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Rabat 2011-2012
ENZYMOLOGIE?
L'enzymologie est la partie de la biochimie qui tudie les proprits structurales et fonctionnelles des enzymes. Elle sintresse aussi dcrire la vitesse des ractions catalyses par les enzymes (cintique enzymatique).
Introduction
Les organismes vivants sont le sige dinnombrables ractions biochimiques. Ces ractions constituent le mtabolisme cest dire la biosynthse et le catabolisme dun grand nombre de molcules biologiques. Ces ractions se droulent dans des conditions physiologiques (pH:7,4 et temprature :37oC) grce la prsence des enzymes Sans la prsence des enzymes, la vie serait impossible Les enzymes ont donc un rle vital
Contenu du cours
Expliquer les diffrents types de classifications des enzymes et dresser les diffrents groupes Dcrire la structure des enzymes et des coenzymes Expliquer le mode daction des enzymes Citer les facteurs qui influencent la cintique enzymatique Expliquer le mode daction des diffrents facteurs influenant la cintique enzymatique
Catalyseurs biologiques trs puissants Elles augmentent la vitesse des ractions chimiques, sans en modifier lquilibre.
A + B C +D
Les protines enzymatiques sont synthtises par des tres vivants. Cette synthse est dtermine gntiquement. Chaque enzyme est le produit dexpression dun gne Parfois 2 gnes
S + E substrat
ES
P + E produit
2- Historique
1730: La digestion est un phnomne plus chimique que mcanique 1850: Pasteur dmontra que la fermentation du sucre en alcool par la levure est catalyse par une substance qui existe dans la levure
En zyme
dans 1897: 1929: levure
Buchner a extrait de la levure les premires enzymes La 1re enzyme purifie et cristallise est lurase Ure Urase
3- PROPRIETS ET CARACTRISTIQUES DES ENZYMES 3.1- Agissent en trs faible quantit: une molcule de catalase peut hydrolyser 5 millions de molcules dH2O2 en une min dans des conditions de pH et de temprature physiologiques 3.2- Ne sont pas consommes au cours de la raction: comme les catalyseurs chimiques, elles se retrouvent intactes la fin de la raction 3.3- Sont spcifiques: Une enzyme transforme un S donn (spcificit de substrat) grce une raction donne (spcificit de raction)
oxydase
oxydation dsamination HK et GK
AA (S)
Spcificit troite Certaines E peuvent distinguer entre la forme D et L ou entre la forme et Spcificit large R-P HK, PAL Phosphatase alcaline = strospcificit
R+ P
3.4- Mode daction des enzymes S nergie tat de transition sans catalyseur Energie dactivation catalyseur enzyme tat initial tat final Les enzymes abaissent lnergie dactivation droulement de la raction P
Sans catalyseur : 18 kcal/mole dH2O2 Catalyseur chimique (le platine) : 11,7 kcal/mole dH2O2 Enzyme (catalase) : 2 Kcal/mole dH2O2 Les enzymes abaissent lnergie dactivation Elles ne modifient pas lquilibre Elles augmentent la vitesse de raction 3.5- Les enzymes sont rgulables Lactivit catalytique de nombreuses enzymes varie en rponse des signaux mtaboliques (inhibiteurs, activateurs)
ex: Chymotrypsine
cofacteur apoenzyme
Une partie non protique: cofacteur - ion mtallique - coenzyme, groupement prosthtique
Apoenzyme: intervient dans la spcificit, thermolabile Cofacteur: effectue la raction chimique, thermostable
4.1- Les enzymes holoprotiques: Les enzymes sont des protines globulaires. Elles peuvent tre formes: - dune seule chane polypeptidique Exemple: le lysozyme
- de plusieurs chanes identiques ou diffrentes Exemples: Isoenzymes (LDH, CPK) enzymes allostriques
- Mise en vidence des AA du site actif: a- Utilisation des composs qui se fixent spcifiquement un AA Diisopropylfluorophosphate (DFP): Serine Parachloromercuribenzoate: Cystine Drivs arsenicaux: Cystine b- Mthodes de gnie gntique
4.1.2- Relation entre la structure spatiale et la fonction catalytique Exemple: : la trypsine: enzyme pancratique
Zymogne
Trypsinogne Nt Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (inactif)
His His
49
29
Ser
183
S S
entrokinase : E intestinale
Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
Site actif
His His 29 49 183
Trypsine (active)
Ser S S
Le dpart de lhexapeptide, fortement charg (-) par les 4 Asp, modifie la conformation de la protine, en favorisant la formation dhlice .
