertilidad y tamao de camada. Los resultados se muestran como medias SEM (error estndar de la media). En todos los casos los porcentajes fueron transformados segn el modelo binomial de parmetros. Para todo el anlisis estadstico se utiliz el General Linear Models del programa informtico SYSTAT 9.0 y cuando el ANOVA revel un efecto significativo los valores fueron comparados por el test de Tukey. Se consideraron diferencias estadsticamente significativas aqullas que alcanzaron niveles de probabilidad de p<005.
53
Resultados
4. RESULTADOS 4.1. EFECTO DE LA ADICIN DE CRIOPROTECTORES
(GLICEROL VS. RAFINOSA) El estudio sobre el efecto de la adicin de glicerol y rafinosa en el medio de congelacin relev diferencias significativas con respecto a los valores de motilidad y de calidad de movimiento en los que se observaron mejores resultados cuando se utiliz un medio con glicerol. Por otro lado, se encontr un efecto significativo del macho en MOT, NAR y DCF. No se detectaron diferencias significativas en el resto de parmetros seminales (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de los crioprotectores sobre la calidad del semen descongelado. M: macho. CR: crioprotector. MOT: % motilidad. CAL: calidad de movimiento. TV: % tincin vital. NAR: % acrosomas normales. DCF: % diacetato de carboxifluorescena .
M A A B B CR Glicerol Rafinosa Glicerol Rafinosa ANOVA CR M Interaccin
a,b
MOT 3772227ab 1667307c 4428428a 2969379b 0000 0007 0347
CAL 336009a 233017b 335014a 275037ab 0001 0357 0343
TV 4050585 4850096 4429428 5200231 0872 0106 0269
NAR 24419 3067355ab 4543346b 3075538ab 0387 0026 0027
DCF 2936256 2633084 35335 35361 0620 0025 0620
: Distintos superndices en la columna indican valores significativamente
diferentes (p<005).
En un sistema de FIV, los espermatozoides congelados en un medio que contena glicerol dieron lugar a una mayor tasa de penetracin, un mayor nmero de espermatozoides por ovocito y un
55
Resultados
menor porcentaje de monospermia, con respecto a los espermatozoides congelados en un medio que contena rafinosa. El efecto del macho slo es significativo para E/O (Tabla 2).
Tabla 2. Efecto de los crioprotectores en un sistema de FIV. M: macho. CR: crioprotector N: nmero de ovocitos. PEN: % penetracin. E/O: nmero de espermatozoides por ovocito. MON: % monospermia. FPM: % formacin de proncleo masculino.
M A A B B CR Glicerol Rafinosa Glicerol Rafinosa N 107 113 103 107 % PEN 7664411a 6283457a 9320249b 4766485c E/O* 175012a 165098a 335028b 131009a % MON* 5732550ac 5352596a 3021471b 7647600c %FPM* 6250775 7353768 7297520 7500903
ANOVA CR M Interaccion 0000 0866 <0001 <0001 0002 <0001 <0001 0713 <0001 0389 0431 0553
* Basado en ovocitos penetrados.

a,b
diferentes (p<005).
4.2. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE DESCONGELACIN Despus de la contrastacin seminal se pudo observar que la velocidad de descongelacin no ejerca ningn efecto estadsticamente significativo sobre los parmetros de calidad seminal. En el estudio de las diferentes velocidades de descongelacin se obtuvieron aceptables resultados para los dos mtodos, siendo ambos vlidos para obtener adecuada viabilidad posdescongelacin, excepto en NAR donde los valores en semen fresco normalmente suelen estar alrededor de un 8090% y en este caso no superan el 50%. En cuanto a la influencia del
56
Resultados
eyaculado si se detect un efecto sobre los parmetros de motilidad y NAR (Tabla 3).
Tabla 3. Diferentes velocidades de descongelacin (Velocidad descong.) sobre la calidad seminal. MOT: motilidad. CAL: calidad de movimiento. TV: % tincin vital. NAR: % acrosomas normales. DCF: % diacetato de carboxifluorescena. Velocidad descong. 50C/12 seg 37C/30 seg ANOVA Velocidad descong. Eyaculado Interaccin <0001 0459 0125 0658 0221 0132 <0001 0850 0082 0053 0462 0671 0058 0961 0117 6227353 6045401 364015 373014 7655174 7236186 4936434 4891357 6664253 6345241 MOT CAL TV NAR DCF
En cuanto a los resultados obtenidos tras la utilizacin de los espermatozoides descongelados en un sistema de FIV se alcanzaron buenos niveles de penetracin en las dos velocidades empleadas (Tabla 4). Sobre las tasas de penetracin y la tasa de monospermia no se encontraron diferencias significativas entre las dos velocidades de descongelacin estudiadas. S se reflej una diferencia significativa en el nmero de espermatozoides por ovocito y en el % de formacin de proncleo masculino cuando se emple el proceso rpido de descongelacin, en el que se obtuvieron mejores resultados. El eyaculado ejerci un efecto significativo en el porcentaje de penetracin, el nmero de espermatozoides por ovocito y el rango de monospermia (Tabla 4).
57
Resultados
Tabla 4. Diferentes velocidades de descongelacin en un sistema de FIV. N: n ovocitos. PEN: % penetracin. E/O: n espermatozoides por ovocito. MON: % monospermia. FPM: % formacin de proncleo masculino. Velocidad descong. 50C/12 seg 37C/30 seg ANOVA Velocidad descong. Eyaculado Interaccin
a,b
%PEN
E/O*
%MON*
%FPM*
230 254
6913305 7008288
391027 a 306019b
3396377 3483358
7547342 a 6573357b
0840 <0001 0949
<0001 <0001 <0001
0641 <0001 0519
0020 0654 0019
*Basado en ovocitos penetrados. : Distintos superndices en la columna indican valores significativamente diferentes (p<005).
4.3. EFECTO DE LA ADICIN DE GSH AL MEDIO DE CONGELACIN Los resultados de esta experiencia muestran que la adicin de 5 mM de GSH al medio de congelacin no determin diferencias significativas en cuanto a los parmetros de calidad seminal con respecto al grupo control (Tabla 5). Respecto al estudio en un sistema de fecundacin in vitro, no se observ el efecto de GSH pero si unos resultados variables debidos al efecto del macho, donde la interaccin macho-tratamiento fue de 0020 en el %PEN y de 0017 en EO, es decir, cada verraco mostr un efecto individual en presencia de GSH (Tabla 6).
58
Resultados
Tabla 5. GSH en el medio de congelacin sobre la calidad seminal. M: macho. Trat: tratamiento. MOT: motilidad. CAL: calidad de movimiento. TV: % tincin vital. NAR: % acrosomas normales. DCF: % diacetato de carboxifluorescena.
M A A B B C C D D Trat Control GSH Control GSH Control GSH Control GSH
ANOVA Trat M Interaccin 0888 0007 0089 0517 0006 0177 0668 0011 0703 0354 0005 0666 0119 0097 0484
MOT 3773227 385259 4300604 4100400 5292225 4417546 3312266 4286325
CAL 336009 35007 340019 35016 391008 367015 343015 364009
TV 405585 43629 58208 58505 6041374 5167626 5950323 5700186
NAR 2400419 2610673 492351 392467 3392254 2717376 2787372 2686268
DCF 2936256 2910475 344471 3180328 4692428 3354605 3737604 3186478
Tabla 6. GSH en el medio de congelacin en FIV. M: macho. Trat: tratamiento. N: n ovocitos. PEN: % penetracin. E/O: n espermatozoides por ovocito. MON: % monospermia. FPM: % formacin de proncleo masculino.
M A A B B C C D D Trat Control GSH Control GSH Control GSH Control GSH
ANOVA Trat M Interaccin 0264 <0001 0020 0479 0012 0017 0727 0011 0320 0743 0190 0815
N 91 97 117 115 124 123 87 96
% PEN 8791344a 6907472ab 7594372a 7206386a 3306424c 3171421c 5632535b 6667484b
E/O* 241017a 183012ab 208017ab 225017a 175016ab 136009b 181015ab 225021ab
% MON* 3625541a 4328610ab 5248499ab 4796507ab 5610785ab 6923749b 5306720ab 4375625ab
%FPM* 7250502 7313546 7129452 7340 458 6585750 7436708 8367533 7969507
*Basado en ovocitos penetrados.

