PODREDUMBRES DE POSTCOSECHA EN PERA: BUSQUEDA DE POSIBLES ANTAGONISTAS BIOLOGICOS

M. Cristina Sosa
1,2,3

, Andrea Robiglio , M. Cecilia Lutz , Christian A. Lopes

1,3

1,3

and Marcela P. Sangorrn

1,3*

1- Laboratorio de Fitopatologa, Facultad de Ciencias Agrarias; 2- Laboratorio de Microbiologa y Biotecnologa, Facultad de Ingeniera; 3- Instituto Multidisciplinario de Investigacin y Desarrollo de la Patagonia Norte (IDEPA, CONICET- UNComahue). *sangorrinmarcela@conicet.gov.ar

Las podredumbres ms importantes de poscosecha en peras de la regin de los valles de Ro Negro y Neuqun, son el moho azul causado por Penicillium expansum y Penicillium spp. y el moho gris causado por Botrytis cinerea (Dobra et al., 2008). Las restricciones en el uso de principios activos de fungicidas de sntesis -falta de registro- y en los lmites mximos de residuos permitidos, as como la prdida de eficacia de algunos fungicidas, dada la presencia de cepas de Penicillium y Botrytis resistentes, evidencian la falta de estrategias alternativas ms seguras, amigables con el ambiente y a la vez, eficientes en el control de estos patgenos. En diferentes estudios, se ha demostrado que el control biolgico de enfermedades de poscosecha mediante microorganismos epfitos (bacterias y levaduras) es una alternativa promisoria y factible de incorporase en sistemas de produccin de fruta orgnica e integrada. En los ltimos aos, se han seleccionado levaduras como Agentes de Control Biolgico (ACB) de patgenos de citrus, frutos de pepita y frutillas en poscosecha (Janisiewicz, 2010). Sin embargo, slo unos pocos ACB se formularon comercialmente y no tienen registro en Argentina. En el ao 2007 se inici una lnea de investigacin en UNCOMA para abordar la problemtica del control de podredumbres en pera en la zona del Alto Valle de Ro Negro y Neuqun, proponiendo como estrategia las levaduras nativas como ACB.
Por qu en pera?

Argentina lidera las exportaciones mundiales, con el 40% del total producido en el Hemisferio Sur. Las podredumbres aparecen despus de 3-4 meses de conservacin en fro y aumentan a tiempos mayores.

Qu ventajas presentan las levaduras? Se aslan de los mismos alimentos que se quieren preservar. Se reconocen como GRAS (Generally Recognized as Safe). No afectan la salud humana. Utilizan un amplio rango de nutrientes, crecen con baja concentracin de oxgeno, baja actividad de agua, baja

temperatura y sobreviven en condiciones ambientales adversas. Son genticamente estables y efectivas en bajas cantidades.

Por qu la aplicacin de ACB en postcosecha?

El ambiente de conservacin de la fruta es confinado y controlado, lo que facilita su aplicacin y adaptacin. El valor agregado de los productos cosechados, justifica mayores costos de aplicacin.

En este estudio se plante que levaduras nativas aisladas y seleccionadas de fruta de pera almacenada a 0/-1C, tienen mayor adaptacin al hbitat de conservacin y mejor capacidad antagnica frente a los patgenos regionales, que las levaduras comerciales. En este primer artculo se presenta el trabajo de aislamiento y caracterizacin de los principales patgenos postcosecha y de las levaduras epfitas de peras de la regin. Aislamiento y caracterizacin de patgenos: B. cinerea y P. expansum Los patgenos se aislaron de peras con sntomas de moho gris y moho azul (Figura 1), conservadas en una cmara frigorfica de la regin (A), con manejo convencional de la fruta: tratamiento de TBZ en el drencher y en la lnea de empaque. Mediante mtodos morfolgicos y
moho gris en DAnjou moho azul en Packhams

Figura 1. Peras con sntomas de podredumbre .