1890:
Fischer a propos que la forme du substrat est complmentaire de la forme du site actif de lenzyme = modle de la cl et de la serrure
1958:
Koshland a propos que lenzyme et le substrat adaptent mutuellement leurs formes respectives Une molcule denzyme nest pas rigide mais flexible = modle de lajustement induit (comme la main et le gant)
coenzymes
Lorsque le coenzyme se lie la protine enzymatique par une liaison covalente, on parle de groupement prosthtique Lorsque la liaison est faible on parle de cofacteur apoenzyme
4-2-2 Coenzyme
Molcule indispensable la raction enzymatique. La raction se produit avec le coenzyme et non avec la protine (coenzyme = site catalytique) Lapoenzyme intervient dans la spcificit (site de fixation) Mode daction des coenzymes
A + FADH2
BH2 + FAD
Le coenzyme nest pas spcifique: plusieurs enzymes diffrentes peuvent avoir le mme coenzyme certaines enzymes ont besoin dun ion mtallique et dun groupement prosthtique: cas des cytochromes: noyau porphyrique + Fe2+
E1 Dcarboxylase Acide amin E2 Aminotransfrase E3 Oxydase 1961: lunion internationale de biochimie (UIB) : nouvelle classification des enzymes selon le type de raction catalyse
6 classes denzymes
Aox + Bred
Hydroxylases: (=monooxygnases) -CH2OH -CHOH-CH3 -CH2 Dshydrognases:
Ared + Box
catalysent la fixation dun atome doxygne
lactate dshydrognase CH3- CHOH-COOH + NAD+ CH3-CO-COOH ac. pyruvique ac. lactique
+ NADH + H+
Cytochromes: ont un coenzyme hminique avec un ion, qui prsente 2 tats doxydation, ce qui en fait un transporteur dlectrons. Fe2+ Fe3+ + 1erduit oxyd
5.2- Les transfrases catalysent le transfert de groupement autre que lhydrogne entre deux substrats ncessitent un coenzyme
A-X + B
A + B-X
les transaminases: transfrent les radicaux amins -NH2 dun AA un acide ctonique accepteur. Le coenzyme est le phosphate de pyridoxal. les phosphokinases ou kinases: transfrent un P sur une molcule dADP. Lion Mg++ est indispensable. ATP + glucose Les transactylases: ADP + glucose 6P
transfrent les radicaux actyles(-CH2COOH), le coenzyme est CoA transfrent les radicaux mhyles (-CH3), dune molcule une autre, le coenzyme est lacide tetrahydrofolique.
Les transmthylases:
Les estrases: hydrolysent les esters en acides gras et en alcool RCOO-CH2-R + H2O RCOOH + RCH2OH
Les lipases : hydrolysent les glycrides en glycrol et en acides gras Les osidases: hydrolysent les osides glucosidase, galactosidase Les enzymes protolytiques: hydrolysent les liaisons peptidiques R-CO-NH-R + H2O RCOOH + NH2-R
CH NH2
COOH
R-CH2-NH2 + CO2
catalysent le transfert dun radical dune partie dune molcule une autre
CH3 H C CO CoA COOH
COOH
Succinyl CoA
A+B
6- PRINCIPAUX COENZYMES
Origine des coenzymes 1- mtabolisme 2- Vitamine (ATP, S adnosyl mthionine)
(= amine vitale)
Un certain nombre de coenzymes drivent de vitamines, notamment de vitamines hyrosolubles et en particulier les vitamines du groupe B
- Coenzymes intervenant dans les ractions doxydorduction (4 coenzymes) - Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement (6 coenzymes)
6.1- Coenzymes intervenant dans les ractions doxydorduction 6.1.1- Nicotinamide adnine dinuclotide (NAD+) et NADP+ Structure NAD+