a,b
diferentes (p<005). 59
Resultados
4.4. EFECTO DE LA ADICIN DE GSH AL MEDIO DE DESCONGELACIN Sobre los parmetros de calidad seminal, la adicin de 1 y 5 mM de GSH al medio de descongelacin no ejerci ningn efecto con respecto al grupo control (Tabla 7).
Tabla 7. Efecto de la adicin de GSH en el medio de descongelacin sobre la capacidad fecundante. M: macho. Trat: tratamiento. MOT: motilidad. CAL: calidad de movimiento. TV: % tincin vital. NAR: % acrosomas normales. DCF: % diacetato de carboxifluorescena.
M B B B C C C Trat Control 1 mM GSH 5 mM GSH Control 1 mM GSH 5 mM GSH ANOVA Trat M Interaccin 0870 0279 0945 0647 0689 0819 0987 0048 0960 0701 0627 0982 0980 0011 0879 MOT 5333667 5833441 55763 5000284 5100305 4969424 CAL 316017 367017 333033 323018 333017 328022 TV 71152 72252 72173 6126408 582463 6006429 NAR 3267240 2667371 3167233 3460307 3053419 3333408 DCF 657 686 705550 5221311 5028478 498389
En un sistema de FIV, la adicin de GSH al medio de descongelacin marc su efecto sobre la tasa de penetracin y sobre la formacin de proncleo masculino, en este ltimo caso con una tendencia de 0062 (Tabla 8).
60
Resultados
Tabla 8. Efecto de la adicin de GSH al medio de descongelacin en un sistema de FIV. M: macho. Trat: tratamiento. N: n ovocitos. PEN: % penetracin. E/O: n espermatozoides por ovocito. MON: % monospermia. FPM: % formacin de proncleo masculino.
M B B B C C C Trat Control 1 mM GSH 5 mM GSH Control 1 mM GSH 5 mM GSH ANOVA Trat M Interaccin <0001 <0001 0578 0254 <0001 0480 0292 <0001 0409 0062 <0001 0167 N 96 107 118 135 154 148 % PEN 8333382c 8505346c 9746146c 1852336a 2597354b 3176384b E/O* 316029b 344017b 401028b 120008a 132010a 136010a % MON* 3125521b 1429369b 2348397b 8000816a 7750669a 7447643a %FPM* 8125439bc 8462380c 8435340c 48001020a 6000784ab 7234660ac
*Basado en ovocitos penetrados.

a,b
diferentes (p<005).
4.5. EMPLEO DE SEMEN CONGELADO-DESCONGELADO EN UN SISTEMA DE FERTILIDAD IN VIVO FRENTE A UN SISTEMA DE FIV Despus de la utilizacin del semen congelado-descongelado en un sistema de fertilidad in vivo y de la contrastacin de los parmetros de calidad seminal se observ que el semen descongelado de los machos A y B presentaba un mayor nmero de clulas con membrana estructural y funcionalmente ntegras (TV y DCF) (Tabla 9).
61
Resultados
Tabla 9. Parmetros de calidad seminal del semen congelado-descongelado. M: macho. MOT: motilidad. CAL: calidad de movimiento. TV: % tincin vital. NAR: % acrosomas normales. DCF: % diacetato de carboxifluorescena.
M A B E ANOVA M
a,b
MOT 6420172 6200200 6156245
CAL 388523 395005 378909
TV 6763121a 7250288a 5833217b
NAR 3921156 4250349 395214
DCF 5514435a 6975317a 4983482b
0593
0315
<0001
0591
0036
diferentes (p<005).
Los resultados obtenidos en FIV son consistentes con los obtenidos en la fertilidad in vivo. Se detect una marcada tendencia (p=0066) para el efecto del macho sobre la fertilidad obtenida, probablemente debido a las limitaciones del ensayo de campo. El macho E obtuvo un menor porcentaje de penetracin y un menor nmero de espermatozoides por ovocito que los machos A y B (Tabla 10).
Tabla 10. Resultados de fertilidad en un sistema de FIV frente a un sistema de fertilidad in vivo. M: macho. N: n ovocitos. PEN: % penetracin. E/O: n espermatozoides por ovocito. MON: % monospermia. FPM: % formacin de proncleo masculino. FERT: % fertilidad. LNT: n lechones nacidos totales.
M A B E N 329 148 212 % PEN 6717259a 7230369a 4434342b E/O* 222011b 304033a 166013b % MON* 4072331a 4299481a 6170504b %FPM* 8733224 8692328 8298390 % FERT 8462 (11/13) 80 (4/5) 3333 (2/6) 0066 LNT 918154 115119 6
ANOVA M <0001 <0001 0002 0577
0380
* Basado en ovocitos penetrados.