culturales se identific a

P. expansum,

causal del moho azul en 13 aislamientos y a B. cinerea, causal del moho gris en 10 aislamientos (Figura 2). La identificacin de P. expansum se confirm por el mtodo
Figura 2: Morfologa de los patgenos Penicillium expansum

molecular RFLP-PCR de la regin ITS del DNAr; con un amplificado de 600 pares de
400x

1x

bases (pb) y con patrones de bandas de restriccin que corresponden a los descriptos para la especie (Pianzzola et al., 2004). Los aislamientos de P. expansum y B. cinerea se caracterizaron por virulencia en ensayos de 7 das a 24C (dimetro de lesin en pera) y por resistencia a dos fungicidas usados habitualmente en la regin: tiabendazol (TBZ) y captan, cuyas dosis comerciales son 500 y 660 ppm

1x
Botrytis cinerea

400x

respectivamente. Se realizaron ensayos in vitro a concentraciones de 1 a 2000 ppm, determinndose la concentracin inhibitoria

mnima (CIM) para cada aislamiento de patgeno a cada fungicida (Tabla 1). En cuanto a la resistencia al TBZ, el criterio usado para la caracterizacin de los patgenos fue la concentracin discriminatoria propuesta por la FRAC: aislamiento sensible: crecimiento por debajo de 10ppm; aislamiento resistente: crecimiento desde y por encima de 10ppm. El 76% de aislamientos de P. expansum y 90% de B. cinerea fueron resistentes a

Tabla 1. Virulencia y resistencia de P. expansum y B. cinerea

Patgeno y aislamiento

TBZ (Tabla 1). Se destacaron los aislamientos AP7 y AP13 de P.

Dimetro de lesin (mm) 22,6 2,0 abc 22,3 5,0 abc 24,6 4,0 abc 27,0 1,0 bc 20,0 5,0 ab 22,3 7,0 abc 29,0 2,0 c 22,3 3,0 abc 20,0 5,0 ab 17,6 3,0 a 26,0 6,0 bc 20,3 0,5 ab 29,0 6,0 c 37,6 8,0 ab 45,3 9,0 b 24,0 6,0a 28,6 10,0ab 38,0 1,0 ab 34,0 11,0 ab 33,6 6,0 ab 34,3 11,0 ab 39,6 12,0 ab 39,3 4,0 ab

CIM (ppm) Captan 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 41 88 41 88 41 41 41 41 5 41 TBZ 250 >2000 250 250 250 1 250 250 250 250 1 5 >2000 250 250 250 250 250 250 250 250 1 250

expansum por presentar mayor dimetro de podredumbre (29mm) y resistencia a TBZ. Adems para este patgeno se encontraron dos aislamientos sensibles a la dosis comercial del TBZ (AP2 y AP13). Dentro de los aislamientos de B. cinerea AB2 fue el ms virulento, con 45mm de lesin, y con alta resistencia a TBZ, pero con CIM menores a la dosis comercial de este fungicida. Todos los aislamientos de P. expansum fueron sensibles a 5 ppm de captan (Tabla 1), en cambio el 70% de los aislamientos de B. cinerea pudo crecer hasta 41 ppm y el 20% hasta 88 ppm. No

AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 AP6 AP7 AP8 AP9 AP10 AP11 AP12 AP13 AB1 AB2 AB3 AB4 AB5 AB6 AB7 AB8 AB9 AB10

hay para este fungicida cepas resistentes a las dosis comerciales. Aislamiento y caracterizacin de levaduras De superficie de peras sanas con 7 meses de conservacin a 0/-1C tanto de la cmara (A) como (B), manejo de transicin a orgnico certificado, se aislaron 75 levaduras epfitas en total, que se agruparon por caracteres culturales y microscpicos (Figura 3).
Figura 3. Grupos de levaduras establecidos por caractersticas culturales y microscpicas (400x)