CO- NH2
nuclotide
O HO P O H H OH O H
N+
H OH
O N
NH2 N
nuclotide
HO P O O H H OH O H
Adnine
N
H OH
centre actif
CO- NH2 O HO P O H H O OH O H H OH NH2 N N HO P O O H H OH HO O H O P O H N N N+
NAD+
NADP+
OH
Mcanisme ractionnel AH2 + Substrat rduit NAD+ (ou NADP+) A + NADH + H+ (ou NADPH) Substrat oxyd
H H CO- NH2 N
H CO- NH2 N+
AH2 +
+ H+
Substrat oxyd
260
350
Spcificit NAD+ Localisation mitochondriale Coenzyme doxydation NADP+ Localisation cytoplasmique Coenzyme dhydrognation, de biosynthse
[NAD+]
>
[NADP+]
La plupart des enzymes sont spcifiques soit du NAD+ soit du NADP+ sauf qq exceptions comme la glutamate dshydrognase Origine Le NAD+ et le NADP+ sapparentent la vitamine B3 ou PP (pellagre preventive) Lavitaminose PP entrane une maladie appele pellagre
6.1.2- Flavine mononuclotides (FMN) et Flavine adnine dinuclotide (FAD) Structure Flavine mononuclotides: FMN ribitol
O CH2 CH3 (CHOH)3 CH2 O P OH N N O OH
NH CH3 N O
NH CH3 N O
OH
P O
NH2 N N N
Ac adenylique
N CH2 O H H OH H H OH
Mcanisme ractionnel
E
A +
N
AH2 +
N
Les FMN et FAD sont appels ferments jaunes FMN et FAD sont lis lenzyme: groupements prosthtiques
Les dshydrognases FAD les plus importantes sont les NADH dshydrognases qui permettent la roxydation du NADH
FAD
FADH2
6.1.3- Les ferroporphyrines: Coenzymes associs aux cytochromes grpt prosthtique + Fe Structure
CH3 CH2-CH2
CH3
N N Fe N N
Cyt C
CH3
Rle Jouent un rle important dans le transfert dlectron Fe2+ Fe3+ + 1erduit oxyd
6.1.4- Acide lipoque Structure Ce coenzyme a la structure dun Acide gras satur 8 C avec un pont disulfure entre C6-C8. 7 1
COOH
2
CH2
3
CH2
4
CH2
5
CH2
6
CH S
CH2
8
CH2 S
+ 2H
SH
SH
Rle:
Transporteur dH2
Lacide lipoque est attach par covalence lenzyme par son carboxyle un reste lysine de lenzyme : groupement prosthtique
6.2- Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement 6.2.1- Thiamine pyrophosphate (TPP) Structure:
NH2 N CH2 N N+ CH2 CH3 CH3 CH2 O
centre actif
S OH P O O OH P O OH
Cycle pyrimidique
Cycle thiazole
Thiamine = vitamine B1 Rle: Transporteur dactaldhyde dans les ractions de dcarboxylation COOH Ex: Pyruvate DH
C=O CH3
O H
CO2 + CH3
Actaldhyde
Structure
O CH2 H H O O O P O O P O CH2 CH3
H
NH2 N N H H OH OH N N
6.2.2- Coenzyme A (CoA-SH) ou Coenzyme dAcylation Drive dune vit amine du groupe B: ac pantothnique Rle Transporteur dactyle et dacide gras
O P OH
OH OH
CH3
Acide pantothnique CoA-SH + CH3COOH CH3CO-SCoA actyle CoA CoA-SH + R-COOH Thiothylamine ou mercaptoethylamine RCO-SCoA acyl CoA
SH
(FH4)
Acide folique
N 4
2
NH2
5 6 8 7
N
CH2 NH
10
CO NH
CH COOH
N. pteridine
OH H N H H N H CH2
Glu
FH4
N NH2
NH
CO NH
CH COOH
Rle
: transporteur dunits un C (CH3) CH2 Sur N5 Sur N10 N CH2 5 entre N5 et N10
10
Structure: Met
NH2
adnosine
CH3
CH3 H H OH
O H H OH
Structure:
O HO P OH O O P OH OO O P OH H O H OH O H
N N
adnine
H OH
AMP ADP ATP Rle: transfert de groupements ATP ATP ATP ADP AMP + P + P-P + P + P-P
adnosyl
drive de la vit B6
= vit B6
CHO CH2OH OH CH3 N N OH CH3 CH2-NH2
pyridoxine Rle:
pyridoxal
pyridoxamine
O HO P OH O CH3
O CHO
NH3
OH CH3 N
HO
P OH
Phosphate de pyridoxal
Phosphate de pyridoxamine