a,b:
Distintos superndices en la columna indican valores significativamente
diferentes (p<005). 62
Resultados
El macho E en el sistema de fertilidad in vivo mostr un descenso en los porcentajes de fertilidad y tamao de camada, sin que se obtuvieran diferencias significativas debido al pequeo nmero de hembras inseminadas. Esto nos demuestra la marcada tendencia para el efecto macho sobre los resultados de fertilidad obtenidos. Los resultados totales de fertilidad conseguidos en la prueba de campo (total 7083%, 17/24) seran lo suficientemente eficientes como para su aplicacin comercial, en especial para los machos A y B (80 y 8462 % respectivamente). Tras el estudio estadstico entre los resultados de FIV y de fertilidad in vivo, se detectaron correlaciones significativas entre la fertilidad y la tasa de penetracin, monospermia y formacin de proncleo; no se encontr correlacin con el tamao de camada (Tabla 11).
Tabla 11. Relacin entre fertilidad y tamao de camada con respecto a los resultados de FIV. PEN: % penetracin. E/O: n espermatozoides por ovocito. MON: % monospermia. FPM: % formacin de proncleo masculino. FERT: % fertilidad. LNT: n lechones nacidos totales.
%FERT FIV Coeficiente correlacin (r) %PEN E/O %MON %FPM 0801 0553 -0680 0689 0009 0122 0044 0040 Significancia (p) Coeficiente correlacin (r) 0529 0178 -0132 0192 0143 0647 0736 0621 LNT Significancia (p)
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Discusin
5. DISCUSIN La discusin de los resultados obtenidos se presentar
considerando cada uno de los diferentes apartados del diseo experimental. 5.1. ADICIN DE CRIOPROTECTORES En ausencia de crioprotectores pocos espermatozoides han encontrado crioprotector la supervivencia han sido tras el proceso con de congelacin y descongelacin. Espermatozoides de verraco sin ningn tipo de almacenados baja viabilidad postdescongelacin (Wilmut y Polge, 1977). Dada la importancia del crioprotector como agente imprescindible en la crioconservacin espermtica, su estudio parece ser una buena va para mejorar la calidad y capacidad fecundante de los espermatozoides descongelados. Como ya se haba explicado anteriormente en la revisin bibliogrfica, el efecto solucin es aquel fenmeno que se produce durante el enfriamiento y por el que las clulas sufren una excesiva deshidratacin debido a una lenta velocidad de congelacin, lo que les provoca una exposicin a altas concentraciones de solutos (Mazur, 1984). El efecto del crioprotector hace que el agua salga de la clula con ms lentitud y as se minimiza el efecto solucin, permitiendo la salida de agua intracelular y evitando la formacin de cristales (deshidratacin celular). El crioprotector ms utilizado en la especie porcina es el glicerol, que a diferencia de otras especies animales debe ser empleado a bajas concentraciones (Watson, 1995). Otros crioprotectores como los azcares no penetran en las membranas espermticas y probablemente
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actan aumentando el porcentaje de agua extracelular no congelada (Mazur, 1984), stos se utilizan fundamentalmente en congelaciones ultrarpidas. Altos niveles de azcares ejercen un efecto negativo en la motilidad pero un efecto positivo en los acrosomas (Bwanga, 1991). Aunque poco se conoce acerca de la utilizacin de rafinosa en la especie porcina, las referencias sobre su empleo en espermatozoides de ratn s indican una accin claramente positiva sobre la calidad de los espermatozoides congelados-descongelados ya que aumenta sustancialmente la proteccin frente al choque de fro (Tao et al., 1995). Por otro lado, es importante determinar el adecuado porcentaje de crioprotector a emplear en la constitucin de los medios de congelacin. As, diferentes autores evaluaron distintas concentraciones de glicerol, Almlid y Johnson (1988) concluyeron que la concentracin ideal deba estar entre un 2 y un 4%, y Fiser et al. (1993) sealaron que despus de la congelacin existe una tasa ptima segn las diferentes concentraciones de glicerol (2-3%) donde el porcentaje de motilidad y NAR aumenta gradualmente cuando se aumenta la velocidad de calentamiento. Es por ello que en nuestro estudio se eligi una concentracin del 3% de glicerol como tasa media ptima para mejorar todos los parmetros de calidad seminal. La concentracin del crioprotector debe estar en relacin inversa a la velocidad de congelacin empleada, es decir, a mayor velocidad de congelacin debe ser usada una menor concentracin de glicerol (Polge et al., 1949, Mazur 1985). En lo que a viabilidad espermtica se refiere los resultados obtenidos en el tratamiento con glicerol estn dentro de los rangos descritos por otros autores (Bwanga, 1991; Watson, 1995; Holt, 1997). En nuestra experiencia los resultados de viabilidad espermtica pueden
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considerarse normales y comparables con los que obtienen los autores anteriormente citados. La adicin del glicerol repercute en unos resultados ms beneficiosos sobre la motilidad espermtica y calidad de movimiento en comparacin con los resultados de viabilidad espermtica de las muestras con rafinosa. El glicerol, adems, muestra mejores resultados en el sistema de FIV ya que produce un aumento en la tasa de penetracin y en el nmero de espermatozoides por ovocito. Sin embargo, el tratamiento con rafinosa produce mejores ndices en cuanto a las tasas de monospermia aunque quizs como consecuencia de los menores ndices de penetracin (Coy et al., 1999). Los resultados preliminares han determinado que las muestras congeladas con glicerol como agente crioprotector presentan los mejores ndices de capacidad fecundante, determinndose adems la influencia del verraco en los resultados. En la actualidad, se siguen planteando estudios sobre la accin aislada o en combinacin de diversos crioprotectores y su proporcin en los medios de congelacin de semen porcino con buenas perspectivas (Zheng et al., 1992, Katkov et al., 1999), as como su manera de adicin (Poto et al., 2000). 5.2. VELOCIDAD DE DESCONGELACIN La velocidad de descongelacin debe estar adaptada a la velocidad de congelacin y al tipo de envase seleccionado. En nuestro caso se utilizaron pajuelas de 05 ml ya que estudios previos (Hofmo y Almlid, 1990; Berguer y Fischerleitner, 1992; Crdova et al., 2001) demostraron que la viabilidad espermtica mejoraba significativamente con este tipo de envase despus de compararlo con otros de distinto dimetro.