B. cinerea

P. expansum

Tabla 2. Diversidad y abundancia de especies de levaduras aisladas de pera. grupo Especies de levaduras Nmero de aislamientos (%) Cmara A Cmara B Total

1 2 3 4 5 6 7

Aureobasidium pullulans Pichia philogaea Cryptococcus difluens Cryptococcus albidus Pichia membranifaciens Rhodotorula mucilaginosa Saccharomyces cerevisae Total /cmara

10 (37) 1 (4) 5 (18) 11 (41) 27

24 (50) 7 (15) 9 (19) 1 (2) 1 (2) 6 (12) 48

34 9 7 2 1 11 11 75

Se identificaron las especies de cada grupo (Tabla 2) por mtodos moleculares propuestos por Esteve-Zarzoso et al. (1999). El 64% de las levaduras aisladas provinieron de la cmara de transicin a orgnico (B), presentando mayor diversidad de especies que en la cmara A.
Tabla 3. Caracterizacin de levaduras de pera y de otros orgenes Especies de levaduras (N de aislamientos) A. pullulans (34) C. difluens (9) Epfitas de pera C. albidus (2) P. membranifaciens (1) P. philogaea (7) R. mucilaginosa (11) S. cerevisiae (11) H. uvarum (2) Bodegas regionales M. pulcherrima (2) T. delbrueckii (2) W. anomala (2) Comercial C. albidus C85
+ = alto, m= moderado - = ausente

En

el

biocontrol

de

patgenos las levaduFuente Crecimiento a 0C + m 28 7 1 7 7 1 1 1 1 1 4 1 1 2 2 1 1 2 11 1 1 1 1 Toxinas killer N (%) 28 (82) 8 (90) 2 (100) 1 (100) 4 (57) 7 (63) 11 (100) 2 (100) 2 (100) 2 (100) 2 (100) 1 (100)

ras

pueden

empelar

varias estrategias, dos de ellas son: buen

crecimiento en fro y produccin de toxinas killer. Estas caractersticas se evaluaron en los

aislamientos epfitos de pera, en otras levaduras de bodegas vnicas

productoras de toxinas killer y en una levadura

comercial propuesta para control biolgico poscosecha en otros pases (Tabla 3). En este estudio se demostr que:

En la regin, existen aislamientos de P. expansum y B. cinerea de pera resistentes a

TBZ, que respaldan la necesidad de mtodos de control alternativos a los fungicidas. El manejo libre de qumicos conserva mejor la diversidad y abundancia de la flora

epfita de levaduras de la fruta de la cmara B. Existe un alto porcentaje de levaduras productoras de toxinas killer y con buen

crecimiento a 0C, caractersticas alentadoras en la bsqueda de buenos antagonistas. Las levaduras aisladas de pera A. pullulans, C. albidus y P. membranifasciens, han

sido reportadas como eficientes antagonistas de patgenos en postcosecha. En el prximo artculo se presentarn los estudios sobre la capacidad biocontroladora de las levaduras nativas y su comparacin con la levadura comercial. Bibliografa de referencia:
Dobra, A., M.C. Sosa & M.C. Dussi. 2008. Low Incidence of Fungal and Bacterial Diseases in the Pear Production of North Patagonia. Argentina. En: 10th Proceedings of the Tenth International Pear Symposium. Acta Horticulturae N 800. Peniche, Portugal. pp. 907-912. Esteve-Zarzoso, B, C. Belloch, F. Uruburu & A. Querol. 1999. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and two ribosomal internal transcribed spacers. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 329-337. Janisiewicz W.J., 2010. Quo vadis of biological control of postharvest diseases. D. Prusky & M.L. Gullino (eds.), Postharvest Pathology, Vol. 2, Springer Science. Pianzzola, M.J, M. Moscatelli & S. Vero., 2004. Characterization of Penicillium Isolotes Associated with Blue Mold on Apple en Uruguay. Plant Dis. 88 (1): 23-28.