Chapitre 2:
Objectifs:
La cintique enzymatique
Dfinir la vitesse maximale (Vmax) et la constante de Michaelis (KM) Reprsenter graphiquement la cintique dune enzyme en fonction des diffrentes variables
=k
V=
[A]
V=
d[ A] d[P ] = K 1 [ A] = dt dt
K1 K2
d[ A] d[P] = K [ A] = 1 dt dt
d[P ] d[ A] = K 2 [P] = dt dt
quilibre
K1[A] = K2[P]
Keq =
K1 [P ] = K 2 [A ]
K1 A+B K2 P
V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de P ): V = K1[A][B] V de retour= V dapparition de A et B (disparition de P): V = K2[P] quilibre K1[A][B] = K2[P]
K1 [P] = Keq= K 2 [ A ][B]
K1 A +B K2 C+ D V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de C et D): V=K1[A][B] V de retour= V dapparition de A et B (disparition de C et D): V=K2[C][D] K1[A][B] = K2[C][D] Keq=
K1 [C][ D] = K 2 [ A ][B ]
S +E
K1 K2
ES
K3 K4
P +E
La V de la raction enzymatique est influence par: [S], [E], temprature, pH, effecteurs.
2.1- V de la raction en fonction de [S] Ltude de la cintique enzymatique a t ralise essentiellement par Michaelis et Menten en 1913. 2.1.1 Courbe de Michaelis-Menten [E] fixe et faible V V=Vmax [E] =[ES] Saturation de lenzyme Vmax Ordre 0
Courbe de Michaelis-Menten
Ordre 1
S S S S S S S S S S S S S
[S]
S S S S
Interprtation de la courbe de MM
- Aux faibles conc de substrat, la vitesse de la raction est proportionnelle celle du substrat (raction dordre 1)
- Lorsque la conc de S augmente, la vitesse ne saccrot plus dans les mmes proportions (raction dordre mixte)
- Aux fortes conc de S la vitesse devient constante, indpendante de cette concentration (raction dordre 0): lenzyme est sature par son substrat. Ce phnomne est particulier la cintique enzymatique.
V= f([S]) ?
S +E ES K3
ES (rapide)
[E] = concentration totale de lenzyme [ES] = concentration du complexe Enz-Sub [E]L = concentration de lenzyme libre [E] = [E]L+ [ES] [E]L= [E] - [ES]
P + E (lente)
V= K3[ES] Vitesse de formation de [ES] = Vitesse de disparition de [ES] = d[ES] = K1[E]L[S] = K1([E]-[ES])[S] dt - d[ES] = K2[ES] + K3[ES] = [ES] (K2+K3) dt
Etat stationnaire: V de formation de [ES] = V de disparition de [ES] K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)
K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3) ([E]-[ES])[S] [ES] (K2+K3) = KM = K1 [E][S] - [ES][S] = [ES] KM
[E] [S] [ES](KM+[S]) = [E][S] Or, V = K3[ES] Vmax = K3 [E] Vmax [S] KM+[S] [ES] = KM+[S] = K3 [E] [S] KM+[S] V=Vmax [E]=[ES]
V=
Equation de M-M
V=
2[S]= KM +[S]
KM = [S]
Vmax
Vmax 2
KM 1.1.3- Signification de Vmax et de KM Vmax est atteinte lorsque toute lenzyme est sature par le substrat
[S]
KM est la valeur de S pour laquelle la vitesse de la raction est Vmax/2 KM est une grandeur exprimentale qui peut varier avec la structure du S, le pH, la temprature. Chaque enzyme a un KM caractristique pour un S KM indique laffinit de lenzyme pour le S KM affinit
1.1.4- Reprsentation de Linweaver et Burk [S] KM 1 = KM +[S] = + V Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S]
V=
1 V
1/Vmax 1 [S]
-1/KM
Cette reprsentation offre lavantage de permettre la dtermination plus prcise de KM et Vmax. De plus, tant une droite, elle ncessite moins de points exprimentaux.