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As, en el protocolo de congelacin descrito por Westendorf et al. (1975) se utilizaron pajuelas de 5 ml pero debido al gran dimetro del envase la viabilidad de los espermatozoides descongelados se redujo significativamente. La congelacin en este tipo de envase se produce de manera irregular en toda la pajuela al existir cierta distancia entre el centro y la periferia de la misma, dando lugar a una cristalizacin no uniforme (Weitze, 1987). Mazur (1984) observ que el principal dao celular producido en el proceso de congelacin de espermatozoides estaba causado por los cristales de hielo que crecan durante una lenta descongelacin y que una alta velocidad de descongelacin era esencial para la criosupervivencia. Adems, la posicin de los cristales determina el grado de dao celular y viabilidad al descongelar (Bwanga et al., 1991a). Por otro lado, Bamba y Cran en 1985 demostraron que el shock trmico producido por el rpido calentamiento causaba una inmediata disminucin en la proporcin de acrosomas normales, mientras que la motilidad y la respiracin celular se vean poco afectadas. Estos mismos autores (1988) pudieron comprobar que los espermatozoides de verraco eran daados severamente por el choque de calor, viendo que el efecto del rpido calentamiento era negativo para los acrosomas. De igual forma, observaron que para espermatozoides de toro y conejo el rpido calentamiento de semen desde 5C hasta 37C causaba tambin daos visibles en los acrosomas. Sealaron tambin que hay una importante influencia de otros factores como son la concentracin de glicerol, la temperatura y el grado de dilucin. Bwanga et al. (1991a) observaron que la presencia de alteraciones a nivel del acrosoma en las muestras descongeladas pueden ser debidas al proceso de descongelacin empleado. La velocidad de descongelacin
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es importante para la viabilidad espermtica, fundamentalmente para los acrosomas. Por todo lo expuesto, los estudios realizados han demostrado que es necesario encontrar un equilibrio para el adecuado desarrollo del proceso, ya que una velocidad rpida forma cristales de hielo en el interior de la clula y una velocidad lenta provoca una excesiva deshidratacin que da lugar a una exposicin prolongada de las clulas a altas concentraciones de solutos, lo que junto con el cambio de pH y la precipitacin de solutos produce alteracin celular. Por esta razn, se ha de buscar una velocidad adecuada, ni muy lenta ni demasiado rpida para facilitar la salida de la mayor parte de agua del interior de las clulas y para evitar la exposicin de espermatozoides al efecto solucin. En nuestro estudio hemos encontrado que con dos velocidades de descongelacin, prximas a las condiciones ptimas, se obtienen buenos resultados sobre la viabilidad espermtica, sobre todo cuando se utilizan altas velocidades de descongelacin, aunque los resultados en calidad seminal no presentan diferencias significativas. Y en cuanto a los resultados obtenidos tras un sistema de FIV, segn nuestras observaciones, las diferencias se establecen en el nmero de espermatozoides por ovocito y en el porcentaje de formacin de proncleo masculino, parmetros que aumentan significativamente cuando utilizamos la velocidad ms rpida. No hay que olvidar la importancia de la interaccin entre el rango de concentracin de glicerol, el rango de congelacin y el de descongelacin. Segn Jonhson et al. (2000) para una buena crioconservacin se requiere de una ptima combinacin de estas tres variables. As estos autores recomiendan para un mantenimiento
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adecuado de la motilidad e integridad de los acrosomas la siguiente combinacin: 3% glicerol, rango de enfriamiento entre 0C y 5C a una velocidad de 30C/min y una velocidad de descongelacin de 1200C/min. 5.3. ADICIN DE GSH A LOS MEDIOS DE CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE ESPERMATOZOIDES Existen evidencias que sugieren que las sustancias oxgeno reactivas (ROS), generadas durante la congelacin de espermatozoides, juegan un papel muy importante en la fertilidad (Shekarriz et al., 1995). Sin embargo, la relacin entre los niveles de antioxidantes en los eyaculados y la disminucin de la fertilidad despus de un proceso de congelacin-descongelacin no est totalmente explicada (Bilodeau et al., 2000). Lo que si se ha demostrado es que la composicin lipdica de las membranas espermticas en la especie porcina junto con el proceso de crioconservacin aumentan la produccin de sustancias ROS, por lo que el fenmeno de peroxidacin lipdica sera una de las causas de la baja viabilidad y fertilidad de los espermatozoides porcinos congelados (Nishimura y Morii, 1993). Alvarez y Storey (1989) evaluaron el efecto antioxidante de glutatin-peroxidasa y la proteccin de las membranas espermticas en ratn, conejo y humano, donde observaron que jugaba un papel importante en los mecanismos intracelulares de proteccin oxidativa. En este sentido, el ciclo del GSH ha demostrado ser un efectivo sistema de mecanismo de defensa intracelular contra el estrs oxidativo (Kosower et al., 1971).
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Li et al. (1975) encontraron niveles de 5nM de GSH despus de someter los eyaculados de perro, hombre, cordero y macho cabro a un proceso de lavado, mientras que en conejo y verraco fueron hallados niveles prcticamente despreciables de GSH, lo que demuestra que pueden estar relacionadas estas prdidas con la especial sensibilidad de la especie porcina al ataque oxidativo. Dawra et al. (1983) comprobaron que el lavado de los
espermatozoides exacervaba los procesos de peroxidacin lipdica en el semen de toro, ya que el plasma seminal era capaz de controlar la peroxidacin. De igual forma, Bilodeau et al. (2000) observaron como despus de someter a los espermatozoides de bovino a un proceso de lavado disminuan los niveles de GSH en un 78%. En la especie humana, si se ha demostrado que el lavado espermtico implica un aumento de las sustancias ROS (Shekarriz et al., 1995). Tambin se ha comprobado que los espermatozoides humanos que han sido alterados funcionalmente o han muerto despus de un proceso de crioconservacin, producen tambin un aumento en la generacin de sustancias ROS (Aitken et al., 1994). En la especie porcina no existen estudios sobre el efecto de la centrifugacin del eyaculado en la produccin de este tipo de sustancias, aunque si ha sido demostrado en la especie humana (Shekarriz et al., 1995). Todos estos estudios hacen pensar en la sensibilidad de los espermatozoides de ciertas especies como la porcina a la peroxidacin lipdica despus de un proceso de congelacin y nos motivan a estudiar el efecto de la adicin de sustancias antioxidantes para compensar esas prdidas.
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Actualmente, an no se ha demostrado el mecanismo de accin frente a la prevencin del mecanismo de peroxidacin lipdica. No obstante, si se ha podido evidenciar el efecto beneficioso de la aplicacin de antioxidantes en medicina humana para tratamientos de infertilidad (Irvine, 1996). En el mismo sentido, Lenzi et al. (1994) comprobaron que la administracin por va oral de GSH aumentaba los parmetros de calidad seminal en humanos. Sin embargo, la adicin de antioxidantes a los diluyentes de congelacin no siempre implica un efecto positivo en los espermatozoides; en este sentido, Aitken (1995) comprob que una determinada concentracin de antioxidantes puede provocar una accin prooxidante y generar sustancias ROS como consecuencia de una liberacin adicional de electrones. As, Miller y Aust (1989) determinaron que el cido ascrbico puede tener un efecto oxidante a bajas concentraciones y por el contrario, una accin antioxidante a concentraciones elevadas. Beconi (1993) observ que el cido ascrbico actuaba como antioxidante congelados a de una concentracin Donelly de et 5mM al. en espermatozoides vacuno. (1999)
determinaron el mismo efecto en espermatozoides humanos. Todos estos estudios demuestran que la concentracin del antioxidante es muy importante y ha de ser la adecuada para que ste ejerza un efecto positivo. Sinha et al. (1996) demostraron que aadiendo 5 mM de GSH al medio de congelacin se produca un aumento en la viabilidad de los espermatozoides descongelados de caprino dando como resultado un aumento de la motilidad y una disminucin en el porcentaje de acrosomas anormales, as como un aumento en la tasa de gestacin.
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Donnelly et al. (2000) pudieron comprobar que en humana la adicin de GSH e hipotaurina, simple o en combinacin en los medios de preparacin de espermatozoides, no tienen efecto significativo sobre la motilidad progresiva o sobre la integridad del ADN. Sin embargo, al aadir unos niveles de 10 mM de GSH y 10 mM de hipotaurina los espermatozoides si obtuvieron una significativa proteccin contra el H2O2 y la generacin de sustancias ROS. Existen adems numerosos estudios con otros antioxidantes que ejercen buenos resultados en los medios de espermatozoides como la catalasa que aumenta la viabilidad de los espermatozoides conservados a 5C (Foote, 1962) y la superxido dismutasa que produce un aumento en la motilidad espermtica en la especie humana (Kobayashi et al., 1991). Tambin se han realizado diversos estudios con la glutamina en los que se ha demostrado que aumenta la motilidad en espermatozoides descongelados de caballo a una concentracin de 40 mM (Trimeche et al., 1999) y produce tambin un aumento en la motilidad y fertilidad de espermatozoides humanos descongelados (Renard, 1996). Kuo y Huang (1999) probaron la adicin de catalasa como antioxidante junto con LEY (lactosa + yema de huevo) en el medio de descongelacin de semen porcino y encontraron que la motilidad posdescongelacin era significativamente mejor despus de aadir dicha mezcla que en su ausencia. Tambin comprobaron que estas sustancias podran ser importantes para la supervivencia de espermatozoides en el tracto reproductor femenino ya que observaron que despus de ser empleado en un sistema de fertilidad in vivo se consiguieron unos resultados de concepcin y de tamao de camada elevados.
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De todo esto se deriva la importancia de encontrar sustancias antioxidantes que al aadirlas al medio de congelacin puedan mejorar la viabilidad y capacidad fecundante de los espermatozoides de verraco. Por todas estas consideraciones planteamos para este trabajo la adicin de antioxidantes, en nuestro caso GSH a una concentracin de 5 mM, con el fn de poder comprobar si se produce una mejora en los ndices de viabilidad espermtica y capacidad fecundante de los espermatozoides de verraco en un sistema de FIV. En nuestra experiencia no pudimos observar tal efecto sobre la calidad seminal cuando se aadi GSH al medio de congelacin, ya que no se encontraron diferencias significativas. Sin embargo, despus de demostrar que el GSH previene la produccin de malondialdehdos al aumentar la actividad de la superxido dismutasa, determinaron que la adicin de este antioxidante si que conllev a un aumento en los porcentajes de motilidad de los espermatozoides congeladosdescongelados, dando como consecuencia un aumento en el rango de concepcin y el tamao de camada. En cuanto a nuestros resultados sobre la capacidad de penetracin in vitro no se pudo observar el efecto del GSH, , aunque los resultados fueron variables dependiendo del macho (ya que la interaccin macho-tratamiento fue de 0020 en el %PEN y de 0017 en EO), confirmando por otra parte, las diferencias en la capacidad de congelacin que presentan los diferentes verracos (Medrano y Holt, 1998). Es importante anotar que la peroxidacin lipdica, con su consecuente dao celular, acontece tambin durante el proceso de descongelacin, aunque este mecanismo todava no est del todo claro.
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Como se haba comentado previamente el GSH protege a los espermatozoides de la peroxidacin lipdica, proceso que ocasiona prdidas irreversibles de motilidad, inhibicin de la respiracin celular por prdida de enzimas intracelulares y daos cromatnicos (White, 1993). En nuestros resultados, cuando se aade GSH al medio de descongelacin encontramos un efecto positivo sobre los parmetros de FIV, aumentando el porcentaje de penetracin y el porcentaje de FPM. En cambio, no se determin ningn efecto significativo sobre la calidad seminal. Todos los estudios que se conocen acerca de la adicin de GSH en los medios de preparacin de espermatozoides han obtenido resultados significativos cuando se han utilizado en sistemas de FIV (Nishimura y Morii, 1993; De Matos et al., 1996), por el contrario, no se conocen suficientes trabajos que demuestren su eficacia sobre la viabilidad espermtica cuando el GSH es utilizado como complemento en los medios de descongelacin de espermatozoides en la especie porcina. Nuestros resultados sugieren la posibilidad de usar GSH como complemento en los sistemas de FIV cuando utilizamos semen congelado de verraco. Aunque en nuestro caso el GSH no ha demostrado que ejerza la accin protectora referida, sera muy interesante seguir investigando en este campo, fundamentalmente aumentando el nmero de reproductores en las futuras experiencias, analizando primeramente la prdida de GSH que se produce durante el proceso de congelacin (Gadea, datos no publicados), los efectos de diferentes concentraciones del antioxidante (ya que si bien una determinada concentracin puede ser eficaz sobre la viabilidad espermtica luego puede no serlo tanto
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sobre la capacidad fecundante) y la combinacin de los mismos que aumenten la proteccin de los espermatozoides contra el ataque de los radicales. 5.4. EMPLEO DE SEMEN CONGELADO-DESCONGELADO EN UN SISTEMA DE FERTILIDAD IN VIVO FRENTE A UN SISTEMA DE FERTILIDAD IN VITRO Desde que en la dcada de los setenta se obtuvieran las primeras camadas a partir de semen congelado por inseminacin quirrgica (Polge et al., 1970) e inseminacin cervical (Crabo y Einarsson, 1971; Graham et al. 1971b), se han realizado muchos esfuerzos para optimizar los procesos de congelacin. El objetivo que se pretende es obtener unas tasas de fertilidad al menos de un 65-70% que permitan su utilizacin en condiciones comerciales (Rodriguez-Martnez, 2001). Los resultados obtenidos en esta experiencia muestran, an con las limitaciones de nuestros ensayos, que para dos de los tres verracos estudiados se alcanzan estos objetivos (fertilidad >80%) y podran ser suficientes como para iniciar una etapa en el uso comercial de machos con fertilidad probada. Estos resultados de fertilidad pueden compararse de algn modo con los obtenidos por Bwanga et al. (1991), Almlid y Hofmo (1996), Bertani et al. (1997) y Eriksson et al. (2000). De este modo se pone de manifiesto que la IA con semen congelado puede ser una alternativa al semen refrigerado en determinadas condiciones, posibilitndose la creacin de bancos de semen para su transporte a largas distancias y para la conservacin de los recursos genticos de razas en peligro de extincin y de animales de alto valor.