V E3 E2 E1 V
[S]
[E]
Dnaturation de la protine
temprature
20 30 40 50 60
1.4- Influence du pH
pepsine
cholinestrase
10
12
pH
Le pH agit:
1.5- Effet des effecteurs Rle des effecteurs: Physiologique: Rgulation du mtabolisme cellulaire Biochimique: Permettre de mieux comprendre le mode daction des enzymes comptitive rversibles inhibiteurs activateurs effecteurs allostriques irrversibles non comptitive incomptitive
1.5.1- Inhibiteurs 1.5.1.1- Inhibition rversible 1.5.1.1.1- Inhibition comptitive Exerce par un compos dont la structure ressemble celle du S E + S E + I KI = ES E + P S i
K1 K2
KM= KM(1+[I]/KI)
Vmax [S]
1 V
Sans I [I]
1/ V
[I]
Vmax/2
1/Vmax
KM KM KM
[S] KM affinit
1/[S]
Quand [S] augmente , leffet de linhibiteur disparat: Linhibition comptitive est leve par un excs de substrat Vmax nest pas modifie
COOH
Succinate dshydrognase
CH2 CH2 COOH
CH CH COOH
FAD
FADH2
succinate
COOH
COOH
Fumarate
CH2
CH2
CO
COOH
malonate
COOH
oxaloactate
Les amines quaternaires sont des inhibiteurs comptitifs de la cholinestrase actylcholinestrase Choline + ac. actique CH3
actylcholine
R1 R2 R3 N+ R4
Amines quaternaires
Antimtaboliques
En sintroduisant dans lorganisme, ils donnent naissance des composs anormaux et ralentissent certains mtabolismes. fluorouracile 2-amino adnine Action anti-cancreuse
La sulfamide bactrie
N-ptridine +Ac. para amino-benzoque + Glu
NH2
NH2
E
COOH
SO2-NH2
KM
[S]
1/[S] -1/KM
Ce type dinhibition nest pas lev par un excs de substrat KM est inchang, laffinit de E pour S nest pas affecte Vmax est diminue par linhibiteur Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des ractifs capables de se combiner rversiblement avec les groupement SH des radicaux Cys indispensables lactivit enzymatique comme les mtaux lourds (Cu2+, Ag2+, Hg2+..) Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg2+, cet ion peut tre chlat par EDTA (thylne diamine ttra actique).
Vmax
[S]
Vmax Vmax
[S]
-1/KM -1/KM
1/[S]
Cet inhibiteur dplace leq, abaisse KM. Une partie de ES reste bloque sous forme ESI, donc Vmax est diminue
KM
Comptitive Non comptitive Incomptitive
Vmax
Pente
F
CH3
E-CH2OH + E Ser
CH CH3
P O
CH
CH3 CH3
CH3 CH CH3 O
O P O O CH CH3 CH3
+ HF
DFP
Ex. enzyme srine: actylcholinestrase 3me exemple: Acide cyanhydrique (HCN): Poison respiratoire Forme un complexe stable avec le fer des cytochromes (enzymes respiratoires cellulaires) et provoque leur inhibition
1.5.2- Activateurs 1.5.2.1- Activation par protection de lenzyme Des composs qui protgent les enzymes contre les oxydations dans les enzymes Cys se comportent comme des activateurs E-SH + SH-G E Cys Glutathion E-S ------ SG + H2
1.5.2.2- Activation par les ions Concerne les enzymes qui ncessitent des ions pour leur activit Exemple: Mg2+ est un activateur des kinases
1.5.2.3- Activation par action sur les subunits enzymatiques Protine kinase protine + ATP Protine-P + ADP
AMPc
AMPc
E inactive
[S] Contrairement aux enzymes michaeliennes, les enzymes allostriques nexercent leur action qu des concentrations en substrat leves
ont une structure quaternaire, formes dun nombre pair de sous units.