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Discusin
No hay que olvidar que el semen congelado tiene una vida ms corta que el semen fresco en el tracto genital de la hembra debido a los cambios que sufren las membranas espermticas (Rodriguez-Martnez, 2000), por lo que es importante que estos espermatozoides encuentren los ovocitos de la hembra ms rpidamente que cuando se utiliza semen fresco. Por ello la IA con semen congelado se realiza con otro patrn de aplicacin que permita sincronizar la vida de los espermatozoides y la de los ovocitos. En nuestro caso se procedi a dos inseminaciones, a las 12 y a las 24 h despus de haberse detectado el celo, mientras que Eriksson et al. (2000) sugiere la inseminacin 24-30 h despus de detectarse el celo y una segunda inseminacin 12 h despus, asegurando as un momento de inseminacin prximo al momento de la ovulacin (Waberski et al., 1994). Las limitaciones que supone el grn nmero de espermatozoides congelados utilizados por dosis de inseminacin (5x109) y en consecuencia el reducido nmero de dosis que puede obtenerse por eyaculado, parece que pueden verse solventadas con el desarrollo de los nuevos sistemas de inseminacin intrauterina (Krueger y Rath, 2000, Martnez et al., 2001; Watson et al., 2001). Otro factor muy importante es la evaluacin de la calidad del semen descongelado mediante diferentes mtodos de anlisis in vitro (Woelders, 1990). Al estudiar las diferencias entre la capacidad de congelacin de los diferentes machos, encontramos que el semen congelado de los machos A y B result tener un mayor nmero de clulas con membrana estructural y funcionalmente ntegras (EN y DCF) y tambin tener una mayor capacidad de penetracin in vitro que el macho E (Tablas 9 y 10). Estos resultados confirman por una parte las diferencias en la
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capacidad de congelacin que presentan los diferentes verracos (Medrano y Holt, 1998; Gadea et al., 1998b) y por otra parte ponen de manifiesto la mayor capacidad discriminante que presenta la fecundacin in vitro frente a los parmetros que habitualmente se utilizan para medir la calidad seminal (motilidad y acrosomas) (Gadea et al., 1998a). De todas las tcnicas utilizadas, las que mejor predicen la capacidad fecundante son aquellas que estudian la interaccin entre los gametos (Larsson y Rodriguez-Martnez, 2000). En la especie porcina se han utilizado diversos sistemas de fecundacin in vitro que permiten predecir la capacidad fecundante del semen refrigerado con una elevada precisin (Ivanova y Mollova, 1993; Xu et al., 1998; Gadea et al., 1998a; Gadea y Mats, 2000). Sin embargo, se dispone de escasa informacin acerca del semen congelado (Wang et al., 1991; Gadea et al., 1998b; Eriksson, 2000). Podemos terminar concluyendo que los sistemas de FIV pueden ser una buena herramienta para la evaluacin de la calidad del semen porcino congelado que vaya a ser utilizado de manera comercial, al igual que para comprobar la calidad de los bancos de semen y para evaluar los distintos mtodos de congelacin (Gadea et al., 2001).
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Conclusiones
6. CONCLUSIONES
1. El glicerol se comporta como un crioprotector ms efectivo que
la rafinosa, al aumentar los parmetros de calidad seminal en cuanto a motilidad y calidad de movimiento de los espermatozoides descongelados. Adems, el glicerol ejerce un efecto positivo en los sistemas de FIV aumentando el porcentaje de penetracin y el nmero de espermatozoides por ovocito.
2. Una velocidad rpida de descongelacin supone, dentro de un
sistema de FIV, una mejora significativa del nmero de espermatozoides por ovocito y del porcentaje de formacin de proncleo masculino.
3. La adicin del antioxidante GSH tanto en el medio de
congelacin como en el medio de descongelacin no refleja ningn incremento significativo sobre los parmetros de calidad seminal, pero s modifica la capacidad fecundante de los espermatozoides, cuando se utiliza el GSH en el medio de descongelacin al aumentar los porcentajes de penetracin y de formacin de proncleo masculino, mientras que cuando se utiliza en el medio de congelacin ejerce un efecto variable dependiendo del macho.
4. La FIV es el mejor sistema para la evaluacin de la calidad
capacidad fecundante del semen congelado/descongelado. 5. En cuanto a la fertilidad in vivo, los resultados obtenidos, en condiciones normales, estn muy marcados por el efecto macho, pero ofrecen resultados viables para la aplicacin comercial de la IA con semen congelado.
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Resumen
7. RESUMEN La crioconservacin espermtica porcina sigue siendo una tarea difcil, fundamentalmente debido a la baja resistencia de los espermatozoides porcinos a la disminucin de temperatura, a causa de los cambios a nivel de membrana plasmtica que se producen durante procesos como son la dilucin, el enfriamiento y la congelacin. Los objetivos de este trabajo se han centrado en el estudio de varios factores que pueden ejercer un efecto positivo en dichos procesos, as se han realizado las siguientes experiencias: 1) adicin de diferentes crioprotectores en el medio de congelacin (glicerol vs. rafinosa), 2) estudio de dos diferentes velocidades de descongelacin (37C/30 seg vs. 50C/12 seg), 3) adicin de glutatin (GSH) como antioxidante en el medio de congelacin, 4) adicin de GSH en el medio de descongelacin y 5) evaluacin de la fertilidad in vivo del semen congeladodescongelado frente a un sistema de fertilidad in vitro. Todos estos factores fueron analizados, tras la descongelacin de los espermatozoides, mediante la contrastacin de los parmetros seminales y mediante un sistema de FIV. En cuanto a los resultados obtenidos tras el estudio de crioprotectores se encontr un efecto positivo sobre la motilidad y calidad de movimiento cuando se utiliz glicerol y una mayor tasa de penetracin y un mayor nmero de espermatozoides por ovocito despus de utilizar glicerol frente a rafinosa. Con respecto a las velocidades de descongelacin estudiadas, no se encontr ningn efecto significativo en los parmetros de calidad seminal, aunque si se detect el efecto del eyaculado sobre la motilidad y estado del acrosoma despus de utilizar la velocidad ms rpida. Y en
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Resumen