La fixation de S au 1er site entrane un changement A de conformation des autres sites, ce qui modifie laffinit pour le S. On dit quil y a un effet coopratif.
En plus du site actif o se fixe le substrat, lenzyme possde un ou plusieurs sites allostriques o peuvent se fixer des effecteurs allostriques (activateurs ou inhibiteurs). Ces effecteurs nont aucune analogie structurale avec le substrat.
2.2- Action des effecteurs allostriques Ce sont des substances qui agissent comme activateurs ou inhibiteurs en modifiant la conformation des sites de liaison au substrat, ce qui change laffinit pour le substrat Activateurs allostriques Augmentent laffinit de lenzyme pour le substrat, lui permettant dagir de faible concentration en substrat inhibiteurs allostriques
V
Activateur
Comme les inhibiteurs non comptitifs diminuent laffinit de lenzyme pour le substrat Vmax 2 Inhibiteur
KM(a)KM KM(I)
[S]
Model de Monod Wyman et Changeux (MWC) 1- possdent 2 sites: site actif et des sites rgulateurs (activateur et inhibiteur) 2- formes de plusieurs sous units identiques (= protomres) 3- existent sous 2 tats en quilibre: tat catalytique R et tat inhib T
A ou S
Allostrie
Autre forme
4- effet coopratif:du la prsence de plusieurs sous units (protomres) la fixation dune molcule de S sur un protomre dplace lquilibre vers la forme active
2.4- Importance des enzymes allostriques Ont un rle de rgulation trs important dans la cellule: Permettent ladaptation du mtabolisme au besoin de la cellule En gnral lenzyme allostrique catalyse la 1re raction, limitante dune voie mtabolique Son activit peut tre contrle par des activateurs ou inhibiteurs appartenant cette voie mtabolique
E1
E2
E3
X X= inhibiteur allostrique
Les effecteurs allostriques ont une action spcifique sur les enzymes allostrique, en se fixant sur leur sites allostriques
MECANISME DE LA REACTION ENZYMATIQUE 1- Chymotrypsine: hydrolyse les peptides au niveau de la Tyr et de Phe
R-CO-NH-R + H2O RCOOH + NH2-R
O C R C O O- H N (Asp102)
R'
R'
O N C O R
(His 57)
(His 57)
Enzyme
Enzyme
acylchymotrypsine
H
O C O
-
O
H N N
O
O C O R
OH
H N N H O(His 57)
(Asp102)
(His 57)
(Asp102)
CH2
(Ser 195)
CH2
(Ser 195)
Enzyme
Enzyme
acylchymotrypsine
2- Actylcholinestrase
enzyme
NH Site estrasique N
O C
actylcholine
CH3
CH2
CH2
OH CH2
CH3
Ser
CH3
HO
Tyr
H 2O
O
OH
HO
C CH3
choline
Ac. actique
HOOC CH NH2C HO R
CH2 O P N
HOOC CH N
CH2 O P N
H 2O
Base de schiff
COOH R
OH CH3
HOOC C R N
CH2 O P N
+ H 2O
C O
+
NH2
OH CH3
N CH2 O P
Ac. ctonique
Phosphate de pyridoxamine
DO
DO = [C] l
260
350
AH2
+ NAD+
A + NADH + H+
La prsence de certaines enzymes dans le srum est le signe dune ncrose tissulaire Mais dans certains cas la mme activit enzymatique peut tre due a les enzymes diffrentes selon leur origine tissulaires. Cest le cas des isoenzymes Llectrophorse des isoenzymes permet de localiser lorigine de la ncrose
3- Les isoenzymes
Ce sont des enzymes qui ont la mme proprit catalytique mais qui diffrent par leur proprits physicochimique. Les isoenzymes peuvent diffrer dun tissu un autre. LDH Ac. pyruvique Ex.: Lactate dshydrognase (LDH): Ac. lactique LDH: 4 sous units de 2 types, H et M Forme H (coeur) Forme M (muscle et foie)
En plus de ces anomalies, il existe des dficits hrditaires de certaines enzymes qui sont lorigine de maladies mtaboliques graves: Ex: maladie Enzyme altre Tyrosine hydroxylase Phnylalanine hydroxylase Cystathionine synthtase