cuanto a los resultados obtenidos tras un sistema de FIV la velocidad ms rpida de descongelacin obtuvo un mayor nmero de espermatozoides por ovocito y un mayor porcentaje de formacin de proncleo masculino. Tambin el eyaculado ejerci su efecto en los porcentajes de penetracin y monospermia y en el nmero de espermatozoides por ovocito. En cuanto a la adicin de GSH como antioxidante en los medios de congelacin y descongelacin de espermatozoides, no se obtuvieron diferencias significativas en los parmetros de calidad seminal con respecto al grupo control. Tras un sistema de FIV, la utilizacin de GSH en el medio de congelacin determin unos resultados muy variables por el efecto del macho, mientras que cuando se utiliz GSH en el medio de descongelacin se obtuvo un efecto significativo sobre la tasa de penetracin y de formacin de proncleo masculino. Por ltimo, cuando se evalu el semen congelado-descongelado en un sistema de fertilidad in vivo se observ que para dos de los tres verracos estudiados se alcanzan estos objetivos y podran ser suficientes como para iniciar una etapa en el uso comercial de machos con fertilidad probada. Se puso de manifiesto la mayor capacidad discriminante que presenta la fecundacin in vitro frente a los parmetros que habitualmente se utilizan para medir la calidad seminal (motilidad y acrosomas), ya que se obtuvo un alto coeficiente de correlacin (r=0801, p=0009) entre el porcentaje de penetracin y la tasa de fertilidad. Como conclusiones podemos determinar que: 1) el crioprotector ms efectivo de los estudiados en la congelacin de espermatozoides porcinos es el glicerol, 2) una velocidad de descongelacin rpida favorece la capacidad de penetracin del semen congelado, 3) la adicin
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Resumen
de sustancias antioxidantes como el GSH parece ser capaz de prevenir las alteraciones que sufre el espermatozoide en los procesos de descongelacin, 4) la FIV es el mejor sistema para la evaluacin de la capacidad fecundante del semen congelado/descongelado y 5) en cuanto a la fertilidad in vivo, los resultados obtenidos, en condiciones normales, estn muy marcados por el efecto macho, pero ofrecen datos viables para la aplicacin comercial de la IA con semen congelado.
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Summary
8. SUMMARY The porcine sperm cryopreservation is still a difficult work mainly due to the low resistance of porcine spermatozoa, to a temperature decrease because of the changes in the membrane plasmatic during the different processes of the technique such as the dilution, cooling and freezing. The aim of this experimental work was to the study of some factors which can exert a positive effect in such processes. Likewise, the objectives of this study have been: 1) the addition of different cryoprotectors to the freezing media (glycerol vs. rafinose), 2) the study of two different thawing speeds (37C/30 sec vs. 50C/12 sec), 3) the addition of gluthation (GSH) as an antioxidant cryoprotectors to the freezing medium, 4) the addition of GSH to the thawing medium and 5) the evaluation of the fertility of the frozen-thawed semen under in vivo conditions in front of an in vitro fertility system. All these factors were analyzed after the thawing of the spermatozoa both by the study of the seminal parameters and an IVF system. Regarding the obtained results after the study of the
cryoprotectors it was observed a positive effect on the motility, quality of movement, rate of penetration and sperm per oocyte when glycerol was employed vs rafinose With respect to the study of the different thawing speeds it was not observed any significant effect in the parameters of quality semen although it was detected an effect of the ejaculate on the motility results as well as in the status of the acrosome after using the faster speed. The results after the use of an IVF system the faster thawing speed reached a higher number of sperm per oocyte and male pronuclear formation. In
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Summary
the same way, the ejaculate showed a significant effect on the penetration and monospermy rates and in the number of sperm per oocyte. Regarding the addition of GSH to the freezing and thawing media as an antioxidant it was not observed significant differences in the parameters of semen quality with respect to the control group. After the use of an IVF system the addition of GSH to the freezing medium had variable results because of the male effect. However, when GSH was added to the thawing medium we observed a significant effect on the penetration rate and the male pronuclear formation. Finally, when it was evaluated the frozen-thawed semen in an in vivo fertility system by AI in front of an IVF system it was possible to have pregnancies although it was observed a marked tendency for the male effect. Moreover, significant correlations between the fertility and the penetration rate, monospermy and male pronuclear formation but no with litter size. As conclusions we can determine that 1) the glycerol is a cryoprotector more effective than rafinose, 2) a fast thawing speed had a more positive effect in an IVF system, 3) the GSH seems to be able to modify the fertilization ability of the spermatozoa in an IVF system, mainly when it is added to the thawing medium and 4) the in vivo fertility results are highly correlated with IVF results and they show a marked tendency of the boar on the fertility results.
87
Abreviaturas
9. ABREVIATURAS ADN: cido desoxiribonucleico. ATP: adenosin trifosfato. BTS: Beltsville thawing solution. CAL: calidad de movimiento. CR: crioprotector. CTC: clortetraciclina. DCF: diacetato de carboxifluorescena. DMSO: dimetil sulfxido. E/O: nmero de espermatozoides por ovocito. EDTA: cido etilen-diamino-tetractico. esp: espermatozoides. % FERTILIDAD: porcentaje de fertilidad. FIV: fecundacin in vitro. % FPM: porcentaje de formacin de proncleo masculino. GLI: glicerol. GSH: glutatin. HCG: gonadotropina corinica humana. hIVP: test de FIV homoespecfico. HOST: hyposmotic swelling test. Test de endosmosis o hiposmtico. IA: inseminacin artificial. IP: ioduro de propidio. LEY: lactosa-yema. LNT: nmero de lechones nacidos totales. MIV: maduracin in vitro. % MON: porcentaje de monospermia. MOT: motilidad. NAR: porcentaje de acrosomas normales. N2L: nitrgeno lquido.
89
Abreviaturas
OEP: orvus es paste. ORT: osmotic resistence test. Test de resistencia osmtica. PBSDm: tampn fosfato salino de Dulbecco modificado. % PEN: porcentaje de penetracin espermtica. PMSG: gonadotropina srica de yegua gestante. RAF: rafinosa. ROS: sustancias oxgeno reactivas. SPA: sperm penetration assay. Test de penetracin con ovocitos de hmster libres de zona pelcida. SS: solucin salina con kanamicina. SSF: solucin salina formolada. TCM-199: tissue culture medium. TV: porcentaje de tincin vital.
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UNIVERSIDAD DE MURCIA

FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Biologa Animal Ctedra de Fisiologa Animal

ELENA SELLS SORIANO MURCIA, DICIEMBRE DE 2.001

4.2. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE DESCONGELACIN .............. 56

consideraron inmaduros y fueron descartados del estudio.

4. RESULTADOS 4.1. EFECTO DE LA ADICIN DE CRIOPROTECTORES

MOT 3772227ab 1667307c 4428428a 2969379b 0000 0007 0347

CAL 336009a 233017b 335014a 275037ab 0001 0357 0343

TV 4050585 4850096 4429428 5200231 0872 0106 0269

NAR 24419 3067355ab 4543346b 3075538ab 0387 0026 0027

DCF 2936256 2633084 35335 35361 0620 0025 0620

: Distintos superndices en la columna indican valores significativamente

* Basado en ovocitos penetrados.

: Distintos superndices en la columna indican valores significativamente

0840 <0001 0949

<0001 <0001 <0001

0641 <0001 0519

0020 0654 0019

MOT 3773227 385259 4300604 4100400 5292225 4417546 3312266 4286325

CAL 336009 35007 340019 35016 391008 367015 343015 364009

TV 405585 43629 58208 58505 6041374 5167626 5950323 5700186

NAR 2400419 2610673 492351 392467 3392254 2717376 2787372 2686268

DCF 2936256 2910475 344471 3180328 4692428 3354605 3737604 3186478

N 91 97 117 115 124 123 87 96

% PEN 8791344a 6907472ab 7594372a 7206386a 3306424c 3171421c 5632535b 6667484b

E/O* 241017a 183012ab 208017ab 225017a 175016ab 136009b 181015ab 225021ab

% MON* 3625541a 4328610ab 5248499ab 4796507ab 5610785ab 6923749b 5306720ab 4375625ab

*Basado en ovocitos penetrados.

: Distintos superndices en la columna indican valores significativamente

*Basado en ovocitos penetrados.

: Distintos superndices en la columna indican valores significativamente

MOT 6420172 6200200 6156245

CAL 388523 395005 378909

TV 6763121a 7250288a 5833217b

NAR 3921156 4250349 395214

DCF 5514435a 6975317a 4983482b

: Distintos superndices en la columna indican valores significativamente

ANOVA M <0001 <0001 0002 0577

* Basado en ovocitos penetrados.

Distintos superndices en la columna indican valores significativamente

5. DISCUSIN La discusin de los resultados obtenidos se presentar

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